具有增加的稳定性的重组因子viii的制作方法

专利名称：具有增加的稳定性的重组因子viii的制作方法
具有增加的稳定性的重组因子Vl I I本申请要求2007年11月1日提交的美国临时专利申请序列第60/984，518号和 2007年11月30日提交的美国临时专利申请系列第60/991，304号的优先权权益，通过引用 将他们每一个整体并入本文。本发明是根据美国国家卫生研究院授予的HL 76213和HL 38199号基金在政府的 支持下进行的。政府具有本发明的某些权利。
背景技术：
最常见的重度遗传性出血疾患血友病A是由血浆蛋白因子VIII的缺乏或缺陷引 起的。还没有血友病A的治愈方法并且治疗由使用(纯化的)血浆制剂或重组蛋白制剂的 替代治疗组成。因子VIII以非共价的金属离子依赖性的异源二聚体参与循环。这种前体辅因 子(procofactor)形式的蛋白含有包括Al (al)A2 (a2)B结构域的重链(HC)和包括(a3) A3C1C2结构域的轻链(LC)，小写的a表示富含酸性残基的短的(约30至40个残基)区 段(参见 Fay, "Activation of Factor VIII andMechanisms of Cofactor Action (因子 VIII的激活和辅因子的作用机制)，"Blood Rev. 18 :1_15 (2004))。因子VIII在A1A2、A2B 和A3A3接合处被凝血酶或因子Xa催化的蛋白裂解激活。该反应的产物因子VIIIa是包括 称为A1、A2和A3C1C2的亚基的异源三聚体，它在酶原因子X向丝氨酸蛋白酶因子Xa的膜 依赖性的转化中作为丝氨酸蛋白酶因子IXa的辅因子起作用(参见Fay，“Activation of Factor VIII and Mechanisms of Cofactor Action (因子 VIII 的激活和辅因子的作用机 制)，” Blood Rev. 18 1-15 (2004)) ·重构研究已显示因子VIII异源二聚体结构是由静电相互作用和疏水相互作用二 者支撑的(Fay, "Reconstitution of Human Factor VIII from IsolatedSubunits (由 分离的亚基重构人因子 VIII)，”Arch Biochem Biophys. 262 525-531 (1988) ；Ansong 等 人，“Factor VIII Al Domain Residues 97_105Represent a Light Chain-interactive Site(因子VIII Al结构域残基97-105代表轻链相互作用位点)，"Biochemistry. 45 13140-13149(2006))，并且链间亲和力被因子VIII与冯维勒布兰德(von ffillebrand) 因子的结合进一步加强(Fay, "Reconstitution of Human Factor VIII from Isolated Subunits (由分离的亚基重构人因子 VIII)，”Arch Biochem Biophys. 262 525-531 (1988)； Kaufman等人,“Regulation of Factor VIII Expression and Activity by vonffillebrand Factor (冯维勒布兰德因子对因子VIII表达和活性的调节，，，Thromb Haemost. 82 201-208(1999))。金属离子也促进链间亲和力和活性参数(Wakabayashi等人，“Metal Ion-independent Association of Factor VlIISubunits and the Roles of Calcium and Copper Ions for Cofactor Activity andlnter-subunit Affinity (金属离子 非依赖性的因子VIII亚基缔合和钙离子和铜离子对辅因子活性和亚基间亲和力的作 用)，"Biochemistry40 10293-10300 (2001))。需要钙来产生活性的因子VIII构象。诱变研 究将钙结合位点定位在Al结构域内富含酸性残基的区段(残基110-126)并且鉴定了此区 域中离子配位的主要的特定残基(Wakabayashi等人，“Residuesll0-126in the Al Domainof Factor VIII Contain a Ca2+ Binding Site Requiredfor Cofactor Activity(因 子VIII的Al结构域中的残基110-126含有辅因子活性所需的Ca2+结合位点)，” J Biol Chem. 279 12677-12684 (2004))。近期的中间分辨率的X射线结构(Shen等人，"The Tertiary Structure and DomainOrganization of Coagulation Factor VIII (凝血因 子VIII的三级结构和结构域组织)，”Blood 111 =1240-1247 (2008))证实了这种钙结合 位点并提出了在A2结构域中的第二个可能位点。这个结构还显示Al和A3结构域中占 有两个1型铜离子位点。较早的功能研究已显示铜离子促进重链和轻链缔合形成异源二 聚体，这在生理PH值下将链间亲和力增加几倍(Fay等人，“HumanFactor Villa Subunit Structure ；Reconstruction of Factor Villa from thelsolated Al/A3-Cl_C2Dimer and A2Subunit (人因子Villa亚基结构由分离的A1/A3-C1-C2 二聚体和A2亚基重构 因子 Villa)，” J Biol Chem. 266 :8957_8962 (1991) ；Wakabayashi 等人，“ρΗ-d印endent Association ofFactor VIII Chains !Enhancement of Affinity at Physiological pH by Cu2+(pH依赖性的因子VIII链的缔合Cu2+在生理pH下增强亲和力)，"BiochimBiophys Acta. 1764 1094-1101 (2006) ；Ansong等人，“Factor VIII A3 DomainResidues 1954-1961 Represent an Al Domain-Interactive Site (因子 VIII A3 结构域残基 1954-1961 代表 Al 结构域相互作用位点)，” Biochemistry44 :8850_8857 (2005))。 因子VIIIa的不稳定性是由A2亚基和A1/A3C1C2 二聚体之间的弱静电相互 作用引起的(Fay 等人，"Human Factor Villa Subunit Structure -Reconstruction of Factor Villa from the Isolated A1/A3-C1-C2 Dimer and A2Subunit(人因 子Villa亚基结构由分离的A1/A3-C1-C2 二聚体和A2亚基重构因子Villa)，” J Biol Chem. 266 8957-8962(1991) ；Lollar φ 入，“pH—dependent Denaturation of Thrombin-activated Poreine Factor VIII (凝血酶激活的猪因子VIII的pH依赖性的 变性，”J Biol Chem. 265 1688-1692 (1990))并且会导致因子 Xase 的活性减弱(Lollar 等人，"Coagulant PropertiesofHybrid Human/Porcine Factor VIII Molecules (杂合 的人/ 猪因子 VIII 分子的促凝血特性)，”J Biol Chem. 267 =23652-23657 (1992) ； Fay 等 人，"Modelfor the Factor Villa-dependent Decay of the Intrinsic Factor Xase Role ofSubunit Dissociation and Factor IXa-catalyzed Proteolysis (因子 Villa 依赖性的内在因子Xase衰退(decay)的模型亚基解离和因子IXa催化的蛋白水解的 作用)，”J Biol Chem. 271 =6027-6032 (1996)) 关于因子VIIIa中的A2亚基的缔合的 可用信息是有限的，Al和A3结构域中的残基似乎都促进这种亚基的保留。已经显示几 种因子VIII点突变相对于野生型有利于A2的解离，并且这些残基定位在A1-A2结构域 界面(Pipe 等人，“Mild HemophiliaA Caused by Increased Rate of Factor VIII A2 Subunit Dissociation :Evidencefor Nonproteolytic Inactivation of Factor Villa in vivo (因子VIII A2亚基解离的速率增加引起的轻度血友病A 体内因子VIII非蛋白 水解灭活的证据)，”Blood 93:176-183(1999) ；Pipe 等人，“Hemophilia A Mutations Associatedwith l-stage/2-stage Activity Discrepancy Disrupt Protein-protein Interactionswithin the Triplicated A Domains of Thrombin-activated Factor VIIIad期/2期活性差异相关的血友病A突变破坏凝血酶激活的因子VIIIa的三个A结构 域中的蛋白-蛋白相互作用)，”Blood 97:685-691(2001))或A2-A3结构域界面(Hakeos等人，“Hemophilia A Mutations within the Factor VIII A2_A3Subunit Interface Destabilize Factor Villa and Cause One-stage/Two-stageActivity Discrepancy(因 子VIII A2-A3亚基界面内的血友病A突变使因子VIIIa不稳定并且引起1期/2期活 性差异)，”Thromb Haemost. 88 781-787 (2002))。这些因子VIII变体表现出特征性 的 1 期/2 期测定差异(Duncan 等人，“Familial Discrepancy Between the One-stage and Two-stage Factor VIIIMethods in a Subgroup of Patients with Haemophilia A(患血友病A的患者亚群中1期和2期因子VIII方法之间的家族差异)，”Br J Haematol. 87 :846-848 (1994) ；Rudzki 等人，“Mutations in a Subgroup of Patients with MildHaemophilia A and a Familial Discrepancy Between the One-stage andTwo—stage Factor VIII =C Methods (患轻度血友病A的患者亚群中的突变和1期与2期因子VIII =C 方法之间的家族差异)，”Br J Haematol. 94 :400_406 (1996))，其中由于A2亚基解离的速 率增加致使后一种测定所测得的活性值显著降低。因子VIII的A结构域的基于血浆铜蓝蛋白的同源性模型的检测(Pemberton等 人，“A Molecular Model for the Triplicated A Domains ofHuman Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin(基于人血浆铜蓝蛋白的晶体结构的 人因子VIII的三个A结构域的分子模型)，” Blood89 =2413-2421 (1997))表明A2结构域 与Al和A3结构域的每一个之间的的延伸界面，其中多个可能的接触点有利于结合相互作 用。在稳定因子VIIIa方面存在着明显的兴趣，因为更稳定形式的蛋白代表了血 友病A的优良治疗剂，可能需要较少的材料来治疗患者(Fay等人，“Mutating Factor VIII =Lessons from Structure to Function(对因子VIII进行突变由结构到功能的 教导)，”Bl00dRevieWS 19:15-27(2005))。为了这个目的，描述了因子VIII的制备，其 中通过在A2和其他的因子VIII结构域之间引入新共价键在重组蛋白中制备了突变以 防止 A2 亚基解离(Pipe 等人，“Characterization of a Genetically Engineered I nactivation-resistantCoagulation Factor Villa( it # XfMit 白勺 舌白勺 Hil IS 子 VIIIa 的表征)，”Proc NatlAcad Sci USA 94:11851-11856(1997) ；Gale 等人，“An EngineeredInterdomain Disulfide Bond Stabilizes Human Blood Coagulation Factor Villa(工程化的结构域间二硫键稳定人血凝血因子Villa)，” J. Thromb. Haemostasis 1 1966-1971(2003))。然而，从此有建议认为这些类型的突变可能在治疗性因子VIII中是不 希望的，因为他们基本上排除了下调的方法。这种情况会产生可能引起损伤的血栓前病症。 因此，可能希望增强因子VIII和因子VIIIa两者的稳定性，但是以促进前血栓病症的可能 性最小的方式进行。本发明针对于克服本领域内的这些和其他缺陷。发明概述本发明的第一方面涉及重组因子VIII，所述重组因子VIII包括导致因子VIII和 因子VIIIa两者的稳定性增强的一种或多种突变。优选地，所述一种或多种突变构成了疏水性氨基酸残基对A1A2或A2A3结构域界 面的任一界面或两个界面的一个或多个带电荷氨基酸残基的取代。本发明的特别优选的重 组因子VIII包括野生型因子VIII的Glu287残基的取代、野生型因子VIII的Asp302残基的取代、野生型因子VIII的Asp519残基的取代、野生型因子VIII的Glu665残基的取代、 野生型因子VIII的Glul984残基的取代或它们的组合。本发明的第二方面涉及包含根据本发明的第一方面的重组因子VIII的药物组合 物。本发明的第三方面涉及编码根据本发明的第一方面的重组因子VIII的分离的核 酸分子。本发明的这个方面还包括含有编码本发明的重组因子VIII的DNA分子的重组DNA 表达系统、和含有所述DNA分子和/或重组表达系统的重组宿主细胞。本发明的第四方面涉及制备重组因子VIII的方法，该方法包括将根据本发明的 第三方面的宿主细胞在使得所述宿主细胞表达重组因子VIII的条件下培养；和分离所述 重组因子VIII。本发明的第五方面涉及治疗动物血友病A的方法。该治疗方法包括给表现血友 病A的动物施用有效量的根据本发明的第一方面的重组因子VIII，从而使动物在血管损伤 后表现出有效的血液凝集。本发明证明在A1A2和A2A3结构域界面的大量带电荷的残基不参与氢键键合，但 是可能使因子VIII结构不稳定和/或在因子VIII前体辅因子激活后促进A2亚基解离。在 所附的实施例中显示用疏水性残基取代这些带电荷的残基-目的是增加隐藏的疏水区域 并诱导隐藏的亲水区域-增强结构域间的结合亲和力。在评估了因子VIII变体在较高的 温度下的活性和A2亚基解离所导致的因子VIII活性衰退的时程之后评估了稳定性参数。 这些研究的结果证明大量突变产生增加的稳定性参数，这与可能由于A2结构域界面处隐 藏的电荷所导致的去稳定力的消除是一致的。因子VIII和激活的辅因子VIIIa的这些稳 定化的变体应该提供治疗血友病A的改良治疗剂。附图简述

图1为图解如通过一期凝集测定(黑色柱)和二期发色因子Xa生成测定(灰色 柱)所测量的因子VIII突变体相对于野生型因子VIII的活性的图。野生型和突变体因子 VIII形式的活性如实施例中所描述地测量。误差线显示由三次独立的测定进行平均的标准 偏差的值。图2A-B分别图解野生型和突变体因子VIII和因子VIIIa的活性衰退。在图2A 中，在55°C下孵育因子VIII(4nM)并在所指示的时间取出等分试样并通过如实施例中所描 述的因子Xa生成测定来测定活性。显示了野生型(虚线，空心圆)、R282A(空心三角形)、 S524A (空心正方形)、N684A (空心菱形)、R531A (实心圆)、S650A (实心三角形)、E287A (实 心正方形)和D302A(实心菱形)的结果。在图2B中，在40nM因子IXa存在的条件下在 23°C下孵育凝血酶激活的因子VIIIa(4nM)并在所指示的时间点取出等分试样并通过如实 施例中所描述的因子Xa生成测定来测量活性。显示了野生型(虚线，空心圆)、R282A(空 心三角形)、S524A(空心正方形)、Y1792F(空心菱形)、N684A(实心圆)、Y1786F(实心三 角形)、R531A(实心正方形)、E287A(实心菱形)和D302A(灰色圆)的结果。所选的快速 衰退的变体的结果在图2B的插图中以放大的比例显示。图3A-B图解因子VIII突变体和野生型因子VIII的SDS-PAGE和蛋白质印 迹分析。图3A显示在8 %的聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE后通过GelCode显现的 纯化的野生型和突变体因子VIII蛋白(0.77yg)。图3B显示在8 %的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转移到PVDF膜上并通过生物素化的R8B12抗体探测的纯化的野生型和 突变体因子VIII蛋白(0.34yg)。条带通过如所附的实施例中所描述的化学荧光显 现。野生型(泳道 1)、Glu272Ala(泳道 2)、Glu272Val (泳道 3)、Asp519Ala(泳道 4)、 Asp519Val (泳道 5)、Glu665Ala(泳道 6)、Glu665Val (泳道 7)、Glul984Ala(泳道 8)和 Glul984Val (泳道9)。MW，分子量标志物sFVIII，单链形式的因子VIII :HC，重链LC， 轻链。单链形式与野生型和突变体因子VIII的异源二聚体形式的表观化学计量比为 0. 96 (野生型)、0. 64(Glu272Ala)、0· 92 (Glu272Val)、0· 74 (Asp519Ala)、0· 8 (Asp519Val)、 0. 64(Glu665Ala)、0. 63(Glu665Val)、0. 91 (Glul984Ala)和 0. 5(Glul984Val)。图4A-D图解因子VIII突变体相对于野生型因子VIII的比活和凝血酶生成测 定。图4A显示使用如所附的实施例中所描述的一期凝集测定(灰色柱)和二期发色因 子Xa生成测定(实心柱)所测定的活性值。图4B-C图解因子VIII蛋白的凝血酶生成图 (thrombogram)。野生型(虚线)、Glu272Ala(空心正方形)、Glu272Val (实心正方形)、 Asp519Ala(空心圆)、Asp519Val (实心圆)、Glu665Ala(空心三角形)、Glu665Val (实心三 角形)、Glul984Ala (空心菱形)和Glul984Val (实心菱形)。图4D图解由凝血酶生成测定 所获得的参数值。凝血酶生成测定如所附的实施例中所描述地进行。凝血酶生成图显示三 次重复样品的平均值。参数值表达为相对于野生型的值(％ )。野生型的实际值为7. 5士0. 5 分钟(滞后时间)、13. 7士0. 3 分钟(峰时间)、157. 3士 14. 7nM(峰值),979. 8士37. 9nM/ 分钟(ETP)。显示了滞后时间(空心柱)、峰时间(灰色柱)、峰值(实心柱)和ETP(线纹 柱)。误差线显示由三次独立的测定进行平均的标准偏差的值。图5A-B图解野生型和突变体因子VIII的活性衰退。在不同的温度(52_60°C )下 孵育因子VIII(4nM)并在所指示的时间取出等分试样并通过如所附的实施例中所描述的 因子Xa生成测定来测定活性。通过非线性最小二乘回归拟合数据，获得衰退速率。每个点 代表由三次独立的测定平均的值。显示了野生型(虚线，交叉符号)、Glu272Ala(空心正方 形)、Glu272Val (实心正方形)、Asp519Ala (空心圆)、Asp519Val (实心圆)、Glu665Ala (空 心三角形)、Glu665Val (实心三角形)、Glul984Ala (空心菱形)、Glul984Val (实心菱形) 和全长的Kogenate因子VIII (灰色圆)的结果。图5A图解在55°C孵育后代表性的因子 VIII衰退曲线。图5B图解在不同温度下的因子VIII衰退速率的曲线。图5B中的插图为 在52-55°C的温度范围内的衰退结果的放大。图6为图解在37°C下血浆中的因子VIII的活性衰退的图。在缺乏因子VIII的 血浆中在37°C下孵育因子VIII (InM)并在所指示的时间取出等分试样并进行如所附的实 施例中所描述的一期凝集测定。显示了野生型(虚线，交叉符号)、Asp519Ala(空心圆)、 Asp519Val (实心圆)、Glu665Ala (空心三角形)、Glu665Val (实心三角形)、Glul984Ala (空 心菱形)和Glul984Val (实心菱形)的结果。通过非线性最小二乘回归拟合数据，并且每 个点代表由三次独立的测定平均的值。图7A-B为图解在不存在或存在因子IXa的条件下野生型和突变体因子VIIIa的 活性衰退的图。图7A显示在23°C下孵育的凝血酶激活的因子VIIIa(4nM)。在所指示的 时间点取出等分试样并通过如所附的实施例中所描述的因子Xa生成测定来测量活性。图 7B显示在存在IXa的条件下野生型和突变体因子VIIIa的活性衰退。在存在40nM因子 IXa的条件下用凝血酶激活因子VIII (4nM)。在所指示的时间点取出等分试样并通过如所附的实施例中所描述的因子Xa生成测定来测量活性。显示了野生型(虚线，交叉符号)、 Glu272Ala(空心正方形)、Glu272Val (实心正方形)、Asp519Ala(空心圆)、Asp519Val (实 心圆)、Glu665Ala (空心三角形)、Glu665Val (实心三角形)、Glul984Ala(空心菱形)和 Glul984Val (实心菱形)的结果。通过非线性最小二乘回归拟合数据，并且每个点代表由三 次独立的测定平均的值。图8为图解将Asp519、Glu665和/或Glul984残基变为Ala或Val的因子VIII 双组合突变体或三组合突变体的比活的图。使用如实施例中所描述的一期凝集测定(灰色 柱)和二期发色因子Xa生成测定(黑色柱)测定活性值。误差线显示由三次独立的测定 进行平均的标准偏差值。图9为图解野生型因子VIII和将Asp519、Glu665和/或Glul984残基变为Ala 或Val的因子VIII双组合突变体或三组合突变体的因子VIII活性衰退速率的图。如实施 例中所描述的，进行因子VIII活性衰退实验并通过非线性最小二乘回归评估衰退速率。灰 色柱显示相对于最佳单突变体的速率(参见实施例5，图5A)并其通过除以最佳(最低)的 速率值计算。例如，最佳单突变体D519AE665A对的速率相对值等于D519AE665A的衰退速 率除以D519A的衰退速率。黑色柱显示表示为10倍的实际衰退速率参数值。图10为图解野生型因子VIII和将Asp519、Glu665和/或Glul984残基变为Ala 或Val的因子VIII双组合突变体或三组合突变体的因子VIIIa活性衰退速率的图。如实 施例中所描述的，在不存在因子IXa的条件下孵育1. 5nM因子VIIIa后进行因子VIIIa活 性衰退测量并且通过非线性最小二乘回归评估了衰退速率。灰色柱显示相对于最佳单突变 体的速率(参见实施例7，图7A)，并且其如图9的说明中所描述的计算。黑色柱显示表示 为10倍的实际衰退速率参数值。图IlA-B图解使用组合突变体的凝血酶生成测定的结果。图IlA显示因子VIII蛋 白的凝血酶生成图。凝血酶生成测定如实施例中所描述的进行。试剂的终浓度为0. 2nM(因 子 VIII)、0. 5pM(rTF)、4 μ M(PSPCPE 囊泡)、433 μ M(荧光底物)、13. 3mM CalClJP 105nM (凝 血酶校准物)。显示了野生型(虚线)、D519AE665V(空心圆)、D519VE665V(实心圆)、 D519VE1984A(空心三角形)和D519VE665VE1984A(实心三角形)的结果。图IlB显示由凝 血酶生成测定所获得的参数值。凝血酶生成图显示三次重复样品的平均值。参数值表达为 相对于野生型的值(％)。野生型的实际值为8. 5士0.4分钟(滞后时间)、21.3士0.6分钟 (峰时间)>58. 5士 15. 6nM(峰值),883. 6士 199. 8nM/分钟(ETP)。滞后时间(空心柱)、峰 时间(灰色柱)、峰值(实心柱)和ETP(线纹柱)。误差线显示由三次独立的测定进行平 均的标准偏差值。图12A-C图解与Glull3Ala突变的组合的在残基Asp519、Glu665和/或Glul984 处的Ala或Val突变体的因子VIII和因子VIIIa的相对于野生型的比活和活性衰退速率。 图12A显示使用如实施例中所描述的一期凝集测定(灰色柱)和二期发色因子Xa生成测 定(黑色柱)所测定的组合突变体相对于野生型的比活。误差线显示由三次独立的测定进 行平均的标准偏差值。图12B显示在55°C下的因子VIII活性衰退测定的结果，衰退速率通 过如实施例中所描述的非线性最小二乘回归评估。图12C显示在不存在因子IXa的条件下 孵育1. 5nM因子VIIIa后进行的因子VIIIa活性衰退测量的结果，并且衰退速率通过如实 施例中所描述的非线性最小二乘回归评估。
发明详述本发明涉及重组因子VIII，所述重组因子VIII具有导致因子VIII和因子VIIIa 两者的稳定性增强的一种或多种突变。本发明的重组因子VIII可以通过修饰野生型因子VIII或突变体因子VIII的氨 基酸序列来制备，所述突变体因子VIII已被另外修饰以影响因子VIII的其他特性，如抗原 性、循环半衰期、蛋白分泌、对因子IXa和/或因子X的亲和力、改变的因子VIII灭活裂解 位点、免疫原性、架存期等。可以根据本发明被修饰的合适的野生型因子VIII可以来自多种动物，包括但不 限于哺乳动物，如人(参见，例如GenBank登录号AAA52484(氨基酸)和K01740(核苷 酸)；和GenBank登录号CAD97566 (氨基酸)和ΑΧ746360(核苷酸)，通过引用将它们整体 并入本文)、大鼠(参见，例如，GenBank登录号AAQ21580(氨基酸)和AY362193 (核苷酸)， 通过引用将它们整体并入本文)、小鼠(参见，例如，GenBank登录号AAA37385(氨基酸)和 L05573(核苷酸)，通过引用将它们整体并入本文)、豚鼠、狗(参见，例如，GenBank登录号 AAB87412 (氨基酸)和AF016234 (核苷酸)；以及GenBank登录号AAC05384 (氨基酸)和 AF049489(核苷酸)，通过引用将它们整体并入本文)、猫、猴、黑猩猩(参见，例如GenBank 登录号XP 529212(氨基酸和XM 529212 (核苷酸)，通过引用将它们整体并入本文)、猩猩、 牛、马、绵羊、猪(参见，例如GenBank登录号NP_999332(氨基酸)和NM_214167 (核苷酸)， 通过引用将它们整体并入本文)、山羊、兔和鸡。这些和其他序列还可以经由血友病A突变、 结构、测试和资源网站(或HAMSTeRS)以电子方式获得，该网站还提供人、猪、鼠和犬的因子 VIII蛋白的比对。因此，哺乳动物因子VIII蛋白的保守性和同源性是熟知的。举例来说，人因子VIII cDNA核苷酸和预测的氨基酸序列分别以SEQID NO :1和2 显示在下面。人因子VIII是作为约300kDa的单链蛋白合成的，它具有定义“结构域”序列 NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H的内在序列同源性。在因子VIII分子中，如本文所用的“结构 域”为通过内在氨基酸序列同一性和凝血酶的蛋白裂解位点定义的连续的氨基酸序列。除 非另外指明，否则在与人氨基酸序列(SEQ ID NO 2)比对时，因子VIII结构域包含下列氨 基酸残基Al，残基 Ala1-Arg372 ；A2，残基 Ser373-Arg740 ；B,残基 Ser741-Arg1648 ；A3，残基 Ser169tl-Ile2032 ；
Cl，残基 Ar&Q33-Asn2172 ；以及C2，残基 Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包含残基Ser169tl-Tyr2332。剩余的序列残基Glu1649-Arg1689通常被称 为因子VIII轻链激活肽。因子VIII被凝血酶或因子Xa激活，凝血酶或因子Xa将它从冯 维勒布兰德因子解离形成因子Villa，因子VIIIa具有促凝血功能。因子VIIIa的生物学 功能是通过几级放大来增加因子IXa对因子X激活的催化效力。凝血酶激活的因子VIIIa 为160kDa的A1/A2/A3-C1-C2异源三聚体，它与因子IXa和因子X在血小板或单核细胞的 表面上形成复合体。如本文所用的“部分结构域”是形成结构域的部分的连续氨基酸序列。编码野生型人因子VIII的基因具有如下的SEQ ID NO=I的核苷酸序列
gccaccagaagatactacctgggtgcagtggaactgtcatgggactatatgcaaagtgatctcggtgagctgcctgtggacgcaagatttcctcctagagtgccaaaatcttttccattcaacacctcagtcgtgtacaaaaagactctgtttgtagaattcacggatcaccttttcaacatcgctaagccaaggccaccctggatgggtctgctaggtcctaccatccaggctgaggtttatgatacagtggtcattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagc
ttctcccagaattcaagacaccctagcactaggcaaaagcaatttaatgccaccacaattccagaaaatgacatagagaagactgacccttggtttgcacacagaacacctatgcctaaaatacaaaatgtctcctctagtgatttgttgatgctcttgcgacagagtcctactccacatgggctatccttatctgatctccaagaagccaaatatgagactttttctgatgatccatcacctggagcaatagacagtaataacagcctgtctgaaatgacacacttcaggccacagctccatcacagtggggacatggtatttacccctgagtcaggcctccaattaagattaaatgagaaactggggacaactgcagcaacagagttgaagaaacttgatttcaaagtttctagtacatcaaataatctgatttcaacaattccatcagacaatttggcagcaggtactgataatacaagttccttaggacccccaagtatgccagttcattatgatagtcaattagataccactctatttggcaaaaagtcatctccccttactgagtctggtggacctctgagcttgagtgaagaaaataatgattcaaagttgttagaatcaggtttaatgaatagccaagaaagttcatggggaaaaaatgtatcgtcaacagagagtggtaggttatttaaagggaaaagagctcatggacctgctttgttgactaaagataatgccttattcaaagttagcatctctttgttaaagacaaacaaaacttccaataattcagcaactaatagaaagactcacattgatggcccatcattattaattgagaatagtccatcagtctggcaaaatatattagaaagtgacactgagtttaaaaaagtgacacctttgattcatgacagaatgcttatggacaaaaatgctacagctttgaggctaaatcatatgtcaaataaaactacttcatcaaaaaacatggaaatggtccaacagaaaaaagagggccccattccaccagatgcacaaaatccagatatgtcgttctttaagatgctattcttgccagaatcagcaaggtggatacaaaggactcatggaaagaactctctgaactctgggcaaggccccagtccaaagcaattagtatccttaggaccagaaaaatctgtggaaggtcagaatttcttgtctgagaaaaacaaagtggtagtaggaaagggtgaatttacaaaggacgtaggactcaaagagatggtttttccaagcagcagaaacctatttcttactaacttggataatttacatgaaaataatacacacaatcaagaaaaaaaaattcaggaagaaatagaaaagaaggaaacattaatccaagagaatgtagttttgcctcagatacatacagtgactggcactaagaatttcatgaagaaccttttcttactgagcactaggcaaaatgtagaaggttcatatgacggggcatatgctccagtacttcaagattttaggtcattaaatgattcaacaaatagaacaaagaaacacacagctcatttctcaaaaaaaggggaggaagaaaacttggaaggcttgggaaatcaaaccaagcaaattgtagagaaatatgcatgcaccacaaggatatctcctaatacaagccagcagaattttgtcacgcaacgtagtaagagagctttgaaacaattcagactcccactagaagaaacagaacttgaaaaaaggataattgtggatgacacctcaacccagtggtccaaaaacatgaaacatttgaccccgagcaccctcacacagatagactacaatgagaaggagaaaggggccattactcagtctcccttatcagattgccttacgaggagtcatagcatccctcaagcaaatagatctccattacccattgcaaaggtatcatcatttccatctattagacctatatatctgaccagggtcctattccaagacaactcttctcatcttccagcagcatcttatagaaagaaagattctggggtccaagaaagcagtcatttcttacaaggagccaaaaaaaataacctttctttagccattctaaccttggagatgactggtgatcaaagagaggttggctccctggggacaagtgccacaaattcagtcacatacaagaaagttgagaacactgttctcccgaaa
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ccagacttgcccaaaacatctggcaaagttgaattgcttccaaaagttcacatttatcagaaggacctattccctacggaaactagcaatgggtctcctggccatctggatctcgtggaagggagccttcttcagggaacagagggagcgattaagtggaatgaagcaaacagacctggaaaagttccctttctgagagtagcaacagaaagctctgcaaagactccctccaagctattggatcctcttgcttgggataaccactatggtactcagataccaaaagaagagtggaaatcccaagagaagtcaccagaaaaaacagcttttaagaaaaaggataccattttgtccctgaacgcttgtgaaagcaatcatgcaatagcagcaataaatgagggacaaaataagcccgaaatagaagtcacctgggcaaagcaaggtaggactgaaaggctgtgctctcaaaacccaccagtcttgaaacgccatcaacgggaaataactcgtactactcttcagtcagatcaagaggaaattgactatgatgataccatatcagttgaaatgaagaaggaagattttgacatttatgatgaggatgaaaatcagagcccccgcagctttcaaaagaaaacacgacactattttattgctgcagtggagaggctctgggattatgggatgagtagctccccacatgttctaagaaacagggctcagagtggcagtgtccctcagttcaagaaagttgttttccaggaatttactgatggctcctttactcagcccttataccgtggagaactaaatgaacatttgggactcctggggccatatataagagcagaagttgaagataatatcatggtaactttcagaaatcaggcctctcgtccctattccttctattctagccttatttcttatgaggaagatcagaggcaaggagcagaacctagaaaaaactttgtcaagcctaatgaaaccaaaacttacttttggaaagtgcaacatcatatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaatttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcactgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgtacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccctgggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttggcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagtttatcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcattatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgggaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgccacctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacctcaggtg
aataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtcacaggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatggcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgttactgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgaggcacaggacctctactga由SEQ ID NO 1编码的野生型人因子VIII具有如下的SEQ ID NO 2的氨基酸序 列ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASL E ISPITFLTAQTLLM D LGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEV⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVED GPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYE DTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTCDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYEGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTffAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEV
EDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVF TVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY在上面的序列中，通过粗体和下划线标记了几个带电荷的残基，包括Glu287、 Asp302、Asp519、Glu665 和 Glul984。本发明的重组因子VIII由在A1A2或A2A3结构域界面的任一个或两个的一个或 多个带电荷氨基酸残基被疏水性氨基酸残基取代来表征。优选地，被取代的带电荷的残基 为不参与A1A2结构域之间或A2A3结构域之间的氢键键合的Glu或Asp残基。取代带电 荷的残基的疏水性氨基酸残基可以为Ala、Val, lie、Leu、Met、Phe或Trp的任一种。本发 明的特别优选的重组因子VIII包括野生型因子VIII的Glu287残基的取代、野生型因子 VIII的Asp302残基的取代、野生型因子VIII的Asp519残基的取代、野生型因子VIII的 Glu665残基的取代、野生型因子VIII的Glul984残基的取代或它们的组合。D302A、E287A、 E665A、E665V、D519A、D519V、E1984A 和 E1984V 取代对于实现因子 VIII 和因子 VIIIa 二者的 稳定性增强的重组因子VIII是优选的。这些取代的优选组合包括但不限于D519AE665V、 D519VE665V 和 D519VE1984A 双突变体、以及 D519AE665VE1984A 和 D519VE665VE1984A 三突 变体。认为这些突变体的增强的稳定性是通过与野生型因子VIIIa相比稳定因子VIII中 的结构域间界面以及降低A2亚基从A1/A3C1C2解离来达成的。可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII序列还可以包括任何先前已知 的或随后被鉴定的突变体因子VIII序列，所述突变体因子VIII序列具有关于多种属性的 被修饰的特性，包括但不限于抗原性、循环半衰期、蛋白分泌、对因子IXa和/或因子X的 亲和力、改变的因子VIII灭活裂解位点、因子VIIIa的增强的比活、免疫原性和架存期。可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的一个实例为具有修饰的钙结 合位点，优选在SEQ ID NO :2的残基113处的因子VIII。这提供具有增强的比活的因子 VIIIa0这种类型的示例性突变体描述在授予Fay等人的美国专利申请公布第10/581,471 号中，通过引用将其整体并入本文。优选地，还根据一种或多种上文所描述的突变(例如， 在位置287、302、519、665和/或1984)修饰残基113突变体以提供高稳定性/高比活的 因子VIII蛋白。示例性的高稳定性/高比活的因子VIII蛋白包括但不限于具有组合的 E113AD519A、E113AD519V、E113AE665A、E113AE665V或E113AE1984V 取代的那些。可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第二个实例为含有SEQ ID NO 2的氨基酸残基1-740和1690-2332的无B结构域的因子VIII (参见，例如授予Lollar 的美国专利第6，458，563号，通过引用将其整体并入本文)。在本发明的无B结构域的重组因子VIII的一个实施方式中，B-结构域被DNA接
16头区段取代，并且至少一个密码子被编码与猪的因子VIII的相应残基具有相同电荷的氨 基酸残基的密码子取代(参见，例如授予Hauser等人的美国专利申请公布第2004/0197875 号，通过引用将其整体并入本文)。在本发明的无B结构域重组因子VIII的另一实施方式中，修饰的突变体因子VIII 被具有插入一个或多个位点的截短的因子IX内含子1的核苷酸序列编码(参见，例如授予 Negrier的美国专利第6，800，461号和授予Negrier的美国专利第6，780，614号，通过引用 将他们每一个整体并入本文)。这种重组因子VIII可用于体外产生较高产率的重组因子 VIII和用于基因治疗的转移载体中(参见，例如授予Negrier的美国专利第6，800，461号， 通过引用将其整体并入)。在此实施方式的具体实例中，重组因子VIII可以被具有插入两 个位点的截断的因子IX内含子1并且具有适于在造血细胞系、并且尤其是在血小板中驱动 表达的启动子的核苷酸序列编码(参见，例如授予Negrier的美国专利第6，780，614号，通 过引用将其整体并入本文)。无论实施方式如何，无B结构域的因子VIII优选含有一种或多种上文所述的突变 (例如，在位置287、302、519、665和/或1984)。根据本文的实施例所制备的重组因子VIII 蛋白为无B结构域的。可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第三个实例为含有一个或多 个动物氨基酸残基作为负责人因子VIII的抗原性的人氨基酸残基的取代的嵌合的人/动 物因子VIII。具体地，动物(例如，猪)残基取代可以包括但不限于下列的一种或多种 R484A、R488G、P485A、L486S、Y487L、Y487A、S488A、S488L、R489A、R489S、R490G、L491S、 P492L、P492A、K493A、G494S、V495A、K496M、H497L、L498S、K499M、D500A、F501A、P502L、 I503M、L504M、P505A、G506A、E507G、I508M、I508A、M2199I、F2200L、L2252F、V2223A、 K2227E和/或L2251 (授予Lollar的美国专利第5，859，204号、授予Lollar的美国专利 第6，770，744号和授予Lollar的美国专利申请公布第2003/0166536号，通过引用将它们 每一个整体并入本文)。优选地，重组嵌合因子VIII含有一种或多种上文所述的突变(例 如，在位置 287、302、519、665 和 / 或 1984)。可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第四个实例为以下的增强的 亲和力的因子 VIII 因子 IXa(参见，例如 Fay 等人，“Factor VIIIaA2 Subunit Residues 558-565R印resent a Factor IXa Interactive Site (因子 Villa A2 亚基残基 558-565 代表因子 IXa 的相互作用位点)，”J. Biol. Chem. 269(32) =20522-7(1994) ；Bajaj 等人， "Factor IXa :Factor Villa Interaction. Helix 330_338of Factor IXa Interacts with Residues 558_565and SpatiallyAdjacent Regions of the A2 Subunit of Factor Villa (因子IXa 因子Villa相互作用。因子IXa的螺旋330-338与因子VIIIa的A2亚 基的残基 558-565 和空间邻近区相互作用)，”J. Biol. Chem. 276(19) =16302-9(2001)； 禾口 Lenting 等人"The Sequence Glu 1811-Lys 1818 of Human Blood Coagulation FactorVIII Comprises a Binding Site for Activated Factor IX(人血凝血因子 VIII 的序列Glul811-Lysl818包含激活的因子IX的结合位点)，”J. Biol. Chem. 271(4) 1935-40(1996)，通过引用将它们每一个整体并入本文)和/或因子X(参见，例如Lapan 等人，"Localization of a Factor X Interactive Site in theAl Subunit of Factor Villa(因子Villa的Al亚基中的因子X相互作用位点的定位)，” J. Biol. Chem. 272 2082-88(1997)，通过引用将其整体并入本文)。优选地，亲和力增强的因子VIII含有一种 或多种上文所述的突变(例如，在位置287、302、519、665和/或1984)。可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第五个实例为被修饰以增强 因子VIII的分泌的因子VIII (参见，例如Swaroop等人，“Mutagenesis of a Potential Immunoglobulin-Binding Protein-Binding SiteEnhances Secretion of Coagulation Factor VIII (可能的免疫球蛋白-结合蛋白-结合位点的诱变增强凝血因子VIII的分 泌)，”J. Biol. Chem. 272(39) :24121_4 (1997)，通过引用将其整体并入本文)。优选地，分 泌增强的突变体因子VIII含有一种或多种上文所鉴定的突变(例如，在位置287、302、519、 665 和 / 或 1984)。可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第六个实例为具有增加 的循环半衰期的因子VIII。这种修饰可以使用多种方法制备，包括但不限于通过降 低与下列物质的相互作用硫酸乙酰肝素(Sarafanov等人，“ Ce 11 Surface Heparan Sulfate Proteoglycans Participate in Factor VlIICatabolism Mediated by Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein(细胞表面酸乙酰月干素蛋白聚糖参 与低密度脂蛋白受体相关蛋白介导的因子VIII的分解代谢)，”J. Biol. Chem. 276(15) 11970-9(2001)，通过引用将其整体并入本文)和/或低密度脂蛋白受体相关的蛋白 ("LRP，，)(Saenko 等 人，“Role of the Low Density Lipoprotein-Related Protein Receptor inMediation of Factor VIII Catabolism(低密度脂蛋白相关蛋白的受体在介 导因子 VIII 分解代谢中的作用)，”J. Biol. Chem. 274(53) :37685_92 (1999)；以及Lenting 等人，"The Light Chain of Factor VIII Comprises a Binding Site for Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein(因子VIII的轻链包含低密度脂蛋白受体相关 蛋白的结合位点)，” J. Biol. Chem. 274(34) :23734_9 (1999)，通过引用将他们每一个整体 并入本文)。优选地，半衰期增强的突变体因子VIII含有一种或多种上文所述的突变(例 如，在位置 287、302、519、665 和 / 或 1984)。可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第七个实例为由以下核苷 酸序列编码的修饰的因子VIII，该核苷酸序列经过修饰编码在已知的现有的表位中的氨 基酸以在天冬酰胺残基处产生糖基化的识别序列(参见，例如授予Lollar的美国专利第 6，759，216号，通过引用将其整体并入本文)。此实例的突变体因子VIII可用于提供逃离 存在的抑制抗体检测(低抗原性因子VIII)和降低发展抑制抗体的可能(低免疫原性因子 VIII)的修饰的因子VIII。在这个实例的一个具体的实施方式中，修饰的因子VIII被突变 为具有N-连接的糖基化的共有氨基酸序列。这种共有序列的实例为N-X-S/T，其中N为天 冬酰胺，X为任一氨基酸，并且S/T代表丝氨酸或苏氨酸(参见授予Lollar的美国专利第 6，759，216号，通过引用将其整体并入本文)。优选地，糖基化位点被修饰的因子VIII含有 一种或多种上文所鉴定的突变(例如，在位置287、302、519、665和/或1984)。可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第八个实例为修饰的因 子VIII，该修饰的因子VIII为具有多种突变的促凝血活性的因子VIII (参见，例如授予 Kaufman等人的美国专利申请公布第2004/0092442号，通过引用将其整体并入本文)。这 种实施方式的一个实例涉及被进行如下修饰的修饰的因子VIII :(i)缺失冯维勒布兰德因 子结合位点；(ii)在Arg 740处添加突变；和(iii)在A2和A3结构域之间添加氨基酸序列间隔区，其中所述氨基酸间隔区具有足以在激活后使促凝血活性因子VIII蛋白变为异 源二聚体的长度(参见授予Kaufman等人的美国专利申请公部第2004/0092442号，通过引 用将其整体并入本文)。优选地，促凝血活性的因子VIII还被修饰以含有一种或多种上文 所述的突变(例如，在位置287、302、519、665和/或1984)。此外，突变体因子VIII可以被修饰以具有通常关于重组凝血因子的多种优势(参 见，例如 Saenko 等人,"The Future of Recombinant CoagulationFactors (重组凝血因子 的前景)，” J. Thrombosis and Haemostasis 1 :922_930 (2003)，通过引用将其整体并入本 文)。本发明的重组因子VIII可以在使A1A2或A2A3结构域界面不稳定的任何带电荷 的残基(包括位置87、302、519、665或1984)处被修饰；以及被修饰为无B结构域、嵌合的、 具有增强因子VIIIa活性的修饰的钙结合位点(例如，在位置113处)、具有改变的灭活裂 解位点、具有增强的因子IXa和/或因子X亲和力、具有增强的分泌、具有增加的循环半衰 期、或具有突变体糖基化位点；或除对带电荷的残基的一个或多个修饰外再进行任何一种 或多种此类修饰，包括改善重组因子VIII的活性的修饰的钙结合位点。实施例中描述了许 多示例性的无B结构域、比活增强、高稳定性的重组因子VIII蛋白。重组因子VIII优选以基本上纯的形式制备。在具体的实施方式中，基本上纯的重 组因子VIII为至少约80%纯的，更优选至少90%纯的，最优选至少95%纯的。基本上纯的 重组因子VIII可以通过本领域内熟知的常规技术获得。通常，基本上纯的重组因子VIII 是被分泌到重组宿主细胞的生长培养基中的。可选择地，制备了基本上纯的重组因子VIII， 但是其并不分泌到生长培养基中。在这种情况下，为了分离基本上纯的重组因子VIII，繁殖 携带重组质粒的宿主细胞，通过超声、加热或化学处理将其裂解，并将勻浆物离心以去除细 胞碎片。然后对上清液进行硫酸铵分级沉淀。将含有基本上纯的重组因子VIII的级分在 合适尺寸的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中进行凝胶过滤以分离重组因子VIII。如果需要，蛋白 级分(含有基本上纯的重组因子VIII)可以进一步通过高效液相色谱(“HPLC”)来纯化。本发明的另一方面涉及编码本发明的重组因子VIII的分离的核酸分子。编码重 组因子VIII的分离的核酸分子可以为RNA或DNA。在一个实施方式中，分离的核酸分子可以具有编码增强因子VIII的比活的位置 113处的突变，同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如，在SEQ ID N0:2的位 置287、302、519、665、1984和/或332-340)修饰的核苷酸序列。在另一实施方式中，分离的核酸分子可以具有编码上文所述类型的无B结构域因 子VIII，同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如，在SEQ ID NO :2的位置287、 302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。在另一实施方式中，分离的核酸分子可以具有编码上文所述类型的嵌合的人/猪 因子VIII，同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如，在SEQ ID N0:2的位置 287、302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。在另一实施方式中，分离的核酸分子可以具有编码灭活位点被如上文所述修饰的 因子VIII，同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如，在SEQ ID N0:2的位置 287、302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。在又一实施方式中，分离的核酸分子可以具有编码对因子IXa和/或因子X的亲
19和力增强了的因子VIII，同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如，在SEQ ID NO 2的位置287、302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。在再一实施方式中，分离的核酸分子可以具有编码对多种血清结合蛋白的亲和力 被改变以增加其循环半衰期的因子VIII，同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种 (例如，在SEQ ID NO 2的位置287、302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。在另一实施方式中，分离的核酸分子可以具有编码在培养物中分泌增加的因子 VIII，同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如，在SEQ ID NO :2的位置287、 302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。在另一实施方式中，分离的核酸分子可以具有编码具有一个或多个非天然存在的 糖基化位点的因子VIII，同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如在SEQ ID NO 2的位置287、302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。在又一实施方式中，分离的核酸分子编码在任何一个或多个如上文所描述的带电 荷的残基处被修饰并且还被修饰以具有下列的任何两个或更多个的分离的核酸分子被修 饰为无B结构域、被修饰为嵌合的、被修饰为具有改变的灭活裂解位点、被修饰为具有增强 的因子IXa和/或因子X亲和力、被修饰为具有增强的分泌、被修饰为具有增加的循环半衰 期、被修饰为具有一个或多个非天然存在的糖基化位点、以及在钙结合位点内(例如，在位 置113)被修饰以便改善重组因子VIII的比活。本发明的另一方面涉及包含本发明的分离的DNA分子的重组DNA表达系统，该表 达系统编码重组因子VIII。在一个实施方式中，DNA分子相对于启动子在有义方向上。本发明的另一方面涉及包含编码本发明的重组因子VIII的分离的核酸分子的宿 主细胞。在具体的实施方式中，宿主细胞可以含有DNA分子形式的分离的核酸分子，所述 DNA分子形式为稳定的质粒或在宿主细胞基因组中的稳定的插入序列或整合序列。在另一 实施方式中，宿主细胞可以含有在表达系统中的DNA分子。合适的宿主细胞可以为但不限 于动物细胞(例如，幼仓鼠肾(“BHK”)细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌(E. coli))、昆 虫细胞(例如，Sf9细胞)、真菌细胞、酵母细胞(例如，酵母菌(Saccharomyces)或裂殖酵母 属(Schizosaccharomyces))、植物细胞(例如，拟南芥(Arabidopsis)细胞或烟草细胞)、 或藻类细胞。重组DNA表达系统和宿主细胞可以使用本领域内熟知的多种重组技术来制备，如 下文所进一步讨论的。可以使用常规的重组DNA技术将编码本发明的重组因子VIII的DNA分子整合到 细胞中。一般地，这包括将DNA分子插入到该DNA分子为异源(即，不是正常存在的)的表 达系统中。异源DNA分子以有义方向和正确的阅读框插入表达系统或载体中。载体含有 用于插入的编码蛋白的序列的转录和翻译的必需元件。因此，本发明的一个实施方式提供 含有本发明的分离的核酸的DNA构建体，所述分离的核酸与5’启动子和3’调节区(即，转 录终止子)两者可操作连接，所述5’启动子和3’调节区能够使本发明的编码的重组因子 VIII在宿主细胞或宿主生物体中转录和表达。关于本发明的重组表达系统，含有编码本发明的重组因子VIII的DNA分子的表达 载体可以使用本领域内的常见技术制备。可以使用本领域内所熟知的试剂将本发明的核酸 分子插入到许多可用的表达载体的任一种中。在制备用于表达的DNA载体中，可以将DNA序
20列正常地插入到或取代到细菌质粒中。可以采用任何方便的质粒，它们的特征为具有细菌 复制系统、容许在细菌中进行选择的标志物和方便定位的一个或多个独特的限制位点。载 体的选择取决于优选的转化技术和用于转化的靶宿主。可以采用多种宿主-载体系统来表达编码重组因子VIII的序列。主要地，载体 系统必须与所用的宿主细胞相容。宿主-载体系统包括但不限于下列用噬菌体DNA、质粒 DNA或粘粒DNA转化的细菌；微生物，如含酵母载体的酵母；用病毒(例如，痘苗病毒、腺病 毒、腺伴随病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞 系统；和用细菌(例如，土壤杆菌属(Agrobacterium))感染的植物细胞。这些载体的表达 元件在它们的强度和特异性方面不同。依据所采用的宿主-载体系统，可以使用大量合适 的转录和翻译元件的任一种。当以重组方式制备时，在重组的宿主细胞中表达因子VIII蛋白或多肽(或它们的 片段或变体)，所述重组的宿主细胞通常但不排他地为真核细胞。用于实施本发明的合适的载体包括但不限于下列病毒载体，如λ载体系统 gtll、gtffES. tB、Charon 4 ；和质粒载体，如 pCMV、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、 pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV 40、pBluescript II SK+/-或 pBluescript II KS+/-(参见"Stratagene Cloning Systems (Stratagene 克隆系统)，， 目录(I"3))、pQE、pIH82l、pGEX、pET 系列(Studier 等人，"Use of T7RNA Polymerase to DirectExpression of Cloned Genes (使用T7RNA聚合酶来指导克隆的基因的表 达)，”Methods in Enzymology 185 :60_89 (1990)，通过引用将其整体并入本文)；以及它 们的任何衍生物。现在已知的或今后描述的用于遗传转化的任何合适的载体适用于本发 明。可以经由转化，尤其是转导、接合、动员或电穿孔将重组分子引入细胞。使用本 领域内标准的克隆方法将DNA序列克隆到载体中，如Maniatis等人在下面文献中所描述
Molecular Cloning :A Laboratory Manual () Cold Springs
Harbor, N. Y. =Cold Springs Laboratory, (1982)，通过引用将其整体并入本文。通过引用整体并入本文的授予Cohen和Boyer的美国专利第4，237，224号描述了 使用限制酶裂解和用DNA连接酶连接制备重组质粒形式的表达载体。然后通过转化方法引 入这些重组质粒并在单细胞培养物中复制，所述单细胞培养物包括原核生物体和以组织培 养物生长的真核细胞。不同的遗传信号和加工事件控制着许多水平的基因表达(例如，DNA转录和信使 RNA (mRNA)翻译)。DNA转录依赖于启动子的存在，所述启动子为指导RNA聚合酶结合并从而促进 mRNA合成的DNA序列。真核启动子的DNA序列与原核启动子的DNA序列不同。此外，真核 启动子和伴随的遗传信号在原核系统中可能不被识别或可能不起作用；并且，另外，原核启 动子在真核细胞中不被识别并且不起作用。类似地，原核细胞中的mRNA翻译依赖于适当的原核信号的存在，该原核信 号与真核细胞的信号不同。mRNA在原核细胞中的有效翻译需要在mRNA上的称为 Shine-Dalgarno ( “SD”)序列的核糖体结合位点。这个序列为位于起始密码子前的短的 mRNA核苷酸序列，所述起始密码子通常为AUG，它编码蛋白氨基末端的蛋氨酸。SD序列与16S rRNA(核糖体RNA)的3’末端互补并且可能通过与rRNA形成双链体来促进mRNA与 核糖体的结合从而容许核糖体正确定位。对于使基因表达最大化的综述，参见Roberts和 Lauer, Methods in Enzymology 68 :473 (1979)，通过引用将其整体并入本文。启动子在它们的“强度”(即，它们促进转录的能力)方面不同。为了表达克隆 的基因的目的，通常希望使用强启动子以获得高水平的转录和因此的高水平基因表达。依 据所采用的宿主细胞系统，可以使用大量合适的启动子的任一种。例如，当在大肠杆菌 (Escherichia coli)中克隆时，它的噬菌体或质粒启动子，如T7噬菌体启动子、Iac启动 子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌噬菌体λ的Pk启动子和P^启 动子以及包括但不限于lacUV5、ompF、bla、Ipp等的其他启动子可用于指导邻近的DNA区 段的高水平转录。此外，杂合的trp-lacUV5 (tac)启动子或由重组DNA或其他合成DNA技 术所制备的其他大肠杆菌启动子可用于提供插入的基因的转录。可以选择在不特异性诱导的时候抑制启动子作用的细菌宿主细胞株系和表达载 体。在某些操作中，特异性诱导物的添加是插入的DNA有效转录所必需的。例如，Iac操纵 子通过添加乳糖或IPTG(异丙基硫代-β -D-半乳糖苷)诱导。诸如trp、pro等的许多其 他操纵子处于不同的控制下。特异性起始信号也是原核细胞中有效的基因转录和翻译所需的。如分别由合成的 基因特异性信使RNA和蛋白的量所测量的，这些转录和翻译起始信号强度可以不同。含有 启动子的DNA表达载体还可以含有多种“强”转录和/或翻译起始信号的任何组合。例如， 大肠杆菌中的有效翻译需要距起始密码子(“ATG”)的5’端约7-9个碱基的SD序列以提 供核糖体结合位点。因此，可以采用宿主细胞核糖体可以利用的任何SD-ATG组合。这种组 合包括但不限于来自大肠杆菌噬菌体λ的cro基因或N基因或来自大肠杆菌色氨酸Ε、 D、C、B或A基因的SD-ATG组合。此外，可以使用通过重组DNA或包括整合合成的核苷酸的 其他技术制备的任何SD-ATG组合。在一个实施方式中，本发明的核酸分子以有义方向整合到合适的载体中以便使开 放阅读框正确地确定方向以便编码的蛋白在所选择的启动子的控制下表达。这包括将合适 的调节元件引入DNA-载体构建体。这些包括载体的非翻译区、有用的启动子和5’和3’的 非翻译区，它们与宿主细胞蛋白相互作用以实现转录和翻译。这些元件在它们的强度和特 异性方面可以不同。依据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数目的合适的转录和翻 译元件，包括组成型的和诱导型的启动子。组成型的启动子为在生物体的整个发育和生命中指导基因表达的启动子。诱导型启动子为能够响应于诱导物直接或间接激活一种或多种DNA序列或基因 的转录的启动子。在不存在诱导物的条件下，DNA序列或基因将不被转录。本发明的DNA构建体还可以包括可操作地连接至编码所选择的蛋白的DNA分子的 3’调节区，该3’调节区选自能够提供在所选的宿主细胞中表达的正确的转录终止和mRNA 多聚腺苷酸化的那些。可以使用如下列文献中所描述的熟知的分子克隆技术将所选择的载体、启动子 和合适的3’调节区连接在一起以制备本发明的DNA构建体=Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor Press, NY (1989)；禾口 Ausubel，F. Μ.等人 Current Protocols in Molecular Biology (现代分子生物学实验技术)，New York，N. Y John Wiley&Sons (1989)，通过引用将它们每一个 整体并入本文。如所注意到的，使用原核宿主细胞的一个替代方案为使用真核宿主细胞，如哺乳 动物细胞，真核宿主细胞也可用于重组制备本发明的重组因子VIII。适于实施本发明的哺 乳动物细胞包括，但不限于:C0S(例如，ATCCNo. CRL 1650或1651)、BHK(例如，ATCC No. CRL 6281)、CHO(例如，ATCC No. CCL 61)、HeLa(例如，ATCC No. CCL 2)、293(ATCC No. 1573)、 CHOP、和 NS-I 细胞。用于在哺乳动物细胞中指导表达的合适的表达载体通常包括启动子以及本领域 内已知的其他转录和翻译控制序列。常见的启动子包括SV40、MMTV、金属硫蛋白-1、腺病毒 Ela、CMV、极早期(immediate early)、免疫球蛋白重链启动子和增强子和RSV-LTR。一旦制备了本发明的DNA构建体，其便可容易地被整合到宿主细胞中。因此，本发 明的另一方面涉及制备重组细胞的方法。基本地，此方法通过在有效地在宿主细胞中产生 DNA分子转录的条件下用本发明的DNA构建体转化宿主细胞来进行。可以经由转化，尤其是 转导、接合、动员或电穿孔将重组分子引入细胞。根据本文所讨论的重组技术，本发明的另一方面涉及制备本发明的重组因子VIII 的方法。此方法包括将本发明的宿主细胞在使宿主细胞表达重组因子VIII的条件下培养。 然后分离重组因子VIII。在一个实施方式中，宿主细胞在生长培养基中体外生长。在具体 的实施方式中，合适的生长培养基可以包括但不限于含有冯维勒布兰德因子(在本文中称 为“VWF”)的生长培养基。在这个实施方式中，宿主细胞可以含有编码VWF的转基因或VWF 可以作为补充物被引入生长培养基。生长培养基中的VWF将容许重组因子VIII的较高表 达水平。一旦重组因子VIII被分泌到生长培养基中，随后便可以使用相关的重组DNA和蛋 白领域内的那些普通技术人员所熟知的技术(包括本文所描述的那些技术)将其从生长培 养基中分离。在另一实施方式中，制备本发明的重组因子VIII的方法还包括在分离重组因 子VIII之前破坏宿主细胞。在这个实施方式中，重组因子VIII是从细胞碎片中分离的。位置287、302、519、665和/或1984处的修饰是尤其优选的，因为他们导致因子 VIII和因子VIIIa两者的稳定性增强。这种增加的稳定性对于因子VIII的循环半衰期和 血液凝集期间因子VIIIa的活性是很重要的。此外，这种特性在用于治疗用途的蛋白的纯 化和制备期间增强可用因子VIII的回收方面很重要。当表达载体用于体内转化以诱导靶细胞中的因子VIII表达的目的时，可以依据 所需的增强程度采用不同强度的启动子。本领域的技术人员可以根据哺乳动物启动子作为 启动子的强度而容易地选择合适的哺乳动物启动子。可选择地，可以为了在需要表达或抑 制因子VIII时进行控制的目的而采用诱导型启动子。本领域的技术人员可以从本领域内 已知的那些诱导型哺乳动物启动子中选择合适的启动子。最后，可以选择组织特异性哺乳 动物启动子以将任何基因转化系统的效力限制在特定的组织中。组织特异性启动子是本领 域内已知的并且可以根据要治疗的组织或细胞类型选择。本发明的另一方面涉及治疗动物的诸如血友病尤其是血友病A的血液疾患的方 法。这种方法包括给表现血友病A的动物施用有效量的本发明的重组因子VIII，从而使动 物在血管损伤后表现出有效的血液凝集。合适的有效量的重组因子VIII可以包括但不限 于约10至约50单位/千克动物体重之间。所述动物可以为任何动物，但是优选为人、大鼠、小鼠、豚鼠、狗、猫、猴、黑猩猩、猩猩、牛、马、绵羊、猪、山羊或兔。本发明的重组因子VIII可用于在具有和不具有抑制抗体的血友病患者中和由于 抑制抗体的显现所引起的获得性因子VIII缺乏的患者中治疗由因子VIII缺乏所致的不受 控的出血(例如，关节内、颅内或胃肠出血)。在具体的实施方式中，根据与用于人或动物 因子VIII相同的方法将单独的重组因子VIII或药物组合物形式(即，与稳定剂、递送溶媒 (delivery vehicles)和/或载体组合)的重组因子VIII静脉内输注给患者。可选择地，或除此之外，可以如下来施用重组因子VIII 通过施用如腺伴随病毒 的病毒载体(Gnatenko 等人，"Human Factor VIII Can BePackaged and Functionally Expressed in an Adeno-associated VirusBackground !Applicability to Hemophilia A Gene Therapy (人因子VIII可以在腺伴随病毒背景中被包装并功能性表达血友病A基 因治疗的适用性).”Br. J. Haematol. 104 :27_36 (1999)，通过引用将其整体并入本文)； 或通过移植遗传工程化以制备重组因子VIII的细胞，通常经由含这种细胞的装置进行移 植。这种移植通常包括使用重组皮肤成纤维细胞，一种非病毒方法(Roth等人，“Nonviral Transfer of the Gene Encoding Coagulation FactorVIII in Patients with Sever Hemophilia(在患重度血友病的患者中编码凝血因子VIII的基因的非病毒转移)."New Engl. J. Med. 344 1735-1742 (2001)，通过引用将其整体并入本文)。应施用给需要这种治疗的患者的重组因子VIII的治疗剂量依据因子VIII缺乏的 严重程度而不同。一般地，在频率、持续时间和单位方面调节剂量水平以与各患者的出血发 作的严重程度和持续时间一致。因此，如标准的凝集测定所测量的，重组因子VIII以足以 递送给患者治疗有效量的蛋白以停止出血的量包含在药物上可接受的载体、递送溶媒或稳 定剂内。因子VIII经典地被定义为存在于正常血浆中纠正由患血友病A的个体所获得的 血浆中的凝集缺陷的物质。纯化的和部分纯化的形式的因子VIII的体外促凝血活性被 用于计算输注到人患者中的重组因子VIII的剂量并且是从患者血浆中恢复活性和体内 出血缺陷纠正的可靠指示物。根据Lusher等人，“Recombinant Factor VIII for the Treatment of Previously UntreatedPatients with Hemophilia A-Safety, Efficacy, and Development of Inhibitors (用于治疗之前未被治疗的患血友病A的患者的重组 因子VIII-抑制剂的安全性、效力和开发)”New Engl. J. Med. 328:453-459(1993); Pittman 等人，"A2Domain of Human Recombinant-derived Factor VIII is Required forProcoagulant Activity but not for Thrombin Cleavage (人重组衍生的因子 VIII 的A2结构域是促凝血活性所需的但不是凝血酶裂解所需的).”Blood79 =389-397(1992)； 禾口 Brinkhous 等人，"Purified Human Factor VIIIProcoagulant Protein-Comparative Hemostatic Response After Infusions intoHemophilic and von Willebrand Disease Dogs (纯化的人因子VIII促凝血蛋白输注到患血友病的狗和患冯维勒布兰德疾病的狗中 之后的比较性止血反应)，” Proc. Natl. Acad. Sci. 82 =8752-8755 (1985)，通过引用将它们 整体并入本文，在新的因子VIII分子的体外标准测定和他们在狗输注模型或人患者中的 行为之间没有报道差异。通常，通过施用重组因子VIII在患者中实现的期望的血浆因子VIII活性水平在 正常的30-100%的范围内。在一个实施方式中，治疗性重组因子VIII的施用以静脉内给予，优选的剂量在约5至50单位/kg体重的范围内，具体在10-50单位/kg体重的范围内， 更具体为20-40单位/kg体重的剂量；频率间隔为约8至24小时(重度感染的血友病患 者)的范围内；治疗持续时间天数在1至10天的范围内或直至出血发作消退。参见，例如， Roberts 禾口 Jones,"Hemophilia and Related Conditions—CongenitalDeficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to XII)(血友病禾口相关病症疑血 酶原(因子II、因子V和因子VII至XII)先天性的缺乏)，”Ch. 153，1453-1474，1460，in Hematology (血液学)，Williams，W. J.等人，编辑(1990)，通过引用将其整体并入本文。 具有抑制剂的患者可能需要与它们先前的因子VIII形式不同的重组因子量。例如，患者可 能需要较少的重组因子VIII，因为该重组因子VIII比野生型VIII具有更高的比活和降低 的抗体反应性。对于使用人或血浆来源的因子VIII的治疗，输注的治疗性重组因子VIII 的量通过一期因子VIII凝血测定来界定，并且在选择的情况下，通过测量在输注后患者血 浆中的因子VIII来测定体内恢复。应了解对于任何具体的受试者，应根据个体的需要和施 用或监督组合物施用的人员的专业判断随时间调整特定的剂量方案，并且本文所列出的浓 度仅为示例性的，不旨在限制所要求保护的重组因子VIII的范围或实施。根据需要，治疗形式可以为重组因子VIII的单次静脉内施用或在长期的时间阶 段内的定期施用或连续施用。可选择地，治疗性重组因子VIII可以与脂质体一起以不同时 间间隔内的一个或几个剂量皮下或口服施用。重组因子VIII还可以用于治疗在显示出人因子VIII抗体的血友病患者中由于因 子VIII缺乏所致的不受控的出血。本文证明了本发明的重组因子VIII的比活可以与野生型因子VIII不同。具有比 野生型因子VIII高的促凝血活性的因子VIII可用于治疗血友病，因为将需要较低的剂量 来纠正患者的因子VIII缺乏。这不仅降低了患者和保险公司的医疗费用，还降低了发展针 对因子VIII的免疫反应的可能(因为施用了较少的抗原)。
实施例提供了下列实施例来说明本发明的实施方式，但是它们不意欲限制本发明的范围。材料与方法试剂M^lSi VIII(Kogenate ) ^Bayer Corporation (Berkeley, CA) ^ LisaRegan 博士慷慨赠送的。含有20%磷脂酰胆碱(PC)、40%磷脂酰乙醇胺(PE)和40%磷脂酰丝氨 酸(PS)的磷脂囊泡如先前所述使用辛基葡糖苷制备(Mimms等人，“Phospholipid Vesicle Formation and TransmembraneProtein Incorporation Using Octyl Glucoside (使用辛 基葡糖苷的磷脂囊泡形成和跨膜蛋白整合)，"Biochemistry20 :833_840 (1981)，通过引用 将其整体并入本文)。试剂α-凝血酶、因子Vila、因子IXa β、因子X和因子Xa (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN)、虫至素禾口憐月旨(DiaPharma, West Chester, OH)、发 色的 Xa 底物 Pefachrome Xa (Pefa-5523，CH30C0-D-CHA-Gly-Arg-pNA · AcOH ；Centerchem Inc. Norwalk CT)、重组人组织因子(rTF)、Innovin(Dade Behring, Newark, DE)、荧光底物 Z-Gly-Gly-Arg-AMC(Calbiochem, San Diego, CA)和凝血酶校准物(Diagnostica Stago,Parsippany, NJ)购自所指示的卖主。野生型和变体因子VIII的构建、表达和纯化将Ala 突变体(在 D27、H281、R282、E287、D302、S313、H317、T522、S524、R531、 N538、E540、S650、S654、D666、E683、N684、S695、D696、S1791、D1795、Q1820、E1829、S1949、 N1950 和 R1966 处)；Phe 突变体(在 Y476、Y664、Y1786 和 Y1792 处)；Ala 和 Val 突变体 (在带电荷的残基E272、D519、E665和E1984处)；和野生型因子VIII形式分别构建为在B 结构域中缺乏残基Gln744-Serl637的无B结构域的因子VIII (Doering等人，“Expression and Characterization of Recombinant MurineFactor VIII (重组鼠因子 VIII 的表达禾口 表征)，”Thromb Haemost. 88 :450_458 (2002)，通过引用将其整体并入本文)。克隆和表达 构建体是Pete Lollar博士和John Healey博士慷慨赠送的。如先前所描述的在BHK细胞 中稳定地表达重组野生型和变体因子VIII形式并将其纯化(Wakabayashi等人，“Residues 110-126in the A IDomain of Factor VIII Contain a Ca2+BindingSite Required for Cofactor Activity (因子VIII的Al结构域中的残基110-126含有辅因子活性所需的Ca2+ 结合位点)，”J Biol Chem. 279 12677-12684 (2004)，通过引用将其整体并入本文)。转染 后，变体之间因子VIII分泌的量没有显著差异。如通过SDS-PAGE判断的，来自两个750cm2 培养瓶的变体蛋白产量范围在大于IOyg至约100 μ g，纯度为约85%至大于95%。因子 VIII制剂中的主要污染物为白蛋白并且其在因子VIII中存在的浓度显示对活性参数的稳 定性没有影响。因子VIII的浓度使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量，并且因子VIII的 活性通过一期凝集测定和二期发色的因子Xa生成测定来确定，如下文所述。SDS-PAGE和蛋白质印迹将因子VIII蛋白(0.77 μ g用于凝胶染色并且0.34 μ g用于蛋白质印迹)在8% 聚丙烯酰胺凝胶上以恒定电压(100V)电泳。将凝胶用Gelcode Blue (Thermo Scientific, Rockford, IL)染色；或将凝胶转移到聚偏氟乙烯膜上并用生物素化的抗A2抗体(R8B 12， Green Mountain Antibodies, Burlington, VT)探测，然后用过氧化物酶轭合的链霉亲 和素(Calbiochem，San Diego, CA)孵育。使化学发光底物(ECF 底物，GE Healthcare, Piscataway, NJ)反应，并且使用磷光影象分析仪(Storm 860，GE Healthcare)扫描荧光 信号。单链因子VIII形式(170kDa)和重链(HC，90kDa)的密度使用ImageQuant软件(GE Healthcare)定量并且计算了量的比率。ELISA如先前所描述的进行夹心ELISA以测量因子VIII蛋白的浓度(Wakabayashi 等人，"A Glu 113Ala Mutation within a Factor VIIICa2+-Binding Site Enhances Cofactor Interactions in Factor Xase (因子 VIIICa2+结合位点内的 Glull3Ala 突变增 强因子Xase中的辅因子相互作用)，"Biochemistry 44 10298-10304(2005)，通过引用将 其整体并入本文)，使用纯化的商业重组因子VIII (Kogenate，Bayer Corporation)作为标 准物。因子 VIII 的捕获使用抗 C2 抗体(ESH-8，American Diagnostica Inc.，Stamford, CT)，并采用生物素化的R8B12抗体来进行因子VIII检测。一期凝集测定(One-stage Clotting Assay)使用化学消除了因子VIII的基质血浆进行一期凝集测定(参见，“Methodology of the One-stage Assay of Factor VIII (VIII :C)(因子 VIII (VIII :C) 一期测定的方法)，”Scand J Haematol Suppl. 41 13-24 (1984)，通过引用将其整体并入本文)并使用 Diagnostica Stago 凝集仪器进行测定。在 37°C下用 APTT 试剂(General Diagnostics) 孵育血浆6分钟，然后添加稀释的因子VIII至杯皿中。1分钟后对混合物进行复钙，测定凝 集时间并将其与混合的正常血浆标准物比较。二期发色因子Xa生成测定根据先前所描述的方法(Wakabayashi等人，“Metal Ion-independentAssociation of Factor VIII Subunits and the Roles of Calcium and Copper Ionsfor Cofactor Activity and Inter-subunit Affinity(金属离子非 依赖性的因子VIII亚基缔合以及钙离子和铜离子对辅因子活性和亚基间亲和力的作 用),"Biochemistry 40:10293-10300(2001) ；Wakabayashi 等人，"Ca2+Bindingto Both the Heavy and Light Chains of Factor VIII Is Required for CofactorActivity (Ca2+ 与因子VIII的重链和轻链二者的结合是辅因子活性所需的)，”Bi0ChemiStry 41 8485-8492 (2002)，通过引用将它们每一个整体并入本文)，在纯化的系统(Lollar等人， "Factor VIII and Factor VIIIa(因子 VIII 和因子 Villa)，”Methods Enzymol. 222 128-143 (1993)，通过引用将其整体并入本文)中监测因子X向因子Xa转化的速率。用20nM α-凝血酶激活在含有20mM N_[2_羟乙基]哌嗪_N，-[2_乙烷磺酸](HEPES)，pH 7.2,0. IM NaCl、0. 01% 吐温 20、0. 01% BSA、5mM CaCl2 和 10 μ M PSPCPE 囊泡的缓冲液(缓冲液 Α)中 的因子VIII (InM)I分钟。通过添加蛭素(10U/ml)来终止反应并使所得的因子VIIIa与因 子IXa(40nM)反应1分钟。添加因子X(300nM)以开始反应，1分钟后通过添加50mM EDTA 来淬灭反应。与发色底物Pefachrome Xa(0. 46mM的终浓度)反应后测定生成的因子Xa。 所有反应都在23°C下进行。凝血酶生成测定血浆中生成的凝血酶的量通过自动校准的凝血酶生成图象法测量(Hemker等人， “Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement inClotting Plasma(凝集 的血浆中自动校准的凝血酶生成测量),” PathophysiolHaemost Thromb. 33 4-15(2003)； Hemker 等人，"Thrombin Generation inPlasma :Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential (血浆中的凝血酶生成经由内源凝血酶潜能的凝血酶生成评 估)，” Thromb Haemost. 74 134-138 (1995)，通过引用将他们每一个整体并入本文)。在 96孔板中，将来自缺乏因子VIII抑制剂的重度血友病A患者的80 μ 1缺乏因子VIII (小 于 的残余活性，血小板贫乏)的血浆(George King Bio-Medical, OverlandPark, KS) 与在含有下列物质的 HEPES-BSA 缓冲液(20mM HEPES, pH7. 35、0. 15M NaCl,6% BSA)中的 因子VIII样品(20 μ 1 ；6ηΜ)混合3pMrTF(rTF储液的浓度通过因子Xa生成测定使用已 知浓度的因子VIIa测定)、PSPCPE囊泡(24 μ M)，或与20 μ 1凝血酶校准物(630ηΜ)混 合，并且立即通过与在含有0. IM CaCl2的HEPES-BSA缓冲液中的20 μ 1荧光底物(2. 5mM, Z-Gly-Gly-Arg-AMC)混合来开始反应。在37°C下将所有试剂预热。试剂的终浓度为 InM因子VIII (除非另外指明)、0· 5pM rTF、4 μ MPSPCPE囊泡、433 μ M荧光底物、13. 3mM CalCl2和105nM凝血酶校准物。使用微板荧光分光光度计(Spetramax Gemini,Molecular Devices, Sunnyvale, CA)用355nm(激发)/460nm(发射)的滤光设置以8秒钟的间隔监 测37°C下的荧光信号的显现。荧光信号通过来自荧光酶校准物样品的参考信号来校正
27(Hemker 等人，"Calibrated Automated ThrombinGeneration Measurement in Clotting Plasma (凝集的血浆中自动校准的凝血酶生成测量)，"Pathophysiol Haemost Thromb. 33 4-15 (2003)，通过引用将他们每一个整体并入本文)并且如先前所述计算以nM表示的实 际凝血酶生成(Hemker 等人，"Thrombin Generation in Plasma :Its Assessment via theEndogenous Thrombin Potential (血浆中的凝血酶生成经由内源凝血酶潜能的凝血 酶生成评估)，” Thromb Haemost. 74 134-138 (1995)，通过引用将其整体并入本文。在较高的温度下的因子VIII活性在52_60°C下孵育在缓冲液A中的野生型因子VIII或因子VIII变体(4nM)。在所 指示的时间取出等分试样并使用二期发色因子Xa生成测定来测定残余的因子VIII活性。因子VIIIa活性的时程在23°C下用20nM凝血酶激活在含有10 μ M PSPCPE囊泡的缓冲液A中的野生型和 突变体因子VIII(4nM)l分钟。立即用蛭素(10U/ml)淬灭反应，在所指示的时间取出等分 试样并在添加因子IXa(40nM)和因子X(300nM)后使用因子Xa生成测定来测定活性。对于 在存在因子IXa的条件下进行的衰退测量，在添加凝血酶之前将因子IXa(40nM)添加至反 应物中。血浆中的因子VIII稳定性将野生型或变体因子VIII (InM)添加到来自缺乏因子VIII抑制剂的重度血友病 A患者的缺乏因子VIII (小于的残余活性)的血浆(GeorgeKing Bio-Medical)中。对 血浆补充0. 02% NaN3以防止微生物的生长，并在37°C下孵育样品。在所指示的时间取出 等分试样并使用一期凝集测定来测定残余的活性。数据分析通过非线性最小二乘回归使用如下的等式将因子VIIIa的活性值作为时间的函 数与单指数衰退曲线拟合A = A0Xe^klt其中A为残余的因子VIIIa活性(nM/分钟/nM因子VIII)，A0为初始活性，k为 表观速率常数，并且t为在较高的温度下因子VIII的反应时间(分钟)(对于因子VIII 衰退实验)或在淬灭凝血酶激活后的反应时间(分钟)(对于因子VIIIa衰退测量)。通 过Kaleidagraph (Synergy，Reading, PA)进行非线性最小二乘回归分析。通过Student t 检验进行平均值的比较。使用Swiss PDB Viewer分析了因子VIII A结构域的模制结构 (Pemberton等人,“A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIIIBased on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin(基于人血菜铜蓝蛋白 的晶体结构的人因子VIII的三个A结构域的分子模型)，”Blood89 =2413-2421 (1997)， 通过引用将其整体并入本文)以鉴定定位在A2结构域界面的带电荷的残基和根据分离 互补结构域的极性原子的大于2.8人的阈值显示出极小的氢键相互作用可能的带电荷 的残基(Weiner 等人，"ANew Force Field for Molecular Mechanical Simulation of Nucleic AcidsProteins(核酸蛋白的分子机械模拟的新力场)，”J Am Chem Soc. 106 765-784(1984)，通过引用将其整体并入本文)。实施例1 靶向氢键相互作用的因子VIII突变体的活性值目前仍然不够了解的涉及因子VIII中的A2结构域的键合相互作用代表了调节辅因子活性的主要机制。因子VIII同源性模型(Pemberton等人，“A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIIIBased on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin (基于人血浆铜蓝蛋白的晶体结构的人因子VIII的三个A结构 域的分子模型)，"Blood89 :2413-2421 (1997)，通过引用将其整体并入本文)鉴定了许多氢 键连接A2结构域中的残基与Al或A3结构域中的那些残基的可能。使用氢供体和受体原 子之间的空间间隔小于2.8人这一标准(Weiner等人，“A NewForce Field for Molecular Mechanical Simulation of Nucleic Acids Proteins (核酸蛋白的分子机械模拟的新力 场)，”J Am Chem Soc. 106 :765_784 (1984)，通过引用将其整体并入本文)，鉴定出30个残 基具有可能参与与来自互补的A结构域的原子氢键键合的侧链原子(参见下表1)。在所鉴 定的残基的约一半中，侧链原子与骨架的羰基氧或酰胺氢原子并置，而剩余的则表现相邻 侧链之间可能有相互作用。除了用Phe取代Tyr之外，将因子VIII A结构域中的靶残基分 别突变为Ala，点突变以无B结构域的因子VIII稳定地表达。使用一期凝集测定和(二期)因子Xa生成测定测量纯化的蛋白的因子VIII活性。 来自一期测定(图1)的结果表明30个点突变体中9个显示出相对于野生型因子VIII小 于50%的活性。这些变体中的5个表现出一期/ 二期测定差异(大于1.5倍的差异)，其 中3个突变体(S524A、H281A和E287A)仅在二期测定中显示出降低。在几个被靶向的残基 中突变的活性值降低与那些侧链对因子VIII和/或因子VIIIa的结构稳定性的作用一致。表1 能够氢键键合的氨基酸残基
29
权利要求
一种重组因子VIII，包含导致因子VIII和因子VIIIa二者的稳定性增强的一种或多种突变，其中所述一种或多种突变包括在A1A2或A2A3结构域界面的任一界面或者两个界面用疏水性氨基酸残基取代一个或多个带电荷的氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的重组因子VIII，其中所述带电荷的氨基酸残基为Glu或Asp， 并且所述疏水性氨基酸残基取代为Ala、Val、lie、Leu、Met、Phe或Trp之一。
3.根据权利要求1所述的重组因子VIII，其中所述一种或多种突变包括野生型因子 VIII的Glu287残基的取代、野生型因子VIII的Asp302残基的取代、野生型因子VIII的 Asp519残基的取代、野生型因子VIII的Glu665残基的取代、野生型因子VIII的Glul984 残基的取代或它们的组合。
4.根据权利要求3所述的重组因子VIII，其中所述Asp302残基的取代为D302A。
5.根据权利要求3所述的重组因子VIII，其中所述Glu287残基的取代为E287A。
6.根据权利要求3所述的重组因子VIII，其中所述Glu665残基的取代为E665A或 E665V。
7.根据权利要求3所述的重组因子VIII，其中所述Asp519残基的取代为D519A或 D519V。
8.根据权利要求3所述的重组因子VIII，其中所述Glul984残基的取代为E1984A或 E1984V。
9.根据权利要求3所述的重组因子VIII，其中所述一种或多种突变包括选自下列的两 种或更多种取代Glu665残基、Asp519残基和Glul984残基。
10.根据权利要求9所述的重组因子VIII，其中所述两种或更多种取代包括 D519VE665V、D519AE665V、D519VE1984A, E665VE1984A, E665AE1984V, D519AE665VE1984A, D519VE665VE1984A 或 D519VE665VE1984V。
11.根据权利要求1所述的重组因子VIII，其中所述重组因子VIII由结构域Al、A2、 A3、Cl和C2、或它们的部分组成。
12.根据权利要求11所述的重组因子VIII，其中结构域Al和A2存在于重链上并且结 构域A3、Cl和C2存在于轻链上。
13.根据权利要求1所述的重组因子VIII，其中所述重组因子VIII包含来自人因子 VIII的一个或多个结构域或其部分，和来自非人哺乳动物的因子VIII的一个或多个结构 域或其部分。
14.根据权利要求1所述的重组因子VIII，其中所述重组因子VIII为基本上纯的。
15.根据权利要求1所述的重组因子VIII，其中所述重组因子VIII还包含下列的一种 或多种(i)经修饰以增强重组因子VIII对因子IXa和因子X中的一种或两种的亲和力的 因子IXa和/或因子X结合结构域；(ii)增强在培养物中的分泌的修饰的位点；(iii)增强 其循环半衰期的修饰的血清蛋白结合位点；(iv)有效降低其抗原性和/或免疫原性的至少 一个糖基化识别序列；和(ν)改善重组因子VIIIa的比活的修饰的钙结合位点。
16.根据权利要求1所述的重组因子VIII，还包含野生型因子VIII的Glull3残基的 取代，所述Glull3残基的取代增强激活的因子VIIIa的活性。
17.根据权利要求16所述的重组因子VIII，其中所述一种或多种突变包括野生型因子 VIII的Glu287残基的取代、野生型因子VIII的Asp302残基的取代、野生型因子VIII的Asp519残基的取代、野生型因子VIII的Glu665残基的取代、野生型因子VIII的Glul984 残基的取代或它们的组合。
18.根据权利要求17所述的重组因子VIII，其中所述取代包括E113AD519A、 E113AD519V,E113AE665A,Ell3AE665V 或 E113AE1984V。
19.一种药物组合物，包含根据权利要求1所述的重组因子VIII。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，还包含稳定剂。
21.根据权利要求19所述的药物组合物，还包含递送溶媒。
22.根据权利要求19所述的药物组合物，还包含药物上可接受的载体。
23.一种分离的核酸分子，编码根据权利要求1所述的重组因子VIII。
24.根据权利要求23所述的分离的核酸分子，其中所述一种或多种突变包括野生型因 子VIII的Glu287残基的取代、野生型因子VIII的Asp302残基的取代、野生型因子VIII的 Asp519残基的取代、野生型因子VIII的Glu665残基的取代、野生型因子VIII的Glul984 残基的取代或它们的组合。
25.根据权利要求24所述的分离的核酸分子，其中所述Asp302残基的取代为D302A。
26.根据权利要求24所述的分离的核酸分子，其中所述Glu287残基的取代为E287A。
27.根据权利要求24所述的分离的核酸分子，其中所述Glu665残基的取代为E665A或 E665V。
28.根据权利要求24所述的分离的核酸分子，其中所述Asp519残基的取代为D519A或 D519V。
29.根据权利要求24所述的分离的核酸分子，其中所述Glul984残基的取代为E1984A 或E1984V。
30.根据权利要求24所述的分离的核酸分子，其中所述一种或多种突变包含选自下列 的两种或更多种取代Glu665残基、Asp519残基和Glul984残基。
31.根据权利要求30所述的分离的核酸分子，其中所述两种或更多种取代包括 D519VE665V、D519AE665V、D519VE1984A, E665VE1984A, E665AE1984V, D519AE665VE1984A, D519VE665VE1984A 或 D519VE665VE1984V。
32.根据权利要求23所述的分离的核酸分子，其中所述重组因子VIII还包含下列的 一种或多种(i)经修饰以增强重组因子VIII对因子IXa和因子X中的一种或两种的亲和 力的因子IXa和/或因子X结合结构域；(ii)增强在培养物中的分泌的修饰的位点；(iii) 增强其循环半衰期的修饰的血清蛋白结合位点；(iv)有效降低其抗原性和/或免疫原性的 至少一个糖基化识别序列；和(ν)改善重组因子VIIIa的活性的修饰的钙结合位点。
33.根据权利要求23所述的分离的核酸分子，其中所述核酸为RNA。
34.根据权利要求23所述的分离的核酸分子，其中所述核酸为DNA。
35.一种重组DNA表达系统，包含根据权利要求34所述的DNA分子。
36.根据权利要求35所述的重组DNA表达系统，其中所述DNA分子相对于启动子在有 义方向上。
37.一种宿主细胞，包含根据权利要求23所述的核酸分子。
38.一种宿主细胞，包含根据权利要求34所述的DNA分子。
39.根据权利要求38所述的宿主细胞，其中所述DNA分子在表达系统中。
40.根据权利要求38所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为动物细胞、细菌细胞、昆虫 细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞或藻类细胞。
41.一种制备重组因子VIII的方法，包括将根据权利要求38的宿主细胞在使该宿主细胞表达所述重组因子VIII的条件下培 养；和分离所述重组因子VIII。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述培养在生长培养基中体外进行。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述生长培养基包含冯维勒布兰德因子。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述宿主细胞包含编码冯维勒布兰德因子的转基因。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述重组因子VIII被分泌到生长培养基中，所 述分离包括将重组因子VIII从生长培养基中分离。
46.根据权利要求41所述的方法，还包括在所述分离之前破坏所述宿主细胞，其中所述分离包括从细胞碎片中分离所述重组因 子 VIII。
47.一种治疗动物血友病A的方法，所述方法包括给表现血友病A的动物施用有效量的根据权利要求1所述的重组因子VIII，从而使动 物在血管损伤后表现出有效的血液凝集。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述有效量包括约10至约50单位/kg动物体 重之间。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述动物为哺乳动物。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述动物选自由下列组成的组人、大鼠、小鼠、 豚鼠、狗、猫、猴、黑猩猩、猩猩、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔和鸡。
51.根据权利要求47所述的方法，还包括周期性地重复所述施用。全文摘要
本发明涉及重组因子VIII，所述重组因子VIII包括导致因子VIII和因子VIIIa两者的稳定性增强的一种或多种突变。还公开了制备和使用所述重组因子VIII的方法和含有所述重组因子的药物组合物。本发明还涉及编码所述重组因子VIII的分离的核酸分子以及含有所述分离的核酸分子的DNA表达系统和宿主细胞。
文档编号C12P21/06GK101965409SQ200880123751
公开日2011年2月2日 申请日期2008年7月25日 优先权日2007年11月1日
发明者H·瓦卡巴亚施, P·J·费伊 申请人:罗切斯特大学