专利名称：重组修饰的纤溶酶的制作方法
重组修饰的纤溶酶相关申请的交叉引用本申请根据35 USC §119要求在2007年11月29日提交的美国临时申请 60/991，148的优先权，通过引用将其并入本文。
背景技术：
人纤溶酶原是单链蛋白质，含有791个氨基酸残基。酶原中Arg561_Val562肽键 的单一的切割引起纤溶酶原激活成为纤溶酶。产生的纤溶酶分子是具有胰蛋白酶样特异性 (在Lys和Arg之后切割)的双链的二硫键连接的丝氨酸蛋白酶。纤溶酶的氨基-末端重链(残基1-561， 60kDa)由五个三环域(Kringle domain)组成，每个都含有大约80个氨基酸残基。三环域负责纤溶酶原的调控特性，如与 激活抑制子(例如，Cr1离子)的相互作用；与激活刺激子(例如氨基酸)的相互作 用；与哺乳动物和细菌细胞的相互作用；以及与其他蛋白质(如纤溶酶生理底物纤维蛋白 和纤溶酶抑制子α 2-抗纤溶酶的相互作用)。所有五个三环中，三环1是最具多功能性 的一个已经显示其赖氨酸结合活性负责纤溶酶与α 2-抗纤溶酶和纤维蛋白的相互作用。 β Wiman, B.，等人，Biochim. Biophys. Acta 579 142-154 (1979)；及 Lucas，Μ. Α.，等人， J. Biol. Chem. 258 :4249_4256 (1983)。纤溶酶的C-末端轻链(残基562-791， 25kDa)是典型的丝氨酸蛋白酶，与胰蛋 白酶同源，并含有经典的丝氨酸蛋白酶催化三联体HiS603、ASp646和Ser741。纤溶酶原含 有24个二硫键桥及位于Asn289和Thr346的2个糖基化位点。已显示纤溶酶原被弹性蛋白酶有限蛋白水解产生三个主要片段 (Sottrup-Jensen, L.，等人，Prog. Chem. Fibrinol. Thrombo 1.，3 191-209 (1978))。第一 个片段K1-3包括前三个三环，可以分离为两种形式，Tyr80-Val338和Tyr80_Val354。第 二个片段K4对应于第四个三环，包括残基Val355-Ala440。最后一个，C-末端片段(所谓 的小_纤溶酶原)包括残基Val443-ASn791，并由第五个三环及丝氨酸蛋白酶结构域构成。 小_纤溶酶原能以与纤溶酶原相同的方式被激活，形成小_纤溶酶。由于全长纤溶酶原分子的复杂结构，不能证明细菌表达系统可用于重组纤溶酶原 的生产。纤溶酶原以不溶性包涵体形式生产，不能从该状态重折叠。进一步地，纤溶酶原在 哺乳动物细胞中的表达由于细胞内纤溶酶原激活为纤溶酶并产生细胞毒性而变得复杂。使 用昆虫细胞进行完全活性纤溶酶原的生产是可能的，然而，由于产量低该系统不适合于大 规模生产。进一步地，与任何重组蛋白的方案相同，接受治疗性重组蛋白质的受试者中存在 遇到免疫原性问题的可能。免疫原性是有效和/或高效利用特定重组蛋白质治疗方案的障碍。免疫原性是对 于被认为是外来的物质(例如，蛋白质的化学结构，包括氨基酸序列)的一系列复杂反应， 并且可能包括产生中和及非中和抗体、免疫复合体形成、补体激活、肥大细胞激活、炎症及 过敏性反应。免疫原性可以多重方式限制蛋白质治疗剂的效力和安全性。效力可直接通过 形成中和抗体的形成被减少。效力还可以间接减少如结合于中和或非中和抗体一般导致 其从血清中被迅速清除。当引发免疫反应时会发生严重的副作用甚至死亡。当中和抗体与
4内源蛋白质交叉反应并阻断其功能时，产生一类特殊的副作用。因此，需要经修饰的重组蛋白质，其具有纤溶酶/纤溶酶原的理想特征(例如，具 有天然样的化学结构的区域)而同时缺少特定负面特征，且能够在重组蛋白质表达系统 (包括细菌细胞)中大量产生。发明概述在一方面，本发明提供包含编码多肽的核苷酸序列的多聚核苷酸，所述多肽具有a)与天然人纤溶酶原的三环域同源的单个N-末端三环域，其中三环域内最后四 个氨基酸残基为V、P、Q和C;和b)与人纤溶酶原中对应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结 构域；其中多肽结合于固定化的赖氨酸。在另一方面，本发明提供多肽，其包含a)与天然人纤溶酶原的三环域同源的单个N-末端三环域，其中三环域内最后四 个氨基酸残基为V、P、Q和C;和b)与人纤溶酶原中对应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结 构域；其中多肽结合于固定化的赖氨酸。在另一方面，本发明提供包含本发明多聚核苷酸的表达载体。在一个实施方式中， 多聚核苷酸包含如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。在一些方面，本发明提供培养的细胞，其包含具有本发明的多聚核苷酸的表达载 体。在一个实施方式中，所述多聚核苷酸包含如SEQID NO :1所示的核苷酸序列。在另一个 实施方式中，培养的细胞为原核生物。在一个实施方式中，原核生物为大肠杆菌(E.coli)。在一方面，本发明提供用于制备一种或多种重组纤溶酶多肽的方法。该方法包 括a)提供多肽，其具有与天然人纤溶酶原的三环域同源的单个N-末端三环域，其中 三环域内最后四个氨基酸残基为V、P、Q和C ；以及与人纤溶酶原中对应结构域同源的C-末 端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域；其中多肽结合于固定化的赖氨酸；和b)将步骤a)中提供的多肽在足以切割一个或多个肽键的条件下与蛋白酶接触， 从而形成一种或多种重组纤溶酶多肽。在一个实施方式中，提供包括在合适宿主中表达具 有对应于如SEQ ID NO :1所示序列的序列的开放阅读框，或其简并变体。在另一个实施方 式中，多肽具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。图像简述
图1为天然纤溶酶被蛋白水解切割而激活后的示意图。K1-K5为三环区域1-5 ；SP 为丝氨酸蛋白酶结构域。“0 24 ”为三环1上的Ci2-抗纤溶酶结合位点。图2为本发明的纤溶酶原缺失突变体的示意图，使用了与图1相同的命名，显示了 K2-5的缺失。图3显示了人纤溶酶原的氨基酸序列，显示了 19-残基的先导序列，编号为-19 至-1，纤溶酶原序列显示为残基1-791 (见SEQ IDNO :3，人纤溶酶原的cDNA序列；及SEQ ID NO :4，所编码的氨基酸序列，如图3所示)。显示了许多特征，包括以下(TAL6003)-纤 溶酶原序列(阴影部分)的一个实施方式；三环域1-5 (双下划线)；糖基化位点Ash289和 Thr346(加粗)；Arg-Val激活位点(R561V562,加粗)；及三环1中的赖氨酸结合位点(下划线
5并具有特异性位置编号)。图4显示天然人纤溶酶(原)的五个三环域(1-5)之间的多肽序列比较(即，缺 口比对)。与三环1中同一个相对位置上的相同的氨基酸残基以下划线显示。图5显示血浆衍生的纤溶酶制备物(泳道1 =非还原(NR)；泳道2 =还原(R)) 及(TAL6003)-纤溶酶(泳道3 =非还原(NR)；泳道4 =还原(R))制备物的8-25%梯度 SDS-PAGE。链激酶分别将血浆衍生纤溶酶原和(TAL6003)-纤溶酶原激活为天然纤溶酶和 重组(TAL6003)-纤溶酶，使得形成对应于三环和丝氨酸蛋白酶结构域的两条带。这样，在 电泳前与还原性试剂二硫苏糖醇(DTT) —起温育后，血浆衍生纤溶酶和(TAL6003)-纤溶酶 (其在非还原胶上是单个条带)被还原成在同一个非还原胶上对应于三环1(下方条带)和 丝氨酸蛋白酶结构域(上方条带)的两条带。图6为链激酶激活(TAL6003)-纤溶酶原的示意图。图7为色谱图，显示了(TAL6003)-纤溶酶原结合于赖氨酸-SEPHAROSE 4B 将0. 5mg纯化的(TAL6003)-纤溶酶原应用到用pH7. 4的Tri s缓冲盐水平衡的赖氨 酸-SEPHAROSE 4B柱子(1x3cm)上。用0_20mM梯度的ε -氨基己酸(ε -ACA)将结合的蛋 白质从柱子上洗脱，作为单一的峰。280nm处的吸光度与ε-ACA浓度作为洗脱剂体积的函 数显示于图像中。 图8显示(TAL6003)-纤溶酶原与纤维蛋白的结合，通过其随后被tPA激活的情况 及所得的凝块溶解进行评估。图9显示(TAL6003)-纤溶酶与血浆衍生纤溶酶的溶解血栓效力的体外比较。图10示例显示了(TAL6003)-纤溶酶(SEQ ID NO 2)的二硫键模式。在图中，(X) 代表氨基酸序列RDVVLFEK。发明详述本发明人已经发现新型重组纤溶酶原多肽或其变体，本文称为(TAL6003)-纤溶 酶原，其具有天然纤溶酶原样特征，虽然从其结构中删除了 4个三环。这些(TAL6003)-纤 溶酶原或其变体为能够在激活事件(至少涉及位于酶原的三环域和丝氨酸蛋白酶结构域 之间的Arg-Val肽键的蛋白水解切割)之后被激活成为功能性纤溶酶酶类(本文称为 (TAL6003)-纤溶酶)的酶原。本发明的(TAL6003)-纤溶酶原或其变体具有纤维蛋白全长天然人纤溶酶原的结 合纤维蛋白、结合抗纤溶酶，以及激活属性。此外，(TAL6003)-纤溶酶原具有许多新型的和 理想的特征，包括在重组生产中高水平表达以及与天然发生的人血浆衍生纤溶酶原相同的 或非常类似的特定的蛋白质化学结构。根据本发明的(TAL6003)-纤溶酶(原)能够至少依据以下几点定性i) (TAL6003)-纤溶酶原激活后产生的(TAL6003)-纤溶酶分子量较低(例如，在一 个实施方式中为大约36，911-大约37，039Da)，由此引起特异性活性(每mg蛋白质)的增 加；ii)缺少至少两个在天然蛋白质中发现的糖基化位点(见图3，S卩，N289和T346)，这 与相对低的分子量一起促进了使用相对廉价的细菌和酵母表达系统进行此蛋白的重组生 产；iii) (TAL6003)-纤溶酶原能够被纤溶酶原激活子tPA、尿激酶和链激酶激活；
iv)与天然人纤溶酶的原三环域同源的单个N-末端三环域的存在保留了纤溶酶 与纤维蛋白结合的属性，这对于溶解血栓效力是重要的；ν)与天然人纤溶酶的原三环域同源的单个N-末端三环域中α 2_抗纤溶酶-结合 位点的存在使得(TAL6003)-纤溶酶被此纤溶酶生理学抑制子迅速抑制(能够阻止流血的 一个特征)；vi) (TAL6003)-纤溶酶较小的大小能够促进其被α 2-巨球蛋白抑制，相对于天然 纤溶酶进一步减少发生流血并发症的机会。在具体实施方式
中，三环5的缺乏(保留了完 整的、未消化的纤维蛋白(原)的主要结合位点)使得能够利用具有减少的循环纤维蛋白 原缺失的(TAL6003)-纤溶酶；vii)与天然人纤溶酶的原三环域同源的单个N-末端三环域(其中三环域内最后 四个氨基酸为V、P、Q和C)的存在提供了与丝氨酸蛋白酶结构域的天然样连接(即，与人纤 溶酶原三环5结构域和丝氨酸蛋白酶结构域之间天然发生的结构域连接处类似的连接)； 及viii)表达重组(TAL6003)-纤溶酶原后，其N-末端可向后切割(即，在激活过程 中向后切割)以提供天然样N-末端。通常，本发明提供重组(TAL6003)-纤溶酶(原)多肽，其具有激活位点N-末端的 单个三环区域和丝氨酸蛋白酶结构域，相比小-纤溶酶(原)有特定优势。尽管本发明的 (TAL6003)-纤溶酶原只有一个例如激活位点N-末端的三环域，一些实施方式包括激活位 点N-末端的其他序列。其它N-末端序列可以衍生自纤溶酶原的天然三环区域的序列。本发明N-末端三环域包括天然纤溶酶(原)三环1和4的三环域序列及其功能 等价物。具体而言，见以下讨论，其中提供了关于多肽变体中功能保留的指导，包括参与或 影响赖氨酸_结合的残基的保留。进一步地，本发明多肽的具体实施方式
由于天然样结构所以能够显示出减少的免 疫原性。例如，在一些实施方式中，本发明的重组纤溶酶原具有与天然发生的人血浆衍生纤 溶酶原形式之一相同的N-末端，其在被链激酶激活后产生包含天然样N-末端的纤溶酶多 肽。此外，本发明的新型多肽在三环和丝氨酸蛋白酶结构域之间具有一个序列，其类似于天 然发生人纤溶酶三环5和SP结构域之间的连接点。定义如本文使用的，术语多肽的“结构域”和“区域” 一般是同义的，除非另外指出是相 反的情况。当与公认的结构或功能名称如“三环”或“丝氨酸蛋白酶”等一同提到时，这些 术语介绍的是多肽特征，其与至少一些通常认可并理解为与对应于这些名称的多肽结构相 关的特性是相关的。如本文使用的，“培养的宿主细胞”指的是含有已经通过任何方式引入细胞的异源 DNA的原核或真核细胞，所述方式例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、转化、病毒感染等寸。如本文使用的，“异源的”意思是“不同于天然来源的”或代表非天然状态。例如， 如果培养的宿主细胞用衍生自另一种生物(特别是来自另一个物种)的DNA或基因转化， 该基因对于所培养的宿主细胞以及对于携带此基因的培养的宿主细胞的后代是异源的。类 似地，“异源的”指衍生自并插入到相同天然、原始细胞类型的核苷酸序列，但其以非天然状
7态存在，例如，有不同拷贝数或受到不同调节元件的控制。进一步地，当用于核酸或氨基酸 序列的情况时，术语“异源的”还可以指此序列上的与同一序列的另一区域具有不同天然来 源的任意区域。例如，如果重组蛋白质包含衍生自载脂蛋白(a)的三环域及衍生自纤溶酶 原的丝氨酸蛋白酶结构域，此三环域和丝氨酸蛋白酶结构域相对彼此为“异源的”，尤其是 当每个结构域衍生自不同物种或生物时。“载体”分子是其中可以插入异源核酸的核酸分子，其然后能引入恰当的培养的宿 主细胞中。载体优选地具有一个或多个复制起点以及一个或多个其中可以插入重组DNA的 位点。载体经常有方便的方法将具有载体的细胞从那些不具有载体的细胞中挑选出来，例 如，其编码药物抗性基因。常见载体包括质粒、病毒基因组和(主要在酵母和细菌中)“人 工染色体”。如本文使用的，术语“转录控制序列”指的是这样的核酸序列，如起始子序列、增强 子序列和启动子序列，其诱导、抑制或控制可操作地连接于其上的编码蛋白质的核酸序列 的转录。术语“多肽”在本文与术语“肽”和“蛋白质”交换使用。术语“多聚核苷酸”和“核酸”在本文交换使用，可以指任何含有上下文指出的目 的所需信息的核酸。即，核酸可以是DNA或RNA，单链或双链的，或其他核酸，只要多聚体能 够代表恰当的信息，例如，关于编码的肽，且包括互补序列，例如，核酸多聚体的正义链和反 义链。术语多肽的“变体”指的是一个或多个氨基酸发生改变的氨基酸序列。变体可以 有“保守”变化，其中被取代的氨基酸具有类似结构或化学属性，例如，以异亮氨酸代替亮氨 酸。备选地，变体可以具有“非保守”变化，例如，以色氨酸代替甘氨酸。类似的微小变化还 可以包括氨基酸缺失或插入，或二者。“变体”多肽的特定形式是“功能上等价的”多肽，即， 显示出与本发明多肽的实例基本类似的体内或体外活性的多肽，如下文更详细描述的。可 以使用本领域熟知的计算机程序找到关于确定哪些氨基酸残基能够被取代、插入或缺失而 不消除生物学或免疫学活性的指导，例如DNASTAR软件(DNASTAR，Inc.，Madison, WI)。进 一步地，下面提供了具体指导，包括引用的参考文献中提供的指导，其全部通过引用并入本 文。术语“N-末端”和“C-末端”用在本文以指应用这些术语的任何氨基酸序列或多 肽结构域或结构的相对位置。相对定位将从上下文变得清楚。也就是，“N-末端”特征比相 同上下文讨论的另一特征(其他特征可能被称作相对于第一个特征位于“C-末端”)将位 于距离多肽分子N-末端至少更近的地方。类似地，术语“5’ -”和“3’ _”可以用于本文以 指多聚核苷酸特征的相对位置。本文所指的具有“与天然人纤溶酶原的三环域同源的”N-末端结构域的多肽显 示出类似于天然纤溶酶原三环域的结构和功能特征。进一步地，本文所指的具有“与三 环1同源的”的N-末端结构域的多肽显示出类似于天然三环1的特征，类似的程度至少 达到多肽能够比三环5具有更高的对于ω-氨基羧酸(及功能同源物如反式-4-氨甲基 环己烷-1-羧酸，一种环酸)的亲和力。对于比较分离的三环域多肽结合5-氨基戊酸 (5-ΑΡηΑ) ；6-氨基己酸(6_ΑΗχΑ)，也称为ε -氨基己酸(ε ACA) ；7_氨基庚酸(7-ΑΗρΑ)；和 反式-4-氨甲基环己烷-1-羧酸(t-AMCHA)的条件和操作流程参见，例如，Chang, Y.，等人，Biochemistry37 :3258_3271 (1998)，通过引用并入本文。“与三环4同源的”三环域的提法的定义类似于上文关于“与三环1同源的”词语。 也就是，其显示出类似于上文讨论的天然人纤溶酶原的三环4的功能特征。如上文所述，这 些多肽也与固定化赖氨酸结合。本发明的多肽与固定化的赖氨酸结合。如本文使用的，词语“与固定化的赖氨酸 结合”指当使用赖氨酸-SEPHAR0SE作为色谱媒介进行柱色谱时，如此表征的多肽相对于 小-纤溶酶原前进较为迟滞。一般地，可以使用含有特定配体(例如eACA，作为洗脱剂) 的溶液将本发明的多肽从这种色谱媒介(赖氨酸亲和树脂)上洗脱下来。进一步地，除了 Chang等人，见上文，本领域技术人员还可以参考其他文献以 确定何种残基可以通过保守或非保守取代、缺失或添加而变化以产生本发明范围内的 缺失突变体。例如，以下参考文献提供了关于对于结合ω氨基羧酸可能具有重要意义 的天然三环域上特定残基的信息Ji等人的美国专利6，538，103 ；Suzuki的美国专利 6，218，517 ；Douglas, J. Τ.，等人，Biochemistry 41(10) :3302_10 (2002) ；Zajicek, J.，等 人，J. Mol. Biol. ,301 (2) :333_47 (2000) ；Lee, H.，等人，Arch BiochemBiophys. ,375(2) 359-63(2000) ；Castellino, F.and S. McCance, CibaFound Symp. 212 46-60(1997)； McCance, S.，等)κ, J. Biol. Chem. ，269 32405-32410 (1994) ；Rejante, Μ. R. and Μ. Llinas, Eur. J. Biochem. ,221 (3) :939_49 (1994) ；ffu, Τ· P.，等人，Blood Coagul. Fibrinolysis, 5(2) 157-66(1994) ；Hoover, C. J.，等人，Biochemistry, 32 (41) 10936-43 (1993)； Menhart, N.，等)κ, Biochemistry, 32 8799-8806 (1993) ；Thewes, Τ.，等)κ, J. Biol. Chem.， 265(7) 3906-3915(1990) ；Novokhatny，V.，等人，Thromb Res. ,53(3) :243_52 (1989)； Motta, A.，等人，Biochemistry, 26 (13) :3827_36 (1987) ；Novokhatny, V.，等人，J. Mol. Biol.，179 215-232 (1984) ；Lerch, P. G.，等人，Eur. J. Biochem.，107 (1) :7_13 (1980)； Sottrup-Jensen, L.,等人，Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol. ,3 191-209 (1978)；及 Wiman, B.和D. CoIlen，Nature 272，549-545 (1978)，皆通过引用全文并入本文。因为本发明人已经认识到可以制备一种有价值的、简单化的纤溶酶(原)分子，其 具有单个具有有益的功能性特征(可以通过测试与固定化赖氨酸的结合而进行部分评估， 如本文所述)的N-末端三环域，所以本发明能包括其他激活位点N-末端的纤维蛋白-结 合结构域或区域。例如，本发明可以包括这样的多肽其中纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域 连接于纤维蛋白结合三环域，所述三环域选自一组，包括但不限于人纤溶酶原的三环4、tPA 的三环2或载脂蛋白(a)的三环。此外，本发明可以包括这样的多肽其中纤溶酶的丝氨酸 蛋白酶结构域连接于任何其他已知的纤维蛋白结合分子，如tPA或纤连蛋白“指状”结构域 或纤维蛋白特异性IgG的FAB片段。在一些方面，本发明的多肽具有与在人血浆衍生纤溶酶(原)的天然发生的形式 中发现的化学结构相同的蛋白质化学结构(例如，天然样N-末端，三环与丝氨酸蛋白酶结 构域之间的天然样连接)。不被具体的理论所限，人们相信蛋白质的特定特征(包括但不限 于氨基酸序列)可以对免疫原性产生作用。因此，本发明提供了基于重组(TAL6003)-纤溶 酶原的有效的蛋白质治疗剂，通过引入与天然人纤溶酶原序列相似的氨基酸序列而预先减 少(TAL6003)-纤溶酶原潜在的免疫原性。在一个方面，本发明的重组(TAL6003)-纤溶酶原多肽包含a)与天然人纤溶酶原
9的三环域同源的单个N-末端三环域，其中三环域内最后四个氨基酸残基为V、P、Q和C ；和 b)与人纤溶酶原中对应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域；其 中多肽结合于固定化的赖氨酸。在一个实施方式中，单个N-末端三环域与天然人纤溶酶原 的三环1或三环4同源。在一些实施方式中，固定化的赖氨酸是结合于固体支持基质，所述 基质选自赖氨酸_琼脂糖、赖氨酸水凝胶、赖氨酸_交联琼脂糖。在另一个实施方式中，固 定化的赖氨酸为赖氨酸_交联琼脂糖。本发明的重组(TAL6003)-纤溶酶原多肽可以被本领域普通技术人员激活以提供 (TAL6003)-纤溶酶多肽。在一个实施方式中，(TAL6003)-纤溶酶多肽显示出纤维蛋白溶解 活性，其被α 2-抗纤溶酶抑制，抑制速率是至少5倍快于Ci2-抗纤溶酶对小-纤溶酶的纤 维蛋白溶解活性的速率抑制。在另一个实施方式中，抑制速率是至少大约10-倍、20-倍、 30-倍或40-倍快于小-纤溶酶的抑制速率。在一个实施方式中，重组(TAL6003)-纤溶酶原多肽与SEQ ID NO :2所示的序列有 至少90 %或95 %，或98 %的同一性。在另一个实施方式中，单个N-末端三环域与天然人 纤溶酶原的三环1或三环4结构域具有至少90%的同一性；且C-末端结构域与人纤溶酶 原的激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域具有至少90%的同一性。在一些实施方式中，多肽具 有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列及其保守取代物。在其他实施方式中，多肽在类似于 SEQ ID NO 2所示氨基酸序列位置85的相对位置上有精氨酸残基。在进一步的实施方式中，单个N-末端三环域与天然人纤溶酶原的三环1或三环4 的氨基酸序列同一性，相对于与天然人纤溶酶原的三环5的序列同一性至少多一个残基， 就与三环5作同一性比较目的而言，单个N-末端三环域相对于人纤溶酶原的三环1和三环 4的天然序列的保守取代不被认为与所述天然序列不同。例如，本发明描述的(TAL6003)-纤溶酶原利用了连接单个三环域和丝氨酸蛋白 酶的连接区域的氨基酸残基修饰。这样，两个结构域之间的该连接更相近地类似于人纤溶 酶原的三环5结构域和丝氨酸蛋白酶结构域之间的天然发生的接合。在另一个实施方式中，本发明描述的(TAL6003)-纤溶酶原进一步包含天然样 N-末端序列。重组生产的(TAL6003)-纤溶酶原可以在激活时被切割以提供同样具有天然 样N-末端的重组(TAL6003)-纤溶酶多肽。在特定实施方式中，(TAL6003)-纤溶酶原的单个N-末端三环域特定位置上的残 基相对于天然人纤溶酶原三环1是保守的。这些可以是与二硫桥和赖氨酸结合相关的位置 上的残基，分别包括 Cys84、Cysl05、Cysl33、Cysl45、Cysl57 和 Cysl62 以及Prol36_Prol40、 Prol43-Tyrl46和Argl53_Tyrl56 (位置按照如图3所示进行编号)。此外，本发明具体的 实施方式可以相对于具有类似结构域成分(即，三环域_丝氨酸蛋白酶(K-SP)的小-纤 溶酶(原)进行化学上的定性(参见Sottrup-Jensen，L.，等人，Progress in Chemical Fibrinolysis andThrombolysis, Vol. 3, (Eds :J. F. Davidson,等 A )Raven 出版社， NewYork(1978))，但是，尤其在类似于SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的位置85的相对位置 上缺少精氨酸(Arg)。在一些实施方式中，本发明的(TAL6003)-纤溶酶原包含单个N-末端 结构域，其在类似于SEQID NO :2所示氨基酸序列的位置85的相对位置上有Arg。类似于 SEQID NO :2所示氨基酸序列的位置85的相对位置的非限制性例子包括SEQ ID N0:4所示 氨基酸序列的 Arg (153)、Arg (234)、Arg (324)和 Arg (426)位置。
在其他实施方式中，指定残基的特定位置可以稍微变化，但仍存在于多肽的结构 和功能类似位置上(即相对于N-末端结构域的三环域结构；见Chang，Y.，等人，如上文讨 论的)。在一些实施方式中，(TAL6003)-纤溶酶(原)多肽的单个N-末端三环域与天然人 纤溶酶原的三环1或三环4天然的同一性百分比，比与天然人纤溶酶原三环5的同一性百 分比至少多一个残基。进一步地，本发明具体实施方式
可以相对于小-纤溶酶(原)进行功能上的定性。 在优选的实施方式中，本发明的(TAL6003)-纤溶酶显示出增加的被Ci2-抗纤溶酶抑制的 速率，例如，比小_纤溶酶的抑制速率快大约一个或两个数量级。进一步地，在具体实施方 式中，(TAL6003)-纤溶酶结合固定化的赖氨酸(例如，赖氨酸-SEPHAR0SE)。将(TAL6003)-纤溶酶原的单个N-末端三环域描述为“N-末端”仅仅是指该结构 域存在于激活位点的N-末端，不意味着不存在此结构域本身N-末端的其他氨基酸残基。进 一步地，纤溶酶原的单个N-末端三环域的多数C-末端半胱氨酸残基(即，图4所示的多数 C-末端Cys残基)和激活位点之间放置的残基数量和同一性可以变化，而不脱离本发明的 范围。基于本文公开以及本文引用的用作关于三环1功能和结构的指导的参考文献，本领 域技术人员无需过量实验即可以确定达到本发明益处的这些变化(ω氨基羧酸的三环1样 结合，缺失突变体大小没有实质增加，也没有引入潜在引起问题的糖基化位点)。因此，本发明涉及多聚核苷酸、多肽、用于生产所述多肽的重组方法、含有所述多 聚核苷酸的载体、用于生产所述多肽的表达系统以及包含这些表达系统的培养的宿主细 胞。如指出的，在一个方面，本发明涉及编码本文公开的多肽的多聚核苷酸或具有其 保守氨基酸取代物的多肽。关于选择“保守”氨基酸取代的指导在下文更详细提供。在一 个实施方式中，多聚核苷酸是DNA。在另一方面，本发明涉及制备载体的方法，包括将本发明的多聚核苷酸插入载体。 在另一方面，本发明涉及由本发明的方法生产的载体。在另一方面，本发明涉及制备培养的宿主细胞的方法，包括将本发明载体引入培 养的宿主细胞。在另一方面，本发明涉及由本发明的方法生产的培养的宿主细胞。在另一方面，本发明涉及本发明分离的多肽，其通过包括下列步骤的方法生产 (a)将包含编码所述多肽的多聚核苷酸的载体引入培养的宿主细胞；(b)培养宿主细胞；以 及(C)回收多肽。在另一方面，本发明涉及用于生产多肽的方法，其包括(a)在表达载体 的条件下培养本发明的宿主细胞；及(b)回收多肽。在另一个方面，本发明涉及含有至少一种本发明的多聚核苷酸的细胞。在一个实施方式中，多聚核苷酸包含如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列。在另一个 实施方式中，多聚核苷酸包含如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的核苷酸4-1032。在其他实 施方式中，多肽包含如SEQ IDNO 2所示氨基酸序列。多聚核苷酸本发明的多聚核苷酸包括具有取代、缺失和/或添加(可以涉及一种或多种核苷 酸)的变体。变体可以在编码区域、非编码区域或二者中有改变。编码区域的改变能够产 生保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。这些之中尤其优选的是沉默的取代、添加和缺 失，其不改变(TAL6003)-纤溶酶(原)蛋白质或其部分的属性和活性。就此而言尤其优选
11的还有保守取代(见下文)。本发明的进一步实施方式包括核酸分子，其包含与以下序列具有至少90 %同一 性，更优选至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列的多聚核苷酸(￡1)编码 具有SEQ ID NO 2的完整氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO 2的 氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和(c)与上文(a)或(b)中任何核苷酸序列互补的核苷 酸序列。在一个实施方式中，本发明的核酸分子包括多聚核苷酸，其具有编码具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在其他实施方式中，核酸分子包括多聚核苷 酸，其具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列或其简并变体。在说到具有与编码(TAL6003)-纤溶酶原的参考核苷酸序列具有例如至少95%的 “同一性”的核苷酸序列的多聚核苷酸，其表示所述多聚核苷酸的核苷酸序列与所述参考序 列是相同的，只不过所述多聚核苷酸序列在编码(TAL6003)-纤溶酶原多肽的参考核苷酸 序列的每100个核苷酸中可以包括多至5个点突变。换句话说，为了获得具有与参考核苷 酸序列至少95%同一性的核苷酸序列的多聚核苷酸，参考序列中多至5%的核苷酸可以缺 失或被其他核苷酸取代，或可以将数目多至参考序列总核苷酸5 %的核苷酸插入所述参考 序列。参考序列的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或位于两个 末端位置之间的任何位置，单独分散在参考序列的核苷酸之中或者在参考序列内的一个或 多个连续的组中。如上文所指出的，可以通过确定它们的百分比同一性来比较两个或更多个多聚核 苷酸序列。同样可以通过确定它们的百分比同一性比较两个或更多个氨基酸序列。无论是 核酸还是肽序列，两个序列的百分比同一性一般被描述为两个比对序列之间完全匹配的数 目除以较短序列的长度并乘以100。核酸序列的近似比对是通过Smith和Waterman的局 部同源性算法提供的，见 Advances in AppliedMathematics 2:482-489(1981)。该算法可 以扩展到用于肽序列，采用由Dayhoff开发的评分矩阵，见Atlas of Protein Sequences andStructure, Μ. 0. Dayhoff ed.,5 suppl. 3 :353_358, National BiomedicalResearch Foundation, Washington, D. C. , USA,并且 通过 GribskovNucl. Acids Res. 14(6) 6745-6763(1986)进行标准化。这种算法对于核酸和肽序列的实施是由Genetics Computer Group (Madison, Wis.)在他们的BESTFIT应用程序中提供的。该方法的缺省参数在以下 文献中描述Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8(1995) (可以从 Genetics Computer Group, Madison, Wis.获得)。例如，由于遗传密码的简并性，本领域普通技术人员将直接意识到与SEQ ID NO 1 所示核酸序列具有至少90 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %同一性的大量核酸分子将编码 (TAL6003)-纤溶酶原多肽。实际上，由于这些核苷酸序列的简并变体都编码相同的多肽， 所以这对于本领域技术人员来说是显而易见的，不需要进行本文描述的任何功能分析或测 定。本领域进一步认识到，对于不是简并变体的这类核酸分子来说，其中也会有合理数量的 核酸分子编码具有(TAL6003)-纤溶酶原多肽活性的多肽。这是因为技术人员完全了解那 些不太可能或不可能显著影响蛋白功能的氨基酸取代(例如，将一种脂肪族氨基酸取代为 另一种脂肪族氨基酸)。最近，在较长的多聚核苷酸序列的合成生产方面的进展已经能够合成生产编码显
12著更长的多肽的核酸，而不使用传统克隆技术。这些服务的商业提供者包括Blue Heron, Inc. ,Bothel 1,WA(http ://www· blueheronbio· com)。由 Blue Heron, Inc.所采用的技术披 露于美国专利号 6，664，112 ；6，623，928 ；6, 613, 508 ；6, 444, 422 ；6，312，893 ；4，652，639 ； 公开的美国专利申请号20020119456A1 ；20020077471A1 ；和公开的国际专利申请(公开 号)W003054232A3 ；W00194366A1 ；W09727331A2 ；和 W09905322A1 中，所有文献皆通过引用 并入本文。当然，分子生物学，微生物学和重组核酸的传统技术也可用于生产本发明 的多聚核苷酸。这些技术是众所周知的，并且披露于以下文献中，例如，Current Protocols in Molecular Biology, F. Μ. Ausebel, ed. , Vols.I, II and III (1997)； Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)； DNA Cloning :A PracticalApproach, D. N. Glover, ed. , Vols. I and 11 (1985); OligonucleotideSynthesis, M.L.Gait, ed. (1984) ；Nucleic Acid Hybridization, Hames 禾口 Higgins, eds. (1985) ；Transcription and Translation, Hames 禾口 Higgins, eds. (1984) ；Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed. (1986) ；Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986) ；Perbal, " APractical Guide to Molecular Cloning “； the series, Methods inEnzymology, Academic Press, Inc. (1984) ；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells, J. H. Miller 禾口 Μ· P. Calos, eds. , Cold SpringHarbor Laboratory (1987)；禾口 Methods in Enzymology, Wu 禾口 Grossman 禾口 Wu, eds.,分另lj 见 Vols. 154和155，以上文献皆通过引用并入本文。载体和培养的宿主细胞本发明还涉及包括本发明分离的核酸分子的载体，使用重组载体进行遗传工程改 造的培养的宿主细胞，以及通过重组技术生产(TAL6003)-纤溶酶(原)多肽。可以使用公知技术(例如感染、转导、转染、转位、电穿孔和转化)将重组构建体导 入培养的宿主细胞。载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载 体可以是能复制的或复制缺陷型的。在后一种情况下，病毒繁殖通常只能在补偿性培养的 宿主细胞中发生。所述多聚核苷酸可以与含有选择标记的载体连接，以便在培养的宿主中繁殖。一 般地，将质粒载体导入沉淀物，如磷酸钙沉淀物，或导入具有带电荷的脂质的复合物。如果 载体是病毒的话，可以使用合适的包装细胞系进行体外包装，然后转导进入培养的宿主细 胞。优选的是包含对感兴趣的多聚核苷酸的顺式作用控制区的载体。合适的反式作用 因子可以由培养的宿主提供，由互补载体提供或在导入培养的宿主后由载体本身提供。在这一方面的特定实施方案中，所述载体提供了特异性表达，它可以是可诱导和/ 或细胞类型特异性的。在这种载体中特别优选的是可以通过便于操纵的环境因素(如温度 和营养添加剂)诱导的载体。可用于本发明的表达载体包括染色体_、附加体_和病毒-衍生的载体，例如，衍生 自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多泡病毒、痘病 毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病毒和逆转录病毒)的载体，以及衍生自它们的组合的载体，
13如粘粒和噬菌粒。DNA插入物应当可操作地连接到合适的启动子，如噬菌体λ PL启动子，大肠杆菌 lac、trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子和逆转录病毒LTR的启动子(仅举几个例 子)。其他合适的启动子为本领域技术人员所公知。表达构建体还包含转录起始位点、终止 位点，并且在转录区中还包含用于翻译的核糖体结合位点。由所述构建体表达的成熟转录 物的编码部分可以包括位于开始部分的翻译起始和适当地位于要翻译的多肽的末端的终 止密码子(UAA、UGA或UAG)。正如所指出的，表达载体优选包括至少一种可选择的标记，这类标记包括二 氢叶酸还原酶或新霉素抗性，用于真核细胞培养物；以及四环素或氨苄青霉素抗性基 因，用于在大肠杆菌(E.coli)和其他细菌中培养。合适的培养的宿主的代表性例子 包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonellatyphimurium)细胞；真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila) S2和草地夜蛾(Spodoptera) Sf9细胞；动物细胞，如CH0、C0S和Bowes黑素瘤细胞；以及植 物细胞。用于上述培养的宿主细胞的合适的培养基和条件为本领域所公知。优选用于细菌的载体包括例如pET24b或pET22b(可获自Novagen，Madison), WI (pET-24b(+)和 pET-22b(+)分别=pETExpression System 24b (Cat. No. 69750)和 22b (Cat. No. 70765), EMDBiosciences Inc., Novagen Brand, Madison, WI, JAL http:// www. emdbiosciences. com关于pET_24b和pET_22b的产品信息部分获得关于载体的详 细资料)，PQE70、pQE60 和 pQE_9(可以从 Qiagen Inc.，Valencia, CA 获得)；pBS 载体、 PHAGESCRIPT 载体、BLUESCRIPT 载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(可以从 Stratagene， LaJolla, CA 获得)；和 ptrc99a、pKK223-3、pKK233_3、pDR540、pRIT5 (可以从 Pharmacia (现 在是 Pfizer，Inc.，New York, NY)获得)。优选的真核载体有 pWLNE0、pSV2CAT、p0G44、pXTl 和 pSG(可以从 Stratagene 获得)；以及 pSVK3、pBPV、pMSG 和 pSVL(可以从 Pharmacia 获 得)。其他合适的载体对本领域技术人员来说是显而易见的。适用于本发明的细菌启动子包括大肠杆菌IacI和IacZ启动子、T3和T7启动子、 gpt启动子、Ara和PL启动子和trp启动子。合适的真核启动子包括CMV立即早期启动 子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR的启动子(如劳氏肉瘤 病毒(RSV)的启动子)和金属硫蛋白启动子(如小鼠金属硫蛋白-I启动子)。将载体构建体导入培养的宿主细胞可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的 转染、阳离子型脂类介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法实现。这样的方法在很多 标准实验室手册中有描述，如 Davis et al.，Basic Methods In Molecular Biology, 2nd Edition(1995)。可以通过将增强子序列插入载体来增强高等真核生物对于编码本发明多肽的DNA 的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10-300bp，它在给定类型的培养的宿主细 胞中提高启动子的转录活性。增强子的例子包括SV40增强子(位于复制起点后侧(late side) 100-270bp处)；巨细胞病毒早期启动子增强子；位于复制起点后侧的多瘤病毒增强 子；以及腺病毒增强子。为了使翻译的蛋白分泌进入内质网腔，进入壁膜间隙或进入细胞外环境，可以将 合适的分泌信号并入到所表达的多肽中。所述信号对多肽来说可以是内源的，或者它们可以是外源信号。多肽能够以修饰的形式表达，如融合蛋白，并且不仅可以包括分泌信号，而且还包 括其他异源功能区。例如，可以将额外的氨基酸区域(特别是带电荷的氨基酸)添加至多 肽的例如N-末端，以在纯化期间或后续的处理和保存中改善在培养的宿主细胞中的稳定 性和持久性。另外，还可以将肽部分添加到多肽上以促进纯化。可以在最终的多肽制备之 前将这些区域移除。向多肽上添加肽部分以引起分泌或排泄以便提高稳定性并促进纯化等 等，这些是本领域熟知的和常规技术。优选的融合蛋白包含来自免疫球蛋白的异源区，其可 用于溶解蛋白。例如，EP 0 464 533 Al (加拿大的对应申请为2，045，869)公开了包含免疫 球蛋白分子的恒定区的不同部分与另一种人类蛋白或其部分的融合蛋白。在许多情况下， 融合蛋白中的Fc部分对于治疗和诊断用途十分有益，并因此带来例如改善了的药物动力 学特性。另一方面，对某些用途来说，需要在以所描述的有益方式表达、检测和纯化融合蛋 白质之后能够删除Fc部分。当Fc部分被证实妨碍了治疗和诊断上的应用时，是这种情况， 例如，当融合蛋白将被用作免疫接种的抗原时。例如，在药物发现方面，已经将人类蛋白与 Fc部分融合，用于进行高通量筛选测定的目的(如hIL5-受体，以鉴定hIL-5的拮抗剂)。 参见 Bennett, D. , et al. , J. Molecular Recognition, 8 52~58 (1995)禾口 Johanson, K. et al.，J. Biol. Chem.，270 (16) :9459_9471 (1995)。可以通过熟知的方法(包括在本文的实施例中具体描述的那些)从重组细胞培养 物中回收和纯化(TAL6003)-纤溶酶原。本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成程序 的产物、以及通过重组技术从原核或真核培养宿主生产的产物，所述宿主包括例如细菌、酵 母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。另外，本发明的多肽还可以包括原始的经修饰的甲硫 氨酸残基，在某些情况下是宿主介导的过程的结果。多月太本发明的多聚核苷酸包括编码本发明多肽的变体和具体例子的那些。例如，取代 在 Bowie, J. U.等人，"Deciphering the Message inProtein Sequences :Tolerance to Amino Acid Substitutions，” Science247 :1306_1310 (1990)中提供了有关如何制备表型 沉默氨基酸取代的指导，其中作者指出，蛋白惊人地耐受氨基酸取代。尽管本发明范围内的 任何数量的取代都可以通过应用这种一般原则获得，但是对于有关取代的具体指导，本领 域技术人员可以参考本文所引用的关于三环1结构域的结构和功能的参考文献。可进一步理解的是，根据所采用的标准，(TAL6003)-纤溶酶原的三环、激活位点， 和丝氨酸蛋白酶结构域的确切“位置”或序列在本发明范围内的具体变体中可略有不同。 例如，相对于激活位点，三环域的确切定位可略微变化和/或三环域结构域的N-末端的序 列的长度可以改变。因此，本发明包括(TAL6003)-纤溶酶原多肽的这样的变体，其表现出 本文所公开的(TAL6003)-纤溶酶原多肽活性。这样的变体包括缺失、插入、倒位、重复和 取代。如上文所指出的，关于哪些氨基酸变化可能是表型沉默的指导可以参见以下文献 Bowie, J. U. , et al. , "Deciphering the Message in Protein Sequences Tolerance to AminoAcid Substitutions”，Science 247:1306-1310(1990)中找到。因此，SEQ ID NO 2的多肽的衍生物或类似物可以是⑴这样的物质，其中一个或 多个氨基酸残基(例如，3、5、8、10、15或20个残基)被保守的或非保守的氨基酸残基(优 选为保守的氨基酸残基)取代。这样的经取代的氨基酸残基可以是或者不是由遗传密码编
15码的，或(ii)这样的物质，其中一个或多个氨基酸残基包括取代基团(例如，3、5、8、10、15 或20)，或(iii)这样的物质，其中成熟的多肽与另一种化合物融合，如能延长多肽半衰期 的化合物(例如，聚乙二醇)，或(iv)这样的物质，其中附加的氨基酸与成熟的多肽融合， 如IgG Fc融合区肽或前导或分泌序列或用于纯化成熟的多肽或前蛋白序列的序列。这样 的片段、衍生物和类似物被视为在本领域技术人员通过阅读本说明书可以了解的范围内。如所指出的，改变优选是微小性质的，如不会显著影响蛋白折叠或活性的保守性 氨基酸取代。当然，技术人员可以进行的氨基酸取代的数目取决于很多因素，包括上面所描 述的因素。一般来说，对任何给定的(TAL6003)-纤溶酶原多肽的取代数目将不超过50、40、 30、25、20、15、10、5 或 3 个。本发明的(TAL6003)-纤溶酶原中对功能必需的氨基酸可以通过本领域公知 的方法确定，如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham和Wells，Science 244 1081-1085(1989))。后一种程序在分子的每个残基上导入单个的丙氨酸突变。然后测试所 得到的突变型分子的生物学活性，例如，如在本文提供的实施例中显示的。对配体结合有关 键意义的位点还可以通过结构分析确定，如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith，et al., J. Mol.Biol. 224 :399-904(1992)和 de Vos, et al. Science255 :306_312 (1992))。即使 从蛋白的N-末端删除一个或多个氨基酸导致了蛋白的一种或多种生物学功能的改变或丧 失，其他生物学活性仍然可以得以保留。还可以预期的是，可以通过固相合成方法生产可用于生产本发明的“分离的多 月太”的多月太。参见 Houghten，R. Α.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :5131_5135 (1985)；和 Houghten等人的美国专利号4，631，211(1986)。本发明的多肽可以以分离的形式提供。“分离的多肽”意指从其天然环境中取出的 多肽。因此，对于本发明的目的而言，在重组培养的宿主细胞中生产和/或包含的多肽被认 为是分离的。“分离的多肽”还指已经从重组培养的宿主中部分或实质上纯化的多肽。可以使用一些方法(包括计算机辅助的方法，如上文关于多聚核苷酸中指出的) 来确定具有与(TAL6003)-纤溶酶原多肽的参考氨基酸序列具有所标明的百分比同一性的 氨基酸序列的多肽按照上文关于核苷酸序列的讨论进行多肽氨基酸序列的检查和比较。本 领域技术人员将认识到，这样的概念(如对多聚核苷酸所讨论的分子端点)在考虑这样的 方法和程序用于多肽分析的相应用途时将具有直接的类似物。例如，有关多聚核苷酸讨论 的人工校正指的是核酸的5’和3’端点，不过，将认识到相同的讨论适用于多肽的N-末端 和C-末端。本发明包括(TAL6003)-纤溶酶原多肽，其在翻译期间或之后被差异性修饰，例 如，糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白酶切割、连 接至抗体分子或其他细胞配体等。多种化学修饰中的任何修饰都可以通过已知技术完 成，包括但不限于通过溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、金黄色葡萄球菌 (S. aureus) V8蛋白酶、NaBH4进行的特异性化学切割；乙酰化、甲酰化、氧化、还原；在存在 衣霉素的条件下进行代谢合成；等。本发明包括的其他翻译后修饰包括，例如，N-连接的或0-连接的糖链、N-末端或 C-末端的加工、将化学部分连接至氨基酸骨架、N-连接的或0-连接的糖链的化学修饰，以 及为了改造载体和构建体以便在原核培养宿主细胞中表达(TAL6003)-纤溶酶原多肽而添加的N-末端甲硫氨酸残基。多肽还可以通过可检测的标记(如酶、荧光、同位素或亲和标 记)修饰，以便可以检测和分离蛋白质。药用组合物和治疗方法可以根据以下文献中描述的方法和组合物配制(TAL6003)-纤溶酶(原)用 于治疗用途美国专利申请号 10/143，112 ；和 Novokhatny，V.，et al.，J. Thromb. Haemost. 1 (5) 1034-41 (2003)，二者通过引用并入本文。例如，可以将低pH (大约2. 5-大 约4)，低缓冲力的缓冲液用于配制(TAL6003)-纤溶酶。另外，本领域技术人员所公知的其 他方法和制剂(如对于纤溶酶、小_纤溶酶、和/或微_纤溶酶的实践)可用于配制本发明 的(TAL6003)-纤溶酶以用于治疗性施用。(TAL6003)-纤溶酶(原)可用于治疗多种血栓形成性疾病或病况，例如，根据以下 文献中描述的方法进行美国专利号6，355，243,6, 964，764和6，969，515，皆通过引用并入 本文。同样，正如可应用于(TAL6003)-纤溶酶的可能的药物制剂，(TAL6003)-纤溶酶也可 以通过本领域公知的方法进行治疗性施用，例如，目前以纤溶酶、小-纤溶酶、和/或微-纤 溶酶实施的方法。实施例 表达载体的设计(TAL6003)-纤溶酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。具有编码(TAL6003)-纤 溶酶原的核苷酸序列的多聚核苷酸针对大肠杆菌表达和mRNA稳定性进行密码子优化， 以产生如SEQ ID NO :1所示的DNA序列。将此多聚核苷酸克隆进入大肠杆菌表达载体 pET24b (+) (Novagen ；Madison, WI)的NdeI和BamHl位点，以便生产细胞溶质的蛋白质。如表1中阐述的，细菌(例如大肠杆菌)中的表达提供了重组(TAL6003)-纤溶酶 原，其具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列(S卩，重组(TAL6003)-纤溶酶原有N-末端甲硫 氨酸(即，M1)，紧接着位于对应于SEQ ID NO :4所示的天然人纤溶酶原氨基酸序列的位置 70精氨酸(S卩，Rto)的精氨酸氨基酸残基(即，R2)之前(另见，例如，图3)。这样的重组产 物对进一步切割敏感，产生具有不同N-末端的其他蛋白质，包括具有N-末端赖氨酸(即， K10)或缬氨酸(即，V11)(分别对应于天然人纤溶酶原位置78的赖氨酸(即，K78)或位置79 的缬氨酸(即，V79))的蛋白质。表1 天然纤溶酶原(例如，基于SEQ ID NO 4)和(TAL6003)-纤溶酶(原)(例 如，基于SEQ ID NO :2，或其变体)的N-末端
包含19个氨基!睃的先导序列的天然纤溶酶原(例如，基于seq id no 4) 丄 丄 丄丄m-19ehke …e0Y Y Y Y 1Plddy ... m69r7°dwlfekk78v79ylsec天然“ lys-纤洛f酶原”(sp，切割掉先导序列) 丄 丄丄Y Y Y E01Plddy · · · m69r7cidwlfekk78v79ylsec......(seq id no 5)
17 丨指示潜在的切割位点(TAL6003)-纤溶酶原的表达及纯化将包含编码(TAL6003)-纤溶酶原的DNA的表达载体转化进入多种细胞，包括 BL21 (DE3)RIL(Stratagene, La Jolla，CA)、BL21 (DE3)(基因型ΓοπιρΤ hsdSB(rBi) gal dcm(DE3)) (EMB Biosciences, Inc.，San Diego, CA)及 BLR(DE3)(基因型ΓοπιρΤ hsdSB (rBV) gal dcm(DE3) Δ (srl-recA) 306 =TnlO (TetE))并且通过 SDS-PAGE 分析使用 ImM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)诱导之后蛋白质的过表达。摇瓶中的表达估 计为至少大约250mg/L细胞培养物。细胞类型BL21 (DE3)RIL经过工程改造成表达编码Arg、Ile和Leu的罕见的大肠 杆菌tRNA。进一步地，BL21(DE3)和BLR(DE3) 二者都为大肠杆菌B菌株，基于毒力及定居因 子的缺少，其被分类为对人和动物是非致病性的。BLR(DE3)细胞缺少用于DNA重组的recA 基因，还没有报道用这些细胞进行λ噬菌体的诱导。在Charles River实验室(Malvern， PA)产生了 BLR(DE3)细胞中(TAL6003)-纤溶酶原构建体的研究细胞库，并测试其纯度、同 一性以及噬菌体的诱导。测试证实了研究细胞库的同一性和纯度，这些细胞通过了噬菌体 诱导测试，没有观察到噬菌体(数据未显示)。(TAL6003)-纤溶酶原(即，基于SEQ ID NO 2)的生产在更大规模的表达中得到 证实，其中细胞被裂解，可溶性蛋白质和纯化的包涵体均使用SDS-PAGE检查。以下典型的操作流程用于(TAL6003)-纤溶酶原的表达将包含(TAL6003)-纤溶酶原载体的大肠杆菌细胞(例如，BL21 (DE3) RIL、 BL21 (DE3)或BLR(DE3)的单菌落用于接种5ml的LB/卡那霉素(30 μ g/ml)，并且在37°C在 摇床上培养8小时。此后，从培养的细菌悬浮液中取出50μ 1的等份样品，用于在新鲜培养 基中进一步生长。16小时之后重复以上操作，使用6ml的细菌培养物和250ml的培养基。 培养物在37°C摇动生长，达到0D600nm为 1. 0，加入IPTG至ImM的最终浓度。让培养物 再生长5小时。通过以5，OOOx g离心收获细胞，并且将细胞沉淀物溶解在含有20mM EDTA 的20mMTris pH 8. 0中，并且在_80°C冷冻。为了纯化(TAL6003)-纤溶酶原，将细胞沉淀物解冻，并且添加缓冲液，直到溶液体积约为原始细胞培养物体积的1/20。此后，添加溶菌酶至最终浓度为0. 5mg/ml，并且在 4°C快速搅拌细胞10-15分钟。然后，添加Triton χ-100至1 %的最终浓度，并且再继续搅 拌10分钟。添加DNAse I (0. 05mg/ml)和MgCl2 (2. 5mM)，并且在4°C继续搅拌30分钟，或 直到溶液不再黏稠。最终的溶液在4°C以15，OOOx g离心30分钟，并且丢弃上清液。用洗涤液(50mMTris_HCl，pH 7.4，含有 IOmM EDTA、1 % Triton-X-100 和 0· 5M 尿 素)洗涤细胞沉淀物3次，并且将最终的沉淀物溶解在40ml的提取缓冲液(PBS，pH 7. 4，含 有IOmM EDTA、20mM DTT和6M盐酸胍)中，并且在4°C保存过夜。16小时之后，以15，OOOx g 将该溶液离心30分钟以除去固体，并且将上清液缓慢添加到再折叠溶液(50mM Tris-HCl, pH 8. 3，3. 5M 盐酸胍，0. 5M 精氨酸 HC1，IOmM EDTA, 3mM GSH,0. 3mM GSSG)中，同时在 4°C搅 拌。再折叠过程是在大约0. 29g/L的蛋白质浓度下进行的。将再折叠溶液在4°C保持2天不受干扰，然后针对8倍体积的含有IOmM EDTA、 0. 15M NaCl.O. 15M精氨酸-HCl的0. IM Tris-HClpH 8. 0透析8-10小时，经常更换缓冲溶液。然后从透析中取出蛋白质溶液，并且使用AMICON滤膜(膜截留分子量为IOkDa) 浓缩至大约10-20ml，并且针对100倍体积的含有10mMEDTA、0. 15M NaCl的0. IM Tris pH 8.0透析过夜。离心该材料以除去颗粒物，然后通过赖氨酸亲和树脂(赖氨酸-SEPHAR0SE 4B ；Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)。贞 ffi L 0· 2M ε M S fi Sl ( ε ACA)白勺 Tris-缓冲盐水，pH 8. 0从树脂上洗脱(TAL6003)-纤溶酶原。通常，从1升细胞培养物中可以分离出80mg的包涵体，并且在赖氨酸-SEPHAR0SE 层析步骤中可以洗脱40mg。(TAL6003)-纤溶酶原的特性通过对还原的(二硫苏糖醇-处理的)和非还原的蛋白进行SDS-PAGE分析发现， 纯化的(TAL6003)-纤溶酶原表现为在35-40kDa区域中的条带。通过MALDI质谱法测定的 它的分子量为38，140Da，接近预期值。为了测定(TAL6003)-纤溶酶原被链激酶激活的速率，将lmg/ml重组 (TAL6003)-纤溶酶原与链激酶以1 100(TAL6003)_纤溶酶原比链激酶的比率混合并在室 温PH 7温育。在多个时间点取出样品并以SDS-Page缓冲液淬灭，在还原型SDS-PAGE上分 析，随后用密度计量学方法确定单链(TAL6003)-纤溶酶原分子向双链(TAL6003)-纤溶酶 分子的转换。根据SDS-PAGE确定全长的(TAL6003)-纤溶酶原随着时间的消失，以此作为 链激酶激活(TAL6003)-纤溶酶原的百分率，结果显示于图6。为了证实三环1的功能性，我们测定了 TAL6003-纤溶酶原与赖氨酸-SEPHAR0SE 4B的结合。如图7所示，(TAL6003)-纤溶酶原结合于赖氨酸-SEPHAR0SE并可以使用 0-20mM ε ACA梯度从柱子上将其洗脱在大约4mM时为单峰。重折叠的(TAL6003)-纤溶酶 原结合赖氨酸-SEPHAR0SE的能力表示分子的三环域被恰当折叠且赖氨酸-结合位点完全 有活性。为了进一步证实三环1的功能，通过监测蛋白荧光的相关变化测定eACA与 (TAL6003)-纤溶酶原的结合，如 Matsuka 等人，Eur. J. Biochem. 190 93~97 (1990))和 Douglas 等人 J.，Biochemistry 41 =3302-3310(2002)所述(皆通过引用并入本文)。ε ACA 与(TAL6003)-纤溶酶原的三环1的结合导致荧光的减弱，这可能是由于色氨酸残基(其是
19赖氨酸_结合位点的一部分)的淬灭。为了监测这一过程，将4μ 1至16μ 1的ε ACA浓缩溶液的等份样品添加到2ml 的溶解在含有20mM NaCl的50mM Tri s缓冲液中的5 μ M (TAL6003)-纤溶酶原中(ρΗ 8. 0,25°C )。在298nm的激发波长和340nm的发射波长下以FLU0R0MAX荧光分光光度计 (JobinYvon, Inc.，Edison, NJ)监测荧光；在每次添加ε ACA之后，让溶液平衡直至观察不 到荧光的进一步变化。将所得到的荧光值根据稀释度进行校正，并且对于^ACA的浓度(范围是 0-50uMeACA)作图。通过非线性回归拟合数据，获得大约19 μ M的Kd。纤溶酶的一个特性是它结合纤维蛋白的能力。为了确定(TAL6003)-纤溶酶原是 否保留了与纤维蛋白相互作用的能力，通过微量滴定板测定测试了它的纤维蛋白结合特 性，其中，(TAL6003)-纤溶酶原与纤维蛋白的结合是通过随后tPA对它的激活和所形成的 凝块溶解来评估的。为此目的，在微量滴定板的每一个孔中使用凝血酶将100μ 1的5mg/ml 纤维蛋白原聚合化。将各种浓度的(TAL6003)-纤溶酶原添加到纤维蛋白凝块的顶部，并且 在37°C温育1小时。用PBS充分洗涤平板，同时纤维蛋白凝块仍然保持完整并且附着于孔。 在洗涤之后，将0. lmg/ml tPA溶液添加到每一个孔中，并且在37°C温育平板2小时。结果 是，某些凝块被完全溶解，某些被部分溶解，同时具有极少量(TAL6003)-纤溶酶原的孔和 对照孔几乎保持完整。将原始凝块的残余物在IM NaOH中重构并在280nm测定其吸光度， 以此来监测纤维蛋白溶解的程度。将吸光度值作为(TAL6003)-纤溶酶原浓度的函数形式 作图。如图8所示，(TAL6003)-纤溶酶原与纤维蛋白的结合遵循典型的S形结合曲线。通 过这种测定，发现(TAL6003)-纤溶酶原和纤维蛋白结合的亲和力与全长纤溶酶原的亲和 力相当，并且该相互作用的C5tl( 0. 3μΜ)与全长纤溶酶原和纤维蛋白结合的Kd相当。这些实验表明(TAL6003)-纤溶酶原能够结合纤维蛋白。进一步地，至少 (TAL6003)-纤溶酶原与赖氨酸-Sijpharose的相互作用，其以预期的Kd与ε ACA结合的能 力，其结合纤维蛋白的能力，以及其能被纤溶酶原激活剂激活的能力均表明该分子在大肠 杆菌系统中是以完全功能性的形式生产的。(TAL6003)-纤溶酶的纯化和制剂将SK添加到纯化的(TAL6003)-纤溶酶原溶液中实现了(TAL6003)-纤溶酶原向 (TAL6003)-纤溶酶的转化。蛋白质被浓缩到2mg/ml并以50%甘油1 1稀释以产生25% 甘油中lmg/ml的溶液。将溶液置于室温，并以SK (TAL6003)-纤溶酶原为1 100的摩 尔比添加链激酶。反应在室温温育4. 5小时，不搅拌。然后通过添加NaCl至0. 5M终浓度 而减慢反应。通过SDS-PAGE对激活进行分析表明激活蛋白有90%的产率。通过苯甲脒亲和色谱纯化激活的(TAL6003)-纤溶酶。苯甲脒亲和色谱纯化的 目的是分离未激活(TAL6003)-纤溶酶原与杂质，包括来自活性(TAL6003)-纤溶酶的 (TAL6003)-纤溶酶降解产物。将SK激活溶液应用于经平衡的苯甲脒-SEPHAR0SE 4 Fast Flow柱。截短的和完整的(TAL6003)-纤溶酶均被亲和树脂捕获，而之前提到的杂质流过柱 子。用平衡缓冲液洗涤柱子直至280nm处的吸光度达到基线。然后使用低ρΗ的ε ACA步 骤洗脱结合的(TAL6003)-纤溶酶以从柱子上除去所有残余蛋白质。一般产率为75%，其中 蛋白质有95 %是活性的，如显色纤溶酶效力测定所测。因为(TAL6003)-纤溶酶与全长纤溶酶类似，易于在生理ρΗ下自发降解，所以选择PH 3. 6用于最终制剂(以醋酸盐水进行酸化)。如Novokhatny等人，J Thromb Haemost.， 1(5) :1034-41(2003)(其通过引用并入本文)之前针对纤溶酶指出的，以及(TAL6003)-纤 溶酶的实验证实的，这种低缓冲能力、低PH的制剂不仅使活性纤溶酶能够安全储存延长的 时间段，还与这些直接溶解血栓剂的非肠道施用是相容的。当与血浆或中性PH缓冲液混合 时，(TAL6003)-纤溶酶被迅速重新激活。(TAL6003)-纤溶酶的酶特性利用纤溶酶底物D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺(S-2251) (DiaPharma, West Chester, OH)检验(TAL6003)-纤溶酶的酰胺裂解活性。对于(TAL6003)-纤溶酶，在pH 7. 4，25°C在PBS缓冲液中，发现其对于S-2251的 Michaelis-Menten常数(Km)也为141 μ M(表3)。发现制备物的kcat为大约7251^1^。 通过4-硝基苯基4-胍基苯甲酸酯盐酸盐(pNPGB)滴定(Chase，Τ.和Ε. Shaw，Methods Enzymol. 197 :20_27 (1970))，发现功能性活性位点的百分比为67%。针对百分比活性位点 校正kcat，确定kcat为大约ΤΖδπ ιΓ1。该值非常接近用相同方法测定的全长纤溶酶的值， SZCH/jSmirr1，和微-纤溶酶(缺少所有五个三环)的值，ΤΟδ+ΛΖ^ ιΤ1。这些数据表明， 三环的存在或缺乏不会影响丝氨酸蛋白酶结构域的催化活性。表3 在25°C pH 7. 4的PBS缓冲液中，多种纤溶酶种类与底物S-2251的稳态动力 学参数 使用Wiman 禾口 Collen 的方法(Wiman，B.禾口 D. ColIen，Eur. J. Biochem. 84 573-578(1978))测定α 2-抗纤溶酶对(TAL6003)-纤溶酶的抑制速率为 1. 8士0. OexlO7M-1S-1,其中将纤溶酶和α 2-抗纤溶酶混合，然后在特定时间点分析S-2251 活性(表4)。该值与所报道的纤溶酶的值2. SxlO7M-1S-1 (来自Anonick等，Thrombosis Res. 59 449 (1990))相当。表4在22°C pH 7. 4的PBS缓冲液中测定各种纤溶酶种类和抑制剂的抑制速率。
对微-纤溶酶进行的相同的实验显示α 2-抗纤溶酶在两个单独的实验中抑制速 率为1. SxlO5M-1S-1和3. IxlO5M-1S-10 α 2-抗纤溶酶抑制小-纤溶酶(小-纤溶酶结构域成 分，K5-SP)的速率确定为ZjxIO5M4iT1tj这些数据与微-和小-纤溶酶的文献值具有合理 的一致性，且显示(TAL6003)-纤溶酶被Ci2-抗纤溶酶抑制的速率比微-纤溶酶或小-纤 溶酶的抑制速率快40倍。因此，这些数据表明(TAL6003)-纤溶酶应当是由于其结构中存 在三环1而被α2-抗纤溶酶迅速抑制。总体上，本部分的数据显示(TAL6003)-纤溶酶的 酶特性及抑制特性与全长纤溶酶是类似的。文献值取自Anonick等人，Thrombosis Res. 59 449 (1990)。所有速率均根据 Anonick等人发表的方法测量。体外纤维蛋白溶解效力使用以下实验操作流程，在凝块裂解测定的体外模型上测试了(TAL6003)-纤溶 酶的纤维蛋白溶解效力。将(TAL6003)-纤溶酶与血浆衍生的纤溶酶的血栓溶解效力进行体外比较。将等 摩尔量的血浆衍生纤溶酶(0. 25mg/ml)与(TAL6003)-纤溶酶(0. llmg/ml)在试管中与血 凝块混合，通过凝块中释放的材料的A280吸光度监测凝块裂解的程度。在纤维蛋白和起始血块裂解存在时克服血浆抑制剂所需的纤溶酶或 (TAL6003)-纤溶酶浓度显示于图9。
2权利要求
多聚核苷酸，其包含编码如下多肽的核苷酸序列，该多肽具有a)与天然人纤溶酶原的三环域同源的单个N 末端三环域，其中三环域内最后四个氨基酸残基为V、P、Q和C；和b)与人纤溶酶原中对应结构域同源的C 末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域；其中多肽结合于固定化的赖氨酸。
2.权利要求1的多聚核苷酸，其中单个N-末端三环域与天然人纤溶酶原的三环1或三 环4同源。
3.权利要求1的多聚核苷酸，其中编码的多肽与SEQID NO :2所示序列具有至少90% 或95%，或98%的同一性。
4.权利要求1的多聚核苷酸，其中编码的多肽与SEQID NO :2所示序列具有至少98% 的同一性。
5.权利要求1的多聚核苷酸，其中编码的多肽是SEQID NO :2所示序列。
6.权利要求1的多聚核苷酸，其中多聚核苷酸的核苷酸序列是SEQID NO :1所示序列 或其简并变体。
7.权利要求1的多聚核苷酸，其中单个N-末端三环域与天然人纤溶酶原的三环1或三 环4结构域具有至少90%的同一性；并且C-末端结构域与人纤溶酶原的激活位点及丝氨 酸蛋白酶结构域具有至少90%的同一性。
8.权利要求1的多聚核苷酸，其中固定化的赖氨酸是结合于固体支持基质的赖氨酸， 所述基质选自赖氨酸_琼脂糖、赖氨酸水凝胶、赖氨酸_交联琼脂糖。
9.权利要求8的多聚核苷酸，其中固定化的赖氨酸是赖氨酸-交联琼脂糖。
10.权利要求1的多聚核苷酸，其中多肽显示出比与小-纤溶酶的纤维蛋白原的结合亲 和力低的与纤维蛋白原的结合亲和力.
11.权利要求1的多聚核苷酸，其中多肽显示出比与小-纤溶酶的部分切割纤维蛋白的 结合亲和力高的与部分切割纤维蛋白的结合亲和力。
12.权利要求1的多聚核苷酸，其中多肽比参考多肽具有降低的免疫原性，其中参考多 肽的一级氨基酸序列与所述多肽的一级氨基酸序列相同，条件是参考多肽的单个N-末端 三环域的最后四个氨基酸残基不是V、P、Q和C。
13.多肽，其包含a)与天然人纤溶酶原的三环域同源的单个N-末端三环域，其中三环域内最后四个氨 基酸残基为V、P、Q和C;和b)与人纤溶酶原中对应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构 域；其中多肽结合于固定化的赖氨酸。
14.权利要求13的多肽，其中单个N-末端三环域与天然人纤溶酶原的三环1或三环4 同源。
15.权利要求13的多肽，其中多肽显示出纤维蛋白溶解活性，其被Ci2-抗纤溶酶抑制， 抑制速率是至少大约5倍快于α 2-抗纤溶酶对小_纤溶酶抑制纤维蛋白溶解活性的抑制 速率。
16.权利要求15的多肽，其中抑制速率是至少大约10-倍、20-倍、30-倍或40-倍快于 小-纤溶酶的抑制速率。
17.权利要求13的多肽，其中多肽与SEQID NO :2所示序列具有至少90%或95%，或 98%的同一性。
18.权利要求13的多肽，其中单个N-末端三环域与天然人纤溶酶原的三环1或三环4 结构域具有至少90%的同一性；并且C-末端结构域与人纤溶酶原的激活位点及丝氨酸蛋 白酶结构域具有至少90%的同一性。
19.权利要求13的多肽，其中单个N-末端三环域与天然人纤溶酶原的三环1或三环 4的氨基酸序列同一性，比与天然人纤溶酶原的三环5的氨基酸序列同一性多至少一个残 基；并且其中就与三环5进行同一性比较的目的而言，单个N-末端三环域相对于人纤溶酶 原的三环1和三环4的天然序列的保守取代不被认为与天然序列不同。
20.权利要求13的多肽，其中多肽具有SEQID NO :2所示氨基酸序列及其保守取代物。
21.权利要求13的多肽，其中多肽在类似于SEQID NO :2所示氨基酸序列的位置85的 相对位置上有精氨酸残基。
22.权利要求13的多肽，其中多肽比参考多肽具有降低的免疫原性，其中参考多肽一 级氨基酸序列与所述多肽的一级氨基酸序列相同，条件是参考多肽单个N-末端三环域的 最后四个氨基酸残基不是V、P、Q和C。
23.表达载体，其包含权利要求1的多聚核苷酸。
24.培养的细胞，其包含权利要求23的表达载体。
25.用于制备一种或多种具有不同N-末端的重组纤溶酶多肽的方法，所述方法包括a)提供多肽，其具有与天然人纤溶酶原的三环域同源的单个N-末端三环域，其中三环 域内最后四个氨基酸残基为V、P、Q和C ；以及与人纤溶酶原中对应结构域同源的C-末端结 构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域；其中多肽结合于固定化的赖氨酸；b)将步骤a)中提供的多肽在足以切割一个或多个肽键的条件下与蛋白酶接触，从而 形成一种或多种具有不同N-末端的重组纤溶酶多肽。
26.权利要求25的方法，其中多肽具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列。
27.权利要求25的方法，其中提供包括在大肠杆菌中表达SEQIDNO :1所示的DNA序 列或其简并变体。
全文摘要
本发明提供了涉及重组修饰的纤溶酶(原)分子的多聚核苷酸和多肽。纤溶酶(原)分子具有位于天然人纤溶酶原分子中的激活位点N-末端的单个三环域，其如此组合使得不存在外来序列，并显示赖氨酸-结合以及与天然酶相关的显著的酶特征。
文档编号C12N15/09GK101918548SQ200880123270
公开日2010年12月15日 申请日期2008年11月25日 优先权日2007年11月29日
发明者V·诺沃克哈特尼 申请人:泰勒克里斯生物治疗学公司