降低鞣质对酶促水解纤维素材料的抑制作用的方法

专利名称：：降低鞣质对酶促水解纤维素材料的抑制作用的方法
技术领域：
：本发明涉及降低鞣质对纤维素分解酶组合物的抑制以促进将纤维素材料水解为可发酵糖的方法。相关技术的说明生产乙醇和其它化学品的生物质原料在组成上是复杂的，包括纤维素、半纤维素、木质素和其它组分。所述其它组分包含鞣质(tannins)。鞣质通常分为两组可水解的鞣质和缩合鞣质。可水解的鞣质(也称鞣酸(tannicacid)或没食子鞣质(gallotarmins))由葡萄糖或其它多元醇的多没食子酰基(poly-galloyl)或逆没食子酰基(ellagoyl)酯制_☆革Μ(也禾尔原素(proanthocyanidins)、^Sfe^Sfe素(Ieucoanthocyanidins)、pycnogenols或寡聚原花色素复合物(oligomericproanthocyanidincomplex,0PC))由」匕茶素(catechin)、表儿茶素(印icatechin)、黄酮醇(flavonol)或其它类黄酮的寡聚/多聚化衍生物制得。据报道，鞣质能与蛋白质形成可溶的或不溶的复合物(Zanobini等，1967，Experientia231015-1016；Oh等，1980，J.Agric.FoodChem.28:394_398)。当复合的蛋白质是酶时，鞣质-蛋白质相互作用能导致酶活的丧失。Griffiths和Jones，1977，J.Sci.FoodAgric.28:983_989；Griffiths,1981，J.Sci.FoodAgric.32797-804和Kumar，1992，BasicLifesci.59:699_704描述了鞣质对瘤胃(细菌)纤维素酶的抑制。本发明涉及降低鞣质对酶促水解纤维素材料的抑制作用的方法。
发明内容本发明涉及产生鞣质减少的纤维素材料(acellulosicmaterialreducedinatannin)的方法，包括用有效量的鞣酸酶(tarmase)处理纤维素材料以降低鞣质对酶促糖化纤维素材料的抑制作用。本发明还涉及糖化纤维素材料的方法，其包括用有效量的鞣酸酶和有效量的纤维素分解酶组合物处理纤维素材料，其中用鞣酸酶处理纤维素材料降低了鞣质对于用纤维素分解酶组合物酶促糖化纤维素材料的抑制作用。本发明还涉及产生发酵产物的方法，其包括(a)用有效量的纤维素分解酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)的经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)回收发酵产物，其中用有效量的鞣酸酶处理纤维素材料以降低鞣质对酶促糖化纤维素材料的抑制作用。附图简述图1显示pAlLo27的限制图谱。图2显示pMJ04的限制图谱。图3显示pCaHj527的限制图谱。图4显示pMT2188的限制图谱。图5显示pCaHj568的限制图谱。图6显示pMJ05的限制图谱。图7显示pSMail30的限制图谱。图8显示米曲霉β-葡糖苷酶天然信号序列的DNA序列和推导的氨基酸序列(SEQIDNO105和106)。图9显示特异腐质霉(Humicolainsolens)内切葡聚糖酶V信号序列的DNA序列及推导的氨基酸序列(SEQIDN0:109禾口110)图10显示pSMail35的限制图谱。图11显示pSMail40的限制图谱。图12显示pSaMe-Fl的限制图谱。图13显示pSaMe-FX的限制图谱。图14显示pAlLo47的限制图谱。图15显示pSaMe-FH的限制图谱。图16A和16B显示鞣酸、鞣花酸(ellagicacid)、表儿茶素、4_羟基_2_甲基苯甲酸、香草醛(vanillin)、松柏醇(coniferylalcohol)、松柏醛(coniferylaldehyde)、阿魏酸(ferulicacid)和丁香醛(syringaldehyde)(每种ImM)的混合物对于通过纤维素分解酶组合物#1(A)或纤维素分解酶组合物#2(B)在4或5天中(0Ver40r5dayS)水解PCS的作用。所述水解反应以43gPCS和0.25g纤维素分解酶组合物#1或纤维素分解酶组合物#2每升50mM乙酸钠，pH5在50°C进行。图17A、17B和17C显示鞣酸、4_羟基_2_甲基苯甲酸、香草醛、松柏醇、松柏醛、阿魏酸、丁香醛、鞣花酸或表儿茶素(每种ImM)对于通过纤维素分解酶组合物#1(A和C)或纤维素分解酶组合物#2(B)在4或5天中水解PCS的作用。所述水解反应以43gPCS和0.25g纤维素分解酶组合物#1或纤维素分解酶组合物#2每升50mM乙酸钠，pH5在50°C进行。图18A和18B显示OPC(IOmM)或黄酮醇(ImM)对于通过纤维素分解酶组合物#1(A)或纤维素分解酶组合物#2(B)在4天中水解PCS的作用。所述水解反应以43gPCS和0.25g纤维素分解酶组合物#1或纤维素分解酶组合物#2每升50mM乙酸钠，pH5在50°C进行。图19A、19B、19C和19D显示鞣酸(A和B)或OPC(C^PD)对于通过纤维素分解酶组合物#1水解AVICEL的有效抑制浓度范围。鞣酸的浓度范围是o.05mM至ImM(A和B)，而0PC(以等同于黄烷酮的亚基形式(inflavanone-equivalentsubunits))的浓度范围是ImM至IOmM(C和D)。水解反应以23gAVICEL和0.25g纤维素分解酶组合物#1每升50mM乙酸钠，pH5在50°C进行。迪克逊作图(Dixonplot)=(B)对于鞣酸，线性回归线1/速率=(0.356士0.033)[鞣酸]+(0.045士0.017)，r2=0.975；(D)对于0PC，线性回归线1/速率=(0.0070士0.0007)+(0.056士0.004),r2=0.972。速率从0和6小时时的水解差异(％)估算。图20A、20B、20C和20D显示鞣酸或OPC对于通过纤维素分解酶组合物#2水解PCS的有效抑制浓度范围。鞣酸的浓度范围是0.ImM至ImM(A和B)，而OPC的浓度范围是0.ImM至IOmM(C和D)。所述水解反应以43gPCS和0.25g纤维素分解酶组合物#2每升50mM乙酸钠pH5在50°C进行。迪克逊作图(B)对于鞣酸，线性回归线1/速率=(0.098士0.009)[鞣酸]+(0.018士0.005)，r2=0.983)；(D)对于0PC，线性回归线1/速率=(0.0077士0.0004)+(0.023士0.002),r2=0.996)；速率从0和5小时时的水解差异(％)估算。图2认、2让、21(和210显示11111鞣酸对于里氏木霉CEL7A纤维二糖水解酶I(CBHI)(A)、里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶II(CBHII)⑶、里氏木霉CEL7B内切葡聚糖酶I(EGI)(C)和里氏木霉CEL5A内切葡聚糖酶II(EGII)⑶在4小时中水解PASC的作用。所述水解反应以2gPASC和40mg酶每升50mM乙酸钠pH5在50°C进行。图22A和22B显示ImM鞣酸对于里氏木霉CEL7B内切葡聚糖酶I(EGI)(A)和里氏木霉CEL5A内切葡聚糖酶II(EGII)(B)在4小时中水解羧甲基纤维素的抑制。所述水解反应以IOgCMC和20mgCEL7BEGI或10mgCEL5AEGII每升50mM乙酸钠pH5在50°C进行。图23显示ImM鞣酸对于米曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶在4小时中水解纤维二糖的作用。所述水解反应以2g纤维二糖和Imgβ-葡糖苷酶每升50mM乙酸钠pH5在50°C进行。图24A和24B显示在ImM鞣酸(A)和IOmMOPC(B)存在时米曲霉鞣酸酶对于通过纤维素酶组合物#2在4小时中水解PCS的作用。所述水解反应以43gPCS、25mg鞣酸酶和0.25g纤维素分解酶组合物#2每升50mM乙酸钠pH5在50°C进行。图25显示在鞣酸存在时米曲霉鞣酸酶对于通过纤维素酶组合物#1水解PCS的作用。水解反应以43.4gPCS和0.25g纤维素分解酶组合物#1每升50mM乙酸钠pH5在50°C进行多至4天。水解曲线(profiles)。标志(ο)无鞣酸，无鞣酸酶，(A)ImM鞣酸，(X)ImM鞣酸，每升12.5mg鞣酸酶，(+)ImM鞣酸，25mg/L鞣酸酶，(-)ImM鞣酸，每升50mg鞣酸酶。定义鞣质术语“鞣质”在本文定义为M,500-20，000的化合物，包括足够多数量的酚羟基(每MrIOO约2个基团)从而与大分子(例如蛋白质、纤维素和/或果胶，以及生物碱)形成交联或其它相互作用。鞣质有两类可水解的鞣质和缩合鞣质。在一个方面，所述鞣质是可水解的鞣质、缩合鞣质或其组合。可水解的鞣质术语“可水解的鞣质”在本文定义为能够水解为葡萄糖(或另一种多羟基醇)和没食子酸(没食子丹宁)或鞣花酸(鞣花丹宁)的鞣质。最简单的已知没食子丹宁是1-0-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖。与此相对，没食子丹宁(鞣酸)包含多至10个没食子酰基(galloylgroup)。鞣花丹宁是六羟基联苯甲酸的衍生物，其在水解过程中与鞣花酸内酯化。最简单的已知鞣花丹宁是鞣料云实素(corilagin)。缩合鞣质术语“缩合鞣质”在本文定义为多聚物，其中单体单元是含酚的类黄酮，通常是黄酮醇，并且其中类黄酮单体通过4:8(C-C)键连接。缩合鞣质也称为原花色素、无色花色素、pycnogenols或寡聚原花色素复合物(OPC)。鞣酸术语“鞣酸”在本文定义为没食子丹宁，其包含多至10个没食子酰基。没食子酸术语“没食子酸”在本文定义为3，4，5-三羟基苯甲酸。没食子酸的盐和酯称为没食子酸盐(gallate)。寡聚原花色素复合物(OPC)术语“寡聚原花色素复合物”在本文定义为一类类黄酮复合物。鞣酸酶术语“鞣酸酶”在本文定义为催化鞣质(例如没食子丹宁)水解为酚酸和碳水化合物(例如没食子酸和葡萄糖)的鞣质酰基水解酶(EC3.1.1.20)(参见Schomburg和Schomburg，2003，SpringerHandbookofEnzymes，Springer，187—190页)。鞋酸醇可以通过在特定的PH和温度条件下跟踪检测来自甲基没食子酸盐(一种没食子丹宁(鞣酸)的替代底物)的没食子酸来进行测定。一个单位(U)的鞣酸酶活性等于在特定的pH和温度(V)下每分钟能释放1微摩尔没食子酸的酶量。例如，将在50mM柠檬酸钠pH5中含有鞣酸酶和5mM甲基没食子酸盐的0.5ml反应溶液在30°C温育5分钟。然后加入0.3ml溶于甲醇的0.667%(w/v)罗丹宁(rhodanine)，并将混合物在30°C温育5分钟。然后加入0.2ml0.5M的Κ0Η，并将混合物在30°C温育2.5分钟。最后，加入4ml水，并将混合物在30°C温育10分钟，记录520nm处的吸光度。将缺少鞣酸酶、甲基没食子酸盐或罗丹宁任一种的混合物作为对照。使用没食子酸作为校准标准。鞣酸酶的比活性以在PH5和30°C条件下每分钟每mg鞣酸酶产生的没食子酸的微摩尔数为单位表示。参见Sharma等，1999，WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology15(6)，673—677。纤维素分解活性(cellulolyticactivity)术语“纤维素分解活性”在本文中定义为水解含纤维素材料的生物活性。纤维素分解蛋白质可水解滤纸(filterpaper，FP)，从而降低不溶性纸的质量并增加可溶性糖的量。该反应可通过检测与邻-羟基苯甲酸酰胼形成有色产物的还原糖而测定，测定为滤纸测试单位(FilterPaperAssayUnit，FPU)。纤维素分解蛋白质可水解微晶纤维素或其它纤维素物质，从而降低不溶纤维素的质量并增加可溶性糖的量。该反应可通过用邻-羟基苯甲酸酰胼检测还原糖、高效液相层析(HPLC)或者电化学糖检测器(electrochemicalsugardetector)来测定。纤维素分解蛋白质可以水解可溶的、生色的、有荧光的或其它类似的糖苷物质，从而增加发色的、发荧光的或其它可物理检测的产物的量。所述反应可用分光光度计、荧光计或其它仪器监测。纤维素分解蛋白质可水解羧甲基纤维素(CMC)，从而降低温育混合物的粘度。由此造成的粘度下降可以用振动粘度计(例如Sofraser,France产的MIVI3000)来测定。纤维素酶活性(以纤维素粘度单位(CellulaseViscosityUnit,CEVU)作为量度)测定是通过测量样品降低羧甲基纤维素(CMC)溶液粘度的能力来确定样品中催化活性的量。测定在适合纤维素分解蛋白和底物的温度和PH进行。例如，对CELLUCLAST(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)来说，测定是在40°C在0.IM磷酸盐pH9.O缓冲液中进行30分钟，CMC作为底物(33.3g/升羧甲基纤维素Hercules7LFD)而酶浓度为约3.3-4.2CEVU/ml。CEVU活性是通过相对于已知的酶标准，例如CELLUZYMEStandardl7_1194(得自NovozymesA/S，Bagsvaerd，Denmark)而计算的。就本发明而言，纤维素分解活性是通过测量在下述条件下纤维素分解酶组合物对纤维素材料的水解与不加纤维素分解蛋白质的对照水解相比的增加来确定的=I-IOmg纤维素分解蛋白质/gPCS中的纤维素，历时5-7天，50°C。内切葡聚糖酶术语“内切葡聚糖酶”在本文中定义为一种内切-1，4-(1，3;1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(Ε.C.No.3.2.1.4),其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷键；混合型β-1，3葡聚糖如谷类(cereal)β-D-葡聚糖或木葡聚糖，和其他含纤维素性组分的植物材料中的β_1，4键的内水解(endohydrolysis)。就本发明而言，内切葡聚糖酶活性是根据Ghose，1987，PureandApp1.Chem.59:257_268所述的方法利用羧甲基纤维素(CMC)水解来确定的。纤维二糖水解酶术语“纤维二糖水解酶”在本文中定义为一种1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中1，4-β-D-葡糖苷键的水解，从链的还原性或非还原性末端释放纤维二糖。就本发明而言，纤维二糖水解酶活性是依照Lever等，1972,Anal.Biochem.47:273_279禾口vanTilbeurgh等，1982，FEBSLetters149152-156；vanTilbeurgh禾口Claeyssens，1985，FEBSLetters187:283_288中描述的方法测定的。β-葡糖苷酶术语“β-葡糖苷酶”在本文中定义为一种β-D-葡糖苷葡糖水解酶(Ε.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶活性是根据Venturi等，2002，J.BasicMicrobiol.42:55_66所述的方法来测定的。一个单位的葡糖苷酶活性定义为在IOOmM柠檬酸钠、0.01%TWEEN20中，在50°C、pH5条件下每分钟从作为底物的4mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷产生1.0微摩尔对硝基苯酚。纤维素分解增强活性术语“纤维素分解增强活性”在本文中定义为增强具有纤维素分解活性的蛋白质对纤维素材料的水解的GH61多肽的生物学活性。就本发明而言，纤维素分解增强活性是通过测量纤维素分解蛋白质在下述条件下水解纤维素材料所致的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来加以确定的l_50mg总蛋白/gPCS中的纤维素，其中总蛋白由80-99.5%w/w的纤维素分解蛋白质/gPCS中的纤维素，及0.5-20%w/w的具有纤维素分解增强活性的蛋白质，在50°C历时1-7天，与用相等的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(l-50mg纤维素分解蛋白质/gPCS中的纤维素)所进行的对照水解相比。具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过如下增强由具有纤维素分解活性的蛋白质所催化的纤维素材料的水解将为达到同样水解程度所需的纤维素分解酶的量减少优选至少0.1倍，更优选至少0.2倍、更优选至少0.3倍、更优选至少0.4倍、更优选至少0.5倍、更优选至少1倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至少5倍、更优选至少10倍、更优选至少20倍、进一步更优选至少30倍、最优选至少50倍、进一步最优选至少100倍。家族61糖苷水解酶术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”在本文中定义为根据HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309_316以及HenrissatB.禾口BairochΑ.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696落入糖苷水解酶家族61的多肽。目前，Henrissat将GH61家族归于未分类之列，表明该家族所属的多肽的性质如机制、催化性亲核体/基体(base)、催化性质子供体以及3D结构是未知的。纤维素材料生物质的初生细胞壁中主要的多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，第三是果胶。在细胞停止生长后产生的次生细胞壁也含有多糖，并且被与半纤维素共价交联的多聚木质素增强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是一种直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基的复杂的分枝结构中的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖。虽然纤维素一般是无定形的，但纤维素在植物组织中主要作为平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常通过氢键连接于纤维素以及其他半纤维素上，这有助于细胞壁基质的稳定化。纤维素材料可以是任何含有纤维素的材料。纤维素通常存在于例如植物的茎、叶、果/种壳(hulls)、果/种皮(husks)和穗轴(cobs)，或者树的叶、枝、和木材中。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料(herbaceousmaterial)、农业残余物(agriculturalresidues)、林业残余物(forestryresidues)、城市固体废物(municipalsolidwastes)、废纸(wastepaper)，以及纸浆和造纸厂残余物(pulpandpapermillresidues)。纤维素材料可以是任何类型的生物质，包括但不限于木材资源、城市固体废物、废纸、作物和作物残余物(参见例如Wiselogel等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesΕ.Wyman编)，%105-118]λ,Taylor&Francis,WashingtonD.C.；ffyman,1994,BioresourceTechnology50:3_16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695_719；Mosier等，1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主编，第65卷，第23-40页，Springer-Verlag,NewYork)。在本文中应当理解的是，纤维素可以是木质纤维素的形式、在混合的基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个方面，所述纤维素材料是草本材料。在另一个方面，所述纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，所述纤维素材料是林业残余物。在另一个方面，所述纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，所述纤维素材料是废纸。在另一个方面，所述纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，所述纤维素材料是玉米秸秆。在另一个优选的方面，所述纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，所述纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，所述纤维素材料是橘皮。在另一个方面，所述纤维素材料是稻草。在另一个方面，所述纤维素材料是麦秆。在另一个方面，所述纤维素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一个方面，所述纤维素材料是芒属(miscanthus)。在另一个方面，所述纤维素材料是甘蔗渣。纤维素材料可以按原样使用，或者可以使用本领域已知的常规技术对其进行预处理。例如，物理预处理技术可包括各种类型的粉碎(milling)、辐射(irradiation)、汽蒸/蒸汽爆破(steaming/steamexplosion)、禾口水热解(hydrothermolysis)；化学预处理技术可包括稀酸、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳、和PH受控的水热解；而生物预处理技术可涉及应用溶木质素性微生物(参见，例如Hsu，Τ.-Α.，1996，Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.E.编，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh,P.禾口Singh,A.,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.App1.Microbiol.39295-333；McMillan,J.D.，1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass-.areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,Μ.Ε.,Baker,J.0.禾口Overend,R.P.编，ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.禾口Tsao,G.Τ·,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.编，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207_241；Olsson,L.禾口Hahn-Hagerdal,B.,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18312-331；以及Vallander,L.禾口Eriksson,K.-Ε.L.,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.4263-95)。预处理玉米秸秆术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”在本文中定义为通过以热和稀酸处理从玉米秸秆获得的纤维素材料。就本发明而言，PCS是由实施例26所述方法或改变其时间、温度和酸量来制备的。分离的多肽本文所用的术语“分离的多肽”是指从一个来源分离的多肽。在一个优选的方面，所述多肽是如通过SDS-PAGE测定的至少纯、优选至少5%纯、更优选至少10%纯、更优选至少20%纯、更优选至少40%纯、更优选至少60%纯、进一步更优选至少80%纯、最优选至少90%纯的。就本发明而言，应当理解术语“多肽”包括全长多肽、成熟多肽或催化域；或其具有酶活性的部分或片段。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”在本文是指这样的多肽制备物，其含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，进一步更优选至多2%，最优选至多1%，进一步最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的其他多肽物质。因此，优选的是，基本上纯的多肽以制备物中存在的总多肽物质的重量计是至少92%纯、优选至少94%纯、更优选至少95%纯、更优选至少96%纯、更优选至少96%纯、更优选至少97%纯、更优选至少98%纯、进一步更优选至少99%、最优选至少99.5%纯、进一步最优选100%纯的。所述多肽优选是基本上纯的形式，即，多肽制备物基本上不含与其天然地或重组地结合的其他多肽物质。这可以通过例如用公知的重组技术或通过经典的纯化方法制备所述多肽来实现。分离的多核苷酸本文中所用的术语“分离的多核苷酸”是指从一个来源分离而来的多核苷酸。在一个优选的方面，所述多核苷酸为至少纯、优选至少5%纯、更优选至少10%纯、更优选至少20%纯、更优选至少40%纯、更优选至少60%纯、进一步更优选至少80%纯、最优选至少90%纯，如通过琼脂糖电泳测定的。基本上纯的多核苷酸本文中所用的术语“基本上纯的多核苷酸”是指这样的多核苷酸制备物，其不含有其他外源或不需要的核苷酸，并且处于适合在经基因工程改造的蛋白质的生产系统中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，进一步更优选至多2%，最优选至多1%，进一步最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的其他多核苷酸物质。但是，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸按为重量计至少90%纯、优选至少92%纯、更优选至少94%纯、更优选至少95%纯、更优选至少96%纯、更优选至少97%纯、进一步更优选至少98%纯、最优选至少99%纯、进一步最优选至少99.5%纯。所述多核苷酸优选是处于基本上纯的形式，即多核苷酸制备物基本上不含与其天然或重组结合的其他多核苷酸物质。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或者上述来源的任意组合。cDNA:术语“cDNA”在本文中定义为这样的DNA分子，它能够从获自真核细胞的成熟的、经剪接的mRNA分子通过逆转录制备得到。cDNA缺少在对应的基因组DNA中可能存在的内含子序列。最初的初级RNA转录物是mRNA的前体，它经历一系列步骤被加工之后作为成熟的、经剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因此，源自mRNA的cDNA缺少任何内含子序列。核酸构建体术语“核酸构建体”在用于本文时是指这样的单链或双链核酸分子其是从天然存在的基因分离的，或者经过修饰而以原本不会存在于自然界中的方式包含核酸的片段，或者是合成的。当核酸构建体包含编码序列的表达所需的控制序列时，术语“核酸构建体”与术语“表达盒”同义。控制序列术语“控制序列”在本文中定义为包括编码多肽的多核苷酸的表达所必需的所有组件。每个控制序列对于编码多肽的核苷酸序列而言，或者对于其它控制序列而言，可以是天然的或者外来的。这样的控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽(prop印tide)序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。在最低程度上，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。控制序列可以提供有接头，用来引入特异性限制性位点以促进控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区的连接。可操作地连接术语“可操作地连接”在本文中是指这样一种构型，其中控制序列相对于多核苷酸序列的编码序列被置于合适的位置上，使得该控制序列指导多肽编码序列的表达。编码序列当用于本文时，术语“编码序列”是指这样的核苷酸序列，它直接规定其蛋白质产物的氨基酸序列。编码序列的边界一般是由开读框决定的，后者通常以ATG起始密码子或其他可选的起始密码子如GTG及TTG开始，而以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA或重组的核苷酸序列。表达术语“表达”包含多肽产生过程中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体术语“表达载体”在本文中定义为一种线性或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，且可操作地连接于供用于其表达的其他核苷酸。宿主细胞术语“宿主细胞”在用于本文时包括任何易于用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体所转化、转染、转导等的细胞类型。发明详述本发明涉及通过降低鞣质对纤维素分解酶组合物的抑制从而提高将纤维素材料酶促糖化为可发酵糖的效率，随后可发酵糖能够通过发酵转化为期望的发酵产物。从纤维素材料产生期望的发酵产物通常需要三个主要步骤，其包括预处理、酶促水解(糖化)和发酵。优选地对维素材料进行预处理以减小粒度、破坏纤维壁以及暴露纤维素材料的碳水化合物，提高纤维素材料碳水化合物对酶促水解的易感性。但是，预处理也暴露了鞣质，它可以在酶促水解碳水化合物的过程中抑制纤维素分解酶组合物的组分。进一步地，在酶促水解碳水化合物的过程中，更多的抑制性鞣质可以释放出来，其能够进一步抑制纤维素水解组合物。最后，鞣质还可能对发酵微生物具有不利的影响。因此，本发明提高了将纤维素材料酶促糖化为可发酵糖和将糖转化为期望的发酵产物的效率。在一个方面，本发明涉及生产鞣质减少的纤维素材料(acellulosicmaterialreducedinatanin)的方法，包括用有效量的鞣酸酶处理纤维素材料以降低鞣质对酶促糖化纤维素材料的抑制作用。在另一个方面，本发明涉及糖化纤维素材料的方法，包括用有效量的鞣酸酶和有效量的纤维素分解酶组合物处理纤维素材料，其中用鞣酸酶处理纤维素材料降低了鞣质对于用纤维素分解酶组合物酶促糖化纤维素材料的抑制作用。在另一个方面，本发明涉及生产发酵产物的方法，包括(a)用有效量的纤维素分解酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)的经糖化的纤维素材料以生产发酵产物；(c)回收发酵产物，其中用有效量的鞣酸酶处理纤维素材料以降低鞣质对酶促糖化纤维素材料的抑制作用。纤维素材料的加工本发明的方法可以用来将纤维素材料例如木质纤维素糖化成可发酵糖，并将可发酵糖转化为许多有用的物质，例如化学品和燃料。从纤维素材料生产期望的发酵产品通常涉及预处理、酶促水解(糖化)和发酵。本发明的纤维素材料的加工可以使用本领域常规的方法来完成。此外，本发明的方法可以使用任何经配置以依照本发明操作的常规生物质加工装置来实现。单独或同时进行的水解(糖化)和发酵包括，但不限于单独水解和发酵(SHF)；同时糖化和发酵(SSF)；同时糖化和共发酵(SSCF)；混合水解和发酵(hybridhydrolysisandfermentation,HHF)；SHCF(单独水解和共发酵)，HHCF(混合水解和发酵)，及直接微生物转化(DMC)。SHF使用单独工艺步骤，首先将纤维素材料，例如木质纤维素水解为可发酵糖，例如葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和戊糖，然后将可发酵糖发酵为乙醇。在SSF中，纤维素材料，如木质纤维素的酶促水解和糖至乙醇的发酵合并为一个步骤(Philippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology，于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,Wyman,C.E.编，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212)。SSCF涉及多种糖的共发酵(Sheehan，J.和Himmel，Μ.，1999，Enzymes，energyandtheenvironmentAstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy'sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol，Biotechnol·Prog·15:817_827)。HHF包括单独的水解单独步骤，以及同时糖化和水解步骤，其可以在同一个反应器内进行。HHF工艺中的步骤可在不同的温度下进行，即在高温酶促糖化之后以发酵菌株可耐受的低温进行SSF。DMC将所有的三种工艺(酶的生产、木质纤维素的水解和发酵)合并为一个或多个步骤，其中使用同一种生物产生将纤维素物质，如木质纤维素转化为可发酵糖和将可发酵糖转化为最终产物的酶(Lynd,L.R.，ffeimer,P.J.，vanZyl，W.H.和Pretorius,I.S.，2002，Microbialcelluloseutilization!Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。本文中应当理解，本领域中任何包括预处理、酶促水解(糖化)、发酵或它们的组合的方法都可用于实施本发明的方法。常规装置可以包括补料分批搅拌反应器、分批搅拌反应器、带超滤的连续流搅拌反应器、和/或连续活塞流柱反应器(FernandadeCastilhosCorazza,FlavioFariadeMoraes,GisellaMariaZanin和IvoNeitzel,2003,Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33_38；Gusakov,A.V.和Sinitsyn,A.P.,1985,Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.AmathematicalmodelforabatchreactorProcess,Enz.Microb.Technol.7:346_352)、碾磨反应器(Ryu,S.K.和Lee,J.M.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53_65)、或具有电磁场诱发的强烈搅拌的反应器(Gusakov，Α.V.，Sinitsyn,Α.P.，Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,0.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反应器类型包括用于水解和/或发酵的流化床、厌氧污泥床(upflowblanket)、固定化型、以及挤出机型反应器。可以用鞣酸酶在预处理之前、过程中和/或之后，在水解过程中，和/或在发酵过程中处理纤维素材料。在一个优选的方面，预处理之前用鞣酸酶处理纤维素材料。在另一个优选的方面，在预处理过程中用鞣酸酶处理纤维素材料。在另一个优选的方面，在预处理之后用鞣酸酶处理纤维素材料。在另一个优选的方面，在预处理之前、过程中和之后用鞣酸酶处理纤维素材料。在另一个优选的方面，在预处理之前、过程中和之后的两个或多个过程的组合用鞣酸酶处理纤维素材料。在另一个优选的方面，在水解过程中用鞣酸酶处理纤维素材料。在另一个优选的方面，在发酵过程中用鞣酸酶处理纤维素材料。在另一个优选的方面，在预处理之前、过程中和之后，水解过程中，和发酵过程中的任何过程的组合中用鞣酸酶处理纤维素材料。在鞣酸酶处理的过程中，pH范围优选为约2-约11，更优选为约4-约8，最优选为约5-约6。温度范围优选为约20°C-约90°C，更优选为约30°C-约70°C，最优选为约400C-600C。鞣酸酶的剂量范围优选为约0.1-约10，000，更优选为约1_约1000，最优选为约10-约100单位每g干纤维素材料。预处理。在本发明的方法的实施中，本领域已知的任何预处理方法都可以用来破坏植物细胞壁组分。在预处理之前还可以使用本领域已知的方法对纤维素材料，如木质纤维素进行预浸泡、润湿、或调制(conditioning)。常规的预处理包括但不限于蒸汽预处理(有或没有爆破)、稀酸预处理、热水预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆破、氨纤维爆破(ammoniafiberexplosion)、有机溶剂予页处理(organosolvpretreatment)禾口生物预处理。其它预处理包括超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界吐0、和氨渗滤(ammoniapercolation)予页处理。可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解之前进行。或者，预处理可以和水解同时进行，如在用一种或多种纤维素分解酶或其它酶活性，如半纤维素酶处理纤维素材料以释放可发酵糖如葡萄糖和/或麦芽糖的同时进行预处理。在大多数情况下预处理步骤本身会导致一些生物质转化成可发酵糖(即使没有酶存在)。蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，将纤维素材料加热以破坏植物细胞壁组分，包括例如木质素、半纤维素和纤维素，以使得纤维素和其它部分如半纤维素暴露于酶。使纤维素材料通至或通过反应容器，所述容器中喷射蒸汽以升温到需要的温度和压力，并在其中保持需要的反应时间。蒸汽预处理优选在140-230°C、更优选160-200°C、最优选170-190°C进行，其中最优的温度范围取决于任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选1-15分钟、更优选3-12分钟、最优选4-10分钟，其中最优的停留时间取决于温度范围和任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理容许相对较高的固形物载量，使得纤维素材料在预处理过程中一般仅是轻微潮湿的。蒸汽预处理通常与预处理后对材料的爆破性出料(explosivedischarge)相组合，后者被称为蒸汽爆破(steamexplosion)，即将材料急速瞬时置于大气压和湍流下，以通过碎裂作用增加可接近的表面积(Duff和Murray，1996，BioresourceTechnology8551-33；Galbe禾口Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59618-628；美国专利申请20020164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基被切割而所得酸自催化半纤维素部分水解为单糖和寡糖。仅除去木质素至有限的程度。在蒸汽预处理之前往往添加催化剂如H2SO4或SO2(通常为0.3-3%w/w)，催化剂可减少时间和温度，增加收率，以及改善酶促水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132496-508；Varga^,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116509-523；Sassner等，2006，EnzymeMicrob.Technol.39:756_762)。化学预处理术语“化学预处理”是指任何可促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的化学预处理。合适的化学预处理方法的例子包括，例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆破(AFEX)、氨渗滤(APR)、和有机溶剂预处理。在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸，通常是H2SO4,以及水混合以形成浆液，通过蒸汽加热到希望的温度，然后经过一段停留时间瞬时变化到大气压。稀酸预处理可以用多种反应器设计来实施，例如活塞流反应器、逆流反应器、或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,同上文；Schell等，2004，BioresourceTechnol.91179-188；Lee等，1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93_115)。还可以采用数种碱性条件下的预处理方法。这些碱性预处理包括，但不限于石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆破(AFEX)。石灰预处理用碳酸钙、氢氧化钠或氨在85-150°C的低温进行，停留时间为1小时至数日(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.961959-1966;Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673_686)。WO2006/110891、W02006/11899、WO2006/11900和WO2006/110901公开了使用氨的预处理方法。湿氧化是一种热预处理，通常在180_200°C进行5_15分钟，同时添加氧化剂如过氧化氢或氧过压(Schmidt和Thomsen,1998，BioresourceTechnol.64139-151；Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117:1_17；Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88567-574;Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.811669-1677)。预处理优选在1-40%干物质、更优选2-30%干物质、最优选5-20%干物质的条件下进行，并且经常通过添加碱，如碳酸钠来提高初始PH。湿氧化预处理方法的一种变化形式，称为湿爆破(湿氧化和蒸汽爆破的结合)，可以处理高达30%的干物质。在湿爆破中，在预处理过程中经过一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过瞬间变化到大气压而终止预处理(W02006/032282)。氨纤维爆破(AFEX)涉及用液态或气态的氨在中等温度如90-100°C和高压如17-20巴的条件下处理纤维素材料5-10分钟，其中干物质含量可高达60%(Gollapalli^,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.9823-35；Chundawatφ,2007,Biotechnol.Bioeng.96219-231；Alizadeh^,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.1211133-1141；Teymouri等，2005，BioresourceTechnol.962014-2018)。AFEX预处理导致纤维素的去多聚化和半纤维素的部分水解。木质素_碳水化合物复合物被切割。有机溶剂预处理通过使用乙醇水溶液(40-60%乙醇)在160-200°C提取30_60分钟来使纤维素材料脱木质素(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90:473_481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851_861；Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分的半纤维素被去除。Schell等，2003，Appl.Biochem.andBiotechnol.第105-108卷，第69-85页和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673_686以及美国专利申请公布2002/0164730描述了合适的预处理方法的其他例子。在一个方面，化学预处理优选作为酸处理，更优选作为连续稀酸和/或弱酸(mildacid)处理来实施。所述酸通常是硫酸，但也可以用其它的酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或它们的混合物。弱酸处理在优选1-5，更优选1-4，最优选1-3的PH范围内进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01-20wt%酸，更优选0.05-10wt%酸，进一步更优选0.l_5wt%酸，最优选0.2-2.0wt%酸的范围。将所述酸与纤维素材料接触，并在优选160-200°C，更优选165-195°C的温度范围内保持自若干秒到若干分钟不等的时间，例如1秒至60分钟。在另一个方面，预处理作为氨纤维爆破步骤(AFEX预处理步骤)来实施。在另一个方面，预处理在含水浆料中进行。在一个优选的方面，纤维素材料在预处理过程中以优选10-80wt%，更优选20-70wt%，最优选30-60wt%，如大约50wt%的量存在。经过预处理的纤维素材料可为未洗涤的，或者可以用任何本领域已知的方法洗涤，例如用水洗涤。机械预处理术语“机械预处理”是指各类研磨(grinding)或粉碎(milling)(例如干磨，湿磨或振云力球磨(vibratoryballmilling))。物理预处理术语“物理预处理”是指任何可促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木质纤维素材料分离和/或释放的预处理。例如，物理预处理可涉及辐射(例如微波辐射)、汽蒸/蒸汽爆破、水热解，和它们的组合。物理预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆破)。在一个方面，高压是指在优选约300-约600psi，更优选约350-约550psi，最优选约400-约500psi的范围，如450psi左右。在另一个方面，高温意指约100-约300°C，优选约140-约235°C范围的温度。在一个优选的方面，机械预处理在使用如上定义的高压及高温的分批工艺蒸汽枪水解器系统(batch-Process,steamgunhydrolyzersystem)中，如可获自SundsDefibratorAB,Sweden的SundsHydrolyzer中进行。组合的物理和化学预处理可以既以物理方式又以化学方式处理纤维素材料。例如，预处理步骤可涉及稀酸或弱酸处理以及高温和/或高压处理。根据需要，物理预处理和化学预处理可以顺序地或同时地进行。还可以包含机械预处理。于是，在一个优选的方面，对纤维素材料进行机械、化学、或物理预处理或其任何组合，来促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。生物预处理术语“生物预处理”是指任何可促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木质纤维素材料分离和/或释放的生物预处理。生物预处理技术可涉及施用溶木质素微生物(参见，例如Hsu，Τ.-Α.，1996，Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanol!ProductionandUtilization,ffyman,C.E.编，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh禾口Singh,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39295-333；McMillan,J.D.，1994,PretreatingIignocellulosicbiomass:areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction，Himmel,Μ.E.，Baker，J.0.禾口Overend，R.P.编，ACSSymposiumSeries566，AmericanChemicalSociety,Washington,DC，第15章；Gong,C.S.，Cao,N.J.，Du,J.禾口Tsao，G.Τ.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources，于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.编，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Germany，65:207_241；Olsson禾口Hahn-Hagerdal，1996，Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312_331，及Vallander禾口Eriksson，1990，Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63_95)。ML-在水解步骤(又称糖化)中，经过预处理的纤维素材料被水解以将纤维素或者半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或可溶性寡糖。在一个方面，所述糖选自下组葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖和纤维二糖。水解由纤维素分解酶组合物以酶促方式进行。该组合物中的酶也可以顺序地添加。酶促水解优选在合适的含水环境中于本领域技术人员可容易确定的条件下进行。在一个优选的方面，水解在适合于一种或多种酶的活性的条件，即对一种或多种酶而言最适的条件下进行。水解可以作为补料分批或者连续工艺进行，其中经预处理的纤维素材料(底物)被逐渐添加到例如含酶的水解溶液中。糖化通常在搅拌釜式反应器或发酵罐中在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的过程时间、温度和PH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可持续最多达200小时，但通常进行优选约12到约96小时，更优选约16到约72小时，最优选约24到约48小时。温度范围为优选约25°C-约80°C，更优选约30°C-约70°C，最优选约40°C-60°C。PH范围为优选约3-约8，更优选约3.5-约7，最优选约4-约6，尤其是大约pH5。干固形物含量范围为优选约5-约50wt%，更优选约10-约40wt%，最优选约20-约30wt%。纤维素分解酶组合物优选包括具有内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶活性的酶。在一个优选的方面，纤维素分解酶组合物还包括一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，纤维素分解酶制备物补充有一种或多种选自下组的其它酶活性半纤维素酶、酯酶(如脂肪酶、磷酯酶和/或角质酶)、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶，或其混合物。在本发明的方法中，所述其它酶可以在发酵之前或过程中，包括在繁殖发酵微生物的过程中或之后加入。所述酶可以源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母或哺乳动物来源。术语“获得自(obtainedfrom)”在本文中是指所述酶可以是从天然产生所述酶作为天然酶的生物分离的。术语“获得自”在本文中也指所述酶用本文所述方法在宿主生物体内重组地产生，其中所述重组产生的酶对宿主生物是天然的或外源的，或者具有经过修饰的氨基酸序列，例如具有一个或多个缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组生产的酶是天然氨基酸序列的突变体和/或片段，或者是由本领域公知的核酸改组(shuffling)方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖天然变体，而外源酶的含义中涵盖通过重组，例如定位诱变或改组获得的变体。本发明使用的酶可以是任何适用于本文所述方法的形式，例如含有或不含有细胞的粗发酵液或基本上纯的多肽。所述酶可以是干酚或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定化的液或被保护的酶(protectedenzyme)。颗粒可以如美国专利4，106，991和4，661，452所记载地生产，并可任选地用本领域公知的方法包被/涂覆。液体酶制备物可以例如根据已有方法通过加入稳定剂，如糖、糖醇或另一种多元醇、和/或乳酸或另一种有机酸来稳定化。被保护的酶可以根据EP238，216记载的方法制备。具有纤维素分解增强活性的酶和多肽的最适量取决于数种因素，包括但不限于组分纤维素分解蛋白的混合物，含纤维素底物，含纤维素底物的浓度，含纤维素底物的一种或多种预处理，温度，时间，PH，还包括发酵生物(例如用于同时糖化和发酵的酵母)。在一个优选的方面，一种或多种纤维素分解蛋白对纤维素材料的有效量为约0.5-约50mg，优选约0.5-约40mg，更优选约0.5-约25mg，更优选约0.75-约20mg，更优选约0.75-约15mg，进一步更优选约0.5-约10mg，最优选约2.5-约IOmg每克纤维素材料。在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的一种或多种多肽对纤维素材料的有效量为约0.01-约50.Omg,优选约0.01-约40mg，更优选约0.01-约30mg，更优选约0.01-约20mg,更优选约0.01-约IOmg,更优选约0.01-约5mg,更优选约0.025-约1.5mg，更优选约0.05-约1.25mg,更优选约0.075-约1.25mg,更优选约0.1-约1.25mg,进一步更优选约0.15-约1.25mg，最优选约0.25-约1.Omg每克纤维素材料。在另一个优选的方面，一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽对纤维素分解蛋白的有效量为约0.005-约1.Og,优选约0.01-约1.Og,更优选约0.15-约0.75g，更优选约0.15-约0.5g，更优选约0.1-约0.5g，进一步更优选约0.1-约0.5g，最优选约0.05-约0.2g每克一种或多种纤维素分解蛋白。皿.对于从经过预处理和水解的纤维素材料获得的可发酵糖，可以用一种或多种能够直接或间接将糖发酵为期望的发酵产物的发酵微生物来加以发酵。“发酵”或“发酵方法/工艺”是指任何发酵方法或任何包含发酵步骤的方法。发酵方法还包括食用酒精工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如发酵乳产品)、皮革工业及烟草工业中使用的发酵方法。发酵条件取决于期望的发酵产物及发酵生物，并可以由本领域技术人员容易地予以确定。在发酵步骤中，作为预处理和酶促水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖被发酵生物如酵母发酵成产物，例如乙醇。水解(糖化)和发酵可以分别或同时进行。这样的方法包括，但不限于，分别水解和发酵(SHF)；同时糖化和发酵(SSF)；同时糖化和共发酵(SSCF)；混合水解和发酵(HHF)；SHCF(分别水解和共发酵)；HHCF(混合水解和共发酵)以及直接微生物转化(DMC)。任何合适的经水解的纤维素材料都可以用于本发明实施中的发酵步骤。如本领域中公知的，所述材料的选择通常基于期望的发酵产物，即要通过发酵获得的物质，以及所采用的方法。术语“发酵培养基”在本文中理解为指添加一种或多种发酵微生物之前的培养基，例如由糖化方法得到的培养基，以及在同时糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。“发酵微生物”是指适合在期望的发酵过程中使用来产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物。发酵微生物可以是(6和/或(5发酵生物，或它们的组合。(6和(5发酵生物都是本领域中公知的。合适的发酵微生物能够将糖类，如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖，直接或间接发酵，即转化成期望的发酵产物。一些生物也可以转化可溶性的C6和C5寡聚体。Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627_642记载了产生乙醇的细菌及真菌发酵微生物的例子。能够发酵C6糖的发酵微生物的例子包括细菌和真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种，优选酿酒酵母的菌株。能够发酵C5糖的发酵生物的例子包括细菌和真菌生物，如酵母。优选的发酵C5的酵母包括毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773；假丝酵母属，优选博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、芸苔假丝酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假丝酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candidadiddensii)、假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candidautilis)的菌株。其它发酵生物包括发酵单孢菌属(Zymomonas)如运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的菌株；汉逊酵母属(Hansenula)如异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克鲁维酵母属如脆壁克鲁维酵母(K.fragiliS)的菌株；裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母的菌株；以及大肠杆菌的菌株，尤其是已经过遗传修饰而改善了乙醇产率的大肠杆菌菌株。在一个优选的方面，所述酵母是酵母属的菌种(Saccharomycesspp)。在一个更优选的方面，所述酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是糖化酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一个优选的方面，所述酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选的方面，所述酵母是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)0在另一个更优选的方面，所述酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个优选的方面，所述酵母是假丝酵母属。在另一个更优选的方面，所述酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是芸苔假丝酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，所述酵母是棍孢属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，所述酵母是葡萄牙棍孢(Clavisporalusitaniae)。在另一个更优选的方面，所述酵母是仙人掌棍孢(Clavisporaopuntiae)0在另一个优选的方面，所述酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，所述酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)0在另一个优选的方面，所述酵母是毕赤酵母属。在另一个更优选的方面，所述酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，所述酵母是酒香酵母属(Bretarmomyces)。在另一个更优选的方面，所述酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于Wyman,C.Ε.编，HandbookonBioethanolProductionandUtilization中，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。能够有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，运动发酵单胞菌和热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis，1996，同上文)。在一个优选的方面，所述细菌是发酵单胞菌属。在一个更优选的方面，所述细菌是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，所述细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，所述细菌是热纤维梭菌。适用于乙醇生产的商业上可得到的酵母包括，例如，ETHANOLRED酵母(可获自Fermentis/Lesaffre,USA)、FALI(可获自Fleischmann，sYeast,USA)，SUPERSTART和THERMOSACC鲜酵母(可获自EthanolTechnology,WI,USA),BIOFERMAFT和XR(可获自NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA)、GERTSTRAND(可获自GertStrandAB,Sweden)，以及FERMI0L(可获自DSMSpecialties)。在另一个方面，所述发酵微生物经过了遗传修饰来提供发酵戊糖的能力，例如利用木糖的、利用阿拉伯糖的、以及共利用木糖和阿拉伯糖的微生物。通过克隆异源基因到多种发酵微生物中，已经构建出了能够将己糖和戊糖转化为乙醇(共发酵)的生物(Chen和Ho，1993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,App1.Biochem.Biotechnol.39-40135-147；Ho等，1998,GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffctivelycofermentingSaccharomycescerevisiaeandxylose,Appl.Environ.Microbiol.641852-1859；KotterandCiriacy,1993,XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38776-783；Walfridsson等，1995,Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALlgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.614184-4190；Kuyper等，2004,MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation-.aproofofprinciple,FEMSYeastResearch4655-664；Beall等，1991,ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296_303;Ingram等，1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58:204_214；Zhang等，1995,MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis,Science267240-243；Deanda等，1996,Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisbstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.624465-4470)。在一个优选的方面，所述经过了遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，所述经过了遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，所述经过了遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，所述经过了遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)0本领域公知的是上述生物也可用于生产其它物质，如本文所述。通常将发酵微生物添加到经降解的纤维素材料中，进行约8小时_约96小时，例如约24-约60小时的发酵。温度通常为约26°C-约60°C，尤其是约32°C或50°C，pH为约3-8，如大约pH4-5、6或7左右。在一个优选的方面，将酵母和/或另一种微生物施加到经降解的纤维素材料，并进行大约12小时至大约96小时，如通常24-60小时的发酵。在一个优选的方面，温度优选为大约20°C至大约60°C，更优选大约25°C至大约50°C，最优选大约32°C至大约50°C，特别是大约32°C或50°C，pH—般为大约pH3至大约pH7，优选pH4-7左右。然而，某些微生物如细菌发酵生物，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物施加的量优选为每ml发酵液大约IO5至1012，更优选大约IO7至101(1，特别是大约2xl08个活细胞计数。关于使用酵母进行发酵的更多指导可见例如“TheAlcoholTextbook”(K.Jacques,Τ.P.Lyons和D.R.Kelsall编，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdoml999)，该文献通过提述并入文本。发酵刺激物(fermentationstimulator)可与本文描述的任何酶促方法组合使用以进一步改进发酵方法，特别是发酵微生物的性能，如速率提高和乙醇产量。“发酵刺激物”指用于发酵微生物特别是酵母的生长的刺激物。优选的用于生长的发酵刺激物包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素(multivitamins)、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素、及维生素A、B、C、D禾口E。参见例如Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchProcess,Springer-Verlag,2002，该文献通过提述并入文本。矿物质的实例包括能够提供营养的矿物质和矿物质盐，包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。发酵产物发酵产物可以是任何来源于发酵的物质。所述发酵产物包括，但不限于，醇(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；和气体(例如甲烷、氢(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(C0))。发酵产物还可以是作为高价值产物的蛋白质。在一个优选的方面，所述发酵产物是醇。应理解的是术语“醇”涵盖含有一个或多个羟基部分的物质。在一个更优选的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是1，3_丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨糖醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见例如Gong，C.S.、Cao,N.J.、Du,J.禾口Tsao，G.Τ.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Schepeper,T.编，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207_241；Silveira,Μ.M.,禾口Jonas,R.,2002,Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59400-408；Nigam,P.，禾口Singh,D.，1995，Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2)117-124；Ezeji,T.C.>Qureshi,N.禾口Blaschek，H.P.，2003，Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595-603o在另一个优选的方面，所述发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是富马酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见例如Chen，R.，禾口Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63—65:435_4480在另一个优选的方面，所述发酵产物是酮。可以理解的是术语“酮”涵盖含有一个或多个酮部分的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见例如Qureshi和Blaschek,2003,同上文。在另一个优选的方面，所述发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见例如Richard，Α.，禾口Margaritis，Α.，2004，Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501_515o在另一个优选的方面，所述发酵产物是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是C02。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见例如Kataoka，N.、A.Miya，和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7)41-47-,RGunaseelanV.N.,BiomassandBioenergyVol.13(1-2),H83-114M,1997,Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。Ml^.任选地可以使用任何本领域已知的方法从发酵培养基回收一种或多种发酵产物，这些方法包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦、和大小排阻)、电泳步骤(例如制备型等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、蒸馏或提取。例如，从经过发酵的纤维素材料通过常规蒸馏方法分离醇并纯化。可以获得纯度高达约96vol%的乙醇，它可以用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇(即可饮用酒精(potableneutralspirits))或工业乙酉享。鞣酸酶在本发明的方法中，任何鞣酸酶都可以使用。鞣酸酶可以从任何来源，特别是任何属的微生物获得。就本发明而言，术语“获得自”如本文所定义的那样使用。在一个优选的方面，从给定来源获得的鞣酸酶是胞外分泌的。所述鞣酸酶可以是细菌鞣酸酶。例如，鞣酸酶可以是革兰氏阳性菌鞣酸酶，例如芽孢杆菌属、棒状杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)鞣酸酶，或者革兰氏阴性菌鞣酸酶，例如大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)lifM(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或尿支原体属(Ureaplasma)鞣酸酶。在一个优选的方面，所述鞣酸酶是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热月旨肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月农链球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)或马链球菌兽癌亚禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)革柔酸酶。在另一个优选的方面，所述鞣酸酶是不产色链霉菌(Sti^ptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)鞣酸酶。所述鞣酸酶也可以是真菌鞣酸酶，而更优选的是酵母鞣酸酶，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)革柔酸酶；或更优选的是丝状真菌鞣酸酶，如枝顶孢霉属Mcremonium)、蘑菇属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟赌菌属(Ceriporiopsis)、毛壳菌属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、网孢菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霄属(Humicola)、奉巴菌属(Irpex)、香属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L菌属(Meripilus)、毛霉属Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉？包菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)(Piromyces)>Poitrasia>j[xllii|ifM(Pseudoplectania)>Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂裙菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytaldium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热霉属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、Trichophaea、轮枝抱属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xlaria)鞣酸酶。在一个优选的方面，所述鞣酸酶是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesovifrmis)革柔酸醜。在另一个优选的方面，所述鞣酸酶是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、费氏曲霉(Aspergillusfischeri)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergi1lusniger)(TrEMBL登录号A2Q818、A2QAH7、A2QBC9、A2QBK3、A2QH22、A2QIR3、A2QS33、A2QT57、A2QV40、A2QV44、A2QVF5、A2QW25、A2R0Z6、A2R274和A2R9C0)、米曲霉(Swiss-Prot登录号P78581)、宇佐美曲毒(Aspergillususamii)(Aspergillus(Aspergillusversicolor)、嗜角质金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatum、杆抱状德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、库威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、异抱德抱(Fusariumheterosporum)、合欢木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝,廉抱(Fusariumreticulatum)、粉红德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、肤色德抱(Fusariumsarcochroum)、腐皮德抱(Fusariumsolani)、拟分枝抱,廉抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰色腐质酶(Humicolagrisea)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、乳白耙菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脉抱菌(Neurosporacrassa)、Paecilomycesvariotii、Penicilliumcharlesii、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、扩展青霉(Penicilliumexpansum)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、爪口圭青霉(Penicilliumjavanicum)、点青霉(Penicilliumnotatum)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、局限青霉(Penicilliumrestrictum)、变幻青霉(Penicilliumvariabile)、黄抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、米根霉(Rhizopusoryzae)、无色梭抱壳(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱壳(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱壳(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱壳(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、€包冑(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、zht—胃、(Trichodermaharζianum)(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Terichodermalongibrachiatum)、里氏木霉或绿色木霉(Trichodermaviride)革柔酸酶。在另一个优选的方面，所述鞣酸酶包括SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO8或SEQIDNO10或其具有鞣酸酶活性的片段或由SEQIDNO:2、SEQIDNO4,SEQIDN0:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10或其具有鞣酸酶活性的片段组成。在另一个优选的方面，所述鞣酸酶是SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO8或SEQIDNO:10的成熟的鞣酸酶。在另一个优选的方面，所述鞣酸酶是由SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO7或SEQIDNO9或其编码具有鞣酸酶活性的片段的子序列编码的。在另一个优选的方面，所述鞣酸酶是由SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO7或SEQIDNO9的成熟多肽编码序列编码的。在一个更优选的方面，所述鞣酸酶是米曲霉鞣酸酶。在一个最优选的方面，所述鞣酸酶包括SEQIDNO:2或其具有鞣酸酶活性的片段或由SEQIDNO:2或其具有鞣酸酶活性的片段组成。在另一个最优选的方面，所述鞣酸酶包括SEQIDNO:2的成熟鞣酸酶或其具有鞣酸酶活性的片段或由SEQIDNO:2的成熟鞣酸酶或其具有鞣酸酶活性的片段组成。应当理解的是，就前文所述的物种而言，本发明涵盖了它们的完全和不完全阶段，以及其它分类学上的等同物，例如无性型，不管它们已知的种名是什么。本领域技术人员可以很容易地识别出合适的等同物的身份。公众可以在若干保藏机构容易地获取这些物种的菌株，这样的机构如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心，北区研究中心(NRRL)。此外，还可以使用上文所述的探针从其他来源鉴定和获取这样的鞣酸酶，所述来源包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物。用于从天然生境分离微生物的技术是本领域中公知的。然后可以通过类似地筛选此类微生物的基因组文库或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用探针检测到了编码鞣酸酶的多核苷酸序列，就可以使用本领域普通技术人员公知的技术(参见例如Sambrook等，1989同上)分离或者克隆该多核苷酸。鞣酸酶还包括融合的多肽或者可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在所述鞣酸酶或其片段的N-末端或C-末端。融合的多肽是通过将编码另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到本发明的多肽的核苷酸序列(或其部分)而产生的。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括将编码各多肽的编码序列连接起来使它们符合阅读框，并使得被融合的多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。融合多肽还可以包含切割位点。融合蛋白一旦被分泌，该位点就被切割，从融合蛋白中释放出鞣酸酶。切割位点的实例包括但不限于Kex2位点，其编码二肽Lys-Arg(Martin^,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3568-76；Svetina^,2000,J.Biotechnol.76:245_251；Rasmussen-ffi1son等，1997,App1.Environ.Microbiol.633488-3493；Ward等，1995，Biotechnologyl3498-503；禾口Contreras等，1991，Biotechnology9:378_381)；lie-(Glu或Asp)-Gly-Arg位点，其被因子Xa蛋白酶在精氨酸残基之后切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505_512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点，其被肠激酶在赖氨酸之后切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其被GenenaseI切害Ij(Carter等，1989，Proteins-Structure,Function,andGenetics6:240_248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其被凝血酶在Arg之后切割(Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其被TEV蛋白酶在Gln之后切割(Stevens，2003，同上)；以及Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其被一种遗传工程改造形式的人鼻病毒3C蛋白酶在Gln之后切割(Stevens，2003，同上)。表1列举了本发明可用的其它鞣酸酶的实例。表1适用于本发明的商业鞣酸酶制剂的实例包括，例如米曲霉鞣酸酶(可获自NovozymesA/S)和来自日本东京KikkomanCorp的鞣酸酶,和德国Wiesbaden的JuelichEnzymeProductsGmbH。纤维素分解酶组合物在本发明的方法中，纤维素分解酶组合物可包含任何涉及将纤维素材料，如木质纤维素加工为可发酵糖(例如葡萄糖)的蛋白质。就纤维素降解而言，至少三类酶对于将纤维素转化为可发酵糖是重要的随机水解纤维素链的内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)；从纤维素链末端切割纤维二糖基单元的纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)和将纤维二糖与可溶性纤维糊精转化为葡萄糖的β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。纤维素分解酶组合物可以是单组分制备物，例如内切葡聚糖酶，多组分制备物，例如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、葡糖苷酶，或者多组分蛋白制备物与单组分蛋白制备物的组合。纤维素分解蛋白质可在酸性、中性或碱性PH范围内具有活性，即，水解纤维素。具有纤维素分解酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Str印tococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)的具有纤维素分解酶活性的多肽，或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或尿枝原体属(Ureaplasma)的具有纤维素分解酶活性的多肽。在一个优选的方面，所述多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的具有纤维素分解酶活性的多肽。在另一个优选的方面，所述多肽是似马链球菌(Str印tococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)或马链球菌兽癌亚种(Sti^ptococcusequisubsp.Zoo印idemicus)的具有纤维素分解酶活性的多肽。在另一个优选的方面，所述多肽是不产色链霉菌(Sti^ptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)的具有纤维素分解酶活性的多肽。具有纤维素分解酶活性的多肽还可以是真菌多肽，更优选酵母多肽，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)的具有纤维素分解酶活性的多肽；或者更优选丝状真菌多肽，如枝顶孢霉属(Acremonium)、蘑菇属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟錯菌属(Ceriporiopsis)、毛壳菌属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、漂耳属(Exidia)、网孢菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质毒属(Humicola)、奉巴菌属(Irpex)、香燕属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉？包菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假漂盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂糟菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热霉属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、Trichophaea、轮枝抱属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或炭角菌属(Xylaria)的具有纤维素分解酶活性的多肽。在一个优选的方面所述多肽是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)的具有纤维素分角军酶活性的多肽。在另一个优选的方面，所述多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉、嗜角质金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatum、杆抱状德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、库威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、异抱德抱(Fusariumheterosporum)、合欢木德抱(Fusariumnegundi)、尖,廉抱(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色德抱(Fusariumsarcochroum)、拟分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圆,廉抱(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰色腐质酶(Humicolagrisea)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉(Humicolalmuginosa)、乳白耙菌(Irpexlacteus)、^■€β(Mucormiehei)、口f%罾M胃(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄包平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、无色梭包壳(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱壳(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱壳(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱壳(Thielaviaovispora)、Thieaviaperuviana、Thielaviaspededonium、毛梭抱壳(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)(Trichodermakoningii)、长枝(Trichodermakingibrachiatum)、里氏木霉、绿色木霉(Trichodermaviride)或Trichophaeasaccata的具有纤维素分解酶活性的多肽。也可使用纤维素分解蛋白的化学修饰或蛋白质工程突变体。纤维素分解酶组合物的一个或多个组分可以是重组组分，即通过克隆编码单独组分的DNA序列和随后用所述DNA序列转化细胞和在宿主中表达来产生(参见，例如WO91/17243和WO91/17244)。所述宿主优选异源宿主(对宿主而言酶是外来的)，但在某些条件下宿主也可是同源宿主(对宿主而言酶是天然的)。单组分的纤维素分解蛋白质也可通过从发酵液中纯化该蛋白质而制备。本发明的方法中使用的纤维素分解蛋白可以通过利用本领域已知的方法，用含有合适的碳源及氮源和无机盐的营养培养基发酵上文提到的微生物菌株来产生(参见例如Bennett,J.W.禾口LaSure，L(编)，MoreGeneManipulationsinFungi，AcademicPress，CA，1991)。合适的培养基可以从供应商获得，或者可以依照公开的组成(例如美国典型培养物保藏中心的目录中)来制备。适于生长和纤维素分解蛋白产生的温度范围及其它条件是本领域已知的(参见例如Bailey，J.Ε.和Ollis，D.F.，BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986)。发酵可以是任何培养细胞而导致纤维素分解蛋白的表达或分离的方法。因此，发酵可以理解为包括在实验室或工业发酵罐中实施的摇瓶培养、或小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)，其在合适的培养基中，在容许纤维素分解蛋白表达或分离的条件下进行。依照上述方法所得的纤维素分解蛋白可以从发酵培养基回收并通过如本文描述的常规方法加以纯化。适用于本发明的商业纤维素分解酶制备物的实例包括，例如，CELLUCLAST(可获自NovozymesA/S)和N0V0ZYM188(可获自NovozymesA/S)。其它可用的商业上可得到的制备物包括CELLUZYME、CEREFL0和ULTRAFL0(NovozymesA/S)、LAMINEX和SPEZYMECP(GenencorInt.)、ROHAMENT7069ff(RohmGmbH)和FIBREZYMELDI，FIBREZYMELBR，或VISCOSTAR150L(DyadicInternational,Inc.，Jupiter,FL,USA)ο纤维素酶以约0.001%-约5.0%wt.固体，更优选约0.025%-约4.0%wt.固体，最优选约0.005%-约2.0%wt.固体的有效量加入。可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的例子包括但不限于解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)内切葡聚糖酶(W091/05039;W093/15186；美国专利5，275，944；WO96/02551；美国专利5，536，655，W000/70031,WO05/093050)；褐色喜热裂孢菌(Thermobifidafusca)内切葡聚糖酶III(W005/093050)；和褐色喜热裂孢菌内切葡聚糖酶V(W005/093050)。可以用于本发明的方法的真菌内切葡聚糖酶的例子包括但不限于里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253_263;GenBank登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene6311-22;GenBank登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555_563；GenBank登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249584-591；GenBank登录号Yl1113)；和里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiologyl3:219_228；GenBank登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearchl85884)；川地曲霉(Aspergilluskawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，CurrentGenetics27:435_439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GenBank登录号L29381)；灰腐质霉高温变种(Humicolagriseavar.thermoidea)内切葡聚糖酶(GenBank登录号AB003107)；Melanocarpusalbomyces内切葡聚糖酶(GenBank登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GenBank登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V(SEQIDNO12)；嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶(SEQIDNO14)；担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶(SEQIDNO16)；担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶(SEQIDNO18)；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶(SEQIDNO20)；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶(SEQIDNO22)；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶(SEQIDNO24)；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶(SEQIDNO26)；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶(SEQIDNO:28)；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶(SEQIDNO30)；和里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(SEQIDNO32；GENBANK登录号M15665)。上述SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO20,SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO30和SEQIDNO32的内切葡聚糖酶分别是由SEQIDNO=IUSEQIDNO13,SEQIDNO15,SEQIDNO17,SEQIDN0:19、SEQIDN0:21、SEQIDNO23、SEQIDNO25,SEQIDNO27,SEQIDNO:29禾口SEQIDN0:31的成熟多肽编码序列编码的。可用于本发明的方法中的纤维二糖水解酶的实例包括但不限于里氏木霉纤维二糖水解酶I(SEQIDNO34)；里氏木霉纤维二糖水解酶II(SEQIDNO36)；特异腐质霉纤维二糖水解酶I(SEQIDNO:38)、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II(SEQIDNO40)、土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)(SEQIDNO42)、嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)纤维二糖水解酶I(SEQIDNO44)和嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II(SEQIDNO:46)。上述的SEQIDN0:34、SEQIDNO36,SEQIDNO38、SEQIDNO40,SEQIDNO42、SEQIDN0:44和SEQIDNO46纤维二糖水解酶分别是由SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO37,SEQIDNO39,SEQIDNO:41、SEQIDNO43禾口SEQIDNO:45的成熟多肽编码序列编码的。可用于本发明方法中的葡糖苷酶的实例包括但不限于米曲霉葡糖苷酶(SEQIDNO:48)；烟曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDNO:50)；巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT208883-葡糖苷酶(SEQIDNO52)；黑曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDΝ0:54)；和棘孢曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDΝ0:56)。上述SEQIDNO48,SEQIDNO50,SEQIDNO:52、SEQIDNO54和SEQIDNO56的β-葡糖苷酶分别是由SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO53和SEQIDNO55的成熟多肽编码序列编码的。所述具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可以根据WO2002/095014获得。所述具有β-葡糖苷酶活性的烟曲霉多肽可以根据WO2005/047499获得。所述具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可以根据WO2007/019442获得。所述具有β_葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可以根据Dan等，2000，J.Biol.Chem.275:4973_4980获得。所述具有β_葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可以根据Kawaguchi等，1996，Gene173:287_288获得。公开了使用依照HenrissatB.，1991，Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309_316；以及HenrissatB.禾口BairochΑ.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolasess,Biochem.J.316695-696的分类法分类的大量的糖基水解酶家族中的其它内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个优选的方面，所述β-葡糖苷酶是SEQIDNO:58的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白或SEQIDNO:60的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。在另一个优选的方面，所述米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白由SEQIDNO:57的多核苷酸编码或者所述米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白由SEQIDNO59的多核苷酸编码。纤维素分解酶组合物还可包括一个或多个具有纤维素分解增强活性的多肽，其包括如下基序[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口[Fff]-[TF]-K-[AIV],其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5个邻接位置上的任何氨基酸并且X(4)是在4个连邻接位置上的任何氨基酸。包含上述基序的分离的多肽可进一步包含H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]，[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]禾口[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，其中X是任何氨基酸，X(1，2)是在1个位置或2个邻接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3个邻接位置上的任何氨基酸并且X(2)是在2个邻接位置上的任何氨基酸。在以上基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。在一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽进一步包含H-X(l，2)-G-P-X(3)_[YW]-[AILMV]。在另一优选的方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽还包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一优选的方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽还包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。具有纤维素分解增强活性的分离的多肽的实例包括具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉多肽(SEQIDN0:62、SEQIDNO64、SEQIDNO66、SEQIDNO68、SEQIDNO70或SEQIDN0:72的成熟多肽)；桔橙嗜热霉(Thermoascusauranticus)(SEQIDNO74的成熟多肽)或里氏木霉(SEQIDN0:76的成熟多肽)。上述SEQIDNO62、SEQIDN0:64、SEQIDNO66,SEQIDNO68,SEQIDNO70,SEQIDNO72禾口SEQIDNO:74的具有纤维素分解增强活性的多肽分别是由SEQIDNO:6USEQIDNO63、SEQIDNO65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO73和SEQIDNO75的成熟序列编码序列编码的。具有纤维素分解增强活性的多肽及其多核苷酸的更多细节，请参见W02005/074647、WO2005/074656和公布的美国专利申请序列号2007/0077630，所述文件通过提述并入本文。纤维素分解酶组合物还可包含选自下组的一种或多种酶半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其混合物。可以使用任何适用于将半纤维素优选地水解为木糖的半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶、木糖苷酶及其组合。优选地，半纤维素酶具有在低于PH7，优选pH3-7的酸性条件下水解半纤维素的能力。适用于本发明的半纤维素酶的实例包括VISC0ZYME(可获自NovozymesA/S，Denmark)。在一个方面，所述半纤维素酶是木聚糖酶。木聚糖酶可为微生物来源，例如真菌来源(如木霉属、多孔菌属、腐质霉属、曲霉属、镰孢属)或细菌来源(如芽孢杆菌属)的。在一个优选的方面，所述木聚糖酶得自丝状真菌，优选得自曲霉属，如棘孢曲霉的菌株；或腐质霉属，如疏棉状腐质霉的菌株。所述木聚糖酶优选为内切-1，4-β-木聚糖酶，更优选为GHlO或GHll的内切-1，4-β-木聚糖酶。商业木聚糖酶的实例包括SHEARZYME和BI0FEEDWHEAT(NovozymesA/S，Denmark)。可以有效水解半纤维素的量加入半纤维素酶，例如以总固体(totalsolids,TS)的约0.001-0.5wt.%，更优选以TS的约0.05-0.5wt.%的量。可将木聚糖酶以0.001-1.Og/kgDM(干物质)底物的量，更优选以0.005-0.5g/kgDM底物，最优选0.05-0.10g/kgDM底物的量加入。核酸构建体可以将编码具有酶活，例如鞣酸酶或纤维素分解增强活性的多肽的分离的多核苷酸用多种方法进行操作，以通过构建核酸构建体提供多肽的表达，所述核酸构建体含有与一种或多种控制序列可操作连接的编码所述多肽的分离的多核苷酸，所述控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中在与这些控制序列相容的条件下表达。取决于表达载体，在插入载体之前对多核苷酸的序列进行操作可能是理想的或者必要的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域公知的。控制序列可以是合适的启动子序列，启动子序列是被宿主细胞所识别来表达编码这样的多肽的多核苷酸的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是任何在所选择的宿主细胞中显示转录活性的核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，而且可以从编码对宿主细胞而言为同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。适于指导核酸构建体的转录，尤其是在细菌宿主细胞中转录的启动子的例子是获自大肠杆菌Iac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(PenP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、以及原核β-内酰胺酶基因的启动子(Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727_3731),禾口tac启动子(DeBoer等，1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA8021-25)oScientificAmerican,1980,242:74_94中"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"和Sambrook等，1989(同上)中描述了其它启动子。适于在丝状真菌宿主细胞中指导核酸构建体的转录的启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、镶片镰孢Daria(WC)00/56900)、镶片镰孢Quinn(ff000/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶；以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子的杂合体)；以及它们的突变、截短和杂合的启动子。在酵母宿主中，有用的启动子是从酿酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GALl)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUPl)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因获得的。对酵母宿主细胞有用的其他启动子在Romanos等，1992，Yeast8:423_488中有记载。控制序列还可以是合适的转录终止子序列。终止子序列是被宿主细胞识别来终止转录的序列。终止子序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的3’末端。任何可在所选的宿主细胞中发挥功能的终止子都可以用于本发明。优选的用于丝状真菌宿主细胞的终止子是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得的。优选的用于酵母宿主细胞的终止子是从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYCl)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得的。对酵母宿主细胞有用的其他终止子在Romanos等，1992(同上)中有记载。控制序列也可以是合适的前导序列，前导序列是对于宿主细胞的翻译来说重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’末端。任何可在所选择的宿主细胞中发挥功能的前导序列都可以用于本发明。优选的用于丝状真菌宿主细胞的前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因获得的。对于酵母宿主细胞合适的前导序列是从酿酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得的。控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，聚腺苷酸化序列是一段与核苷酸序列的3’末端可操作连接的序列，转录时被宿主细胞识别为向被转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号。任何可在所选择的宿主细胞中发挥功能的聚腺苷酸化序列都可以用于本发明。优选的用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因获得的。Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology15:5983_5990记载了在酵母宿主细胞中有用的聚腺苷酸化序列。控制序列还可以是信号肽编码序列，其编码的氨基酸序列连接于多肽的氨基末端，并引导被编码的多肽进入细胞的分泌途径。核苷酸序列的编码序列的5’端可以固有地包含信号肽编码序列，该序列天然地以符合翻译阅读框的方式与编码区中编码分泌型多肽的区段连接。或者，编码序列的5’端可以包含对该编码序列而言为外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的场合，可能需要外源信号肽编码序列。或者，外源信号肽编码序列可简单地替代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，引导被表达的多肽进入所选的宿主细胞的分泌途径，即分泌到培养基中的任何信号肽编码序列都可以用于本发明。对细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137记载了其它信号肽。对丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、和疏棉状腐质霉脂肪酶的基因获得的信号肽编码序列。对酵母宿主细胞有用的信号肽是从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶获得的。其它有用的信号肽编码序列在Romanos等，1992，同上文中有记载。控制序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽的氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽被称为酶原(proenzyme)或原多肽(propolyp印tide)(或者在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是没有活性的，并且通过将前肽从原多肽中通过催化或自催化切割转化为成熟的活性多肽。前肽编码序列可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶的基因获得(W095/33836)。在信号肽和前肽序列都存在于多肽氨基末端时，前肽序列位于紧接着多肽氨基末端，而信号肽序列位于紧接着前肽序列的氨基末端。添加这样的调节序列可能也是理想的该序列容许相对于宿主细胞的生长调节多肽的表达。调节系统的例子有导致基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节性化合物的存在)而开启或关闭的那些调节系统。原核系统中的调节系统包括lac、taC、和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。其他调节序列的例子是允许基因扩增的那些调节序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些场合，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。表达载体可以将本文所述的多种核酸和控制序列连接在一起以产生重组表达载体，其包含编码具有酶活性或纤维素分解增强活性的多肽的多核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号。所述表达载体可包括一个或多个方便的限制性位点以允许在这些位点上插入或替换编码多肽的多核苷酸序列。或者，可以将多核苷酸序列或包含该序列的核酸构建体插入合适的表达用载体来表达编码这样的多肽的多核苷酸序列。在生成表达载体的过程中，将编码序列置于载体中使得该编码序列与合适的表达用控制序列可操作地连接。重组表达载体可以是可方便地进行重组DNA步骤并且能够带来多核苷酸序列的表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常将取决于载体与该载体要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或者闭合环状的质粒。所述载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。载体可含有任何用于保证自我复制的手段(means)。或者，载体可以是当导入宿主细胞时整合到基因组中并随所整合的染色体一起复制的载体。另外，可以使用单一的载体或质粒，或两个或更多个载体或质粒，其共同包含要导入宿主细胞基因组的总DNA，或者可以使用转座子。载体优选含有一个或多个选择标记，这些标记容许容易地选择经过转化、转染、转导等的细胞。选择标记是这样的基因，其产物可提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性，对营养缺陷型的原养性，等等。细菌选择标记的例子有来自枯草芽孢杆菌或者地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的合适标记有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷_5，-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)，和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及它们的等同物。优选用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，以及吸水链霉菌(Str印tomyceshygroscopicus)的bar基因。载体优选包含容许载体整合到宿主细胞的基因组或者容许载体在细胞中不依赖基因组自主复制的元件。为了整合到宿主细胞基因组中，载体可能依赖多核苷酸的编码多肽的序列或者载体的任何其它元件来通过同源或异源重组整合到基因组中。或者，载体可含有附加的核苷酸序列，用来指导通过同源重组在染色体上的精确位置整合到宿主细胞的基因组中。为了增加在精确位置上整合的机率，整合元件优选应含有足够数目的与相应靶序列具有高度同一性的核酸，如100-10，000个碱基对，优选400-10，000个碱基对，最优选800-10，000个碱基对，以提高同源重组的概率。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中的靶序列同源的序列。此外，整合元件可以是非编码的或者编码的核苷酸序列。在另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中。为了自主复制，载体可进一步包含复制起点，该起点使得载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是在细胞中发挥功能的任何介导自主复制的质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文中定义为使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。细菌复制起点的实例有容许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及容许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的复制起点。用于在酵母宿主细胞中的复制起点的例子有2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合，以及ARS4和CEN6的组合。在丝状真菌细胞中有用的复制起点的例子有AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。AMAl基因的分离，以及包含该基因的质粒或载体的构建，可以根据WO00/24883中公开的方法来实现。可以向宿主细胞中插入编码这样的多肽的多核苷酸的多于一个拷贝以增加所述多肽的生产。可以通过下述方法获得多核苷酸的拷贝数的增加向宿主细胞基因组中整合入至少一个额外拷贝的序列；或者纳入伴随该多核苷酸的可扩增的选择标记基因，由此通过在合适的选择剂的存在下培养细胞，可以选择出含有扩增拷贝数的选择标记基因，从而也就含有更多拷贝的所述多核苷酸的细胞。用于连接上述元件来构建重组表达载体的步骤是本领域技术人员公知的(参见例如Sambrook等，1989，同上文)。宿主细胞包含编码具有酶活性或纤维素分解增强活性的多肽的多核苷酸的重组宿主细胞可以有利地用于多肽的重组生产。将包含这样的多核苷酸的载体导入宿主细胞使得载体作为染色体整合子或者如前文所述的自复制的染色体外载体被保持。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何因复制过程中的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或者非单细胞微生物，例如真核生物。细菌宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属或尿枝原体属。细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。本发明的实施中可以使用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。在一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，所述细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，所述细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，所述细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，所述细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。细菌宿主细胞也可以是任何链球菌属细胞。本发明的实施中可以使用的链球菌属细胞包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、和马链球菌兽瘟亚种细胞。在一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。细菌宿主细胞也可以是任何链霉菌属细胞。本发明的实施中可以使用的链霉菌属细胞包括但不限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。在一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是天蓝色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。向芽孢杆菌属细胞中导入DNA可以通过例如原生质体转化(参见例如Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111_115)、使用感受态细胞(参见例如Young禾口Spizizen,1961,JournalofBacteriology81:823_829，或Dubnau禾口Davidoff-Abelson,1971,JournalofMolecularBiology56:209_221)、通过电穿孔(参见例如Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742_751)，或通过接合(参见例如Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriology169:5271_5278)来实现。向大肠杆菌细胞中导入DNA可以通过例如原生质体转化(参见例如Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166557-580)或电穿孔(参见例如Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16:6127_6145)来实现。向链霉菌属细胞中导入DNA可以通过例如原生质体转化和电穿孔来实现(参见例如Gong等，2004，FoliaMicrobiol.(Praha)49:399_405)、接合(参见例如Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583_3585)、或转导(参见例如Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98=6289-6294)来实现。向假单胞菌属细胞中导入DNA可以通过例如电穿孔(参见例如Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391_397)、或接合(参见例如Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51_57)来实现。向链球菌属细胞中导入DNA可以通过例如天然感受态(参见例如Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32:1295_1297)、原生质体转化(参见例如Catt和Jollick，1991，Microbios.68189-207)、电穿孔(参见例如Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.653800-3804)、或接合(参见例如Clewell，1981,Microbiol.Rev.45409-436)来实现。尽管如此，本领域已知的用于将DNA导入宿主细胞的任何方法都可以使用。宿主细胞也可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。在一个优选的方面，所述宿主细胞是真菌细胞。本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)禾口接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等在AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,第八版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中定义的)，和卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，同上文，第171页引用的)等门，以及全部有丝分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，同上文)。在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊酵母(basidiosporogenousyeast)禾口属于半知菌类(FungiImperfecti)(芽抱纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能有所改变，就本发明而言，酵母将如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.禾口Davenport,R.R.编，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所述加以定义。在一个进一步更优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialalipolytica)细胞。在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等，1995，同上文定义)。丝状真菌的一般特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，且碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的芽殖，且碳分解代谢可以是发酵的。在一个进一步更优选的方面，丝状真菌宿主细胞枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、网孢菌属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热霉属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。在一个更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)>zFifaIif(Ceriporiopsisaneirina)>zFifaIif(Ceriporiopsisaneirina)>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、虫拟M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(TrametesvilIosa)、杂色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。真菌细胞可以用包括原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身已知的方式来加以转化。用于曲霉属和木霉属宿主细胞转化的合适方法描述于EP238023禾口Yelton等，1984,ProceedingsoftheNational.AcademyofSciencesUSA811470-1474。Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述了转化镰孢属菌种的合适方法。酵母可用Becker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，Μ.I.编GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiologyiMethodsinEnzymology，第194卷，第182-187页，AcademicPress，NewYork；Ito等，1983，JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920中所述的方法转化。生产方法生产具有酶活性或纤维素分解增强活性的多肽的方法包括(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收多肽。或者，生产具有酶活性或纤维素分解增强活性的多肽的方法包括(a)在有益于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞；和(b)回收多肽。在产生方法中，用本领域中公知的方法在适于多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可在实验室或工业发酵罐中通过摇瓶培养、和小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)培养细胞，这在合适的培养基中和使多肽能被表达和/或分离的条件下进行。用本领域中已知的方法，在含有碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业供应商得到或根据公开的组成(例如，于美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。如果该多肽不被分泌，则可从细胞裂解产物中回收它。具有酶活性或纤维素分解增强活性的多肽用本文记载的方法或本领域公知的方法检测。得到的含有或不含有细胞碎片的发酵液可以按原样(asis)使用，或者可以使用本领域已知的方法回收所述多肽。例如，可以通过常规方法，包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀将多肽从营养培养基中回收。多肽可通过本领域中已知的多种方法进行纯化，所述方法包括，但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度法(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(见，例如，ProteinPurificationJ.-C.Janson和LarsRyden编，VCHPublishers,NewYork，1989)，来获得基本上纯的多肽。下面用实施例进一步描述本发明，这些实施例不应解释为对本发明范围的限制。实施例DNA测序DNA测序使用染料终止物化学(dyeterminatorchemistry)(Giesecke等，1992，JournalofVirol.Methods38:47—60)MAppliedBiosystemsModel3130XGeneticAnalyzer(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)进行。序列使用phred/phrap/consed(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)用序列特异性引物进行装配。培养基和溶液YP培养基的组成为每升IOg酵母提取物和20g细菌用胰蛋白胨。纤维素酶诱导培养基的组成为每升20g纤维素、IOg玉米浸浆固形物(cornsteepsolid)、1.45g(NH4)2S04、2.08gKH2P04、0.28gCaCl2,0.42gMgS04·7H20和0.42ml痕量金属溶液。痕量金属溶液的组成为每升216gFeCl3·6H20、58gZnSO4·7H20、27gMnS04·H2O,IOgCuSO4·5Η20、2·4gH3BO3和336g柠檬酸。STC的组成为IM山梨醇、IOmMCaCl2禾口IOmMTris-HCl,pH7.5。COVE平板的组成为每升342g蔗糖、IOmlCOVE盐溶液、IOmllM乙酰胺、IOmll.5MCsCl和25g诺布尔琼脂(Nobleagar)。COVE盐溶液的组成为每升26gKCl、26gMgS04、76gΚΗ2Ρ04*50πι1COVE痕量金属溶液。COVE痕量金属溶液的组成为每升0.04gNa2B4O7·10Η20、0·4gCuS04·5Η20、1·2gFeSO4·7Η20、0·7gMnSO4·H20,0.8gNa2MoO2·2H20和IOgZnSO4·7H20。C0VE2平板的组成为每升30g蔗糖、20mlCOVE盐溶液、25g诺布尔琼脂和IOmlIM乙酰胺。PDA平板的组成为每升39克马铃薯右旋糖琼脂。LB培养基的组成为每升IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化钠。2XYT-Amp平板的组成为每升IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠和15g细菌用琼脂，然后在高压灭菌后加入2ml50mg/ml的氨苄青霉素的过滤除菌溶液。MDU2BP培养基的组成为每升45g麦芽糖、IgMgSO4·7H20、IgNaCl、2gK2HS04、12gKH2PO4,2g尿素和500μ1AMG痕量金属溶液，将pH调至5.0并随后用0.22μm过滤元件进行过滤除菌。AMG痕量金属溶液的组成为每升14.3gZnSO4·7Η20、2·5gCuS04·5Η20、0·5gNiCl2·6Η20、13·8gFeSO4·H20,8.5gMnSO4·7H20和3g柠檬酸。基本培养基(minimalmedium)平板的组成为每升6gNaN03、0.52KC1、1.52gKH2PO4UmlCOVE痕量金属溶液、20g诺布尔琼脂、20ml50%葡萄糖、2.5ml20%MgSO4·7H20和20ml生物素贮存溶液。生物素贮存溶液的组成为每升0.2g生物素。SOC培养基的组成为2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、IOmMNaCl,2.5mMKClUOmMMgCl2和IOmMMgSO4,高压灭菌后加入过滤除菌的葡萄糖至20mM。Mandel培养基的组成为每升1.4g(NH4)2S04、2.OgKH2P04、0.3g尿素、0.3gCaCl2,0.3gMgSO4·7H20、5mgFeSO4·7H20、1.6mgMnSO4·H2OU.4mgZnSO4·H2O禾口2mgofCoCl2。材料磷酸溶胀的纤维素(phosphoricacid-swollencellulose,PASC)根据Schulein,1997，J.Biotechnol.57:71_81的方法从微晶纤维素(AVICEL;PHlOl；FMC,Philadelphia,PA,USA)制备。羧甲基纤维素(CMC，7L2型，70%取代)获自HerculesInc.,Wilmington,DE,USA0寡聚原花色素复合物(OPC)获自MASQUELIER’STru-OPCs(Nature'sffayProducts,Inc.，Springville，UT,USA)，其包含75mg/片干葡萄籽提取物，其中约65%为OPC而30%为其它多酚；非活性组分为纤维素、麦芽糖糊精、经修饰的纤维素胶(modifiedcellulosegum)、硬脂酸、纤维素、硅石、甘油等等)。用研钵和杵将小片(0.45g)磨碎后溶于IOml水中。鞣酸(D-葡萄糖的10-没食子酰基酯)、没食子酸、鞣花酸、甲基没食子酸盐、葡糖五乙酸酯(均为鞣酸组成化合物)、表儿茶素、黄酮醇(均为OPC组成化合物)、4_羟基-2-甲基苯甲酸、香草醛、松柏醇、松柏醛、阿魏酸以及丁香醛(均为木质素前体/组成化合物)获自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA。将IOmM的鞣酸(对应于IOOmM没食子酰基和IOmM葡糖基(glucosyl)组分)贮存液在0.IMNaOH中制备。其它贮存液在去离子水中制备。实施例1具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热霉GH61A的制备桔橙嗜热霉GH6IA根据WO2005/074656在米曲霉JaL250中重组产生。重组产生的桔橙嗜热霉GH61A多肽首先通过使用IOkDa膜超滤而浓缩，缓冲液交换入20mMTris-HClPH8.0，然后在同一缓冲液中以600ml0-600mMNaCl线性梯度用100mlQ_SEPHAROSEBigBeadsft(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)t屯4t。IOml白勺级分并依据SDS-PAGE汇集级分。在同一缓冲液中以500ml0-500mMNaCl线性梯度用20mlMONOQ柱(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)进一步纯化汇集的级分(90ml)。收集6ml的级分并依据SDS-PAGE汇集级分。汇集的级分(24ml)通过使用IOkDa膜超滤而浓缩，并以约1.3升150mMNaCl-20mMTris-HClpH8.0的等度洗脱用320mlSUPERDEX200SEC柱(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)进行层析。收集20ml的级分并依据SDS-PAGE汇集级分。用MicroplateBCAProteinAssayKit(Pierce,Rockford,IL,USA)测定蛋白质浓度。实施例2里氏木霉CEL7A纤维二糖水解酶I的制备里氏木霉CEL7A纤维二糖水解酶I如Ding和Xu，2004，“Productiveeellulaseadsorptiononcellulose"inLignocelluloseBiodegradation(Saha,B.C.编)，SymposiumSeries889,PP.154-169,AmericanChemicalSociety,Washington,DC所述制备。用MicroplateBCAtmProteinAssayKit测定蛋白质浓度。实施例3米曲霉CEL3Ai3-葡糖苷酶的制备米曲霉CEL3A0-葡糖苷酶如WO2004/099228所述重组制备，并如Langston等，2006，Biochim.Biophys.ActaProteinsProteomics1764:972_978所述纯化。用MicroplateBCAProteinAssayKit测定蛋白质浓度。实施例4里氏木霉CEL7B内切葡聚糖酶I的制备如WO2005/067531所述在米曲霉JaL250中克隆和表达里氏木霉CEL7B内切葡聚糖酶I基因。用MicroplateBCAProteinAssayKit测定蛋白质浓度。将里氏木霉CEL7B内切葡聚糖酶I脱盐并根据制造商的说明用HIPREP26/10DesaltingColumn(GEHealthcareLifeSciences,Piscaaway,NJ,USA)缓冲液交换于150mMNaCl-20mM乙酸钠pH5.O中。实施例5里氏木霉CEL6A内切葡聚糖酶II的制备如下所述将里氏木霉家族GH5A内切葡聚糖酶II基因克隆入米曲霉表达载体。设计如下所示的两个合成的寡核苷酸引物以从里氏木霉RutC30的基因组DNA中扩增内切葡聚糖酶II基因。用DNEASYPlantMaxiKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)分离基因组DNA。用IN-FUSI0NPCRCloningKit(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)将所述片段直接克隆入pAILo2(W02004/099228)。正向引物5，-ACTGGATTTACCATGMCAAGTCCGTGGCTCCATTGCT-3，(SEQIDNO77)反向引物5'-TCACCTCTAGTTAATTAACTACTTTCTTGCGAGACACG·-3'(SEQIDNO78)粗体字母表示编码序列。其余序列包含与PA1L02插入位点相比的序列同一性。将50皮摩尔的以上每种引物用于扩增反应，该扩增反应终体积为50μ1，其包含200ng里氏木霉基因组DNA、1XPfx扩增缓冲液(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)、6μ1的IOmMdATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物、2.5单位PLATINUMPfxDNA聚合酶(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA,USA),禾口1μ150mMMgSO4(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA,USA)。扩增反应在如下设定程序的EPPENDORFMASTERCYCLER5333(EppendorfScientific,Inc.,ffestbury,NY,USA)中温育进行98°C2分钟的1个循环；和94°C30秒、61°C30秒和68°C1.5分钟的循环35个。35个循环之后，反应物在68°C温育10分钟，然后于10°C冷却。用40mMTris碱_20mM乙酸钠-ImMEDTA二钠(TAE)缓冲液和0.1μg/ml溴化乙锭在0.8%GTG_琼脂糖凝胶(CambrexBioproducts,Rutherford,NJ,USA)上分离1.5kb的PCR产物。借助DARKREADER(ClareChemicalResearch,Dolores,CO,USA)使DNA条带可视化。用一次性刀片将1.5kb的DNA条带切下并根据制造商的说明用ULTRAFREEDA离心杯(spincup)(Millipore,Billerica,MA,USA)纯化。通过用NcoI和PacI消化使质粒pAILo2(W02004/099228)线性化。如上所述用凝胶电泳和超滤纯化质粒片段。用IN-FUSI0NPCR克隆试剂盒将所述经纯化的PCR片段克隆入经线性化并经纯化的pAILo2载体。反应物(20μ1)包括IXIN-FUS10Ν缓冲液(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)UXBSA(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)Uμ1IN-FUSION酶(以1:10稀释)(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)、IOOng经NcoI和PacI消化的PAlLo2和IOOng里氏木霉CEL6A内切葡聚糖酶IIPCR产物。反应在室温下温育30分钟。依据制造商的说明用2μ1反应物样品转化大肠杆菌XLlOSOLOPACKGold细胞(Stratagene，LaJolla,CA,USA)在恢复期过后，将来自转化反应的2个100μ1的等份试样涂布在补充了100μg/ml氨苄青霉素的150mm2XYT平板上。将平板在37°C温育过夜。在选择平板上复苏(recover)—组3个推定的重组克隆并用BIOROBOT9600(QIAGEN,Inc.，Valencia,CA,USA)从每一个重组克隆制备质粒DNA。用PciI/BspLUllI限制消化分析克隆。然后将一个具有期望的限制性消化图样的克隆测序以确认克隆的插入物中没有突变。选择克隆#3并将其命名为PAlLo27(图1)。根据Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419_1422的方法制备米曲霉JaL250(W099/61651)原生质体。用5微克PAlLo27(以及PAlLo2作为对照)转化米曲霉JaL250原生质体。用PAlLo27转化米曲霉JaL250产生了约50个转化体。将11个转化体分离至单独的PDA平板并在34°C温育5天。用3ml0.01%TWEEN80洗涤汇合的孢子平板，并用孢子悬浮液接种125ml玻璃摇瓶中的25mlMDU2BP培养基。转化体培养物在34°C温育并以200rpm持续摇动。在接种后的第5天，将培养物在6000xg下离心并收集其上清。5微升的每种上清与等体积的2X上样缓冲液(10%β-巯基乙醇)混合并上样至1.5謹8%-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶，用SIMPLYBLUESafeStain(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA,USA)染色。培养液的SDS-PAGE谱显示，11个转化体中的10个产生约45kDa的新蛋白质条带。将命名为米曲霉JaL250AlLo27的转化体1号在发酵罐中培养。摇瓶培养基的组成为每升50g蔗糖、IOgKH2P04、0.5gCaCl2、2gMgS04·7H20、2gK2S04、2g尿素、IOg酵母提取物、2g柠檬酸和0.5ml痕量金属溶液。痕量金属溶液的组成为每升13.8gFeSO4·7Η20、14·3gZnS04·7Η20、8·5gMnSO4·H20,2.5gCuSO4·5H20和3g柠檬酸。将IOOml摇瓶培养基加入500ml摇瓶。用固体平板培养物的2块琼脂块(plug)接种摇瓶，在轨道摇床上以200rpm在34°C温育24小时。用50ml摇瓶培养液接种3升发酵罐。发酵分批培养基的组成为每升IOg酵母提取物、24g蔗糖、5g(NH4)2S04、2gKH2PO4,0.5gCaCl2·2H20、2gMgSO4.7H20、1克柠檬酸、2gK2S04、0.5ml消泡剂和0.5ml痕量金属溶液。痕量金属溶液的组成为每升13.8gFeSO4·7Η20、14·3gZnSO4·7Η20、8·5gMnSO4·H2O,2.5gCuS04·5Η20和3g柠檬酸。发酵补料培养基(fermentationfeedmedium)由麦芽糖组成。将共1.8升的发酵补料培养基加入3升的有玻璃夹套的发酵罐(ApplikonBiotechnology,Inc.FosterCity,CA,USA)中。发酵补料培养基以0-4.4g/l/hr定量添加185小时。将发酵容器的温度保持在34°C，用APPLIKON1030控制系统(ApplikonBiotechnology,Inc.FosterCity,CA,USA)将pH控制在设定点6·1+/-0.1。以Ivvm的速率向罐中加入空气，并通过以1100-1300rpm旋转的Rushton叶轮(impeller)搅动培养液。在发酵结束时，从发酵容器中收获全部培养液并以3000xg离心以除去生物质。将上清过滤除菌并储存在5-10°C。根据制造商的说明用HIPREP26/10脱盐柱将上清脱盐并缓冲液交换入20mM乙酸钠-150mMNaClρΗ5·0中。用MicroplateBCAProteinAssayKit测定蛋白质浓度。实施例6里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶II的制备如WO2005/056772所述，从里氏木霉RutC30中分离里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶II基因。根据公布的美国专利申请序列号20060156437中所述的步骤用pEJG61作为表达载体在镶片镰孢中表达里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶II基因。如公布的美国专利申请序列号20060156437中所述进行发酵。用MicroplateBCAProteinAssayKit测定蛋白质浓度。根据制造商的说明，用HIPREP26/10脱盐柱将里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶II脱盐并缓冲液交换入20mM乙酸钠-150mMNaClpH5.0中。实施例7:pMJ04表达载体的构建使用如下所示的引物993429(反义)和993428(有义)从里氏木霉RutC30基因组DNAPCR扩增了里氏木霉纤维二糖水解酶1基因(cbhl，CEL7A)终止子，从而构建了表达载体PMJ04。经过工程改造，所述反义引物在5’末端具有PacI位点，有义引物在3’末端具有SpeI位点。引物"3429(反义)5，-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3，(SEQIDNO79)引物993428(有义)5，-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3，(SEQIDNO80)用DNEASYPlantMaxiKit分离里氏木霉RutC30基因组DNA。扩增反应物(50μ1)组成为IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反映缓冲液)(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)、0·3mMdNTP、IOOng里氏木霉RutC30基因组DNA、0.3μΜ引物993429、0.3μΜ引物993428和2单位的VentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)将所述反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C30秒、50°C30秒、72°C60秒的循环5次，然后进行94°C30秒、65°C30秒、72°C120秒的循环25次(最终延伸5分钟)。用TAE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，从凝胶上切下229bp产物条带，并使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)依照制造商的说明进行纯化。所得的PCR片段用PacI和SpeI消化后，用RapidDNALigationKit(快速DNA连接试剂盒)(Roche，Indianapolis,IN,USA)连接到经相同的限制酶消化的pAlLol(TO05/067531)中以产生pMJ04(图2)。实施例8=PCaHj568的构建从pCaHjl70(美国专利5，763，254)和pMT2188构建质粒pCaHj568。质粒pCaHjl70包含特异腐质霉内切葡聚糖酶V(CEL45A)全长编码区(SEQIDN0:11，其编码SEQIDN0:12的氨基酸序列)。通过用如下所示的引物142779和142780从pCaHj483(W098/00529)PCR扩增pUC19复制起点来启动pMT2188的构建。引物142780在PCR片段中引入BbuI位点ο引物1427795，-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3，(SEQIDNO81)引物1427805，-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3，(SEQIDNO82)该扩增使用EXPANDPCRSystem(RocheMolecularBiochemicals,Basel,Switzerland)依照制造商的说明进行。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，使用JetquickGelExtractionSpinKit(离心式快速凝胶提取试剂盒)(Genomed,ffielandstr,Germany)分离并纯化1160bp的片段。使用如下所示的引物140288和142778，利用EXPANDPCRSystem从通用酿酒酵母克隆载体pYES2(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)扩增URA3基因。引物140288在PCR片段中引入EcoRI位点。引物1402885，-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3，(SEQIDNO83)引物1427785，-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3，(SEQIDNO84)在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，使用JetquickGelExtractionSpinKit(离心式快速凝胶提取试剂盒)分离并纯化1126bp的片段。通过将所述两个PCR片段混合并并用如上所示的引物142780和140288以重叠剪接(overlapsplicing)法(Horton等，1989，Gene77:61_68)进行扩增，来将这两个片段融合起来。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，使用JetquickGelExtractionSpinKit(离心式快速凝胶提取试剂盒)分离并纯化2263bp的片段。所得的片段用EcoRI和BbuI消化，并使用标准规程连接于用相同的限制酶消化的pCaHj483的最大片段。将连接混合物转化入依照Mandel和Higa，1970，J.Mol.Biol.45154的方法制成感受态的PyrF-阴性大肠杆菌菌株DB6507(ATCC35673)中。在每升补加了Ig酪蛋白氨基酸、500μg硫胺素和IOmg卡那霉素的M9培养基(Sambrook等，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress)上选择转化子。分离了来自一个转化子的质粒，并命名为PCaHj527(图3)。使用EXPANDPCRSystem并依照制造商的说明，通过PCR对PCaHj527上存在的NA2-tpi启动子进行定点诱变。利用如下所示的诱变引物141223，将核苷酸134-144从GTACTAAAACC(SEQIDNO85)转变为CCGTTAAATTT(SEQIDNO:86)。引物1412235，-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3，(SEQIDNO87)利用如下所示的诱变引物141222，将核苷酸423-436从ATGCAATTTAAACT(SEQIDNO88)转变为CGGCAATTTAACGG(SEQIDNO89)。引物1412225，-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3，(SEQIDNO90)所得的质粒命名为pMT2188(图4)。将特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区从PCaHjl70作为BamHI-SalI片段转移到用BamHI和XhoI消化的pMT2188中，以生成pCaHj568(图5)。质粒pCaHj568包含与特异腐质霉内切葡聚糖酶V全长编码序列可操作地连接的突变的NA2-tpi启动子。实施例9:pMJ05的构建使用如下所示的引物HiEGV-F和HiEGV-R通过从pCaHj568PCR扩增915bp的特异腐质霉内切葡聚糖酶V全长编码区，来构建质粒pMJ05。引物HiEGV-F(有义)5，-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3，(SEQIDNO91)引物HiEGV-R(反义)5，-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3，(SEQIDNO92)扩增反应物(50μ1)的组成为IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol缓冲液)、0.3mMdNTPUOng/μ1pCaHj568、0.3μMHiEGV-F引物、0.3μMHiEGV-R引物和2单位VentDNA聚合酶。将反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C30秒、50°C30秒、72°C60秒的循环5次，然后进行94°C30秒、650C30秒、72°C120秒的循环25次(最终延伸5分钟)。用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，从凝胶上切下937bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit依照生产商的说明进行纯化。用937bp的纯化片段作为模板DNA用于以下述引物进行后续扩增引物HiEGV-R(反义)5，-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3，(SEQIDNO93)弓丨物HiEGV-F-重叠(有义)5’-ΑΓΓΓτΓΓτΓτΑΓΤΓτΓΓτΠΑTCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3(SEOIDNO94)斜体表示的引物序列与里氏木霉纤维二糖水解酶I基因(cbhl)的启动子的17bp同源，下划线的引物序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区的29bp同源。启动子和编码序列之间36bp的重叠使得包含里氏木霉cbhl启动子的994bp片段能够精确的融合于包含特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区的918bp片段。扩增反应物(50μ1)的组成为IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol缓冲液)、0.3mMdNTP、ly1纯化的937bpPCR片段、0.3μΜHiEGV-F-重叠引物、0.3μMHiEGV-R引物和2单位VentDNA聚合酶。将反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94V30秒、50V30秒、72°C60秒的循环5次，然后进行94°C30秒、65°C30秒、72°C120秒的循环25次(最终延伸5分钟)。用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，从凝胶上切下945bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit依照生产商的说明进行纯化。使用如下所示的引物(该有义引物经工程改造在5’末端具有SalI限制位点)进行单独的PCR，来从里氏木霉RutC30基因组DNA扩增里氏木霉cbhl启动子序列，该序列从所述基因的ATG起始密码子上游994bp开始延伸。里氏木霉RutC30基因组DNA是用DNEASYPlantMaxiKit分离的。引物TrCBHIpro-F(有义)5，-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3，(SEQIDNO95)弓丨物TrCBHIpro-R(反义)5，-GATGCGCAGTCCGCGGT-3，(SEQIDNO96)扩增反应物(50μ1)的组成为IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPolβ.应缓冲液)、0.3mMdNTP、IOOng/μ1里氏木霉RutC30基因组DNA、0.3μMTrCBHIpro-F引物、0.3μΜTrCBHIpro-R引物和2单位VentDNA聚合酶。将反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育94°C30秒、55°C30秒、72°C120秒的循环30次(最终延伸5分钟)。用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，从凝胶上切下998bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。用纯化的998bpPCR片段作为模板DNA用于以下述引物进行后续扩增。引物TrCBHIpro-F5，-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3，(SEQIDNO97)引物TrCBHIpro-R-重叠5，-GGAGGGGGGAGGAACGCATGATGCGCAGTCCGCGGT·3，(SEQIDNO98)斜体表示的序列与里氏木霉cbhl启动子的17bp同源，下划线的序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区的29bp同源。启动子和编码序列之间36bp的重叠使得包含里氏木霉cbhl启动子的994bp片段能够精确的融合于包含特异腐质霉内切葡聚糖酶V全长编码区的918bp片段。扩增反应物(50μ1)的组成为IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反应缓冲液)、0.3mMdNTP、1μ1纯化的998bpPCR片段、0.3μMTrCBHlpro-F引物、0.3μΜTrCBHlpro-R-重叠引物和2单位VentDNA聚合酶。将反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C30秒、50V30秒、720C60秒的循环5次，然后进行94°C30秒、65°C30秒、72°C120秒的循环25次(最终延伸5分钟)。用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，从凝胶上切下1017bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。用1017bp里氏木霉cbhl启动子PCR片段和945bp特异腐质霉内切葡聚糖酶VPCR片段作为模板DNA用于以下述引物进行后续扩增，以使用重叠PCR将994bpcbhl启动子精确地融合于918bp内切葡聚糖酶V全长编码区。引物TrCBHIpro-F5，-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3，(SEQIDNO99)引物HiEGV-R:5，-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3，(SEQIDNO100)扩增反应物(50μ1)的组成为IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反应缓冲液)、0.3mMdNTP、0.3μΜTrCBHlpro-F引物、0.3μMHiEGV-R引物和2单位VentDNA聚合酶。将反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行940C30秒、50°C30秒、72°C60秒的循环5次，然后进行94°C30秒、65°C30秒、72°C120秒的循环25次(最终延伸5分钟)。用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，从凝胶上切下1926bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。将所得的1926bp片段使用ZEROBLUNTTOPOPCRCloningKit(ZEROBLUNTTOPOPCR克隆试剂盒)(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)依照制造商的规程克隆入pCR-Blunt-II-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)中。所得的载体用NotI和SalI消化，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)凝胶纯化1926bp片段，然后使用T4DNA连接酶(Roche,Indianapolis,IN,USA)连接到pMJ04(其也用同样两种限制酶消化)中，产生pMJ05(图6)。质粒pMJ05包含与特异腐质霉内切葡聚糖酶V全长编码序列可操作地连接的里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子及终止子。实施例10:PSMail30表达载体的构建从作为模板的pJaL660(W02002/095014)用如下所示的引物993467(有义)和993456(反义)通过PCR扩增了米曲霉β-葡糖苷酶全长编码序列(cDNA序列SEQIDNO47；推定的氨基酸序列SEQIDNO48；大肠杆菌DSM14240)中从ATG起始密码子直到TAA终止密码子的2586bp的DNA片段。SpeI位点被工程构建到反义引物的5’末端以便于连接。斜体字的引物序列与里氏木霉cbhl启动子的24bp同源，下划线的序列与米曲霉β-葡糖苷酶编码区的22bp同源。引物993467:5，-ATAGTCAΑΓΓΓτΓΓτΓτΑηΤΓτΓΓτΓΑΤΓATGAAGCTTGGTTGGATCGAGG-3，(SEQIDΝ0:101)引物993456:5，-ACTAGTTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3，(SEQIDNO102)扩增反应物(50μ1)的组成为Pfx扩增缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),0.25mMdNTP,IOngpJaL660，6.4μM引物993467，3.2μM引物993456，ImMMgCl2和2.5单位PfxDNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad，CA，USA)。将反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C1分钟、55°C1分钟、72°C3分钟的循环30次(最终延伸15分钟)。用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，从凝胶上切下2586bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。使用如下所示的引物993453(有义)和引物993463(反义)进行单独的PCR，来扩增里氏木霉cbhl启动子序列(其从该基因ATG起始密码子上游IOOObp处开始延伸)，以产生IOOObp的PCR片段。引物993453:5，-GTCGACTCGAAGCCCGAATGTAGGAT-3，(SEQIDNO103)引物"!Μ63:5，-CCTCGATCCAACCAAGCTTCATGATGCGCAGTCCGCGGTTGACTA-3，(SEQIDNO104)斜体表示的引物序列与里氏木霉cbhl启动子的24bp同源，下划线的引物序列与米曲霉β-葡糖苷酶全长编码区的22bp同源。启动子和编码序列之间46bp的重叠使得包含里氏木霉cbhl启动子的IOOObp片段能够精确的融合于包含米曲霉β-葡糖苷酶编码区的2586bp片段。扩增反应物(50μ1)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mMdNTP、IOOng里氏木霉RutC30基因组DNA、6.4μM引物993453、3.2μM引物993463、lmMMgClJP2.5单位PfxDNA聚合酶。将反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C1分钟、55°C1分钟、72°C3分钟的循环30次(最终延伸15分钟)。用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，从凝胶上切下IOOObp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。用纯化的片段作为模板DNA，进一步使用上文所示的引物993453(有义)和引物993456(反义)通过重叠PCR进行扩增，从而将包含里氏木霉cbhl启动子的IOOObp片段精确地融合于包含米曲霉β-葡糖苷酶全长编码区的2586bp片段。扩增反应物(50μ1)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mMdNTP,6.4μM引物99353、3.2μM引物993456、ImMMgCl2和2.5单位PfxDNA聚合酶。将反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C1分钟、60°C1分钟、720C4分钟的循环30次(最终延伸15分钟)。将所得的3586bp片段用SalI和SpeI消化，并连接到用同样两种限制酶消化过的PMJ04中，产生pSMail30(图7)。质粒pSMail30包含与米曲霉天然β-葡糖苷酶信号序列及编码序列(即全长米曲霉葡糖苷酶编码序列)可操作地连接的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子及终止子。实施例11:PSMail35的构建从作为模板的pJaL660利用如下所示的引物993728(有义)及引物993727(反义)PCR扩增出从Lys-20到TAA终止密码子的米曲霉β_葡糖苷酶成熟编码区(减去天然信号序列，见图8；SEQIDNO105和106代表信号肽和它的编码序列)。引物993728:5’-ταγγγτγττγτττγτγτπηηττγτπηaaggatgatctcgcgtactccc-3(seqidno:io7)引物993727:5’-gactagtcttactgggccttaggcagcg-3，(seqidno:108)斜体字的序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列的20bp同源，下划线的序列与米曲霉β-葡糖苷酶编码区的22bp同源。将SpeI位点工程化到反义引物的5’端中。扩增反应物(50μ1)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mMdNTP、IOng/μlpJaL660、6.4μM引物993728、3.2μM引物993727、ImMMgCl2和2.5单位PfxDNA聚合酶。将反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C1分钟、550C1分钟、72°C3分钟的循环30次(最终延伸15分钟)。用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，从凝胶上切下2523bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。使用如下所示的引物993724(有义)和引物993729(反义)进行单独的PCR扩增来扩增里氏木霉cbhl启动子的IOOObp和特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列的63bp(ATG起始密码子到Ala-21,图9，SEQIDNO109和110)。引物993724:5，-acgcgtcgaccgaatgtaggattgttatcc-3，(seqidno111)引物“37295，-gggagtacgcgagatcatccttCtCtCAAGCtCtCCAACACCGCtCA_3，(seqidno112)斜体字的引物序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列的20bp同源，下划线的引物序列与米曲霉β“葡糖苷酶编码区的22bp同源。用包含在cbhl启动子控制下的特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区的质粒pMJ05作为模板，以产生包含里氏木霉cbhl启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列片段的1063bp片段。里氏木霉cbhl启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列与米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码序列之间有42bp的重叠，以提供所述启动子与2523bp米曲霉β-葡糖苷酶编码区的ATG起始密码子之间的完美连接。扩增反应物(50μ1)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mMdNTP、IOng/μlpMJ05、6.4μM引物993728、3.2μM引物993727、ImMMgCl2和2.5单位PfxDNA聚合酶。将反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C1分钟、600C1分钟、72°C4分钟的循环30次(最终延伸15分钟)。用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，从凝胶上切下1063bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。用纯化的重叠片段作为模板，用如上所述的引物993724(有义)和引物993727(反义)进行扩增，以通过重叠PCR将所述包含里氏木霉cbhl启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列的1063bp片段精确地融合于所述包含米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码区框的2523bp片段。扩增反应物(50μ1)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mMdNTP,6.4μM弓丨物993724、3.2μΜ引物993727、lmMMgCl2和2.5单位PfxDNA聚合酶。将反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C1分钟、60°C1分钟、72°C4分钟的循环30次(最终延伸15分钟)。用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，从凝胶上切下3591bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。将所得的3591bp片段用SalI和SpeI消化，连接到用相同的限制酶消化过的PMJ04中产生pSMail35(图10)。质粒pSMai135包含可操作地连接于特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列和米曲霉β_葡糖苷酶成熟编码序列的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和终止子。实施例12带有特异腐质霉内切葡聚糖酶V分泌序列的米曲霉β-葡糖苷酶的表达通过PEG-介导的转化(Penttila等，1987，Gene61155-164)将编码与特异腐质霉内切葡聚糖酶V分泌信号连接的成熟米曲霉葡糖苷酶的质粒pSMail35(图9)导入里氏木霉RutC30中。该质粒含有构巢曲霉amdS基因，使得转化子可以利用乙酰胺作为唯一氮源生长。将里氏木霉RutC30在25ml添加了2%(w/v)葡萄糖和IOmM尿苷的YP培养基中在27°C、90rpm条件下培养17个小时。用VacuumDrivenDisposableFiltrationSystem(—次性真空驱动过滤系统)(Millipore，Bedford,MA,USA)通过过滤收集菌丝体，用去离子水和1.2M山梨醇各洗涤两次。将经过洗涤的菌丝体重悬在含15mg/mlGLUCANEX(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)禾口0.36单位/ml壳多糖醇(SigmaChemicalCo.，St.Louis,M0,USA)的20ml1.2M山梨醇中，在90rpm轻柔震荡下在34°C温育15-25分钟来生成原生质体。通过在400xg离心7分钟收集原生质体，用冷的1.2M山梨醇洗涤两次。原生质体用血细胞计数器计数并重悬于STC中至终浓度为IXlO8个原生质体/ml。多余的原生质体在CryoI0CFreezingContainer(1°C冷冻柜)(Nalgene，Rochester，NY，USA)中在-80°C保存。将大约7μg经PmeI消化的pSMai135加入100μ1原生质体溶液中，轻柔混合，然后加入260μ1PEG缓冲液，混合，并在室温温育30分钟。然后加入STC(3ml)，混合，将转化溶液涂布到使用构巢曲霉amdS选择的COVE平板上。将平板在28°C温育5_7天。将转化子在C0VE2平板上传代培养，使其在28°C生长。将用PSMail35获得的67个转化子(称为SMA135)在含有乙酰胺的新鲜平板上传代培养，让它们在28°C产生孢子7天。将这67个SMA135里氏木霉转化子在含25mlpH6.0纤维素酶诱导培养基的125ml带挡板摇瓶中培养，其中用所述转化子的孢子接种培养基并在28°C、200rpm条件下温育7天。用里氏木霉RutC30作为对照。在第7天取出培养液样品。将每种培养液Iml在微量离心管中以15，700xg离心5分钟，将上清液转移到新管中。样品保存在4°C直到进行酶测定。用对硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷作为底物测定上清液的葡糖苷酶活性，如下所述。β-葡糖苷酶活性测定在环境温度下进行，使用25μ1在50mM琥珀酸盐(succinate)pH5.0中110稀释过的培养上清液的等分试样，在作为底物的200μ10.5mg/ml对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(溶于50mM琥珀酸盐pH5.0)中实施。温育15分钟后通过加入100μIlMTriS-HClpH8.0终止反应，用分光光度计读取405nm吸光度。1个单位的β_葡糖苷酶活性对应于在PH5.0、环境温度下每升每分钟产生1μmol对硝基苯。用黑曲霉β-葡糖苷酶(N0V0ZYM188,NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)作为酶标准ρBFIο若干个SMA135转化子显示了为里氏木霉RutC30所分泌的数倍高的β-葡糖苷酶活性。一个命名为SMA135-04的转化子产生了最高的β-葡糖苷酶活性。用CRITERION系统(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)使用CRITERIONTris-HCl(5%分离型)凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行SDS-PAGE。将5μ1第7天上清液(见上文)重悬在2Χ浓度的LaemmliSampleBuffer(Laemmli样品缓冲液)(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)中，在5%β-巯基乙醇存在下煮沸3分钟。将上清液样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，并以IXTris/甘氨酸/SDS作为运行缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行电泳。所得的凝胶用BIO-SAFECoomassieBlueStain(考马斯亮蓝染料)(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)染色。在38个通过SDS-PAGE分析的里氏木霉SMA135转化子中，26个产生了大约1IOkDa的蛋白质，其未见于作为对照的里氏木霉RutC30。转化子里氏木霉SMA135-04产生的β-葡糖苷酶水平最高，如通过SDS-PAGE所见的IlOkDa条带的丰度所证明的。将里氏木霉SMA135-04通过孢子划线进行两轮平板上的生长，确保其为纯系菌株(clonalstrain)，在扩大至工艺规模发酵罐生产之前冷冻多个小管。从真菌细胞生物质回收所得的蛋白质培养液，过滤、浓缩并进行配制。所述纤维素分解酶制剂被命名为纤维素分解酶组合物#1。实施例13表达载体pSMail40的构建通过用Nco1消化质粒？5々161118641(1004/099228)而构建表达载体pSMail40，质粒pSATelllBG41携带米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41全长编码区(SEQIDΝ0:113，其编码SEQIDNO114的氨基酸序列)。所得1243bp的片段用TAE缓冲液在1.0%的琼脂糖凝胶上分离并使用QIAQUICKGelExtractionKit根据制造商的说明进行纯化。用NcoI消化表达载体pSMail35，用TAE缓冲液在1.0%的琼脂糖凝胶上分离8286bp的片段并使用QIAQUICKGelExtractionKit根据制造商的说明进行纯化。然后用T4DNA连接酶(Roche，Indianapolis,IN,USA)根据制造商的规程将1243bp经NcoI消化的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41片段与8286bp的载体连接产生表达载体pSMail40(图11)。质粒pSMai140包含与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列以及米曲霉β-葡糖苷酶变体的成熟编码序列可操作地连接的里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)基因启动子和终止子。实施例14用pSMai140转化里氏木霉RutC30用PmeI将质粒pSMai140线性化并如实施例12所述转化入里氏木霉RutC30菌株。从4个独立的转化实验中共获得100个转化体，将所有转化体在摇瓶中在纤维素酶诱导性培养基上培养，然后如实施例12所述从转化体的培养基中测定葡糖苷酶活性。许多里氏木霉SMA140转化体显示为里氏木霉RutC30数倍高的β-葡糖苷酶活性。通过实施例12所述的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Coomassie染色从分析过酶活性的同样13个培养物上清检测到培养基中米曲霉葡糖苷酶变体BG41蛋白质的存在。所有13个具有高葡糖苷酶活性的转化体也以不同产率表达约IlOkDa的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41。如通过β_葡糖苷酶活性测定和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所评价的，将表达最高β-葡糖苷酶变体的转化体命名为里氏木霉SMA140-43。实施例15表达载体pSaMe-Fl的构建用pMJ05作为模板，用下述引物PCR扩增包含209bp的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V基因的核心区(SEQIDNO:11的核苷酸1-702，其编码SEQIDNO12的氨基酸1-234，WO91/17243)的DNA片段。引物995103:5，-cccaagcttagccaagaaca-3，(SEQIDNO115)引物995137:5'-gggggaggaacgcatgggatctggacggc-3'(SEQIDNO116)扩增反应物(50μ1)的组成为IXPfx扩增缓冲液、IOmMdNTP、50mMMgS04、IOng/μ1pMJ05、50皮摩尔995103引物、50皮摩尔995137引物和2单位PfxDNA聚合酶。所述反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C30秒、55°C30秒和72°C60秒的循环30次(3分钟最后延伸)。用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，将911bp的产物条带从凝胶上切下，并根据制造商的说明用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。用pSMail40作为模板与下述引物PCR扩增包含806bp米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41基因的DNA片段。引物995133:5'-gccgtccagatccccatgcgttcctccccc-3'(SEQIDNO117)引物995111:5'-ccaagcttgttcagagtttc-3'(SEQIDNO:118)扩增反应物(50μ1)的组成为IXPfx扩增缓冲液、IOmMdNTPs、50mMMgS04、IOOngpSMail40、50皮摩尔995133引物、50皮摩尔995111引物和2单位PfxDNA聚合酶。所述反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C30秒、55°C30秒和72°C120秒的循环30次(3分钟最后延伸)。用TAE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，将806bp的产物条带从凝胶上切下并根据制造商的说明用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。然后将以上两个PCR片段进行重叠PCR。使用纯化的重叠片段作为扩增模板，用于使用上述引物995103(有义)和引物995111(反义)进行扩增，以通过重叠PCR将包含209bp的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心序列的702bp片段精确融合于包含一部分米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41编码区的806bp片段。扩增反应物(50μ1)的组成为IXPfx扩增缓冲液、IOmMdNTP、50mMMgS04、2.5μ1的每种片段(20ng/μ1)、50皮摩尔995103引物、50皮摩尔995111引物和2单位的PfxDNA聚合酶。所述反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行95°c初始变性3分钟，然后进行1分钟变性、60°C1分钟退火和72°C3分钟延伸的循环30次。用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，将1.7kb的产物条带从凝胶上切下并根据制造商的说明用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。根据制造商的说明将1.7kb的片段连入pCR4平末端载体(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)。然后根据制造商的快速化学转化步骤将构建体转化入ONESHOTT0P10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。通过质粒分离和用HindIII消化选择与分析菌落，以释放1.7kb的重叠PCR片段。同样用HindIII消化质粒pSMail40以将质粒线性化。使用RapidDNALigationKit根据制造商的说明将两个消化的片段在连接反应中组合以产生pSaMe-Fl(图12)。将大肠杆菌XLI-BlueSubcloning-GradeCompetentCells(大肠杆菌XLl-蓝色亚克隆级感受态细胞)(Stratagene，LaJolla,CA,USA)用连接产物转化。通过对从转化的大肠杆菌中纯化的质粒进行DNA测序来确认构建体的身份，所测序列为里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41和里氏木霉纤维二糖水解酶I基因终止子序列。一个包含重组质粒的克隆被命名为PSaMe-Fl。质粒PSaMe-Fl包含里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和终止子，和特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号肽序列，特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号肽序列直接与特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心多肽连接，特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心多肽直接与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号肽融合，特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号肽直接与米曲霉β_葡糖苷酶变体BG41成熟编码序列连接。米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列分别如SEQIDNO57和58所示。实施例16用pSaMe-Fl转化里氏木霉RutC30将含有25ml补加了2%葡萄糖和IOmM尿苷的YP培养基的摇瓶用5X107个里氏木霉RutC30的孢子接种。在27°C，90rpm的条件下大约16小时温育过夜之后，用真空驱动的抛弃式过滤系统收集菌丝。菌丝在100ml去离子水中洗涤两次，在1.2M的山梨醇中洗涤两次。如实施例12所述产生原生质体。将两微克经PmeI线性化的pSaMe-FlDNA，100μ1的里氏木霉RutC30原生质体和50%PEG(4000)混合并在室温下温育30分钟。然后加入3mlSTC并将内容物倾倒至补加了IOmM尿苷的COVE平板上。然后将平板在28°C温育。转化体在第6天开始出现并被挑出至C0VE2平板上在28°C生长6天。回收了22个里氏木霉转化体。将转化体在摇瓶中在纤维素酶诱导性培养基上培育，并如实施例12所述测定β-葡糖苷酶活性。许多PSaMe-Fl转化体都产生β-葡糖苷酶活性。一个命名为里氏木霉SaMeFl-9的转化体产生最大量的β_葡糖苷酶，与表达米曲霉β_葡糖苷酶变体的菌株(实施例15)相比，其具有两倍的活性。内切葡聚糖酶的活性根据Beguin,1983，AnaalicalBiochem.131(2):333_336用羧甲基纤维素(CMC)覆层(overlay)测定法测定。将从5个培养液样品(具有最高β_葡糖苷酶活性的那些)中得到的5yg总蛋白用NativeSampleBuffer(天然样品缓冲液)(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)稀释并用IOXTris/甘氨酸运行缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA,USA)在CRITERION8-16%Tris-HCl凝胶上运行，然后将凝胶铺在含有1%羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)的平板的上面。在37°C温育1小时后，将凝胶用0.CongoRed(刚果红)染色20分钟。然后用IMNaCl为平板脱色以鉴定指示内切葡聚糖酶活性的澄清区域。两个澄清区域可见，一个为约IlOkDa的上方区域，另一个为约25kDa的下方区域。特异腐质霉内切葡聚糖酶V和米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41融合体的预测蛋白质大小是118kDa，如果两个蛋白质未被切割并保持为单个多肽的话；单个内切葡聚糖酶V核心域和β_葡糖苷酶的糖基化导致单个蛋白质迁移到比根据一级序列预测的更高的分子量(mw)。如果两个蛋白质被切割，那么特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心域的预测大小是24kDa而米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41的预测大小是94kDa。由于IlOkDa处存在澄清区域，这一结果显示最起码内切葡聚糖酶和葡糖苷酶融合蛋白的群体作为单个的大蛋白保持完整。下方澄清区域很可能代表内源的内切葡聚糖酶活性，可能是由于特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心域与米曲霉β-葡糖苷酶的部分断裂而额外导致的。所述结果证明特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心是有活性的，即使是将其连接到米曲霉β-葡糖苷酶。此外，葡糖苷酶活性的提高似乎是由于蛋白质分泌的分泌效率相对于非融合的β-葡糖苷酶的分泌效率的增加所致。通过将米曲霉葡糖苷酶变体BG41序列连接到有效分泌的特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心，使更多的β-葡糖苷酶被分泌。实施例17载体pSaMe-FX的构建质粒pSaMe-FX通过修饰pSaMe-Fl而构建。用BstZ17和EcoRI消化质粒PSaMe-Fl以产生含有β-葡糖苷酶变体BG41编码序列的Ikb片段和包含质粒剩余部分的9.2kb片段。所述片段用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离，将9.2kb的片段根据制造商的说明用QIAQUICKGelExtractionKit切下并纯化。质粒pSMail35也用BstZ17和EcoRI消化以产生含有与米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41编码序列同源的碱基的Ikb片段和含有质粒剩余部分的8.5kb片段。如上分离和纯化Ikb片段。根据制造商的说明用RapidDNALigationKit在连接反应中组合9.2kb和Ikb的片段以产生pSaMe-FX，其除了含有野生型β-葡糖苷酶成熟编码序列而不是变体成熟编码序列之外，与pSaMe-Fl相同。用连接产物转化大肠杆菌SURE感受态细胞(Stratagene，LaJolla,CA,USA)。通过对里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心序列、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码序列和来自经转化的大肠杆菌中纯化的质粒上的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因终止子序列的DNA测序来确定构建体的身份。将一个含有重组质粒的克隆命名为pSaMe-FX(图13)。米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列分别如SEQIDNO59和60所示。实施例18木霉转化体的转化和表达如实施例16所述用PmeI线性化pSaMe-FX构建体并将其转化入里氏木霉RutC30菌株。单次转化共获得63个转化体。转化体在摇瓶中的纤维素酶诱导性培养基上培养并如实施例12所述测定β-葡糖苷酶活性。许多pSaMe-FX转化体产生了β-葡糖苷酶活性。一个命名为SaMe_FX16的转化体与里氏木霉SaMeFl_9(实施例16)相比产生了两倍量的葡糖苷酶活性。实施例19里氏木霉转化体的分析如实施例15所述，通过融合特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心(包含其自身的天然信号序列)和与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列连接的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41成熟编码序列来构建融合蛋白。和与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列连接的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41成熟编码序列相比，该融合构建体导致分泌的β-葡糖苷酶的活性增加为两倍(two-foldincrease)0第二个融合构建体如实施例17所述产生，其由与米曲霉野生型葡糖苷酶编码序列(该序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列连接)融合的特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心(包括其自身信号序列)组成，而这导致β-葡糖苷酶活性的进一步提高。用野生型融合蛋白转化的菌株相对于用葡糖苷酶变体BG41融合蛋白转化的菌株具有两倍的分泌的葡糖苷酶活性。实施例20将β-葡糖苷酶融合蛋白编码序列克隆入米曲霉表达载体设计如下所示的两个合成寡核苷酸引物，以从编码葡糖苷酶融合蛋白的PSaMeFXPCR扩增全长开放阅读框。PCR正向引物5'-GGACTGCGCAGCATGCGTTC"3'(SEQIDNO119)PCR反向引物5'-AGTTAATTAATTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3'(SEQIDno:120)粗体字母代表编码序列。正向引物中带有下划线的‘‘G”表示引入的用以产生SphI限制性位点的碱基改变。剩余的序列与PSaMeFX插入位点相比包含序列同一性。反向引物中带有下划线的序列表示添加的PacI限制性位点，其有助于在表达载体PAlLo2中克隆该基因(W004/099228)。在PCR反应中使用50皮摩尔的上述每种引物，所述PCR反应在50μ1终体积中包含50ngρSaMeFXDNAUXPfx扩增缓冲液、6μ1IOmMdATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物、2.5单位PLATINUMPfxDNA聚合酶和1μ150mMMgSO40扩增反应在如下设定程序的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行98°C2分钟的1个循环；和960C30秒、61°C30秒和68°C3分钟的循环35个。35个循环之后，反应物在68°C温育10分钟，然后于10°C冷却。用TAE缓冲液和0.1μg/ml溴化乙锭在0.8%GTG_琼脂糖凝胶上分离3.3kb的PCR反应产物。为了避免UV-诱导的突变，借助DARKREADER使DNA可视化。用一次性刀片将3.3kb的DNA条带切下并根据制造商的说明用ULTRAFREE-DA离心杯(spincup)纯化。将纯化的3.3kbPCR产物克隆入pCR4Blunt_TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)。将4微升纯化的PCR产物与1μ12M氯化钠溶液和1μ1TOPO载体混合。反应物在室温下温育15分钟，然后根据制造商的说明用2μ1反应物转化ONESHOTT0P10化学感受态大肠杆菌细胞。将每个转化反应的三个83μ1的等份试样涂布在补加了100μg/ml氨苄青霉素的三个150mm2XYT平板上并在37°C温育过夜。用8个重组菌落为含有补加了100μg/ml氨苄青霉素的3mlLB培养基接种。用BIOROBOT9600从这些培养物中制备质粒DNA。克隆用PacI限制酶消化进行分析。将来自每个克隆的质粒DNA用PacI消化并用TAE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。所有的8个克隆都具有期望的限制消化图样，选择克隆5、6、7和8进行测序以确认在克隆的插入物中没有突变。对它们的5’和3’末端的序列分析显示所有的4个克隆都具有正确的序列。选择克隆5和7进行进一步测序。两个克隆都测序为PhredQ值超过40以确保没有PCR导致的错误。克隆5和7显示具有期望的序列而选择克隆5重克隆入PAlLo2。通过用SphI消化将来自克隆5的质粒DNA线性化。然后通过加入1.2μIlOmM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物和6单位的T4DNA聚合酶(NewEnglandBioloabs,Inc.，Ipswich,MA,USA)将线性化的克隆平末端化。所述混合物在12°C温育20分钟，然后通过加入1μ10.5ΜEDTA停止反应并在75°C加热20分钟使酶失活。编码β-葡糖苷酶融合蛋白的3.3kb片段如上所述通过凝胶电泳和超滤纯化。通过用NcoI消化使载体PAlLo2线性化。然后通过加入0.5μIlOmM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物和1单位的DNA聚合酶I使线性化的载体平末端化。在25°C将混合物温育15分钟，然后通过加入1μ10.5MEDTA停止反应并在75°C加热15分钟使酶失活。然后用PacI消化载体。平末端化的载体如上所述通过凝胶电泳和超滤纯化。将编码β-葡糖苷酶融合蛋白的3.3kb片段克隆入经线性化和纯化的PAlLo2载体，所述克隆是用RapidDNALigafionKit进行的。根据制造商的说明用1μ1反应样品转化大肠杆菌XLlOSOLOPACKGold细胞(Stratagene，LaJolla,CA,USA)0在回收阶段之后，将来自转化反应的2个100μ1等份试样涂布在补加了100μg/ml氨苄青霉素的2个150mm2XYT平板上并在37°C温育过夜。从选择平板上随机挑选一组8个推定的重组克隆并用BIOROBOT9600从每个克隆制备质粒DNA。选择克隆1-4用PAlLo2特异性引物测序以确认连接载体/插入物具有正确的序列。克隆3具有完美的载体/插入物连接并被命名为PAlLo47(图14)。为了获得无标记的表达菌株，进行限制性内切酶消化将赋予对抗生素氨苄青霉素的抗性的blaA基因与表达构建体的其它部分分离。用PmeI消化30微克PAlLo47。然后将经消化的DNA如上所述用琼脂糖凝胶电泳纯化。用刀片将含有表达构建体但缺少blaA基因的6.4kbDNA条带切下并用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。实施例21特异腐质霉/米曲霉cel45A核心-cel3A融合基因在米曲霉JaL355中的表达根据Christensen等，1988，同上的方法制备米曲霉JaL355(W000/240694)的原生质体。使用10微升实施例20的经纯化的表达构建体转化米曲霉JaL355原生质体。米曲霉JaL355的转化产生大约90个转化体。分离50个转化体至单独的PDA平板上并在34°C温育5天。用3ml0.01%TWEEN80洗涤48个汇合的孢子平板，并用孢子悬浮液接种125ml玻璃摇瓶中的25mlMDU2BP培养基。转化体培养物在34°C温育并以200rpm持续摇动。5天之后，将每个培养物的Iml等份试样在12，OOOxg离心并收集其上清。5μ1的每种上清与等体积的2Χ上样缓冲液(10%β-巯基乙醇)混合并上样至1.5mm8%-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶，用BIO-SAFECoomassieBlueStain染色。培养液的SDS-PAGE谱显示，48个转化体中的33个能够表达表观分子量与期望的IlSkDa非常相近的新蛋白质。转化体21具有最佳产率并被选择进行进一步研究。实施例22米曲霉JaL355转化体21的单孢子分离将米曲霉JaL355转化体21的孢子涂布在PDA平板上并在34°C温育5天。将汇合的孢子平板上的一小块区域用0.5ml0.01%TWEEN80洗涤以重悬孢子。将孢子悬浮液100μ1的等份试样用0.01%TWEEN80稀释至终体积5ml。借助血球计数器(hemocytometer)测定孢子浓度并将其稀释至终浓度为每微升0.1个孢子。将孢子稀释液200μ1的等份试样涂布在150mm基础培养基平板上并在34°C温育2_3天。将出现的克隆从平板上切下转移至PDA平板并在34°C温育3天。然后将孢子涂布在平板上并在34°C再温育5天。将汇合的孢子平板用3ml0.01%TWEEN80洗涤并用孢子悬浮液接种125ml玻璃摇瓶中的25mlMDU2BP培养基。单孢子培养物在34°C温育并以200rpm持续摇动。5天之后，将每个培养物的Iml等份试样以12，OOOxg离心并收集其上清。5μ1的每种上清与等体积的2Χ上样缓冲液(10%β-巯基乙醇)混合并上样至1.5mm8%-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶，用BIO-SAFECoomassieBlueStain染色。培养液的SDS-PAGE谱显示所有的8个转化体都能够以非常高的水平表达β-葡糖苷酶融合蛋白，而将产生最高产率的培养物之一命名为米曲霉JaL355AlLo47。实施例23:pCW087的构建设计如下所示的2个合成寡核苷酸引物以从质粒pDZA2-7(W02005/074656)中PCR扩增桔橙嗜热霉GH61A多肽基因。正向引物产生平的5’末端而反向引物在3’末端并入PacI位点。正向引物5，-ATGTCCTTTTCCAAGATAATTGCTACTG-3，(SEQIDNO121)反向引物5，-GCTTAATTAACCAGTATACAGAGGAG-3，(SEQIDNO122)将50皮摩尔的以上各种引物用于终体积为50μ1的PCR反应中，所述反应的组成为50ngpDZA2-7、lμIlOmMdATP、dTTP、dGTP禾口dCTP混合物、5μIlOXACCUTAQDNA聚合酶缓冲液(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO,USA)和5单位ACCUTAQDNA聚合酶(Sigma-Aldrich,St.Louis,M0,USA)。用EPPENDORFMASTERCYCLER5333扩增DNA片段，程序设定为95°C3分钟，1个循环；94°C45秒、55°C60秒和72°C1分30秒，30个循环。25个循环之后，将反应在72°C温育10分钟然后冷却至4°C直到进一步处理。用PacI消化桔橙嗜热霉GH61APCR片段的3，末端。根据制造商的说明用MINELUTEReactionCleanupKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)纯化消化产物。利用5’末端平的NcoI位点和3’末端的PacI位点将GH61A片段直接克隆入pSMail55(W02005/074647)。质粒pSMail55用NcoI和PacI消化。然后用Klenow酶将NcoI位点变平以填补5，凹陷的NcoI位点。Klenow反应由20μ1pSMail55消化混合物加ImMdNTP和IylKlenow酶组成，短暂地在室温温育。将刚刚线性化的pSMail55质粒根据制造商的说明用MINELUTEReactionCleanupKit纯化。这些反应导致产生与新产生的GH61A片段相适应的5’平末端和3’PacI位点。然后根据制造商的说明用RapidDNALigationKit将GH61A片段克隆入pSMail55表达载体。用连接产物转化大肠杆菌XLl-BlueSubcloning-Grade感受态细胞(Stratagene，LaJolla,CA,USA)通过DNA测序来自质粒的GH61A编码序列来确认构建体的身份，该质粒是从经转化的大肠杆菌中纯化的。含有重组质粒的一个大肠杆菌克隆被命名为PCW087-8。实施例24:pSaMe-Ta61A的构建表达载体pSaMe-Ta61通过用NsiI消化携带amdS选择标记的质粒pMJ09，释放2.7kb的amdS片段而构建。然后用TAE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离2.7kb的amdS片段并用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。用NsiI消化表达载体pCW087，将4.7kb的片段用TAE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离并用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。然后根据制造商的方案用T4DNA连接酶(Roche，Indianapolis，IN，USA)将2.7kb的amdS片段与4.7kb的载体片段连接以产生表达载体pSaMe-Ta61A。质粒pSaMe-Ta61A包含可操作地连接到桔橙嗜热霉GH61A成熟编码序列的里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)基因的启动子和终止子。实施例25里氏木霉菌株SaMe_MF268的构建用共转化将质粒pSaMe-FX和pSaMe_Ta61A导入里氏木霉RutC30。质粒pSaMe_FX和pSaMe-Ta61A是通过PEG-介导的转化(Penttila等，1987，同上)导入里氏木霉RutC30的。每个质粒含有构巢曲霉amdS基因能够使转化体利用乙酰胺作为唯一氮源生长。里氏木霉RutC30在27°C和90rpm条件下在补加了2%(w/v)葡萄糖和IOmM尿苷的25mlYP培养基中培养17小时。用真空驱动的抛弃式过滤系统通过过滤收集菌丝并用去离子水洗涤2次，1.2M山梨醇洗涤2次。用含有15mg/mlGLUCANEX和0.36单位/ml壳多糖酶(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)的20ml1.2M山梨醇悬浮洗涤后的菌丝并在34°C以90rpm轻柔振荡15-25分钟以产生原生质体。通过在400xg的条件下离心7分钟收集原生质体并用冷的1.2M山梨醇洗涤2次。原生质体用血细胞计数器计数并在STC中重悬至终浓度为IXlO8个原生质体/ml。将过量的原生质体在-80°C贮存于Cryo1°CFreezingContainer中。用PmeI消化各约4μg的质粒pSaMe-FX和PSaMe_Ta61A以有助于去除氨苄抗性标记。PmeI消化之后，将线性片段用TAE缓冲液在琼脂糖凝胶电泳上纯化。将来自PSaMe-FX的7.5kb片段和来自pSaMe-Ta61A的4.7kb片段从凝胶上切下并根据制造商的说明用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。这些纯化的片段含有amdS选择性标记盒和里氏木霉cbhl基因启动子和终止子。此外，所述片段包括特异腐质霉EGV核心/米曲霉BG融合编码序列或桔橙嗜热霉GH61A编码序列。转化中使用的片段不包含抗生素抗性标记，因为ampR片段通过这一凝胶纯化步骤被去除。然后将纯化的片段加至100μ1原生质体溶液并轻柔混合，然后加入260μ1PEG缓冲液，混合，并在室温温育30分钟。然后加入STC(3ml)并混合，将转化溶液涂布在使用构巢曲霉(Aspergillusnidulans)amdS进行选择的COVE平板上。将平板在28°C温育5-7天。将转化体在C0VE2平板上传代培养并在28°C下生长。将超过400个转化体在新鲜的含有乙酰胺的平板上传代培养并允许其在28°C形成孢子7天。里氏木霉转化体在含有用转化体孢子接种的25mlpH6.0纤维素酶诱导性培养基的125ml带挡板摇瓶中培养，并在28°C和200rpm条件下温育5天。将里氏木霉RutC30作为对照。在第5天将培养液样品除去。在15，700xg条件下在微离心管中离心Iml的各种培养液5分钟并将上清转移至新管。用CRITERIONTris-HCl(5%分离型)(resolving)凝胶和CRITERION系统进行SDS-PAGE。用2X浓度的LaemmliSampleBuffer(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)悬浮5μ1的第5天上清(见上)并在5%巯基乙醇存在下煮沸3分钟。将上清样品上样至聚丙烯酰胺凝胶并用IXTris/甘氨酸/SDS作为运行缓冲液(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)进行电泳。所得凝胶用BIO-SAFECoomassieBlueStain染色。如在SDS-PAGE凝胶上观察条带所见的，显示出同时表达桔橙嗜热霉GH61A多肽和由特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心(CEL45A)与米曲霉β-葡糖苷酶融合组成的融合蛋白的转化体，然后在PCS水解反应中测试所述转化体以鉴定产生最佳水解液的菌株。实施例26里氏木霉菌株SaMe_MF268的鉴定将显示同时表达桔橙嗜热霉GH61A多肽以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白的转化体在含有25mlpH6.O的纤维素酶诱导性培养基的125ml带挡板摇瓶中培养，其中将培养基用转化体的孢子接种，并在28°C和200rpm温育5天。将摇瓶培养液以6000xg离心并在水解前用STERICUPEXPRESS(Millipore,Bedford,MA,USA)过滤至0.22μm。培养液的活性可以通过其水解PCS并产生糖的能力来测定，所述糖可以通过化学测定其还原端来检测。在美国能源部国家可再生能源实验室(U.S.D印artmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory(NREL),Boulder,CO,USA)用稀硫酸预处理玉米秸秆。用以下条件进行预处理0.048g硫酸/g干生物质，190°C和25%w/w干固体，约1分钟。预处理的玉米秸秆(pretreatedcornstover,PCS)中的水不溶固体包含59.2%纤维素，如通过极限消化PCS释放葡萄糖和纤维二糖所确定的。酶促水解之前，用大体积的双去离子水(doubledeionizedwater)洗涤PCS；水洗后PCS的干重为17.73%。将Ikg量的PCS重悬在约20升双去离子水中，在PCS沉降之后将水倒出。重复这一操作直到洗涤用水在PH4.O以上，此时还原性的糖低于每升0.06g。如果是小量实验(如lml)，沉降的浆料(slurry)用100目的筛网筛分以确保能够吸取。洗涤后PCS的百分比干重含量通过在105°C的烘箱干燥样品至少24小时(直至恒重)并与湿重比较而测定。PCS水解在Iml体积的96深孔板(AxygenScientific)上进行，用ALPS300自动实验室平板密封机(automatedlabplatesealer)(ABgeneInc.,Rochester,NY,USA)进行加热密封。在pH5.O的50mM乙酸钠中，PCS浓度为每升10g。PCS水解在50°C进行，除了如上述的取样期间搅动以外不用额外地搅动。每个反应一式三份进行。释放的还原糖用下述的对羟基苯甲酸酰胼(p-hydroxybenzoicacidhydrazide,PHBAH)试剂分析。将体积为0.8ml的PCS(每升水中12.5g)移液至96深孔板的每个孔中，然后是0.10mlpH5.0的0.5M乙酸钠，然后是0.IOml稀释的酶溶液以起始终反应体积为1.0ml、PCS浓度为每升IOg的反应。将平板密封。反应混合物在水解开始时和记录每个样品时间点(takingeachsampletimepoint)前通过颠倒深孔板进行混合。在每个样品时间点，将平板混合然后将深孔板在2000rpm离心(具有RTH-250转子的SorvallRT7)10分钟，然后将20μ1水解物(上清)移出并加至96孔微量滴定板中的180μ10.4%NaOH中。在必要时，将这种反应已停止的溶液进一步稀释至合适的还原糖的范围。释放的还原糖用对羟基苯甲酸酰胼试剂(PHBAH，4-hydroxybenzyhydrazide,SigmaChemicalCo.,St.Louis,M0,USA)测定将50μ1的PHBAH试剂(1.5%)与100μ1样品在V型底的96孔THERM0WELL平板(Costar6511)中混合，在95°C的平板加热块上温育10分钟，然后向每个孔加入50μ1双去离子水，混合，然后转移100μ1至另一个平底的96孔板(Costar9017)并在410nm处读取吸光度。还原糖使用同样条件下的葡萄糖校准曲线(calibrationcurve)进行计算。纤维素转化为还原糖的百分比转化率如下计算%转化率=还原糖(mg/ml)/(添加的纤维素(mg/ml)xl.11)因子1.11可修正将纤维素水解为葡萄糖的重量增加。Iml的PCS水解测试之后，在2升发酵罐中一式两份培养最佳的候选物。摇瓶培养基的组成为每升20g右旋糖、IOg玉米浆固体、1.45g(NH4)2S04、2.08gKH2P04、0.36gCaCl2,0.42gMgSO4·7H20和0.42ml痕量金属溶液。痕量金属溶液的组成为每升216gFeCl3·6H20、58gZnSO4·7H20、27gMnSO4·H2OUOgCuSO4·5Η20、2·4gH3BO3和336g柠檬酸。将IOml摇瓶培养基加入500ml摇瓶。用2块固体平板培养物的琼脂块接种摇瓶，温育在轨道摇床上以200rpm在28°C进行48小时。用50ml摇瓶培养液接种3升发酵罐。发酵分批培养基的组成为每升30g纤维素、4g右旋糖、IOg玉米浆固体、3.8g(NH4)2SO4,2.8gKH2PO4,2.64gCaCl2U.63gMgSO4·7Η20、1·8ml消泡剂和0.66ml痕量金属溶液。痕量金属溶液的组成为每升216gFeCl3*6H20、58gZnSO4-7H20,27gMnSO4·H2O、IOgCuSO4·5Η20、2·4gH3B03和336g柠檬酸。发酵补料培养基(fermentationfeedmedium)由右旋糖和纤维素组成。将总量为1.8升的发酵分批培养基加入3升发酵罐。发酵补料培养基以0_4g/l/hr定量提供165小时。将发酵容器的温度保持在28°C，pH控制在设定点4.75+/-0.1。以Ivvm的速率向罐中加入空气，用以1100-1300rpm旋转的Rushton叶轮(impeller)搅动发酵液。发酵结束时，从罐中收获全液并用3000rpmχg离心以除去生物质。将上清过滤除菌并储存在35-40°C。测定总蛋白浓度并在50g的PCS水解反应中再次测试发酵液，如下所述。每次实验之前，酶稀释剂从储存在4°C的贮存酶溶液中新鲜地制备。PCS的水解在125ml的上有旋塞的Erlenmeyer烧瓶(VWR，WestChester,PA,USA)中用50g总反应质量根据NRELLaboratoryAnalyticalProtocol#008进行。在这一规程中PCS的水解(约11.4%的PCS和在50mM乙酸钠pH5.0水溶液中6.8%的纤维素)用不同蛋白质加载量(表示为mg蛋白质/g纤维素)的2升发酵液样品进行。PCS水解能力的测定用INNOVA4080培养箱(NewBrunswickScientific,Edison,NJ,USA)在50°C以150rpm的轨道摇动进行。在水解过程中的72、120和168小时取等份试样并离心，使用MULTISCREENHV0·45μmII(Millipore,Billerica,MA,USA)在SORVALLRT7平板离心机(ThermoFisherScientific,ffaltham,MA,USA)上2000rpm离心10分钟用以过滤上清液。不即刻使用时，将过滤的等份试样在-20°C冷冻。通过在65°C以每分钟0.4ml的流速用0.005MH2SO4洗脱4.6x250mmAMINEXHPX-87H柱(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)来测定在0.005MH2SO4中稀释的样品的糖浓度，其使用以纯糖样品校准的CHEMSTATIONAGILENT1100HPLC(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)通过积分来自折射率(refractiveindex)检测葡萄糖和纤维二糖信号来定量。所得当量(equivalent)用以计算每个反应的纤维素转化率的百分比。用以下等式计算纤维素转化为葡萄糖加纤维二糖的程度(转化率，％)转化率=(葡萄糖+纤维二糖Xl.053)(mg/ml)X100X162/(纤维素(mg/ml)xl80)=(葡萄糖+纤维二糖χ1.053)(mg/ml)X100/(纤维素(mg/ml)xl.Ill)在此等式中，因子1.111反映将纤维素转化为葡萄糖时的重量增加，而因子1.053反映将纤维二糖转化为葡萄糖时的重量增加。表2显示上述50g摇瓶测定中PCS水解反应的结果。产生性能最佳培养液的一个菌株被命名为里氏木霉SaMe-MF268。表2:168小时时间点时转化为糖的百分比相对于蛋白质加载量的百分比转化率(葡萄糖加纤维二糖)培养液ID-菌株名称2.5mg/g纤维素40mg/g纤维素XCL-461-SaMe-MF26866.2980.08XCL-465-SaMe-MF26869.1382.80XCL-462-SaMe-MF33062.9877.99XCL-466-SaMe-MF33063.3477.90XCL-463-SaMe-MF37764.0378.45XCL-467-SaMe-MF37764.1979.06实施例27载体pSaMe-FH的构建表达载体pSaMe-FH(图15)通过用Bsp1201和PacI水解质粒pSMail55(W02005/074647)和质粒plasmidpSaMe-FX(实施例17)构建。来自pSMail55的5.5kb片段和来自PSaMeFX的3.9kb片段用TAE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离并用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。两片段根据制造商的规程用T4DNA连接酶连接。用连接产物转化大肠杆菌SURECompetentCell。从转化的大肠杆菌中纯化质粒，通过对质粒上的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心序列、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码序列和里氏木霉纤维二糖水解酶I基因终止子序列进行DNA测序以确认构建体的身份。一个含有重组质粒的克隆被命名为pSaMe-ra。质粒pSaMe-ra含有与特异腐质霉CEL45A核心/米曲霉β-葡糖苷酶基因融合体可操作地连接的里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)基因的启动子及终止子。除了移去amdS选择性标记并用潮霉素抗性选择性标记代替之外，质粒PSaMe-FH与pSaMe-FX完全相同。实施例28具有增加的纤维素酶产量和增强的预处理玉米秸秆(PCS)降解能力的里氏木霉SMA135-04突变体的分离PCS(实施例26)用作纤维素分解酶实验和选择平板的纤维素底物。实验前，用大体积的蒸馏去离子水洗涤PCS直到滤液PH值大于PH4.0。同时，将PCS用100MF金属滤器筛分以去除颗粒。经洗涤和过滤的PCS在蒸馏水中重悬为浓度60mg/ml的悬液，并储存在4°C。用主要诱导碱基取代和一些缺失的化学诱变剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(N-methy1-N-nitro-N-nitrosoguanidine,NTG)(SigmaChemicalCo.,St.Louis,M0,USA)(Rowlands,1984，EnzymeMicrob.Technol.6:3_10)对里氏木霉菌株SMA135-04(实施例12)进行诱变处理。用恒定的暴露时间和变化的NTG用量，以及恒定的NTG浓度和变化的暴露时间做存活曲线，得到10%的存活水平。为了得到这一存活率，在37°C用0.2mg/mlNTG70以轻柔旋转处理分生孢子悬液。每个实验与对照一起进行，对照中的分生孢子未用NTG处理。在NTG处理之后对突变体进行第一轮筛选。将突变后存活的共SxlO6个分生孢子与30ml含有0.5%蛋白胨、0.1%TRITONX-100和1.5g琼脂的Mandel培养基混合。将悬浮液加入深平板(直径150mm，深25mmKorningInc.,NY,USA)并使琼脂在室温下凝固。琼脂凝固之后，加入200ml含有0.5%蛋白胨、0.l%TRITONX_100、l.5%琼脂和1.0%PCS的Mandels培养基。琼脂凝固之后将平板在28°C温育。温育3_5天后，将700个先于未经处理的对照菌株穿透PCS筛选层的菌落用于第二轮筛选。在第二轮筛选中，将来自每个分离株的三满环分生孢子加入含有25ml纤维素酶诱导培养基的125ml摇瓶并在28°C和200rpm的条件下温育5天以诱导纤维素酶的表达和分泌。以400xg的速率在小离心机中离心Iml的每种培养液5分钟，分析上清的PCS水解活性和总蛋白产率。通过将摇瓶培养液样品以120稀释至50mM乙酸钠pH5.0来进行“robotic(自动化的)”PCS水解实验。稀释前，以400μ1样品/gPCS的量将经稀释的样品加入实验平板(96孔平底平板)。用BIOMEKFX(BeckmanCoulter,Fullerton,CA,USA)，以IOgPCS/升加入PCS，然后加入50mM乙酸钠pH5.0至总体积为180μ1。在以250rpm摇动的加湿盒(humidifiedbox)中将实验平板在30°C温育5天。为了提高实验的统计学准确性，每个样品进行6个重复。但是，2个重复是以120的样品稀释进行的。温育5天之后，用PHBAH实验测定经水解的PCS样品中的还原糖(RS)的浓度，该实验经改进适用于96孔微平板(microplate)模式。使用0RCA机器人(BeckmanCoulter,Fullerton,CA,USA)将生长平板转至BIOMEKFX，从实验平板取出9μ1培养液样品并将其等份加入96孔V形底平板(MJResearch,ffaltham,MA,USA)。加入135μ1在2%氢氧化钠溶液中的0.533%PHBAH起始反应。将每个实验平板在TETRADThermalCycler(MJResearch,ffaltham,MA,USA)上在95°C加热10分钟，然后冷却至室温。温育之后，将40μ1反应样品稀释于160μ1去离子水中并转至96孔平底平板。然后用SPECTRAMAX250(MolecularDevices,Sunnyvale，CA,USA)测定样品在405nm处的吸光度。借助标准曲线将A4tl5值翻译为葡萄糖当量，所述标准曲线是通过与样品相似地处理6个葡萄糖标准(0.000,0.040,0.080,0.120、0.165和0.200mg/ml去离子水)而得到的。标准曲线的平均相关系数大于0.98。用实施例26所述等式计算纤维素转化为还原糖的程度(RS产率，％)。用二喹啉甲酸(bicinchoninicacid,BCA)实验测定总蛋白产率。将样品以18稀释至水中从而将浓度控制在合适的范围内。用水将清蛋白标准物(Albuminstandard,BSA)稀释到不同水平，从浓度2.0mg/ml开始直至浓度0.25mg/ml。用BIOMEKFX将每个稀释液(包括标准)的共20μ1转入96孔平底平板。将200微升BCA底物溶液(BCAProteinAssayKit,Pierce,Rockford,IL,USA)加入每个孔，然后在37°C温育45分钟。温育完成后，用SPECTRAMAX250测定96孔板在562nm处的吸光度。样品浓度通过从由MicrosoftExcel(MicrosoftCorporation,Redmond,WA,USA)生成的标准曲线的夕卜推来确定。与菌株SMA135-04的培养液相比，第一轮挑取的分离株中的20个产生了显示改进的PCS水解活性的培养液。这些分离株与亲本菌株相比，其生成的纤维素分解培养液能产生高5-15%的还原糖。一些分离株，例如SMai-M104显示了对每体积培养液中纤维素PCS的水解的增强的性能，而且还分泌更高水平的总蛋白。最佳性能的里氏木霉突变株SMai_M104的筛选是通过评价由发酵产生的培养液的纤维素酶性能而确定的。发酵如实施例26所述进行7天。在125-ml有旋塞的Erlenmeyer摇瓶(VWR，WestChester,PA,USA)中用50gPCS水解来测试发酵样品。反应条件为6.7%的纤维素上样；6和12mg/g纤维素的酶上样；50g的总反应物；50°C和pH5.0。将每个摇瓶和塞称重，将所需量的PCS加入摇瓶并记录总重量。向每个摇瓶加入IOml蒸馏水然后将所有摇瓶在121°C高压灭菌30分钟。高压灭菌之后，允许摇瓶冷却至室温。为了使每个摇瓶的总重量都调整至50克，加入5ml0.5M乙酸钠pH5.0，然后加入培养液以达到要求的加样量。然后加入适量蒸馏水以达到要求的终重量50g。然后将摇瓶置于50°C和130rpm的温育摇床(NewBrunswickScientific,Edison,NJ,USA)。在第3、5和7天，从每个摇瓶中移出Iml样品并将其加入96深孔平板(总体积2.Oml)。用SORVALLRT7平板离心机(ThermoFisherScientific,ffaltham,MA,USA)以3000rpm将96孔板离心15分钟。离心后，将200μ1上清转入96孔0.45μm孔径过滤平板(Millipore,Bedford,MA,USA)并使用真空来收集滤液。然后用0.4%NaOH稀释滤液使还原糖处在合适的范围并用PHBAH试剂(1.5%)测定如下将50μ1的PHBAH试剂与IOOul的样品加入V型底的96孔板并在95°C温育10分钟。为了完成反应，向每个孔加入50μ1蒸馏水并在混合样品之后将100μ1混合物转移至另一个平底的96孔板并在410nm处测定吸光度。还原糖的量用葡萄糖校准曲线(calibrationcurve)进行计算，而百分比消化率如下计算%消化率=还原糖(mg/ml)/(添加的纤维素(mg/ml)xl.11)，其中因子1.11反映了将纤维素转化为葡萄糖时的重量增加。PCS水解实验的结果显示命名为SMai_M104的突变体性能稍微(约5%的葡萄糖增量)优于亲本菌株里氏木霉SMA135-04，特别是在大加样量时(12mg/g纤维素)。实施例29里氏木霉菌株SMai26_30的构建用共转化将质粒pCW085(W02006/074435)、pSaMe-FH和pCW087(实施例23)导入里氏木霉SMai-M104。质粒pCW085是土生梭孢霉NRRL8126纤维二糖水解酶(CEL6A)的表达载体。三个质粒均是通过PEG介导的转化导入里氏木霉SMai-M104的(Penttila等，1987，同上)。每个质粒都含有大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶(hygromycinBphosphotransferase,hph)基因以使转化体能在潮霉素B上生长。将里氏木霉SMai_M104在27°C和90rpm的条件下，在补加了2%(w/v)葡萄糖和IOmM尿苷的25mlYP培养基中培养17小时。通过使用VacuumDrivenDisposableFiltrationSystem过滤收集菌丝并用去离子水洗涤2次，用1.2M山梨醇洗涤2次。通过在20ml含有15mgGLUCANEX/ml和0.36单位几丁质酶/ml的1.2M山梨醇中悬浮经洗涤的菌丝，并在34°C以90rpm轻柔摇动温育15-25分钟来产生原生质体。通过以400xg离心7分钟来收集原生质体，并用冷的1.2M山梨醇洗涤2次。原生质体用血球计数器计数并在STC中重悬至终浓度为IXlO8原生质体/ml。过量的原生质体在-80°C储存于Cryo1°CFreezingContainer中。质粒pCW085、pSaMe-FH和pCW087每种约10μg用PmeI消化，并添加至100μ1的原生质体溶液中并轻柔混合，然后添加260μ1PEG缓冲液，混合，并在室温温育30分钟。然后加入STC(3ml)并混合，将转化溶液涂布在含有IM蔗糖和IOmM尿苷的PDA平板上。将平板在28°C温育16小时，然后加入含有潮霉素B(终浓度30μg/ml)的琼脂覆层，继续温育4-6天。将80个转化体在PDA平板上传代培养并在28°C生长。里氏木霉转化体在含有用转化体孢子接种的25mlpH6.0的纤维素酶诱导培养基的125ml带挡板摇瓶中培养，并在28°C和200rpm温育5天。将里氏木霉SMai_M104作为对照。将培养液样品在第5天移去。将每种培养液中的Iml在小离心机中以15，700xg离心5分钟并将上清转至新管。在CRITERIONSystem中用CRITERIONTris-HCl(5%解析(resolving))凝胶进行SDS-PAGE。将5μ1的第5天上清(见上)悬浮在2X浓度的LaemmliSampleBuffer中并在5%β-巯基乙醇存在的情况下煮沸3分钟。将上清样品上样至聚丙烯酰胺胶上并用IXTris/甘氨酸/SDS作为运行缓冲液进行电泳。所得凝胶用Bio-SAFECoomassieBlueStain染色。然后将转化体如实施例26所述在PCS水解反应中进行测试以确定产生最佳水解培养液的菌株，该转化体显示桔橙嗜热霉GH61A多肽和由与米曲霉β-葡糖苷酶和土生梭孢霉纤维二糖水解酶II融合的特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心(CEL45A)组成的融合蛋白的表达，如通过观察SDS-PAGE凝胶的条带所示。将一个产生最佳表现的培养液的转化体命名为里氏木霉SMai26-30。里氏木霉菌株SMai26_30培养液对PCS的水解如实施例26所述以及如下修改进行。PCS的批号(lot)与实施例26所用的不同，但是在相似条件下制备。在这个规程中，PCS的水解(在50mM柠檬酸钠水溶液pH5.0缓冲液中有约11.3%PCS和6.7%纤维素)是用里氏木霉菌株SMai26-30发酵液的不同蛋白质加样量(表示为mg蛋白质/克纤维素)进行的。在水解过程中在第48、120和168小时取等份试样。表3显示了上述50g摇瓶实验中PCS水解反应的结果。表3在48、72和168小时时的糖的百分比转化率水解小时数48120168mg/ml百分比转化率2.5247.260.464.12.5248.261.164.85.0167.285.087.75.0167.985.888.89.9885.295.496.09.9885.393.694.7用里氏木霉SMai26_30的孢子划线，通过两轮在平板上的生长以确认其为纯系的(clonal)菌株，并在放大至工艺规模发酵罐的生产之前冷冻多个小管。将所得的蛋白质培养液从真菌细胞物质中回收、过滤、浓缩和配制。将所述纤维素分解酶制备物命名为纤维素分解酶组合物#2。实施例30鞣酸、鞣花酸、表儿茶素和多种木质素成分化合物对PCS水解的作用在美国能源部国家可再生能源实验室(U.S.D印artmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory(NREL),Boulder,CO,USA)用稀硫酸预处理玉米秸秆。用以下条件进行预处理1.4wt%硫酸，195°C，4.5分钟。依据用过量纤维素酶的极限消化，预处理的玉米秸秆(PCS)中的水不溶固体含有59.5%纤维素。使用之前，用大体积的去离子水洗涤PCS直至除去可溶性酸和糖。水洗后PCS的干重为19.16%。测定了鞣酸、鞣花酸、表儿茶素和六种木质素组分化合物(4-羟基-2-甲基苯甲酸、香草醛、松柏醇、松柏醛、阿魏酸和丁香醛)混合物对于通过纤维素分解酶组合物#1或纤维素分解酶组合物#2水解PCS的作用。所述PCS水解反应是一式两份在有盖的1.7mlEPPENDORF管(小规模)中进行的，管中包括Iml的43.4gPCS(干重)/升50mM乙酸钠pH5.OUmM鞣酸(对应于IOmM没食子酰基和ImM葡糖基成分)、ImM鞣花酸、ImM表儿茶素和同样缓冲液中ImM4-羟基-2-甲基苯甲酸、ImM香草醛、ImM松柏醇、ImM松柏醛、ImM阿魏酸和ImM丁香醛的木质素成分混合物。以0.25g/升加入纤维素分解酶组合物#1或纤维素分解酶组合物#2。将未加入所述化合物的反应作为对照。将所述有盖的小管在INNOVA4080温育摇床(NewBrunswickScientificCo.，Inc.，Edison,NJ,USA)中在50°C在150rpm温育。用0.45μmMULTISCREENHV膜将随时间取样的悬浮液的等份试样(Millipore，Billerica,MA,USA)在SORVALLRT7离心机中(ThermoFisherScientific，ffaltham,MA,USA)以2000rpm离心15分钟过滤。不即刻使用时，将过滤的等份试样在_20°C冷冻。通过在65°C以每分钟0.4ml的流速用0.005MH2SO4洗脱4.6x250mmAMINEXHPX-87H柱(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)来测定在0·005MH2SO4中稀释的样品中糖的浓度，其使用以标准糖和纤维二糖校准的折射率(refractiveindex)检测(CHEMSTATION，AGILENT1100HPLC，AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)通过积分葡萄糖和纤维二糖来定量。所得当量(equivalent)用以计算每个反应的纤维素转化百分比。用以下等式计算纤维素转化为葡萄糖加纤维二糖的程度(转化，％)转化率(%>=(葡萄糖+纤维二糖xl.053)(mg/ml)X100X162/(纤维素(mg/ml)xl80)=(葡萄糖+纤维二糖xl.053)(mg/ml)X100/(纤维素(mg/ml)xl.Ill)在此等式中，因子1.111反映将纤维素转化为葡萄糖时的重量增加，而因子1.053反映将纤维二糖转化为葡萄糖时的重量增加。PCS中的纤维素是通过PCS的极限消化释放葡萄糖和纤维二糖来测定的。图16A和16B所示结果证明所述混合物显著地抑制了通过纤维素分解酶组合物#1或纤维素分解酶组合物#2水解PCS。实施例31鞣酸、鞣花酸、表儿茶素和多种木质素成分化合物对PCS水解的作用重复实施例30，除了每个化合物单独进行测试之外。如实施例30所述用HPLC测定可溶性还原糖。将未加每种化合物的反应作为对照。图17A、17B和17C所示结果证明只有鞣酸(图17A)，而非其组分鞣花酸(图17C)显著地抑制PCS的水解，而ImM的所有木质素/鞣质组分化合物都不是抑制性的。ImM的表儿茶素对纤维素分解酶组合物#1有轻微的抑制(图17C)。实施例32缩合鞣质(OPC)和组分化合物对PCS水解的作用OPC或黄酮醇对于通过纤维素分解酶组合物#1或纤维素分解酶组合物#2对PCS74水解的作用根据实施例30所述步骤确定。OPC和黄酮醇以ImM的浓度存在。将未加入化合物的反应作为对照。可溶性还原糖如实施例30所述用HPLC测定。由于OPC含有来自OPC片剂所用的非活性组分的可水解聚糖，因此在减去无PCS时从水解得到的糖之后估计OPC的作用。图18A和18B所示结果证明只有0PC，而非其组分黄酮醇对纤维素分解酶组合物#1是抑制性的。黄酮醇对纤维素分解酶组合物#2也不是抑制性的。实施例33鞣酸和OPC抑制的浓度依赖鞣酸和OPC的有效抑制浓度范围通过纤维素分解酶组合物#1对AVICEL的水解来测定。涉及鞣酸的水解用实施例30所述“小规模”水解反应步骤一式两份进行，除了使用0.05mM-lmM鞣酸和23gAVICEL(干重)/升的50mM乙酸钠pH5.0之外。涉及OPC的7jC角军在2.8ml96-孑LDe印WellMicroplates(VffRInternational,WestChester,PA)(“小平板规模”)中以一式两份进行，其中包含ImM至IOmMOPC和23gAVICEL(干重)/升50mM乙酸钠pH5.0的Iml悬浮液。每个水解反应以0.25g/升加入纤维素分解酶组合物#1。用ALPS300密封器将小平板在160°C密封2秒。将未加入芳香化合物的反应作为对照。将有盖小管或密封的小平板在NewBrunswickScientificInnova4080温育摇床中在50°C在150rpm温育。可溶性还原糖用HPLC测定，如实施例30所述。图19A和19C所示结果证明在0.05mM到ImM鞣酸的浓度范围内鞣酸具有逐渐增加的抑制性(图19A)，而OPC在ImM到IOmM的浓度范围内具有逐渐增加的抑制性(图19C)。迪克逊作图(起始速率的倒数比抑制剂浓度)显示鞣酸的抑制常数(inhibitionconstant)Ki(χ-截距)为约0.13mM(图19B)而OPC为约8mM(图19D)。鞣酸和OPC的有效抑制浓度范围也用纤维素分解酶组合物#2通过如实施例30所述的“小规模”水解测定。鞣酸的浓度范围为0.ImM至ImM，而OPC的浓度范围为0.ImM至10mM。将未加入鞣质化合物的反应作为对照。可溶性还原糖如实施例30所述通过HPLC测定。图20A和20C所示结果证明鞣酸在0.ImM到ImM的浓度范围内具有逐渐增加的抑制性(图20A)，而OPC在0.ImM到IOmM的浓度范围内具有逐渐增加的抑制性(图20C)。迪克逊作图指示鞣酸的Ki(χ-截距)为约0.ISmM(对应于1.SmM没食子酰基成分)(图20Β)，而OPC(黄酮醇等同物)的为约2.9mM(图20D)。实施例34鞣酸成分对AVICEL水解的抑制作用为了进一步解释鞣酸如何抑制纤维素的酶促水解，评价了存在或不存在IOmM甲基没食子酸盐加ImM葡糖五乙酸酯或5mM鞣花酸加ImM葡糖五乙酸酯(所述两种组合均模拟了ImM鞣酸)时纤维素分解酶组合物#1对AVICEL的水解。水解反应根据实施例33所述“小平板规模”水解步骤以25gAVICEL和0.25g纤维素分解酶组合物#1/升50mM乙酸钠pH5.0在50°C进行。可溶性还原糖如实施例30所述用HPLC测定。结果证明鞣花酸加葡糖五乙酸酯的混合物产生约20%初始速率的降低但第8天时水解程度无降低，而甲基没食子酸盐加葡糖五乙酸酯的混合物在初始速率和第8天时的水解程度上都有20%的降低。相反，鞣酸产生约90%初始速率的降低和第8天时70%的水解程度的降低，指示了鞣酸结构，而非组合物在抑制中的重要性。实施例35鞣酸组分在酶促PCS水解中的作用在IOmM至ImM将甲基没食子酸盐和鞣花酸与鞣酸在通过纤维素分解酶组合物#1水解PCS中进行对比。根据实施例33所述“小平板规模”步骤以50gPCS和0.25g纤维素分解酶组合物#1/升50mM乙酸钠pH5.0在50°C进行水解反应。可溶性还原糖如实施例30所述用HPLC测定。结果证明鞣花酸产生约30%初始速率的降低和第4天时水解程度的40%的降低，而甲基没食子酸盐产生约10%的初始速率和第4天时水解程度的降低。相反，鞣酸产生约70%初始速率的降低和第4天时水解程度的60%的降低。实施例36鞣酸的抑制常数鞣酸对纤维素分解酶组合物#1的抑制是根据实施例33所述的“小平板规模”水解步骤使用0.6-4gPASC或AVICEL和0.Olg纤维素分解酶组合物#1/升50mM乙酸钠PH5.0，和0.1-0.7mM的鞣酸在50°C进行的一系列水解反应来定量的。可溶性糖如实施例30所述用HPLC测定。初始水解速率是从最初的两个水解时间点得到的(即可溶性糖测定)(通常伴有<20%的水解程度，速率=水解差/时间差)。双倒数作图(1/(初始速率)与1/[纤维素]之比作为鞣酸浓度的函数)指示“混合”型抑制，但是它们的复杂性阻碍了简单抑制常数的求解(extraction)。初始速率与鞣酸浓度之比对PASC或AVICEL水解分别产生了0.2士0.1或0.27士0.07mM的I5tl(导致水解速率降低50%的抑制剂浓度)。实施例37鞣酸对单个纤维素分解酶的抑制作用用PASC作为底物测定了鞣酸对里氏木霉CEL7A纤维二糖水解酶I、里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶II、里氏木霉CEL7B内切葡聚糖酶I和里氏木霉CEL5A内切葡聚糖酶II的抑制作用。水解是根据实施例33所述步骤用一系列以一式两份进行的“小平板规模”水解反应进行的，只是使用ImM鞣酸(对应IOmM没食子酰基和ImM葡糖基成分)和2gPASC(干重)和0.5g牛血清清蛋白(BSA)/升50mM乙酸钠pH5.0。图21A、21B、21C和21D所示结果证明鞣酸显著地抑制里氏木霉的酶。单独使用鞣酸时未观察到PASC的水解。鞣酸对里氏木霉CEL7B内切葡聚糖酶I和里氏木霉CEL5A内切葡聚糖酶II的作用也使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物进行评价。水解反应是根据实施例33所述“小平板规模”水解步骤以一式两份进行的，只是使用ImM鞣酸和10至20g羧甲基纤维素(CMC)和1至20mg酶/升50mM乙酸钠ρΗ5·0，50°C，4小时。可溶性还原糖根据Lever，1972，Anal.Biochem.47:273_279的方法通过对-羟基苯甲酸酰胼(p-hydroxybenzoicacidhydrazide,PHBAH)实验，而不是实施例30和33所述的HPLC进行分析。将未添加酶的反应作为对照来修正背景吸收。分光光度检测是用SPECTRAMAX340PC读数器(MolecularDevicesCorp.，Sunnyvale,CA，USA)禾口COSTAR96孑L小平板(Cole—ParmerInstrumentCo,VernonHills,IL,USA)进行的。图22A和22B所示结果证明鞣酸显著地抑制两种酶，与上述PASC水解观察到的结果一致。鞣酸对米曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶的作用也通过根据实施例30所述步骤进行的一系列“小规模”水解反应进行评价，只是使用ImM鞣酸(对应于IOmM没食子酰基和ImM葡糖基成分)和2g纤维二糖和Imgβ-葡糖苷酶/升39mM乙酸钠pH5.0。将未加入鞣酸的反应作为对照。如实施例30所述用HPLC对反应进行监测。图23所示结果证明鞣酸显著地抑制米曲霉CEL3Ai3-葡糖苷酶。实施例38鞣酸对单个纤维素分解酶催化的纤维素水解的抑制实施例37显示鞣酸抑制多种纤维素酶的水解活性。为了定量这种抑制，对鞣酸在水解PASC时进行了评价。水解反应根据实施例33所述“小平板规模”水解步骤使用0.1至0.7mM鞣酸，和0.6至4gPASC和0.04g里氏木霉CEL7ACBHI、CEL7BEGI或CEL5AEGII/升50mM乙酸钠pH5在50°C进行。可溶性糖如实施例30所述用HPLC测定。双倒数作图(如实施例36所述)指示“混合”型抑制，但是它们的复杂性阻碍了简单抑制常数的求解。如表4所示，初始速率与鞣酸浓度之比分别对CEL7ACBHI、CEL7BEGI或CEL5AEGII显示了约为1、0.3士0.2或0.32士0.05mM的15。。在纤维二糖的水解中也对鞣酸进行了评价。水解反应根据实施例33所述“小平板规模”水解步骤使用0.6至4g纤维二糖和0.OOlg米曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶/升50mM乙酸钠pH5在50°C进行。结果显示抑制表现为混合型，具有约0.SmM的I5tl(表4)。表4鞣酸对酶促纤维素水解的抑制常数I5tl(平均值士标准差，单位mM)纤维素分解酶CEL7ACEL6ACEL7BCEL5ACEL3A组合物#1CBH-ICBH-IIEG-IEG-IIBGPASC0.2士0.1约为1ND0.3士0.20.32士0.05约为0.8ND:未测得实施例39鞣酸或OPC对纤维素水解的抑制的定位为了研究鞣酸在何处实施了抑制，进行了纤维素分解酶组合物#1对AVICEL的一系列水解反应，其中AVICEL和纤维素分解酶组合物#1是新鲜地或者是与鞣酸预温育之后使用的。水解反应根据实施例33所述“小平板规模”水解步骤使用25gAVICEL和0.25g纤维素分解酶组合物#1/升50mM乙酸钠pH5.0在50°C进行。0.25g纤维素分解酶组合物#1/升50mM乙酸钠pH5.0和ImM鞣酸在50°C预温育1小时之后(可见可检测的沉淀)，用BioSpin6脱盐柱(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)将预温育的纤维素分解酶组合物#1进行凝胶过滤。在25gAVICEL/升50mM乙酸钠pH5.0与ImM鞣酸在50°C预温育1小时后，将预温育的AVICEL和鞣酸用50mM乙酸钠PH5缓冲液充分地洗脱。将加入或未加入抑制剂的未处理的或仅用缓冲液预温育的AVICEL和纤维素分解酶组合物#1作为对照。向新鲜的纤维素分解酶组合物#1和AVICEL混合物加入ImM鞣酸导致初始速率约90%的降低和8天之后水解程度的70%的降低。将AVICEL和鞣酸预处理不影响水解。相反，预处理纤维素分解酶组合物#1显示显著降低的活性(约80%的降低)。由于可检测的沉淀发生在预温育期间，提示纤维素分解酶组分与鞣酸的复合，活性的降低可能是由于复合因而凝胶过滤时蛋白质丢失而导致的。如上所述也评价了0PC。在50V将0.25g纤维素分解酶组合物#1或25gAVICEL/升50mM乙酸钠pH5.0与IOmMOPC(亚基形式(insubunit))预温育1小时后，进行凝胶过滤或洗脱，预温育的纤维素分解酶组合物#1知AVICEL和鞣酸与缓冲液预温育的纤维素分解酶组合物#1和AVICEL就水解(实施例33所述“小平板规模”步骤)而言未显示明显差异(<10%)，显示OPC对AVICEL或纤维素分解酶组合物#1没有修饰或者有可逆的修饰(如果有修饰的话)。实施例40鞣酸酶对鞣质或OPC抑制的减少评价了鞣酸酶的降低鞣酸或OPC对于通过纤维素分解酶组合物#2水解PCS的抑制作用的能力。水解如实施例33所述用“小平板规模”水解步骤以一式两份进行，只是使用ImM鞣酸或IOmMOPC和43gPCS/升，25mg纤维素分解酶组合物#2/升50mM乙酸钠pH5.0，50°C，4小时。但是，在加入纤维素分解酶组合物#2之前，PCS或OPC与鞣酸的混合物用米曲霉鞣酸酶(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)以10%的终蛋白质水平处理30分钟。将未加入鞣酸、OPC或鞣酸酶的反应作为对照。可溶性还原糖如实施例30所述用HPLC测定。图24A和24B所示结果证明米曲霉鞣酸酶对鞣酸和OPC的预处理显著地降低了鞣酸和OPC对纤维素分解酶组合物#2的抑制作用。鞣酸或OPC不存在时，单独用鞣酸酶稍稍增强(水解程度提高约2%)了纤维素分解酶组合物#2对PCS的水解。实施例41鞣酸酶对鞣酸抑制的降低实施例40显示鞣酸酶减轻了鞣酸对于纤维素分解酶组合物#2的纤维素水解的抑制。鞣酸酶的有效浓度范围使用实施例33所述“小平板规模”水解步骤进行研究，只是使用43.4gPCS和0.25g纤维素分解酶组合物#1/升50mM乙酸钠pH5.0，50°C，存在或不存在ImM鞣酸，反应多至4天。为了减少抑制，鞣酸酶以12.5、25和50mg/升(或0.21、0.42和0.85μM)加入。图25所示结果证明鞣酸酶以剂量依赖的方式降低鞣酸的抑制，分别以约12或25mg/升达到约50或100%降低。本文中所描述并要求保护的发明的范围不局限于本文中公开的具体方面，因为这些方面意欲说明本发明的数个方面。任何等同的方面意欲在本发明的范围内。事实上，除了本文中显示和描述的那些之外，从前面的描述，本发明的多种修改对于本领域技术人员将是显而易见的。这些修改也意欲落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，应以包括定义在内的本公开内容为准。本文引用了多种参考文献，它们通过提述以其整体并入本文。权利要求生产鞣质减少的纤维素材料的方法，包括用有效量的鞣酸酶处理所述纤维素材料以降低鞣质对酶促糖化纤维素材料的抑制作用。2.权利要求1的方法，其中所述鞣质是可水解的鞣质、缩合鞣质或其组合。3.权利要求1或2的方法，其中用所述鞣酸酶处理所述纤维素材料在优选约2-约11，更优选约4-约8，最优选约5-约6的pH范围内进行。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中用所述鞣酸酶处理所述纤维素材料在优选约200C-约90°C，更优选约30°C-约70°C，最优选约40°C-约60°C的温度范围内进行。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述鞣酸酶的有效量在优选约0.1-约10，000,更优选约1-约1000，最优选约10-约100单位/g干纤维素材料的范围内。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中在预处理之前、过程中和/或之后，和/或在糖化过程中和/或在发酵过程中用鞣酸酶处理所述纤维素材料。7.糖化纤维素材料的方法，其包括用有效量的鞣酸酶和有效量的纤维素分解酶组合物处理纤维素材料，其中用所述鞣酸酶处理所述纤维素材料降低了鞣质对于用纤维素分解酶组合物酶促糖化纤维素材料的抑制作用。8.权利要求7的方法，其中在糖化之前预处理所述纤维素材料。9.权利要求7或8的方法，其中在预处理之前、过程中和/或之后，和/或在糖化过程中用鞣酸酶处理所述纤维素材料。10.权利要求7-9中任一项的方法，其中所述鞣质是可水解的鞣质、缩合鞣质或其组I=IO11.权利要求7-10中任一项的方法，其中用所述鞣酸酶处理所述纤维素材料在优选约2_约11，更优选约4-约8，最优选约5-约6的pH范围内进行。12.权利要求7-11中任一项的方法，其中用所述鞣酸酶处理所述纤维素材料在优选约200C-约90°C，更优选约30°C-约70°C，最优选约40°C-约60°C的温度范围内进行。13.权利要求7-12中任一项的方法，其中鞣酸酶的有效量在优选约0.1-约10，000，更优选约1-约1000，最优选约10-约100单位/g干纤维素材料的范围内。14.权利要求7-13中任一项的方法，其中所述纤维素分解酶组合物包含具有内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和葡糖苷酶活性的多肽。15.权利要求14的方法，其中所述纤维素分解酶组合物还包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽。16.权利要求14或15的方法，其中所述纤维素分解酶组合物还包含一种或多种选自下组的酶半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其混合物。17.权利要求7-16中任一项的方法，还包括回收降解的纤维素材料。18.权利要求17的方法，其中所述降解的纤维素材料是糖。19.权利要求18的方法，其中所述糖选自下组葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖和纤维二糖。20.产生发酵产物的方法，包括(a)用有效量的纤维素分解酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)的经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)回收发酵产物，其中用有效量的鞣酸酶处理所述纤维素材料以降低鞣质对酶促糖化纤维素材料的抑制作用。21.权利要求20的方法，其中在糖化步骤之前预处理所述纤维素材料。22.权利要求20的方法，其中在预处理之前、过程中和/或之后，和/或在糖化过程中和/或在发酵过程中用鞣酸酶处理所述纤维素材料。23.权利要求20-22中任一项的方法，其中所述鞣质是可水解的鞣质、缩合鞣质或其组I=Iο24.权利要求20-23中任一项的方法，其中用所述鞣酸酶处理所述纤维素材料在优选约2-约11，更优选约4-约8，最优选约5-约6的pH范围内进行。25.权利要求20-24中任一项的方法，其中用所述鞣酸酶处理所述纤维素材料在优选约20°C-约90°C，更优选约30°C-约70°C，最优选约40°C-约60°C的温度范围内进行。26.权利要求20-25中任一项的方法，其中所述有效量的鞣酸酶在优选约0.1-约10，000，更优选约1-约1000，最优选约10-约100单位/g干纤维素材料的范围内。27.权利要求20-26中任一项的方法，其中所述纤维素分解酶组合物包含具有内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和葡糖苷酶活性的多肽。28.权利要求27的方法，其中所述纤维素分解酶组合物还包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽。29.权利要求27或28任一项的方法，其中所述纤维素分解酶组合物还包含一种或多种选自下组的酶半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其混合物。30.权利要求20-29中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)以同时糖化和发酵同时进行。31.权利要求20-30中任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。全文摘要本发明涉及生产鞣质减少的纤维素材料的方法，包括用鞣酸酶处理纤维素材料以降低鞣质对酶促糖化纤维素材料的抑制作用。本发明还涉及糖化纤维素材料的方法，包括用鞣酸酶和有效量的纤维素分解酶组合物处理纤维素材料。本发明还涉及产生发酵产物的方法，包括(a)用有效量的纤维素分解酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)的经糖化的纤维素材料；和(c)回收发酵产物，其中所述纤维素材料用纤维素酶处理以降低鞣质对酶促糖化纤维素材料的抑制作用。文档编号C12P7/10GK101910405SQ200880123713公开日2010年12月8日申请日期2008年10月31日优先权日2007年11月1日发明者徐丰申请人:诺维信股份有限公司