专利名称：带有修饰碱基的寡核苷酸在核酸杂交中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有特异性修饰的DNA碱基的修饰的寡核苷酸的应用，用于核酸杂 交、核酸扩增(例如使用聚合酶链反应(PCR))和siRNA介导的基因沉默(RNAi)。
背景技术：
寡核苷酸和修饰的寡核苷酸的应用在现代疗法中是极为重要的，并已经有详 尽记录(Uhlmann 等，Antisense oligonucleotides :A newtherapeutic principle. (反义寡核苷酸新的治疗原理)Chemical Reviewsl990,90 =543-584 ；Crooke等《反义 石if 究禾口 应用》(Antisense Researchand Applications), CRC Press (1993) ；Mesmaekar 等，“Antisenseoligonucleotides “(反义寡核苷酸)，Ace. Chem. Res. 1995, 28 366-374 ；Stein. “ The experimental use of antisense oligonucleotides :a guide for theperplexed.“(反义寡核苷酸的实验应用困惑指南)J. Clin. Invest. 2001，108， 641-644)。反义多核苷酸与DNA或RNA靶的特异性结合，可以使核酸的复制、转录或翻译失 活，从而提供了用于控制疾病例如癌症和病毒感染的机制。因此，反义寡核苷酸与靶的结合 可用于在各种不同的情况下改变基因表达，例如干扰病毒的生命周期或癌细胞的生长。结合性寡核苷酸的阵列，已经成为生物技术业和相关领域中越来越重要的工具。 这些沉积在固相载体表面上的阵列应用于许多领域，包括药物筛选、核酸测序、突变分析寸。例如，核酸杂交已经变成鉴定、测量和检测特定核酸在给定样品中的存在的越来 越重要的手段。因此，医学诊断、法医、环境和食品检测，都受益于使用核酸杂交作为测试样 品中给定生物污染物或微生物的存在或不存在的快速、简单和精确的方式。从机械上说，核 酸杂交利用了单链核酸与具有互补核苷酸序列的核酸链的相应区域形成稳定的杂交体的 能力。这样的杂交体通常由双链的双链体组成，尽管三链结构也是已知的。在核酸双链体 中，每个碱基对都对稳定性有贡献。因此，双链体越短，每个单独的碱基对对双链体稳定性 的相对贡献越大。因此，对于较短的寡核苷酸来说，完美匹配与错配之间稳定性的差异将较 大。但是，因为短的寡核苷酸杂交弱，可以使用结合更强的核苷酸来增强它。已经开发了许多方法用于核酸的指数扩增。它们包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶 链反应(LCR)、自动维持序列扩增(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA) 以及使用Q-Beta复制酶的扩增。PCR的成功依赖于与DNA单链结合的引物的效率。同样， 结合越强，在给定循环中扩增的DNA越多。目前认为，哺乳动物中RNA诱导的基因沉默涉及最少三种不同水平的控制(i)转 录失活(siRNA指导的DNA和组蛋白甲基化)；(ii)小干扰RNA(siRNA)诱导的mRNA降解； 以及(iii)mRNA诱导的转录弱化。通过siRNA产生的RNA干扰(RNAi)可以在多次细胞分裂过程中长期持续和有效。因此，通过siRNA介导的方法评估基因功能以及开发用于过表 达基因的疗法的能力，代表了激动人心的有价值的工具，将加速基因功能分析、药物靶验证 和基因组范围的研究。在所有上述领域中，已经尝试了通过使用修饰的核苷酸来增加效率。因此，已经构 建了许多在含氮碱基处具有修饰的寡核苷酸衍生物，包括将腺苷6位的氨基用氢取代产生 嘌呤；将鸟苷的6-酮基氧用氢取代产生2-氨基嘌呤，或用硫取代产生6-硫代鸟苷，以及将 胸苷的4-酮基氧用硫或氢取代，分别产生4-硫代胸苷或4-氢胸苷。所有这些核苷酸类似 物可以用作反应试剂来合成寡核苷酸。同样地，已经报道了许多核苷酸衍生物具有呋喃核 糖或呋喃脱氧核糖部分的修饰。大多数含有这样的修饰碱基的寡核苷酸的配制，是着眼于 增加细胞摄入、核酸酶抗性和/或增加底物的结合。发明概述本发明涉及含有修饰的核碱基的寡核苷酸，这增加了它们与互补核酸结合的能 力，并可以增加它们与核酸互补链的杂交。依赖于所公开的化合物的寡核苷酸部分中修饰 的核碱基的数量性质，化合物与互补靶核酸的结合能力，与典型的互补寡核苷酸相比，可以 显著增加。本发明的主题是在核酸的杂交、聚合酶链反应(PCR)和siRNA介导的基因沉默 (RNAi)中这样的修饰的寡核苷酸类似物的应用。本发明的一个方面是用作核酸杂交的标记 探针的寡核苷酸类似物。该杂交尤其包括将探针与DNA杂交(例如Southern杂交)、与RNA 杂交(例如Northern杂交)，将探针与结合在芯片上的任何核酸序列杂交等。本发明的另 一方面是在PCR反应过程中用作PCR引物的一种寡核苷酸类似物或一对或多对寡核苷酸类 似物。这些PCR反应包括例如常规PCR、实时PCR、反向录PCR等，概括地说包括下述的所有 不同反应，所述反应中发生磷酸二酯键的重复催化合成，通过用高温变性先前合成的双链 核酸链来打断合成。本发明的另一方面是寡核糖核苷酸类似物，其与未修饰的寡核糖核苷 酸或可以选择与另一个修饰的寡核糖核苷酸一起使用，以退火短干扰RNA(SiRNA)，并使用 该退火的siRNA来沉默与相应siRNA互补的核酸序列。所提到的siRNA可以使用转染、微 注射、轰击、病毒载体或其他技术，导入到细胞中。所提到的沉默意味着例如靶核酸的序列 特异性降解或靶核酸的序列特异性翻译抑制。有鉴于本发明的修饰的寡核苷酸超常的结合力，本发明的一个方面是抑制靶核酸 表达的方法，包括将已知序列的靶核酸与具有与所述靶核酸的链至少部分互补的核碱基序 列的修饰的寡核苷酸，在允许修饰的寡核苷酸与靶核酸的链杂交的条件下相接触，其中杂 交的修饰的寡核苷酸抑制了靶核酸的表达，其中修饰的寡核苷酸包含5到150个核碱基，其 中修饰的寡核苷酸的至少一个核碱基是修饰的核碱基，选自5_巯基胞嘧啶，5-巯基尿嘧 唳，8-巯基鸟嘌呤，8-巯基腺嘌呤，5-羟基胞嘧啶，5-羟基尿嘧啶，8-羟基腺嘌呤和8-羟基 鸟嘌呤。一个方面，靶核酸的表达被抑制至少20 %。在某些方面，靶核酸是RNA，在其他方 面修饰的寡核苷酸本质上是单链的。在某些方面，修饰的寡核苷酸与另一个寡核苷酸一起 使用，并且是双链的，其中两条链中的至少一条链是含有至少一个修饰的核碱基的修饰的 寡核苷酸。本发明的另一方面涉及细胞中的靶核酸，以及修饰的寡核苷酸与靶核酸的接触，包括将修饰的寡核苷酸导入到细胞中。在这些方面的一些中，接触选自用修饰的寡核苷酸 转化和转染细胞。在其他方面，靶核酸在生物体的细胞中，接触包括向生物体施用含有修饰的寡核 苷酸和可药用载体的组合物。在某些实施方案中，组合物还包含投送载体，例如脂质体。在 各种不同方面，生物体是哺乳动物，在其他方面是人类。除了上述之外，作为另外的情况，本发明包括了使用修饰的寡核苷酸检测靶核酸 的方法，包括将靶核酸与修饰的寡核苷酸，在允许修饰的寡核苷酸与所述靶核酸(可以具 有1、2条或更多的链，通常为1或2条链)的链杂交的条件下相接触，其中修饰的寡核苷酸 包含与靶核酸链的序列至少部分互补的核碱基序列，并且其中修饰的寡核苷酸的至少一个 核碱基是修饰的核碱基，选自5_巯基胞嘧啶，5-巯基尿嘧啶，8-巯基鸟嘌呤，8-巯基腺嘌 呤，5-羟基胞嘧啶，5-羟基尿嘧啶，8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤；并且通过检测与靶核 酸链杂交的修饰的寡核苷酸来检测靶核酸。在某些方面，靶核酸被固定化到固相载体上。在其他方面，固定化的靶核酸是DNA 或RNA。在某些上述的方面，检测在本质上是定量的。例如，杂交的测量为靶核酸的量提供 了绝对或相对的量度。本发明的另一方面是聚合酶链反应(PCR)方法，包括将模板核酸与修饰的寡核苷 酸相接触，所述修饰的寡核苷酸包含与模板核酸的一部分充分互补的序列，从而允许修饰 的寡核苷酸与模板核酸在PCR退火条件下杂交，其中杂交的修饰的寡核苷酸在PCR扩增条 件下用作PCR引物，以产生第一条PCR产物链，并且其中修饰的寡核苷酸包含5到150个核 碱基，其中至少一个核碱基是修饰的核碱基，选自5_巯基胞嘧啶，5-巯基尿嘧啶，8-巯基 鸟嘌呤，8-巯基腺嘌呤，5-羟基胞嘧啶，5-羟基尿嘧啶，8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤。在某些方面，PCR包括制备含有热稳定DNA聚合酶、模板核酸、修饰的寡核苷酸和 核苷酸(例如dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的反应混合物。在PCR反应中使用的试剂，包括 MgCl2、缓冲液等，是众所周知的。在其他方面，PCR反应混合物还包含第二种寡核苷酸，它含有与靶核酸链的一部分 或第一条PCR产物链的一部分之一互补的核苷酸序列。在各种不同方面，第二种寡核苷酸 是修饰的寡核苷酸，其中修饰的寡核苷酸含有5到150个核碱基，其中至少一个核碱基是修 饰的核碱基，选自5_巯基胞嘧啶，5-巯基尿嘧啶，8-巯基鸟嘌呤，8-巯基腺嘌呤，5-羟基 胞嘧啶，5-羟基尿嘧啶，8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤。在某些方面，模板核酸是DNA，而 在其他方面模板核酸是RNA。本发明还提供了其中扩增产物被实时定量的方法。在其他方面，聚合酶链反应包含使模板核酸变性、将修饰的寡核苷酸与模板核酸 在退火条件下退火、以及通过延伸退火的修饰的寡核苷酸合成聚合酶链反应产物的重复的步骤。在本发明的某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含可检测的标记。在某些方面，本发明的方法提供的杂交条件包括4到10之间的pH。在其他方面， 杂交条件包括4到6之间的pH。在本发明的某些变体中，预期本发明提供的修饰的寡核苷酸具有10到100个核碱 基的长度。在各种不同的方面，修饰的寡核苷酸的长度为10到50个核碱基。在其他方面，修饰的寡核苷酸的长度为20到30个核碱基。在某些方面，修饰的寡核苷酸中0. 5%到40%的核碱基是巯基-或羟基-核碱基。除了上述之外，作为其他方面，本发明包括了以任何方式在范围上比上面具体提 到的变体更窄的本发明的所有实施方案。例如，尽管出于简要的目的，本发明的情况已经可 以用类属或值的范围进行描述作为参考，但应该理解，类属的每个成员和范围内的每个值 或子范围都旨在作为本发明的方面。同样地，本发明的各种不同方面和特点可以组合，产生 旨在处于本发明的范围之内的其他方面。以单数形式(包括使用不带数量指示的名词形式)描述的本发明的方面，应该被 理解为包括了包含一或一以上的实施方案，除非上下文明显需要较狭义的解释。术语“包 含”旨在允许附加的要素或特点。尽管申请人发明了随附的权利要求书的整个范围，但随附的权利要求书不打算在 其范围内包含其他人的现有技术的工作。因此，在专利局或其他团体或个人就权利要求范 围内法定的现有技术提请申请人注意的情况下，申请人保留在可适用专利法规下行使修改 权来重新限定所述权利要求的主题内容，以便从这样的权利要求范围内具体排除这些法定 现有技术或法定现有技术的明显变体的权利。由这样的修改的权利要求书限定的本发明的 变体也打算作为本发明的方面。附图简述
图1描绘了浓度为Ipmol的修饰的寡核苷酸的相对结合效率的多项式拟合。图2描绘了浓度为5pmol的修饰的寡核苷酸的相对结合效率的多项式拟合。图3描绘了修饰的寡核苷酸与Ing DNA的相对结合效率的多项式拟合。图4描绘了修饰的寡核苷酸与5ng DNA的相对结合效率的多项式拟合。图5描绘了修饰的寡核苷酸在杂交中的效率。图6描绘了修饰的寡核苷酸与1. 25ng互补mRNA的相对结合效率的多项式拟合。图7描绘了修饰的寡核苷酸与2. 5ng互补mRNA的相对结合效率的多项式拟合。图8描绘了对于不同靶浓度来说，寡核苷酸fl在不同PH值下相对结合效率的多 项式拟合。图9描绘了对于不同靶浓度来说，寡核苷酸f2在不同pH值下相对结合效率的多 项式拟合。图10描绘了修饰的寡核苷酸在PCR中的利用。显示了带有修饰碱基的寡核苷酸 相对于PCR中增加的退火温度的适用性和效率。图11描绘了修饰的siRNAs对eGFP转入基因表达的影响。发明详述本发明提供了含有寡核苷酸的新的化合物，它具有用于反义和其他使用寡核苷酸 的方法的性质。本发明的化合物包括具有一个或多个修饰的核碱基的反义和其他寡核苷 酸，它们与天然核碱基具有高的结合效率。包含修饰的寡核苷酸的化合物可用于核酸的杂 交、PCR和siRNA介导的基因沉默(RNAi)。寡核苷酸在本发明的背景中，术语“寡核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA) 的寡聚物或多聚物，或其模拟物、嵌合体、类似物和同系物。该术语包括由天然存在的核碱
7基、糖和共价的核苷间(骨架)连键组成的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分的寡核苷 酸，这些非天然存在的部分在例如与靶核酸杂交或与互补寡核苷酸相互作用时，以类似天 然存在的寡核苷酸的方式发挥作用。这样的修饰的或取代的寡核苷酸与天然形式相比往往 是优选的，因为它们具有期望的性质，例如细胞摄入增强、对靶核酸的亲和性增加和在存在 核酸酶情况下稳定性增加。本发明的化合物与生物学配对物(例如RNA和/或DNA)结合的增强的效率，是通 过掺入修饰的核碱基或其他具有两性离子或离子互变异构体的类似物来获得的。本发明的 化合物有至少一个核碱基具有修饰的核碱基或其他具有两性离子或离子互变异构体的类 似物。在优选实施方案中，修饰的核碱基是选自5-羟基胞嘧啶和8-羟基鸟嘌呤的羟基核碱 基，或选自5-巯基胞嘧啶、5-巯基尿嘧啶、8-巯基鸟嘌呤和8-巯基腺嘌呤的巯基核碱基。 正如在引为参考的美国专利公布US20070259830和国际专利公布WO 2007/125173中证明 的，在羟基核碱基或巯基核碱基与靶核酸的核碱基之间可以发生更稳定的氢键结合，因此 它们可以被认为与互补核酸链更有效地结合。修饰的核碱基中酸性互变异构基团可以是任何其他的酸性基团，例 如-SH、-C00H、-SO3H 等。在一个实施方案中，寡核苷酸包含5-羟基尿嘧啶阴离子的一种或多种互变异构 形式。在另一个实施方案中，本发明的化合物包括羟基碱基5-羟基胞嘧啶。在另一个实施 方案中，羟基碱基是8-羟基腺嘌呤及其阴离子的互变异构形式。本发明的另一个实施方案 提供了由8-羟基鸟嘌呤及其阴离子的互变异构形式修饰的本发明的化合物。这些核碱基 的互变异构形式在WO 2007/125173中更详细地描述，该专利在此引为参考。本文中考虑到的其他修饰的核碱基包括巯基修饰的核碱基。巯基修饰的嘧啶和嘌 呤的合成在本技术领域中是已知的(参见例如《杂环化合物化学嘧啶》，增补本1，第16册 (Chemistry of HeterocyclicCompounds :The Pyrimidines, Supplement 1, Volume 16), D. J. Brown 主编，John ffiley&Sons, Inc. , 1970, pp. 202-229 ；以及 Khalyullin 等“缩合的嘌 Πφ" (Condensed purines), Pharmaceutical Chemistry Journal，1992，26 :270_284)。考 虑到的巯基核碱基包括5-巯基胞嘧啶、5-巯基尿嘧啶、8-巯基鸟嘌呤和8-巯基腺嘌呤。在本文中使用时，每个羟基核碱基当与相对的核碱基稳定地形成氢键时，被认为 与该核碱基互补。因此，在某些情况下，5-羟基尿嘧啶与腺嘌呤互补，5-羟基胞嘧啶与鸟嘌 呤互补，8-羟基腺嘌呤与尿嘧啶和/或胸腺嘧啶互补，8-羟基鸟嘌呤与胞嘧啶互补。羟基 核碱基与靶核酸的核碱基可以发生其他稳定的氢键键合，因此羟基核碱基被认为同与其发 生稳定的氢键键合的靶核酸的核碱基互补。在本发明的给定化合物中，羟基核碱基和/或巯基核碱基的数量，是化合物的寡 核苷酸部分的核碱基总数的至少到最高100%。在本发明的化合物中存在一种以上羟 基核碱基或巯基核碱基的情况下，羟基核碱基或巯基核碱基可以是相同的或不同的(以不 同碱基和/或修饰类型的任何组合)。预期在本文描述的寡核苷酸中，10%到90%、20%到 80%,30%到70%、40%到60%或50%的核碱基是修饰的核碱基。此外，预期10、20、30、40、 50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%的核碱基是修饰的核碱基。本发明的化合物优选包含大约5到大约150个核碱基(即从大约5到大约150 个连接的核苷)。本技术领域的普通专业人员将会认识到，本发明包含了长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147、148、149和150个核碱基的化合物。在一个优选实施方案中，本发明的化合物长度为10到100个核碱基。本技术领 域的普通专业人员将会认识到，这包含了长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99或100个核碱基的化合物。在另一个优选实施方案中，本发明的化合物长度为10到50个核碱基。本技术领 域的普通专业人员将会认识到，这包含了长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49或50个核碱基的化合物。在另一个优选实施方案中，本发明的化合物长度为20到30个核碱基。本技术领 域的普通专业人员将会认识到，这包含了长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个 核碱基的化合物。特别优选的化合物是从大约10到大约50个核碱基的寡核苷酸，更优选是含有大 约20到大约30个核碱基的寡核苷酸，在样品测试中用作抗病毒剂的化合物由21或23个 核碱基构成。正如上面陈述的，寡核苷酸可以包含100%修饰的核碱基。照此，依赖于寡核苷酸 的长度，寡核苷酸可以包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、 136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149 或 150 个修饰的核碱基， 其中修饰的碱基是巯基核碱基或羟基核碱基。本发明的化合物任选还包含螯合性部分。螯合性部分起到金属配体的作用。它们 能够稳定地螯合金属离子。某些金属配体复合物已被显示能够有效地切开磷酸二酯键。在 具有反义活性的寡核苷酸中引入螯合性部分，由于其降解或切开靶核酸的一个或多个磷酸 二酯键的能力，增加了寡核苷酸抑制靶核酸的功效。因此，本发明的化合物进一步包含了能 够螯合金属离子的螯合性部分。金属离子选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、 铥、镱和镥。在一个方面，优选的离子是铕或镧离子。金属离子可以是任何稳定的离子，例 如 +1、+2、+3、+4 或 +5 离子。优选的离子是 La (III)、Eu (III)、Ho (III)和 Ce ( IV )。
考虑到的螯合性部分包括由下面描述的式所表示的螯合性部分其中R是寡核苷酸的其余部分；
权利要求
一种抑制靶核酸表达的方法，所述方法包括将已知序列的靶核酸和具有与所述靶核酸的链至少部分互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸，在允许所述修饰的寡核苷酸与所述靶核酸的链杂交的条件下相接触，其中杂交的修饰的寡核苷酸抑制靶核酸的表达，其中修饰的寡核苷酸包含5到150个核碱基，并且其中修饰的寡核苷酸的至少一个核碱基是修饰的核碱基，所述修饰的核碱基选自5 巯基胞嘧啶，5 巯基尿嘧啶，8 巯基鸟嘌呤，8 巯基腺嘌呤，5 羟基胞嘧啶，5 羟基尿嘧啶，8 羟基腺嘌呤和8 羟基鸟嘌呤。
2.权利要求1的方法，其中表达被抑制至少20%。
3.权利要求1或2的方法，其中修饰的寡核苷酸是RNA。
4.权利要求3的方法，其中RNA是单链的。
5.权利要求3的方法，其中RNA是双链的，并且其中RNA的至少一条链包含至少一个修 饰的核碱基。
6. 权利要求1-5任一项的方法，其中靶核酸在细胞中，并且接触包括将修饰的寡核苷 酸导入到细胞中。
7.权利要求6的方法，其中接触选自用修饰的寡核苷酸转化和转染细胞。
8.权利要求1-5任一项的方法，其中靶核酸在生物体的细胞中，并且其中接触包括向 生物体施用含有修饰的寡核苷酸和可药用载体的组合物。
9.权利要求8的方法，其中生物体是哺乳动物。
10.权利要求9的方法，其中生物体是人类。
11.一种使用修饰的寡核苷酸检测靶核酸的方法，所述方法包括 将靶核酸与修饰的寡核苷酸在允许所述修饰的寡核苷酸与所述靶 核酸的链杂交的条件下相接触，其中修饰的寡核苷酸包含与靶核酸链的序列至少部分互补的核碱基序列，以及 其中修饰的寡核苷酸的至少一个核碱基是修饰的核碱基，所述修饰的核碱基选自 5-巯基胞嘧啶，5-巯基尿嘧啶，8-巯基鸟嘌呤，8-巯基腺嘌呤，5-羟基胞嘧啶，5-羟基尿嘧 啶，8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤；并且通过检测与靶核酸链杂交的修饰的寡核苷酸来检测靶核酸。
12.权利要求11的方法，其中靶核酸被固定到固相载体上。
13.权利要求12的方法，其中固定化的靶核酸是DNA。
14.权利要求12的方法，其中固定化的靶核酸是RNA。
15.权利要求11-14任一项的方法，其中检测是定量的。
16.一种聚合酶链反应(PCR)方法，所述方法包括将模板核酸与修饰的寡核苷酸相接触，所述修饰的寡核苷酸包含与模板核酸的一部分 充分互补的序列，从而允许所述修饰的寡核苷酸与所述模板核酸在PCR退火条件下杂交，其中杂交的修饰的寡核苷酸用作PCR引物，用于在PCR扩增条件下产生第一条PCR产 物链，以及其中修饰的寡核苷酸包含5到150个核碱基，其中至少一个核碱基是修饰的核碱基，所 述修饰的核碱基选自5_巯基胞嘧啶，5-巯基尿嘧啶，8-巯基鸟嘌呤，8-巯基腺嘌呤，5-羟基胞嘧啶，5-羟基尿嘧啶，8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤。
17.权利要求16的方法，其中PCR包括制备含有热稳定的DNA聚合酶、模板核酸、修饰的寡核苷酸和核苷酸的反应混合物。
18.权利要求17的方法，其中PCR反应混合物还包含第二种寡核苷酸，它含有与靶核酸 链的一部分或第一条PCR产物链的一部分之一互补的核苷酸序列。
19.权利要求18的方法，其中第二种寡核苷酸是修饰的寡核苷酸，其中修饰的寡核苷 酸含有5到150个核碱基，其中至少一个核碱基是修饰的核碱基，所述修饰的核碱基选自 5-巯基胞嘧啶，5-巯基尿嘧啶，8-巯基鸟嘌呤，8-巯基腺嘌呤，5-羟基胞嘧啶，5-羟基尿嘧 啶，8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤。
20.权利要求16-19任一项的方法，其中模板核酸是DNA。
21.权利要求16-19任一项的方法，其中模板核酸是RNA。
22.权利要求16-21任一项的方法，其中扩增产物被实时定量。
23.权利要求16-22任一项的方法，其中聚合酶链反应包含下列重复的步骤将模板核 酸变性，将修饰的寡核苷酸与模板核酸在退火条件下退火，以及通过延伸退火的修饰的寡 核苷酸而合成聚合酶链反应产物。
24.权利要求1-23任一项的方法，其中修饰的寡核苷酸包含可检测的标记。
25.权利要求1-24任一项的方法，其中杂交条件包括pH在4到10之间。
26.权利要求25的方法，其中pH在4到6之间。
27.权利要求1-26任一项的方法，其中修饰的寡核苷酸具有10到100个核碱基的长度。
28.权利要求1-26任一项的方法，其中修饰的寡核苷酸具有10到50个核碱基的长度。
29.权利要求1-26任一项的方法，其中修饰的寡核苷酸具有20到30个核碱基的长度。
30.权利要求1-29任一项的方法，其中修饰的寡核苷酸中0.5%到40%的核碱基包括 巯基核碱基或羟基核碱基。
31.在靶核酸的扩增方法中的改进，所述方法包括将与靶核酸的至少一部分互补的 寡核苷酸引物退火至靶核酸，所述改进包括使用修饰的寡核苷酸作为寡核苷酸引物，其中 修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核碱基，所述修饰的核碱基选自5_巯基胞嘧啶， 5-巯基尿嘧啶，8-巯基鸟嘌呤，8-巯基腺嘌呤，5-羟基胞嘧啶，5-羟基尿嘧啶，8-羟基腺嘌 呤和8-羟基鸟嘌呤。
32.权利要求31的改进，其中扩增方法是指数扩增方法。
33.权利要求31的改进，其中扩增方法是聚合酶链反应(PCR)。
全文摘要
本发明涉及抑制靶核酸的表达，或者检测靶核酸或者靶核酸的PCR扩增，包括将修饰的至少部分互补的寡核苷酸与所述靶核酸的链杂交，其中的寡核苷酸包括下列修饰的核碱基中的一种5-巯基胞嘧啶，5-巯基尿嘧啶，8-巯基鸟嘌呤，8-巯基腺嘌呤，5-羟基胞嘧啶，5-羟基尿嘧啶，8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤。
文档编号C12N15/113GK101983241SQ200880123480
公开日2011年3月2日 申请日期2008年11月5日 优先权日2007年11月5日
发明者埃兰·奥斯佩特, 埃尔基·特鲁维, 塞西莉亚·萨米恩托, 马特·萨尔玛, 马蒂·卡拉尔森 申请人:波罗的科技发展有限公司