草酸脱羧酶的生产中利用的重组表达质粒载体及重组菌、以及重组草酸脱羧酶的生产方法

专利名称：草酸脱羧酶的生产中利用的重组表达质粒载体及重组菌、以及重组草酸脱羧酶的生产方法
技术领域：
本发明涉及微生物来源的草酸脱羧酶。具体而言，涉及草酸脱羧酶的生产中利用 的重组表达质粒载体及重组菌、草酸脱羧酶产生菌的制备方法、以及重组草酸脱羧酶的生 产方法。
背景技术：
草酸是在很多食物(特别是菠菜或其它绿色蔬菜、绿茶、可可豆等)中含有、或者 在人体内(在代谢过程中生成，在生物体内不能进一步分解，与尿液一起排出)生成的一 般化合物。已知草酸是在人体中通过与钙结合而导致结石的物质。另外，也可以见到由于 草酸的摄取量过多或人体的生成量过多而引起的尿中草酸浓度的升高(结石形成风险的 增高)。另外，草酸还作为植物病原菌对植物的攻击手段来利用。即，已知存在进行如下攻 击的植物病原菌在感染的植物组织内产生草酸，由此使植物组织内呈酸性环境，使叶子枯 萎。如上所述，草酸是一般的化合物，而对生物显示有害性的化合物。使具有这样的作 用的草酸分解的酶，在食品领域、医疗领域等各种领域中有用。例如，进行了通过将食物中 的草酸直接或在摄取到体内后用酶、草酸分解菌进行分解，来减少体内吸收的草酸浓度的 尝试。另外，也进行了为赋予对植物病原菌的抗性而在植物体中引入草酸分解酶的研究。作为分解草酸的酶，已知存在草酸脱羧酶(以下也称“0XDC”)、草酸氧化酶和草 酰CoA脱羧酶。OXDC是将草酸分解为甲酸和二氧化碳的酶，其内部含有锰。迄今已知，许 多细菌(芽孢杆菌(Bacillus)属等)、霉菌(曲霉(Aspergillus)属、金针菇(Flammulina velutipes)等)保有草酸脱羧酶基因(以下也称“oxdc基因”)。另外，正在尝试对OXDC 进行酶学性质的解析，特别是正在对枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)及金针菇的OXDC 进行解析。关于芽孢杆菌属来源的0XDC，有普通产生菌枯草芽孢杆菌168菌株的OXDC生产率 为每单位培养液0. 4mg/L的报道(非专利文献1)。另外，为了解析酶学性质，以大肠杆菌为 宿主克隆了 oxdc基因(非专利文献2)。该oxdc基因重组大肠杆菌的生产率比枯草芽孢杆 菌168菌株野生株高，显示每Ig培养菌体2. Smg的OXDC生产率。但是，该生产率即使在研 究水平上足够，但从实用或商业水平而言并不充分。非专利文献1 :J. Bacteriol. 182 (2000)，5271-5273非专利文献2 J. Biol. Chem. 276 (2001)，43627-4363
发明内容
在上述背景下，本发明的课题在于提供高效生产微生物来源的草酸脱羧酶的手 段。具体而言，本发明的课题在于提供对于高效生产微生物来源的草酸脱羧酶的重组菌的 制备有用的表达质粒载体、使用该载体制备的重组菌、使用该重组菌的草酸脱羧酶生产系统等。本发明人为了发现高效生产微生物来源的OXDC的方法进行了反复研究。具体而 言，使用芽孢杆菌属来源的OXDC作为微生物来源OXDC的代表，尝试构建其高效生产系统。 首先，着眼于芽孢杆菌属的α “淀粉酶启动子，制作在该启动子的调控下连接有oxdc基因 的重组表达质粒载体。然后，得到用该载体转化的重组菌(枯草芽孢杆菌及大肠杆菌)。考 察重组菌的生产率，结果确认与过去的报道(非专利文献1、2)相比生产率有飞跃性的提 高。另外判明，使用三处发生突变的启动子(突变型启动子)时可以进一步实现生产率的 提高。另外，在用除oxdc基因以外还连接有yvrL基因的表达质粒载体转化得到的重组菌 中也确认到高生产率。另一方面，研究了以枯草芽孢杆菌及大肠杆菌为宿主的生产系统中 的培养条件，确定了提高生产率的锰(Mn)浓度的范围。如上所述，得到了芽孢杆菌属来源的α “淀粉酶启动子对于构建微生物来源OXDC 的高效生产系统有效的见解，并且成功地发现了对于提高生产率特别有效的突变型启动 子。另外，还得到使用连接有yvrL基因的oxdc基因时也可以得到高生产率的见解。并且 还成功地发现了提高生产率的培养条件。本发明是基于这些成果而完成的，提供以下列举的重组表达质粒载体、草酸脱羧 酶产生菌的制备方法、重组菌(重组草酸脱羧酶产生菌)及重组草酸脱羧酶的生产方法。[1] 一种重组表达质粒载体，包含芽孢杆菌(Bacillus)属的α -淀粉酶启动子和 在其调控下配置的微生物来源的草酸脱羧酶基因。[2]如[1]所述的重组表达质粒载体，其中，α -淀粉酶启动子为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyIoliquefaciens)来源的启动子。[3]如[1]所述的重组表达质粒载体，其中，α-淀粉酶启动子具有序列编号2 序列编号4中任一个所示的DNA序列。[4]如[1] [3]中任一项所述的重组表达质粒载体，其中，微生物为芽孢杆菌属 细菌。[5]如[1] [3]中任一项所述的重组表达质粒载体，其中，微生物为枯草芽孢杆 菌(Bacillus subtilis)。[6]如[1] [3]中任一项所述的重组表达质粒载体，其中，微生物为枯草芽孢杆 菌168菌株。[7]如[1] [3]中任一项所述的重组表达质粒载体，其中，微生物来源的草酸脱 羧酶基因具有序列编号1所示的DNA序列。[8]如[1] [7]中任一项所述的重组表达质粒载体，其中，在微生物来源的草酸 脱羧酶基因的下游包含yvrL基因。[9]如[8]所述的重组表达质粒载体，其中，yvrL基因包含序列编号5所示的DNA 序列。[10]如[8]所述的重组表达质粒载体，其中，包含序列编号16所示的序列的DNA 片段。[11]草酸脱羧酶产生菌的制备方法，其特征在于，用[1] [10]中任一项所述的 重组表达质粒载体转化宿主细菌。[12]如[11]所述的制备方法，其中，宿主细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)或
4芽孢杆菌属细菌。[13] 一种重组菌，是用[1] [10]中任一项所述的重组表达质粒载体转化大肠杆 菌或芽孢杆菌属细菌而得到的。[14]如[13]所述的重组菌，其中，芽孢杆菌属细菌为枯草芽孢杆菌。[15]如[13]所述的重组菌，其中，芽孢杆菌属细菌为枯草芽孢杆菌168菌株。[16] 一种重组草酸脱羧酶的生产方法，包括培养[13] [15]中任一项所述的 重组菌的步骤、和回收产生的草酸脱羧酶的步骤。[17] 一种重组草酸脱羧酶的生产方法，包括在锰浓度为ImM 5mM的培养基中 培养用[1] [10]中任一项所述的重组表达质粒载体转化大肠杆菌而得到的重组菌的步 骤、和回收产生的草酸脱羧酶的步骤。[18] 一种重组草酸脱羧酶的生产方法，包括在锰浓度为0. ImM ImM的培养基 中培养用[1] [10]中任一项所述的重组表达质粒载体转化芽孢杆菌属细菌而得到的重 组菌的步骤、和回收产生的草酸脱羧酶的步骤。


图1是表示宿主与启动子的组合的表。图2是穿梭载体pUBCl的制作顺序。图3是用于连接amy启动子与oxdc基因的操作顺序。图4是用于连接Iac启动子与oxdc基因的操作顺序。图5是oxdc基因表达质粒载体pUBCoxdc2的结构。图6是oxdc基因表达质粒载体pUBCoxdc的结构。图7是oxdc基因表达质粒载体pLacoxdc的构建方法及结构。图8是oxdc基因表达质粒载体pUOXDCCl的结构。图9是oxdc基因表达质粒载体PL0XDCC3的构建方法及结构。图10是oxdc基因表达质粒载体pLOXDCC的构建方法及结构。图11是OXDC浓度测定方法的操作顺序。图12是定性的OXDC活性测定方法的操作顺序。图13是比较重组菌的OXDC生产率的表。图14是用以添加锰浓度OmM时的OXDC生产率为1时的相对值表示使用重组菌 No. 5时的培养基中锰浓度与OXDC生产率的关系的图表。图15是用以添加锰浓度OmM时的OXDC生产率为1时的相对值表示使用重组菌 No. 1时的培养基中锰浓度与OXDC生产率的关系的图表。
具体实施例方式(重组质粒载体)本发明的第一方面涉及重组表达质粒载体(以下也简称“表达载体”)。“重组” 是指并非天然存在的物质，而是作为通过基因工程的方法进行人工操作的结果而得到的物 质。本发明的表达载体中，在芽孢杆菌(Bacillus)属的α _淀粉酶启动子的调控下配置有微生物来源的草酸脱羧酶基因(微生物来源的oxdc基因)。另外，所说的“草酸脱羧酶 基因(oxdc基因)”如果没有特别说明，是指编码草酸脱羧酶的氨基酸序列的DNA区域(所 谓的结构基因)，不包括启动子等调节区域。“启动子”是指对其调控下的基因的转录的开始进行调节的功能区域。本发明中 的启动子，只要是芽孢杆菌属来源的α-淀粉酶启动子则没有特别限制。此处的“芽孢杆 菌属”例如为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)、苏云金芽 包杆菌(Bacillus thuringiensis)，优选为角军淀粉芽 包杆 菌。解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子的DNA序列如序列编号2 (GenBank登录号J01542 的第1个碱基 第249个碱基的区域)所示。本发明的一个方式中使用包含该DNA序列的 α-淀粉酶启动子。只要具有启动子活性，也可以使用该启动子的一部分。作为一个例子， 给出序列编号3所示的DNA序列(删除了序列编号2的DNA序列中5'侧的69个碱基后 的序列)。使用该启动子时，确认到良好的启动子活性(参考后述的实施例栏)。另外，使 用该启动子(序列编号3)的突变体(序列编号4)时，确认到更加良好的启动子活性(序 列编号4的DNA序列是序列编号3的DNA序列中三个部位(在第100个碱基与第101个碱 基之间插入一个碱基、并取代第101个及第102个碱基)发生突变的序列)。如该事实所 证明的那样，即使是序列编号3所示的DNA序列的一部分改变后的DNA序列，有时也能维持 或者提高启动子活性。因此，只要能够发挥启动子活性，也可以使用包含与序列编号3所示 的DNA序列有部分不同的DNA序列的启动子。即，即使是包含以序列编号3所示的DNA序 列为基准、含有一个或多个碱基的取代、缺失、插入、添加或倒位的DNA序列的DNA片段，只 要能发挥启动子活性，都可以作为本发明中的启动子使用。碱基的取代、缺失等可以在多个 部位发生。此处的“多个”例如为2 40个碱基、优选为2 20个碱基、更优选为2 10 个碱基。“调控下”与“支配下”同义，表示启动子与结构基因功能性连接。通过在启动子的 调控下配置结构基因，使结构基因的转录受到启动子的调控(调节)。典型地是启动子与结 构基因直接连接，但是只要结构基因受到启动子转录调控，启动子与结构基因之间也可以 隔有其它序列。芽孢杆菌属来源的α -淀粉酶启动子，可以将本说明书或后附的序列表所公开的 序列信息、公共数据库(例如DDBJ/EMBL/GenBank)中登录的序列信息作为参考，使用标准 的基因工程方法、分子生物学方法、生化学方法等来制备。例如，可以通过包含芽孢杆菌属 细菌的染色体DNA的制备、利用特异性引物的启动子区域的扩增、以及扩增产物的回收的 一系列操作来制备所期望的启动子。特异性引物可以使用市售的自动DNA合成装置等容易 地合成。启动子区域的扩增例如优选使用PCR。本发明的表达载体中，在上述启动子的调控下配置有微生物来源的oxdc基因。已 经明确各种微生物保有oxdc基因，对几个基因进行了序列鉴定，并且也进行了其功能解 析。以下，给出公共数据库中登录的微生物来源OXdc基因的例子(微生物名数据库名登 录号序列表的序列编号)。枯草芽孢杆菌GenBank :Z99120 序列编号1地衣芽孢杆菌GenBank :CP000002 序列编号17
6
金针菇GenBank:AF200683 序列编号 18蜡状芽孢杆菌GenBank :AE016877 序列编号1Θ构巢曲霉GenBank:AACD01000139 序列编号 20变形链球菌GenBank :AE014133 序列编号21本发明的最大特征在于组合使用芽孢杆菌属来源的α -淀粉酶启动子和微生物 来源的OXdc基因，并且微生物来源的OXdc基因的种类没有特别限制。因此，只要是迄今为 止鉴定的微生物来源的OXdc基因原则上均可以采用。优选使用芽孢杆菌属的OXdc基因。 特别优选使用序列编号1所示的枯草芽孢杆菌的OXdc基因。例如，本发明的表达载体中使用的微生物来源的oxdc基因，通过制备保有该基因 的微生物的染色体DNA后，利用序列特异性探针或引物分离oxdc基因来制备。例如，芽孢 杆菌属细菌的染色体DNA的制备方法，在Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley &SonS Ltd(1990)等中进行了详细说明。另外，关于目标DNA的分离方法，可以 参考分子克隆(Molecular Cloning)(第三版，冷泉港实验室出版社，纽约)或最新分子生 物学实验方法汇编(Current protocols in molecular biology) (Frederick M. Ausubel 等编著，1987)等。oxdc基因的下游可以连接终止子(转录终止序列)。作为终止子，除了原本的终 止子以外，可以使用α “淀粉酶终止子、Τ7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子等。考虑到密码子的简并，只要是编码相同蛋白质(即0XDC)的DNA序列，则与序列编 号1所示的DNA序列在功能上等价，可以作为本发明中的oxdc基因使用。另外，一般而言， 对某一蛋白质的氨基酸序列的一部分进行改变时，有时改变后的蛋白质与改变前的蛋白质 具有同等的功能。即，有时氨基酸序列的改变对蛋白质的功能没有实质性的影响，蛋白质的 功能在改变前后维持不变。因此，与序列编号1所示的DNA序列编码的蛋白质(其氨基酸序 列如序列编号15所示)具有同源的氨基酸序列、并且作为草酸脱羧酶起作用的蛋白质(以 下也称为“同源蛋白质”)的DNA序列也可以作为本发明的oxdc基因使用。此处的“同源 的氨基酸序列”是指，与序列编号15所示的氨基酸序列部分不同、但该不同对蛋白质的功能 (该情况下为OXDC活性)没有实质性影响的氨基酸序列。“氨基酸序列的部分不同”，典型地是指通过构成氨基酸序列的一个至数个氨基酸 的缺失、取代、或一个至数个氨基酸的添加、插入、或者它们的组合使氨基酸序列产生突变 (变化)。此处的氨基酸序列的不同只要不使OXDC活性大幅下降就是容许的。只要满足该 条件则氨基酸序列不同的位置没有特别限制，另外也可以在多个位置产生不同。此处的多 个例如为相当于小于全部氨基酸的约30%的个数，优选为相当于小于约20%的个数，进一 步优选为相当于小于约10%的个数，更进一步优选为相当于小于约5%的个数，最优选为 相当于小于约的个数。即，同源蛋白质与序列编号15的氨基酸序列具有例如约70%以 上、优选约80%以上、进一步优选约90%以上、更进一步优选约95%以上、最优选约99%以 上的同源性。优选通过使对于OXDC活性非必须的氨基酸残基发生保守的氨基酸取代来得到同 源蛋白质。此处的“保守的氨基酸取代”是指将某一氨基酸残基取代为具有同样性质的侧 链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链分为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸 性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β _支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧 链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等几个家族。保守的氨基酸取代优选为同一 家族内的氨基酸残基间的取代。本发明人研究的结果判明，使用连接有yvrL基因的oxdc基因时也可以得到发挥 高生产率的重组菌。因此，在本发明的一个方式中，构建在微生物来源的OXdc基因的下游 含有yvrL基因的表达载体。然后，用该表达载体转化宿主，制备重组菌。另外，构建使用该 重组菌的OXDC生产系统。yvrL基因的序列的具体例如序列编号5所示。另外，微生物来源 的oxdc基因的下游含有yvrL基因的DNA片段的序列的具体例如序列编号16所示。本发 明的表达载体的一个方式中，插入该DNA片段。目前，对于各种宿主_载体系统可以获得各种质粒载体。作为以大肠杆菌为 宿主的质粒载体的例子，可以列举pUC系质粒及其诱导体、pBR322系质粒及其诱导 体、pACYC系质粒及其诱导体、pSClOl系质粒及其诱导体。作为以芽孢杆菌属细菌为 宿主的质粒载体的例子，可以列举pUBl 10 (Gryczan，T. J. et al. J. Bacteriol. 134， 318-329(1978))、pTA1060 (Bron, S. et al. Plasmid. 18，8-15 (1987))、pC194 (Horinouchi, S.etal.J.Bacteriol.l50(2),815-8 25(1982))>pE194(Horinouchi,S.et al. J. Bacteriol. 150 (2)，804-814 (1982))等。另外，还可以获得在大肠杆菌和芽孢杆菌属 细菌中均可以进行复制的载体(穿梭载体)(Grande, G. et al. Monogr· (Dtsch. Ges. chem. Apparatewes).105,147-162(1987) ；Truffaut, H. & Sebald，Μ.Biotechnol.Lett.10， 1-6(1988) > Moriyama, H. etal. Nucleic Acids Res. 16,8732(1988) ；Bron, S. et al. Plasmid. 19，231-241(1988) ；Karp, Μ. Biochim.Biophys. Acta. 1007，84-90(1989)等)。本发明的表达载体可以利用以上的质粒载体构建。即，考虑与宿主的关系选择适 当的质粒载体(例如市售品)后，以所期望的配置方式插入芽孢杆菌属的α-淀粉酶启动 子和微生物来源的oxdc基因，则可以得到本发明的表达载体。如果能够获得具备芽孢杆菌 属的α-淀粉酶启动子的质粒载体，则以在α-淀粉酶启动子的调控下配置的方式插入微 生物来源的oxdc基因即可。同样，如果能够获得具备微生物来源的oxdc基因的质粒载体， 则在可调控该基因的位置插入α-淀粉酶启动子即可。在质粒载体中插入芽孢杆菌属的α -淀粉酶启动子和微生物来源的oxdc基因 (或其中任意一方基因)时，可以进行删除基本载体的不需要的序列、追加功能序列(例如 选择标记或增强子)等进一步的改变。另外，关于构建本发明的表达载体时所需的操作方法、试剂、条件等，可以参考例 如分子克隆(Molecular Cloning)(第三版，冷泉港实验室出版社，纽约)或最新分子生物 学实验方法汇编(Frederick Μ. Ausubel等编著，1987)等。(草酸脱羧酶产生菌的制备方法及草酸脱羧酶产生菌)如果用本发明的表达载体转化适当的宿主细菌，则可以得到产生OXDC的重组 菌。因此，作为本发明的第二方面，提供(1)以用本发明的表达载体转化宿主细菌为特征的 OXDC产生菌的制备方法、及(2)通过该制备方法得到的重组菌。本发明的重组菌保有包含 受芽孢杆菌属的α -淀粉酶启动子的转录调控的微生物来源oxdc基因的表达质粒载体。表 达质粒载体的拷贝数没有特别限制，例如为1 700。
此处的宿主细菌没有特别限制，优选为大肠杆菌或芽孢杆菌属细菌。作为大肠 杆菌的具体例，可以列举JM109菌株、MC1061菌株、DH5a菌株、BL21菌株。另一方面， 作为芽孢杆菌属的细菌，可以例示枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽胞杆 菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热月旨肪芽胞 杆菌(Bacillus stearothermophilus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、球形芽孢杆菌 (Bacillus sphaericus)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)。其中，优选枯草芽孢杆菌，特别优选枯草芽孢杆菌168菌株。转化可以在考虑宿主-载体系统的基础上通过常规方法进行。以大肠杆菌为宿 主时，可以利用感受态细胞法(例如氯化钙法、氯化铷法、Hanahan法、SEM法等)或电穿孔 法进行转化。另一方面，以芽孢杆菌属细菌为宿主时的转化可以利用原生质体转化法(参 考 Chang，S. & Cohen，S. N. Mol. Gen. Genet. 168，111-115 (1979)等)或感受态细胞法(参 考 Spizizen，J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 44,1072-1078 (1958)等)等。通过电穿孔法， 在未原生质体化的菌体中也可以导入质粒载体(Kusaoke，H. et al. Agric. Biol. Chem. 53， 2441-2446(1989))。另外，关于转化方法的具体操作规程例如在“分子克隆，第三版，1. 84，冷泉港实验 室出版社，纽约”中有详细说明。(草酸脱羧酶的生产方法)本发明的另一方面涉及使用本发明的重组菌的OXDC的生产方法。本发明的生产 方法中，首先，在诱导α-淀粉酶启动子的条件下培养本发明的重组菌(培养步骤)。然后， 进行回收产生的OXDC的步骤(回收步骤)。培养步骤在“诱导α-淀粉酶启动子的条件”下实施。由此，通过α-淀粉酶启动 子发挥转录活性，表达OXdc基因。可以从培养开始经过规定时间后诱导α-淀粉酶启动 子。α-淀粉酶启动子的诱导时机没有特别限制，从增大OXDC的产生量的观点考虑，优选在 对数增长期或稳定期进行诱导。特别优选在对数增长期的后期至稳定期的中期之间进行诱 导。但是，在以芽孢杆菌属细菌及大肠杆菌为宿主得到的重组菌的情况下，可以在培养开始 时进行诱导。另外，本领域技术人员可以通过预实验设定适当的培养条件。按时间推移从培养液中取样，通过浊度(或吸光度)等的计测计算菌数，由此可以 确定生长时期(对数增长期或稳定期等)。当然，也可以通过预培养制作生长曲线，利用该 曲线确定生长时期。其它培养条件(培养基、培养温度、培养时间等)可以根据进行培养的重组菌适当 设定。例如，如果重组菌为大肠杆菌，可以以标准的培养条件为基准根据需要加以修正。另 外，可以通过预实验设定适当的培养条件。OXDC在其分子内含有锰(Mn)。因此，培养重组菌来生产OXDC时，需要使用添加锰 的培养基。如后述的实施例所述，本发明人的研究结果是，如果是转化大肠杆菌而得到的重 组菌，则培养基中的锰浓度为ImM 5mM时确认到高生产率。另外，添加浓度为5mM时显示 最大生产率。因此，使用转化大肠杆菌而得到的重组菌时，为了提高生产率，培养基中的锰 浓度优选为ImM 5mM、进一步优选为5mM。另一方面，如果是转化芽孢杆菌属细菌而得到 的重组菌，则培养基中的锰浓度为0. ImM ImM时确认到高生产率。另外，添加浓度为ImM 时显示最大生产率。因此，使用转化芽孢杆菌属细菌而得到的重组菌时，为了提高生产率，培养基中的锰浓度优选为0. ImM ImM、进一步优选为ImM。除了培养基中含有锰的条件以外，只要满足进行培养的重组菌可以生长的条件， 则培养基的组成没有特别限制。作为培养基的碳源，可以使用例如麦芽糖、蔗糖、龙胆二 糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等。另外，作为氮源，可以使用例如硫酸铵、碳酸 铵、磷酸铵、醋酸铵、或者蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麦糠、肉提取物等。作 为无机盐，可以使用钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等。为促进重组菌的生长，可 以使用添加有维生素、氨基酸等的培养基。培养基的pH例如调节为约3 8、优选调节为约6 8左右，培养温度通常为约 10 50°C、优选为约27 37°C左右，培养1 15天、优选1 3天左右。以大肠杆菌为宿 主时在需氧的条件下或者厌氧的条件下培养。以芽孢杆菌属细菌为宿主时，在需氧的条件 下培养。作为培养方法，例如可以利用振荡培养法、旋转培养法、通气搅拌培养法等。培养步骤后续的回收步骤中，从培养液或菌体中回收0XDC。从培养液回收时，例如 可以通过下述操作得到OXDC 通过对培养上清进行过滤、离心处理等除去不溶物后，将超 滤膜浓缩、硫酸铵沉淀等盐析、透析、各种层析法等适当组合来进行分离、纯化。另一方面，从菌体内回收时，例如可以通过对菌体进行加压处理、超声波处理等将 其破碎后，与上述同样地进行分离、纯化来得到0XDC。另外，也可以在通过过滤、离心处理等 预先从培养液中回收菌体后，进行上述一系列工序(菌体的破碎、分离、纯化)。
实施例1. oxdc基因表达系统的选择为了提高生产率，对宿主与启动子的组合进行了研究。宿主选择了作为OXDC产 生菌已知的(1)枯草芽孢杆菌168菌株(ATCC(美国典型菌种保藏中心，American Type Culture Collection))和基因重组中一般使用的宿主(2)大肠杆菌(E. coli JM109菌株 (TAKARA BIO公司))。配合这些宿主，选出在各自中可以期待导入基因的高表达的启动子 (图1)。另外，amy启动子是α-淀粉酶基因的启动子。α _淀粉酶基因是多种枯草杆菌 (芽孢杆菌属)具有的基因，迄今为止报道了若干个使用α-淀粉酶启动子克隆的基因。另 一种Iac启动子是以大肠杆菌为宿主时使用的一般的启动子，已知表达量多。2. oxdc基因的获得要进行克隆的oxdc基因(yvrK)从枯草芽孢杆菌168菌株染色体获得。具体而言， 首先，由枯草芽孢杆菌168菌株通过常规方法获得染色体DNA。根据数据库(GenBank登录 号Z99120)上的oxdc基因序列信息(序列编号1)设计引物对。另外，3'侧引物附加有限 制性内切酶(XbaI)位点。3'侧引物(引物1):5' -GGCTCTAGATTATTTACTGCATTTCTTTTTCAC-3'(序列编号 6)5'侧引物(引物2、amy启动子用)5' -AGGGAGAGGAAACATGAAAAAACAAAATGACATTCC-3‘(序列编号 7)5'侧引物(引物3、Iac启动子用):5' -GTCATTTTGTTTTTTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAA-3'(序列编号 8)将由枯草芽孢杆菌168菌株获得的染色体DNA作为模板，使用上述引物进行PCR，得到目标oxdc基因。3. amy启动子的获得amy启动子使用解淀粉芽孢杆菌来源的启动子。首先，由解淀粉芽孢杆菌通过常规 方法获得染色体DNA。参考数据库上的α-淀粉酶基因(GenBank登录号J01542)的序列， 设计特异性扩增启动子区域(序列编号2)的引物。另外，5'侧引物附加有EcoRI的限制 性酶切位点。另外，将含有amy启动子3'末端序列和oxdc基因5‘末端序列的引物作为 3'侧引物。5'侧引物(引物4):5' -CGCCGAATTCTGGATCGATTGTTTGAG-3‘(序列编号 9)3'侧引物(引物5):5' -GTCATTTTGTTTTTTCATGTTTCCTCTCCCTCTCATTTTC-3'(序列编号 10)以准备好的解淀粉芽孢杆菌的染色体DNA作为模板，使用设计好的引物进行PCR， 由此得到amy启动子的DNA片段。4.穿梭载体pUBCl的制作(图2)以枯草芽孢杆菌168菌株作为宿主时，利用芽孢杆菌属表达系统中一般使用的 PUBllO载体(ATCC(美国典型菌种保藏中心))。pUBllO载体并不是直接使用，为了提高重 组菌构建时的转化效率，首先，考虑到在大肠杆菌中构建表达质粒，构建了大肠杆菌用质粒 载体PUC18与pUBllO的穿梭载体。实际操作上，将PUC18和pUBl 10用限制性内切酶AflIII 和XbaI处理，得到包含彼此的复制起始区域的片段。然后，将所得片段之间用连接酶连接， 得到穿梭载体PUBC1。5. amy启动子与oxdc基因的连接(图3)插入的amy启动子与oxdc基因通过PCR连接。首先，利用2.的部分中记载的方 法(使用引物1、2)及3.的部分中记载的方法(使用引物4、5)分别进行PCR(第一阶段)。 将PCR产物混合后，使用引物1、4进行PCR(第二阶段)，得到紧接在amy启动子后连接有 oxdc基因的片段(amy启动子oxde基因连接片段)。6. Iac启动子与oxdc基因的连接(图4)以大肠杆菌为宿主在Iac启动子下游导入oxdc基因时，利用高拷贝载体PUC19。 首先，设计包含存在于Iac启动子上游的AflIII限制性酶切位点的5'侧引物。5'侧引物(引物6):5' -CTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTG-3 ‘(序列编号 11)另一方面，设计包含Iac启动子3'末端序列和oxdc基因5'末端序列的3'侧引 物。3'侧引物(引物7):5' -TTCACACAGGAAACAGCTATGAAAAAACAAAATGAC-3'(序列编号 12)首先，通过2.的部分中记载的方法(使用引物1、3)进行PCR(第一阶段)。另外， 以Iac启动子(pUC19)为模板，使用引物6、7进行PCR(第一阶段)。将第一阶段的PCR得 到的PCR产物混合后，使用引物1、6进行PCR(第二阶段)，得到紧接在Iac启动子后连接有 oxdc基因的DNA片段。7.重组菌(0XDC产生菌)的构建
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(1)重组菌 No. 1将穿梭载体pUBCl及amy启动子oxdc基因连接片段用EcoRI、XbaI处理后，用连 接酶连接，由此得到OXdc基因表达质粒载体pUBCoXdc2(图5)。然后，用该载体转化大肠杆 菌JM109菌株。由该重组大肠杆菌大量制备该载体后，通过原生质体PEG融合法用该载体 转化枯草芽孢杆菌168菌株，得到oxdc基因重组菌。考察该oxdc基因重组菌中保持的oxdc基因表达质粒载体的插入片段的碱基序 列，结果表明在amy启动子中发生了 3个碱基的突变(突变型amy启动子序列编号4)。 参考公共数据库中登录的野生型amy启动子的序列，通过取代、插入发生突变的区域(使用 Stratagene ^W] Quick Change Site-Directed Mutagenesis i式齐[Ι取代、@失)，得 到具有与野生型amy启动子的序列相同的序列的启动子(amy启动子序列编号3)。用如 此操作后的oxdc基因表达质粒载体pUBCoxdc (图6)再次转化枯草芽孢杆菌168菌株，得 到目标oxdc基因重组菌No. 1。(2)重组菌 No. 2将pUC19及Iac启动子oxdc基因连接片段用Afl I II-XbaI处理后，用连接酶连接， 由此得到oxde基因表达质粒载体pLacoxdc (图7)。通过常规方法用该载体转化大肠杆菌 JM109菌株。这样，以大肠杆菌为宿主，得到保有oxdc基因表达质粒载体pLacoxdc的重组 菌 No. 2。(3)重组菌 No. 3利用大肠杆菌JM109菌株大量制备(1)的部分中记载的具有突变型amy启动子的 表达质粒载体pUBCoXdc2(图5)。然后，通过原生质体PEG融合法用该载体转化枯草芽孢杆 菌168菌株，得到重组菌No. 3。(4)重组菌 No. 4枯草芽孢杆菌168菌株的染色体DNA上在oxdc基因下游存在称为yvrL基因的功 能未知的基因，尝试将该基因也包含在内而进行转化。首先，设计用于扩增包含oxdc基因 和yvrL基因的序列的3'侧引物。另外，该引物中，在yvrL基因3‘末端外侧附加有限制 性内切酶XbaI位点。3'侧引物(引物8):5' -TTATCTAGAGCTTGCTTCCGTCTATCAAGG-3'(序列编号 13)以枯草芽孢杆菌168菌株染色体DNA作为模板，使用上述的引物8和作为5'侧引 物的引物2进行PCR(第一阶段)。另一方面，按照2.的部分中记载的顺序进行PCR(第一 阶段)。将第一阶段的PCR得到的PCR产物混合后，使用引物4和引物8进行PCR(第二阶 段)，得到在amy启动子的下游配置有oxdc基因、在更下游配置有yvrL基因的DNA片段。 获得的片段及PUBllO用EcoRI、XbaI处理。将限制性内切酶处理后的DNA片段连接，得到 oxdc表达质粒载体pUOXDCCl (图8)。通过原生质体-PEG-融合法用该载体转化枯草芽孢 杆菌168菌株，得到重组菌No. 4。(5)重组菌 No. 5首先，制作具有在大肠杆菌和枯草杆菌中起作用的复制起始区域的穿梭载体 pCUHB-Ι。将pC194(ATCC(美国典型菌种保藏中心))用ClaI处理、将pUC19用BbiII处 理后，将两者连接(载体1)。另外，将pHV1249(美国芽胞杆菌遗传保藏中心，BacillusGenetic Stock Center)用NcoI处理后，在NcoI位点进行连接，由此得到在NcoI位点内 产生缺损的载体(载体2)。将载体1和载体2用ApaLI处理后，将两者连接(载体3)。用 EcoRI使载体3部分分解，回收5. 7 5. Skbp附近的DNA片段。将回收的DNA片段连接后， 用Avail处理并再次连接(载体4)。载体4用SmaI处理、pBEST501 (非专利文献3 核酸 研究(Nucleic Acids Research)，第 17 卷，第 11 期，4410 页，1989 年)进行 EcoRI-PstI 处 理及平端处理后，将两者连接，得到载体pCUHB-Ι (图9的上部)。插入的amy启动子-oxdc基因连接片段如下制备。设计在amy启动子5'末端侧 外侧附加有限制性酶切位点HindIII位点的引物。5'侧引物(引物9):5' -CTTAAGCTTTGGATCGATTGTTTGAGA-3 ‘(序列编号 14)以pUBCoxdc为模板，使用引物1和引物9进行PCR。由此，得到在5'末端附加有 HindIII位点、在3'末端附加有XbaI位点的amy启动子oxdc基因连接片段(HindIII-amy 启动子-oxdc基因-XbaI)。将该片段用HindIII-XbaI处理，另一方面将pCHUB_l同样用 HindIII-XbaI处理，再将它们彼此连接，得到oxdc表达质粒载体pL0XDCC3 (图9)。用该载 体转化大肠杆菌JM109菌株，得到重组菌No. 5。(6)重组菌 No. 6插入的突变型amy启动子-oxdc基因连接片段如下制备。以解淀粉芽孢杆菌染色体DNA作为模板，使用引物9和引物5进行PCR(第一阶 段)。另一方面，以枯草芽孢杆菌168菌株的染色体DNA为模板，使用引物1和引物2进 行PCR(第一阶段)。将第一阶段的PCR得到的PCR产物混合后，使用引物1和引物9进 行PCR(第二阶段)，得到突变型amy启动子与oxdc基因的连接片段。将该连接片段及载 体pCUHB-Ι用限制性内切酶HindIII-XbaI处理后，将两者连接，得到oxdc表达质粒载体 pL0XDCC(图10)。用该载体转化大肠杆菌JM109菌株，得到重组菌No. 6。8.重组菌的培养方法为了考察重组菌No. 1 6的OXDC生产率，以LB培养基为基本，制备液体培养基。 以下，说明具体的培养方法。首先，使用以下的预培养用培养基5mL进行预培养(37°C下在试管中培养一夜)。 另外，根据重组菌的抗药性添加抗生素。具体而言，重组菌No. 1、3、4、5、6的情况下添加卡 那霉素(终浓度25 μ g/mL)、重组菌No. 2的情况下添加氨苄青霉素(终浓度50 μ g/mL)。〈预培养用培养基(全部重组菌通用)>细菌用酵母提取物(Becton，Dickinsonand Company 制)0· 5%细菌用胰蛋白胨(Becton, Dickinson and Company 制NaCl 0. 5%然后，在300mL带挡板的三角烧瓶中准备下述主培养用培养基50mL后，添加1 %量 的预培养液，在37°C振荡培养一夜(到24小时)(主培养)。此处，由于淀粉酶启动子被二 糖以上的糖类诱导，因此对于表达质粒中保有amy启动子的重组菌(No. 1、3、4、5、6)，在接 种时添加麦芽糖(终浓度1%)和MnCl2 (芽孢杆菌属宿主的情况下为0. ImM、大肠杆菌宿 主的情况下为5mM)。另一方面，对于表达质粒中保有Iac启动子的重组菌(No. 2)，在培养 液浊度A66tl为0. 3 0. 6时添加IPTG (终浓度ImM)，进行Iac启动子的诱导。此时，一并添
13加 MnCl2 (5mM)。<主培养用培养基(LB培养基)>细菌用酵母提取物(Becton，Dickinsonand Company 制)0· 5%细菌用胰蛋白胨(Becton, Dickinson and Company 制NaCl 0. 5%另外，由于OXDC在其分子内含有锰，因此对oxdc基因重组菌进行培养使其产生 OXDC时，需要在培养基中添加锰。因此，在保有插入有amy启动子与oxdc基因的连接片段 的表达质粒载体的重组菌中，从提高OXDC生产率的观点对最适的锰添加浓度也进行了研允。9.重组菌的OXDC生产率oxdc基因重组菌No. 1 6中在菌体内生产0XDC。根据条件，仅生产可溶性0XDC、 仅生产不溶性(包涵体)0XDC、或者生产可溶性OXDC与不溶性(包涵体)的两者。为了考察 OXDC生产率，收集培养后的菌体并破碎，由此回收菌体内的0XDC。实际操作上，通过离心分 离从培养液中回收培养后的菌体后，用适量的缓冲液清洗以除去培养基成分。然后，在得到 的重组菌体中添加玻璃珠和适量的缓冲液，使用多功能珠破碎机(Multi Beads Shocker) (安井器械株式会社)进行菌体破碎(以运转60秒钟、停止30秒钟为一个循环进行600秒 钟，转数为2000rpm)。OXDC在以可溶性形式生产时包含于菌体破碎后的上清中，在以不溶 性形式生产时包含于菌体破碎后的沉淀中。因此，通过以下的方法测定菌体破碎上清中或 者沉淀中的0XDC，求出各重组菌的生产率。通过使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies制)确认菌体破碎 后上清或者菌体破碎后沉淀中的OXDC浓度(图11)。在目标样品(无论可溶性还是不溶 性)添加附带的处理液并进行热处理后，将其供给到填充有凝胶的附带的芯片中，由此以 峰的形式检测蛋白质。峰的大小与蛋白浓度成正比，因此，通过在样品中添加适当浓度的 BSA(牛血清白蛋白)作为内部标准物质，计算样品中的蛋白浓度。使用本方法，测定菌体破 碎后的OXDC浓度。另外，为了定性地确认生产率，还测定了 OXDC的活性。OXDC的活性测定通过利用 如下原理的测定方法进行(图12)。在草酸存在下使OXDC起作用时，草酸分解生成甲酸。 将生成的甲酸以NAD为辅酶用甲酸脱氢酶分解，在NADH特异性吸收波长A34tl下测定该反应 时产生的NADH的生成量，换算成活性值。另外，OXDC以可溶性或不溶性的包涵体形式生产。因此，以不溶性的包涵体形式 生产时无法直接测定，需要如下所述的可溶化/重折叠的工序作为测定前的处理。另外，以 可溶性形式生产时将菌体破碎上清直接供给活性测定系统即可。首先，利用IM盐酸胍进行包涵体OXDC的可溶化。具体而言，在回收的菌体破碎后 的沉淀(含有包涵体0XDC)中添加适量的IM盐酸胍溶液，充分混悬。由此，使包涵体OXDC 溶于溶液中。然后，将含有可溶化OXDC的IM盐酸胍溶液用缓冲液稀释5倍。通过该稀释工 序，使OXDC重折叠，形成活性体形式的结构。使用这样进行可溶化/重折叠处理后的OXDC 样品进行活性测定。另外，可溶化/重折叠效率并非每次固定，另外，可溶性、不溶性的比例 也未必固定，因而认为难以准确评价样品中的OXDC活性。因此，组合使用利用上述Agilent 2100生物分析仪的定量的方法，研究各重组菌的生产率。
10. OXDC生产率的比较各重组菌的生产率的测定结果如图13所示。以枯草芽孢杆菌168菌株为宿主、保 有在amy启动子(或突变型amy启动子)下游连接有oxdc基因的表达质粒载体的oxdc基 因重组菌(重组菌No. 1、3、4)均显示非常高的OXDC生产率(枯草芽孢杆菌168菌株野生 株No. 7的3250 5425倍、已经报道的重组大肠杆菌No. 8的19. 3 36. 9倍)。在此，在向菌体内生产目标物的重组菌的情况下，一般难以得到非常高的生产率。 例如，以大肠杆菌为宿主时，据报道实现超过lg/L的生产率是非常困难的。考虑到这一点， 此次的重组菌的生产率作为向菌体内生产目标物的重组菌可以评价为非常高的生产率。特 别是重组菌No. 1、3、4的生产率令人惊讶(No. 1、No. 4为lg/L以上，No. 3实际上为2g/L 以上)，值得特别说明一下。重组菌No. 1、3、4显示非常高的生产率也表示使amy启动子与 oxdc基因的组合在菌体内表达对于OXDC生产是非常有效的。另一方面，以大肠杆菌为宿主、保有在amy启动子(或突变型amy启动子)下游连 接有oxdc基因的表达质粒载体的oxdc基因重组菌(重组菌No. 5、6)也显示非常高的生 产率(枯草芽孢杆菌168菌株野生株No. 7的495 900倍、已经报道的大肠杆菌No. 8的 3. 7 6. 3倍)。其生产率远在使用Iac启动子的重组菌No. 2的生产率之上。由以上结果表明，无论何种宿主，芽孢杆菌来源的amy启动子作为用于高效生产 OXDC的启动子都是有效的。另一方面，比较重组菌No. 1与重组菌No. 3之间、或重组菌No. 5与重组菌No. 6之 间的生产率时可知，使用突变型amy启动子时比使用野生型amy启动子时oxdc的生产率 高。由此可以说，使用突变型启动子对于生产率的提高是有效的。另外，通过重组菌No. 3的生产率与重组菌No. 4的生产率的比较可知，在oxdc基 因的下游存在yvrL基因时生产率虽然降低，但仍然可以得到高生产率。另外，对培养基中的锰浓度与生产率的关系进行研究的结果是，宿主为大肠杆菌 的情况下(重组菌No. 5)，培养基中的锰浓度为1 5mM时确认到非常高的OXDC生产率， 5mM时OXDC生产率最大(图14)。另一方面，宿主为枯草芽孢杆菌168菌株的情况下(重 组菌No. 1)，锰浓度0. 1 1. OmM时确认到非常高的OXDC生产率，锰浓度1. OmM时OXDC生 产率最大(图15)。产业上的可应用性本发明用于高效生产微生物来源的0XDC。本发明不受上述发明的实施方式及实施例的说明的任何限定。本发明中也包含在 不偏离所要保护的范围的情况下在本领域技术人员可以容易地想到的范围内的各种变形 方式。本说明书中公开的论文、公开专利公报及专利公报等，通过援引其全部内容而使用。
权利要求
一种重组表达质粒载体，其特征在于，包含芽孢杆菌属的α 淀粉酶启动子和在其调控下配置的微生物来源的草酸脱羧酶基因。
2.如权利要求1所述的重组表达质粒载体，其中，α-淀粉酶启动子为解淀粉芽孢杆菌 来源的启动子。
3.如权利要求1所述的重组表达质粒载体，其中，α-淀粉酶启动子具有序列编号2 序列编号4中任一个所示的DNA序列。
4.如权利要求1 3中任一项所述的重组表达质粒载体，其中，微生物为芽孢杆菌属细菌。
5.如权利要求1 3中任一项所述的重组表达质粒载体，其中，微生物为枯草芽孢杆菌。
6.如权利要求1 3中任一项所述的重组表达质粒载体，其中，微生物为枯草芽孢杆菌 168菌株。
7.如权利要求1 3中任一项所述的重组表达质粒载体，其中，微生物来源的草酸脱羧 酶基因具有序列编号1所示的DNA序列。
8.如权利要求1 7中任一项所述的重组表达质粒载体，其中，在微生物来源的草酸脱 羧酶基因的下游包含yvrL基因。
9.如权利要求8所述的重组表达质粒载体，其中，yvrL基因包含序列编号5所示的DNA 序列。
10.如权利要求8所述的重组表达质粒载体，其中，包含序列编号16所示的序列的DNA 片段。
11.一种草酸脱羧酶产生菌的制备方法，其特征在于，用权利要求1 10中任一项所述 的重组表达质粒载体转化宿主细菌。
12.如权利要求11所述的制备方法，其中，宿主细菌为大肠杆菌或芽孢杆菌属细菌。
13.—种重组菌，其特征在于，是用权利要求1 10中任一项所述的重组表达质粒载体 转化大肠杆菌或芽孢杆菌属细菌而得到的。
14.如权利要求13所述的重组菌，其中，芽孢杆菌属细菌为枯草芽孢杆菌。
15.如权利要求13所述的重组菌，其中，芽孢杆菌属细菌为枯草芽孢杆菌168菌株。
16.一种重组草酸脱羧酶的生产方法，其特征在于，包括 培养权利要求13 15中任一项所述的重组菌的步骤，和 回收产生的草酸脱羧酶的步骤。
17.—种重组草酸脱羧酶的生产方法，其特征在于，包括在锰浓度为ImM 5mM的培养基中培养用权利要求1 10中任一项所述的重组表达 质粒载体转化大肠杆菌而得到的重组菌的步骤，和 回收产生的草酸脱羧酶的步骤。
18.—种重组草酸脱羧酶的生产方法，其特征在于，包括在锰浓度为0. ImM ImM的培养基中培养用权利要求1 10中任一项所述的重组表 达质粒载体转化芽孢杆菌属细菌而得到的重组菌的步骤，和 回收产生的草酸脱羧酶的步骤。
全文摘要
本发明的课题在于提供高效生产微生物来源的草酸脱羧酶的手段。构建包含芽孢杆菌(bacillus)属的α-淀粉酶启动子和在其调控下配置的微生物来源的草酸脱羧酶基因的重组表达质粒载体。用该载体转化宿主细菌，制备草酸脱羧酶产生菌。另外，培养该产生菌后，通过回收产生的草酸脱羧酶，生产重组草酸脱羧酶。
文档编号C12N9/00GK101918551SQ200880123693
公开日2010年12月15日 申请日期2008年11月26日 优先权日2008年1月4日
发明者儿岛宪二, 小山贵史, 小嶋裕三, 箕田正史 申请人:天野酶株式会社