带有修饰碱基的寡核苷酸作为抗病毒剂的应用的制作方法

专利名称：带有修饰碱基的寡核苷酸作为抗病毒剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用含有特异修饰的核苷酸碱基的寡核苷酸类似物，来抑制病毒的基 因表达和/或复制。寡核苷酸任选地与具有高选择性人工核酸酶活性的镧系元素有机复合 物结合。
背景技术：
寡核苷酸和修饰的寡核苷酸的应用在现代疗法中是极为重要的，并已有详尽 记录(Uhlmann 等，Antisense oligonucleotides :A newtherapeutic principle.(反 义寡核苷酸新的治疗原理)Chemical Reviewsl990,90 :543_584 ；Crooke等《反义研 究禾口应用》(Antisense Researchand Applications), CRC Press (1993) ；Mesmaekar 等，“Antisenseoligonucleotides “(反义寡核苷酸)，Ace. Chem. Res. 1995, 28 366-374 ；Stein. “ The experimental use of antisense oligonucleotides :a guide for theperplexed.“(反义寡核苷酸的实验应用困惑指南)J. Clin. Invest. 2001，108， 641-644)。反义多核苷酸与DNA或RNA靶的特异性结合，可以使核酸的复制、转录或翻译失 活，从而提供了用于控制疾病例如癌症和病毒感染的机制。因此，反义寡核苷酸与靶的结合 可用于在各种不同的情况下改变基因的表达，例如干扰病毒的生命周期或癌细胞的生长。许多侵害人类的重要传染病由病毒引起。这些疾病中的许多，包括肝炎、免疫缺陷 和各种不同脑炎疾病，通常是致命的。其他这类疾病的重要性在于它们是高度传染性的，引 起急性不适，例如流感、麻疹、流行性腮腺炎和水痘，以及呼吸道或胃肠道疾病。其他例如风 疹和巨细胞病毒能引起先天性畸形。最后，还有被称为致癌病毒的病毒(包括人类乳头瘤 病毒)，能够在人类和动物中引起癌症。病毒基因组可以由DNA或RNA构成。此外，已知有两类病毒，在它们的复制周期中 使用DNA和RNA两种阶段。病毒的基因组DNA可以是双链或单链的，环状或线性的。DNA的 尺寸可以小至4. 5kb，或大至1.2Mbp ；基因的数量在3到高达911个之间变化。DNA基因组 不用作建议的抗病毒的靶。代替病毒编码的mRNAs，可以使用对于病毒感染来说关键的微小 RNAs以及编码宿主因子的mRNAs，作为反义靶。因此，这种方法不导致病毒基因组的直接破 坏，而是能够抑制病毒复制和/或基因表达，并最终导致病毒基因组从细胞中清除。此外， 靶向编码抑制宿主免疫应答所必需的蛋白的病毒mRNAs，可以通过宿主免疫系统增强病毒 的消除。靶向抑制宿主细胞凋亡所必需的病毒基因产物，可以导致被感染细胞的提前死亡 并因此消除病毒感染，而靶向潜伏病毒的维持所必需的病毒基因产物(mRNAs，或在某些情 况下微小RNAs)，可以导致消除被潜伏感染的细胞，并从被感染生物体中除去潜伏病毒。反转录病毒不具有DNA基因组，但是在它们感染的第一阶段，它们合成了它们的 基因组RNA的cDNA拷贝，然后将其整合到细胞DNA中，从而变成了宿主基因组的一部分(所谓的原病毒DNA)。该DNA通常在转录上是沉默的，携带这些原病毒的细胞不能被常规的抗 病毒剂或系统被靶向(这是抗HIV疗法中的最大难题之一)。尽管原病毒不能通过反义技 术被靶向或消除，但感染过程的某些步骤却能。这些步骤包括在反转录反应发生之前，靶 向新被感染细胞中的病毒基因组——在该阶段中基因组RNA被病毒蛋白包封在“核心”粒 子中；靶向病毒受体或共同受体(在HIV的情况中是趋化因子受体)以阻止病毒进入；靶向 病毒cDNA核运输和整合到宿主基因组中所必需的细胞辅因子(对于HIV-I来说许多这样 的因子是已知的)；靶向从原病毒表达的mRNAs，从而抑制反转录病毒复制周期；在病毒基 因组RNAs包衣壳之前靶向它们，并阻止新的病毒粒子的形成。这些策略对于抑制HIV基因 组可能是有效的，该基因组编码了多个调控蛋白，它们的表达可以被阻断。核糖核酸病毒(具有RNA基因组的病毒)的基因组可以用序列特异性抗RNA药剂 直接靶向。因此由核糖核酸病毒引起的感染可以通过单独使用这些种类的药物完全消除。 但是，在实践中，基因组的靶向可能是复杂的，因为病毒基因组通常是受保护的；但即使这 样，病毒mRNAs和病毒所必需的细胞辅因子的mRNAs，仍然可以被靶向。具有双链RNA基因组的病毒的基因组RNA，总是包装在蛋白粒子(病毒核心)中， 从不释放到被感染细胞的细胞质中。因此，很可能只有mRNAs和宿主因子可以用抗RNA药 剂靶向。具有单链负链RNA基因组的病毒的基因组，总是受到病毒核蛋白的保护，但是它不 形成特定的核心-粒子。因此，靶向病毒基因组以及它们的必需mRNAs 二者，将是可能的。具有单链正链RNA基因组的病毒，是其中基因组RNA被直接用作mRNA，并且至少在 感染的某些阶段采取裸露(未受保护)形式的唯一类型的病毒。但是，在复制过程中，基因 组及其互补链通常包装在膜状结构中。因此，可能感染的初始阶段(在复制酶复合物形成 之前)可能对RNA降解剂更敏感。除了病毒靶的本性(基因组，mRNA，或二者)之外，其他 因素也可能具有非常重要的作用。如果抗病毒剂局限于单一作用，例如阻断一种RNA分子(反义寡核苷酸)或切开 仅仅一种RNA分子(使用抗病毒核酶时通常是这种情况)，那么靶RNA的丰度是特别重要 的。病毒RNA的丰度随着病毒的类型和感染阶段变化极大。据假定，在病毒RNA(基因组或 mRNAs)的拷贝数低的感染阶段(这典型对应于感染的早期阶段)，反义剂更加有效。靶的极性对于正义核糖核酸病毒的抑制是重要的，这些病毒具有高度不对称的 RNA合成，例如，这些病毒的正(基因组)链数量通常比负链数量高100倍或以上。这将使负 链成为优选的靶，但是，已知这些病毒的负链通常(可能总是)以双链RNA中间体的形式存 在，并隐藏在膜状复制复合物中。因此，重要的是确定所提出的抗病毒剂是否也结合dsRNA 复合物(在使用RNAi的实验中已报道了负链的特异性降解)。病毒在受感染细胞内部的复制位点取决于病毒的类型，可以在核(反转录病毒， 大多数DNA病毒和流感病毒)或细胞质(除了流感病毒、玻纳病毒属和胞核弹状病毒属以 及DNA基因组的痘病毒之外的所有核糖核酸病毒)中进行。对于在细胞质内复制的病毒来 说，观察到了不同的病毒特异性结构(通常称为“病毒工厂”或“病毒发生基质”)。在理论 上，特定位点(例如核、膜复合物和“病毒工厂”)的用处可以保护病毒基因组不受治疗药剂 影响；然而，已报道至少RNAi具有抗核RNA分子的活性。因此，病毒复制复合物的细胞内定 位的重要性可能具有相对次要的影响，特别是如果纳入以下考虑因素所有病毒使用游离 mRNAs来表达它们的基因，因此具有能够被RNA降解剂靶向的分子，并且所有的正链RNA病毒(其基因组可以被容易地靶向的唯一类型的病毒)都在细胞质中复制。病毒在受感染生物体内复制的位点可能具有大得多的影响。同样，复制位点取决 于病毒的类型。大多数病毒具有一定的组织特异性——某些病毒感染上皮细胞，某些病毒 感染肝细胞等。许多病毒感染不同的细胞类型。感染可以从外周组织(侵入口)开始，但 是疾病由在其他细胞类型(靶细胞)中的复制引起。有许多病毒这两种细胞是完全不同的 (麻疹病毒等)，但是也有许多例子这些细胞是相同的(流感病毒)。生物体内不同复制位点的结果是不同的。如果病毒在上皮组织(肠上皮细胞，呼 吸道)中复制，药物投送方法可以相对简单。这意味着有效但高度不稳定的化合物例如 siRNAs，可用于在体内治疗这些感染。如果病毒在上皮之外的组织中复制，至少对于siRNA 技术来说需要特殊的药物投送系统。在HCV感染的情况下，治疗药剂理论上可以是表达 siRNA前体(shRNA)的肝特异性纳米粒子或肝特异性病毒粒子。在瞬态模型(transient models)中，将编码shRNA的质粒DNA直接注射到血流中，也已经产生了良好结果，但由于缺 乏投送特异性，这种技术的治疗性应用将很可能受限。在这些病毒中，稳定得足以通过血液 投送并且安全无毒的化合物(例如短的寡核苷酸不能整合到宿主DNA中，一般不引起副作 用)，可能比siRNA技术更有优势。如果病毒在特定组织例如神经元组织中复制，可能需要另一种类型的特异性投送 系统。如果病毒的靶组织是CNS，那么也需要穿过血脑屏障的方法，例如抗病毒剂的脑内投 送。感染人类和动物的病毒一般采用几种感染策略之一。在“一打即跑(hit and rim)”策略(急性感染)中，病毒进入宿主，快速活跃地复制，并最终被宿主的免疫应答消 除；唯一的替代结果是感染宿主的死亡。感染时间典型较短(最多几周)，急性感染过程中 病毒量非常高。这种策略被许多“经典”病毒(例如流感病毒)采用。在“一打即躲(hit and hide) ”策略(潜伏感染)中，感染以上述的情景开始和发 展，但是代替被完全消除的是，病毒建立起了终生的潜伏感染。在潜伏期间，病毒的基因表 达最小化，不产生感染性病毒。但是，在某些条件下，病毒重新激活并引起新的疾病(与最 初的疾病相同或不同)。这些类型的病毒非常常见，包括例如单纯性疱疹病毒(HSV)。在许 多情况下，由于倾向于在免疫受损患者(例如AIDS患者)中导致严重或致命疾病，这些病 毒引起了严重问题。“慢性”或“持续性”感染一般以短的急性阶段开始。该阶段可以是无症状的，可 以以病毒的完全消除作为结束。但是结果取决于病毒和宿主两者高达95%的乙肝病毒 (HBV)感染在成年人中以病毒的消除作为结束。或者，病毒可能建立起慢性感染(例如高达 70%的HCV感染和可能100%的HIV感染)。在慢性感染过程中，病毒复制保持活性(与潜 伏感染中相反)，可以产生大量病毒粒子(HCV典型地每天形成多达1012个粒子)。但是， 免疫系统不能消除感染。慢性病毒代表了主要的健康护理问题，因为高达5亿人感染有HBV 或HCV，大约4千万人感染有HIV-I。消除不同类型感染需要的条件可能极为不同。对于急性疾病来说，治疗必须尽可 能早地进行，并很可能相当短。在这种情况下，治疗具有明确的目标，减缓病毒的感染，给免 疫系统时间来消除病毒(通过治疗完全抑制病毒可能是不可能的，在许多情况下可能也是 不必要的)。还不清楚使用药剂的最低效率应该如何——在某些情况下少量抑制复制就可以提供相当大的保护，而在其他情况下可能需要几乎彻底的抑制。对于潜伏病毒来说，主要问题是消除被被潜伏感染的细胞——储存库，新的感染 可能由此开始。目前，对病毒潜伏的机制了解得很少，这是为什么目前的疗法不能消除潜伏 病毒的原因之一。理论上，这些病毒和潜伏细胞可以用针对病毒辅因子(如果它们已知的 话)或针对病毒的必需基因产物的序列特异性RNA降解剂来靶向。例如，在HSV的研究中， 最近已证实病毒编码的微小RNA可能是造成潜伏感染的主要因子，这可以为病毒复制的抑 制提供理想的靶。对于慢性病毒来说，治疗可以旨在防止感染的扩散(例如在向HCV患者进行肝脏 移植的情况下)，以在所有或在许多细胞中消除感染，或至少将病毒的复制保持在某种控制 之下。一般来说，慢性感染的治疗是长期的过程——目前对于HIV患者来说是终生的，对于 HBV和HCV患者来说需要许多月。由于这个事实，治疗的副作用是非常重要的，正如在使用 抗HIV、HCV和HBV治疗的长期效应中看到的。所有类型的抗病毒剂的主要问题之一是对药物具有抗性的病毒变异体的出现。这 个现象背后的一般分子机制包括靶序列的缺失和靶序列的修饰(点突变，小的缺失)。在许 多情况下，完整的基因或其功能可能丢失(使用阿昔洛韦的抗HSV疗法通常引起病毒TK基 因的丢失)。但是，这种抗性机制只有当靶基因编码的功能对于病毒存活来说不是必需的情 况下才有可能。在实际的靶之外的序列的修饰，使得它们补偿了失去的功能，促进了 RNA构 象的变化等，是抗病毒治疗一贯的问题。另一个问题是许多重要病原体在遗传上极为可变 这一事实。现有的HIV-I基因组序列的变异性，与整个小核糖核酸病毒科中的变异性相当； HCV基因型之间的同源性，能够低至60%。本质上，这表明HIV-I和HCV都不代表单一的病 原体；相反，它们是用于(主要由于历史原因)相关病原体类群的名称。这种巨大的多样性 已经严重地阻碍了针对任何这些病毒的有效疫苗的构建。此外，HCV、HIV以及其他核糖核 酸病毒不具有这样固定的基因组序列，相反，它们具有一种共有序列(因此个体基因组一 般不同)，并因此作为准种(quasi-species)存在。已经显示，即使在单一患者内，每个HCV RNAs的序列彼此之间在1-3%的核苷酸位置上存在差异。因此，在任何慢性感染患者中，已 经存在相当大的序列变异性。这些序列变异性通常来自于病毒复制和重组事件中发生的突变。病毒复制过程 中发生的突变主要是由于缺乏校读功能——反转录酶(HIV-I)和RNA依赖性RNA聚合酶 (HCV)都不能校正在病毒复制过程中发生的错误(错误率估计为每个周期每个核苷酸10_4 变化，在HIV和HCV的情况下意味着每个基因组一个变化)。与这些病毒合成的大量基因组 合在一起考虑，HIV和HCV能够极快地突变(据报道HCV的突变率比HIV高100倍)。实质 上，这意味着这些病毒可以在短时间内克服任何序列特异性治疗药剂的效应。对于HIV来 说，这种现象已经进行了最深入的研究，因为抗HIV疗法已经使用了将近20年。结果表明， 为了获得任何长期效果，应该组合使用具有不同靶特异性的抑制剂(这是目前的高效抗反 转录病毒疗法(Highly Active Anti RetrovirusTherapy) :HAART 的原理)。但即使是这 种策略，也没有阻止新的药物抗性HIV变异株的出现。病毒对基于核酸的疗法(反义寡核苷酸，核酶，SiRNA和shRNA)的抗性现象，对于 RNAi系统来说研究得最多。已经证实，反转录病毒(HIV)和核糖核酸病毒(HCV，脊髓灰质 炎病毒)都对RNAi敏感，但是它们通过在siRNA靶位点和/或周围序列中引入突变，快速
9发展出了对任何特异性SiRNA的抗性。也已显示，抗性总是与特异性靶序列相关，而不是与 对RNAi本身的不敏感性相关。发展出对siRNAs的抗性显然相当容易，因为siRNA应当与 靶具有100%的匹配(微小RNA耐受几个改变，但是是效率低得多的沉默子)。此外，由于 遗传密码的冗余性，核酸序列可以改变而不影响编码的蛋白的序列。病毒蛋白具有相当大 的可塑性——可以耐受许多氨基酸的改变(这也可以从关于抗HIV药物抗性的数据中找到 证据)。改变不仅能够影响RNA序列，而且能够影响其二级结构，从而抑制了它被siRNA识 别。有两种通用方法可用于避免(或最小化)抗性病毒基因组的出现。与HAART疗法 相似，可以使用几种siRNAs (或siRNAs与其他抑制剂例如核酶的组合)来治疗病毒感染。 已经显示，这种治疗比使用单一 siRNA的治疗更为有效，并显著减少了抗性突变株的出现。 因此，对于其他基于核酸的治疗性药剂，也应该强烈推荐类似的策略。可以将siRNAs靶向高度保守的序列或具有多个重叠功能的序列。这样的序列不 容易被改变而不影响关键功能。这种序列的例子是HIV-I基因组中的引物结合区，或HCV 基因组中带有IRES元件的5，UTR区。发明_既述本发明涉及含有寡核苷酸的组合物，其中所述寡核苷酸含有修饰的核碱基和任选 的螯合性部分，这增加了它们与互补核酸的结合能力，并表现出抗病毒活性。一方面，本发明提供了在对象中抑制病毒复制的方法，包括向对象施用5到150个 核碱基的寡核苷酸，其中至少一个核碱基是巯基修饰的互变异构或离子型碱基(巯基核碱 基)或羟基修饰的互变异构或离子型碱基(羟基核碱基)。另一方面，本发明考虑到了抑制靶核酸的翻译的方法，包括将靶核酸与含有具有 5到150个核碱基的寡核苷酸的组合物，在允许寡核苷酸与靶核酸杂交的条件下接触，其 中杂交的寡核苷酸抑制了靶核酸的翻译，其中靶核酸与病毒复制相关，并且其中寡核苷酸 含有至少一个修饰的核碱基，所述碱基选自巯基修饰的互变异构或离子型碱基(巯基核碱 基)和羟基修饰的互变异构或离子型碱基(羟基核碱基)。另一方面，本发明提供了在对象或病毒病原体中抑制病毒基因组的复制的方法， 包括预测或测定对象中靶核酸的核苷酸序列，其中靶核酸与病毒复制相关，以及向对象施 用含有5到150个核碱基的寡核苷酸的组合物，其中至少一个核碱基是巯基修饰的互变异 构或离子型碱基(巯基核碱基)或羟基修饰的互变异构或离子型碱基(羟基核碱基)，并且 其中在对象的生理条件下，所述化合物与靶序列的核苷酸序列充分互补，以便在对象中与 其杂交并抑制病毒复制。本发明还考虑到了使用寡核苷酸在对象中抑制病毒复制，其中寡核苷酸被配制成 用于向对象施用，并含有5到150个核碱基，其中至少一个核碱基是巯基修饰的互变异构或 离子型碱基(巯基核碱基)或羟基修饰的互变异构或离子型碱基(羟基核碱基)。在相关方面，本发明提供了寡核苷酸在制造抑制靶核酸翻译的药物中的应用，其 中将靶核酸与含有寡核苷酸的组合物在允许寡核苷酸与靶核酸杂交的条件下接触，其中杂 交的寡核苷酸抑制了靶核酸的翻译，其中靶核酸与病毒复制相关，并且其中寡核苷酸含有 至少一个修饰的核碱基，所述核碱基选自巯基修饰的互变异构或离子型碱基(巯基核碱 基)和羟基修饰的互变异构或离子型碱基(羟基核碱基)。
另一方面，本发明提供了寡核苷酸在制造在对象中抑制病毒基因组复制的药物中 的应用，所述应用包括预测或测定对象或病毒病原体中靶核酸的核苷酸序列，其中靶核酸 与病毒复制相关，以及向对象施用含有具有5到150个核碱基的寡核苷酸的药物，其中至少 一个核碱基是巯基修饰的互变异构或离子型碱基(巯基核碱基)或羟基修饰的互变异构或 离子型碱基(羟基核碱基)，并且其中在对象的生理条件下，所述化合物与靶序列的核苷酸 序列充分互补，以便在对象中与其杂交并抑制病毒复制。在一个实施方案中，可用于本发明的方法或应用或化合物中的寡核苷酸包含至少 一个巯基核碱基。在相关实施方案中，巯基核碱基选自5-巯基胞嘧啶、5-巯基尿嘧啶、8-巯 基鸟嘌呤和8-巯基腺嘌呤。在相关实施方案中，本发明包含至少一个羟基核碱基。在其他 实施方案中，羟基核碱基选自5-羟基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶、8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌 呤。一方面，寡核苷酸还包含与其连接的有机核酸酶。在一个实施方案中，有机核酸酶 包含与镧系金属复合的螯合性有机部分。在优选实施方案中，镧系金属选自镧、铈、镨、钕、 钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥。另一方面，本文描述的寡核苷酸可用于抑制各种不同病毒株的复制。在一个实施 方案中，病毒是正链RNA病毒。在相关实施方案中，病毒是DNA病毒。在另一个实施方案中，病毒是快速急性病毒。在相关实施方案中，快速急性病毒是 甲病毒。 在另一个实施方案中，病毒是慢性病毒。在相关实施方案中，慢性病毒是丙型肝炎 病毒。在另一个实施方案中，病毒是乳头瘤病毒。在相关实施方案中，乳头瘤病毒选自1 型牛乳头瘤病毒和人乳头瘤病毒。在上面考虑到的方法或应用的一个实施方案中，寡核苷酸与编码转录或调控因子 的病毒基因杂交，抑制了具有DNA基因组的病毒的复制。在相关实施方案中，寡核苷酸与病 毒复制因子杂交，抑制了具有DNA基因组的病毒的复制。在另一个实施方案中，寡核苷酸与在其复制周期中使用反转录的病毒杂交。在另 一个实施方案中，寡核苷酸与编码转录或调控因子的病毒基因杂交，抑制了利用反转录进 行复制的病毒的复制。在优选实施方案中，使用反转录的病毒是反转录病毒。在更优选实 施方案中，反转录病毒是人类1型免疫缺陷病毒。在相关实施方案中，寡核苷酸与宿主的与病毒复制相关的因子杂交并抑制病毒复 制。在另一个实施方案中，寡核苷酸可用于处理未被感染的细胞，以便在这些细胞中减少病 毒基因的表达和复制。考虑到了可用于本发明方法的寡核苷酸，其长度为5到150个核碱基，长度为10 到100个核碱基，长度为10到50个核碱基，长度为10到30个核碱基，长度为20到30个 核碱基，长度为或21到23个核碱基。对于本发明的实践来说，从5到150个核碱基内所有 的整数长度，以及5到150个核碱基内的子范围，都被具体地考虑到了。此外，考虑到了在修饰的寡核苷酸中到100%的核碱基是修饰的核碱基。在一 个实施方案中，10 %到90 %的核碱基是修饰的核碱基。在相关实施方案中，20 %到80 %的 核碱基是修饰的核碱基。在其他实施方案中，30%到70%、40%到60%或50%的核碱基是修饰的核碱基。在其他实施方案中，10、20、30、40、50、60、70、80或90 %的核碱基是修饰的
核碱基。在相关实施方案中，寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、多达30、多达40、多达50、多达100个或以上修饰的核碱基，其中修饰的核碱
基是羟基核碱基或巯基核碱基。例如，考虑到了 150个碱基的寡核苷酸整体可以全部包含 修饰的寡核苷酸。在本发明的实施方案中，寡核苷酸与病毒基因组的非编码区杂交，或与病毒基因 组的编码区杂交。在相关实施方案中，寡核苷酸与RNA病毒的编码区杂交。一方面，本发明的方法或应用或化合物还提供了将至少两种具有不同序列的寡核 苷酸施用于对象，其中所述寡核苷酸与不同的靶序列杂交。本发明还提供了使用至少两种 具有不同序列的寡核苷酸来制造用于向对象施用的药物，其中所述寡核苷酸与不同的靶序 列杂交。在一个实施方案中，两种不同的寡核苷酸被施用于对象。在另一个实施方案中，所 述寡核苷酸特异性针对同一个病毒基因组中的不同靶序列。在另一个实施方案中，寡核苷 酸特异性针对同一个功能单位中的靶序列。在另一个实施方案中，寡核苷酸特异性针对不 同功能单位中的靶序列。 还考虑到了组合物还含有本文描述的药物载体或赋形剂。在一个实施方案中，对象是哺乳动物。在相关实施方案中，对象是人类。一方面，用于本发明的方法或应用或化合物的组合物在脂质体中施用。在相关实 施方案中，组合物可以在纳米颗粒药物中施用，例如微胶粒或纳米粒子。考虑到了寡核苷酸与靶序列的杂交诱导了靶核酸的切开。在一个实施方案中，寡核苷酸表现出与靶核酸至少70%的同源性。在相关实施方 案中，寡核苷酸与靶核酸 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%同源。除了上述之外，作为附加的方面，本发明包括了以任何方式在范围上比上面具体 提到的变体更窄的本发明的所有实施方案。例如，尽管出于简要的目的已经参考类属或值 的范围描述了本发明的方面，但应该理解，类属的每个成员和范围内的每个值或子范围，都 意图作为本发明的方面。同样地，本发明的各种不同方面和特点可以组合，产生的附加方面 也打算处于本发明的范围之内。以不包括数量词的单数形式描述的本发明的方面，应该被理解为包括了包含一或 一以上的实施方案，除非上下文明显需要较狭义的解释。术语“包含”意在允许有附加的要 素或特点。尽管申请人发明了本文随附的权利要求书的整个范围，但本文随附的权利要求书 不打算在其范围内包含其他人的现有技术的工作。因此，在专利局或其他团体或个人就权 利要求范围内法定的现有技术提请申请人注意的情况下，申请人保留在可适用专利法规下 行使修改权来重新限定所述权利要求书的主题内容，以便从这样的权利要求的范围内具体 排除这些法定现有技术或法定现有技术的明显变体的权利。由这样的修改的权利要求书限 定的本发明的变体也打算作为本发明的方面。附图简述

图1显示了通过靶向E2mRNA的反义修饰寡核苷酸抑制含有BPV原点的质粒的E2依赖性复制。图2描述了带有修饰的5-0H-dC碱基的反义寡核苷酸对重组病毒的复制的影响。 重组病毒复制的抑制通过测量从病毒的基因组RNA表达的Rluc活性来监测。LF-脂质转染 胺(lipofectamine)处理的对照细胞。图中显示了来自可重复的实验之一的结果。图3显示了核酸酶复合物对带有修饰的8-oxo-dG碱基的寡核苷酸的抗病毒效应 的附加效应。重组病毒复制的抑制通过测量从病毒的基因组RNA表达的Rluc活性来监测。图4证明了核酸酶(命名为HM0_9E的化合物)的存在引起的对HM0_9的有效剂 量50(EC50)的降低。发明详述本发明涉及含有一个或多个修饰碱基的寡核苷酸的应用，所述寡核苷酸可以任选 地与有机核酸酶复合物连接，用于抑制对人类和动物致病的病毒的复制和/或基因表达。本发明提供了含有螯合性部分和寡核苷酸的化合物，所述寡核苷酸具有用于反义 抑制病毒基因表达和/或复制的性质。本发明的化合物包含反义寡核苷酸，所述反义寡核 苷酸具有(a) —个或多个与天然核碱基具有高结合效率的修饰的核碱基，以及任选的(b) 一个螯合性部分。这些化合物可以水解寡核苷酸、RNA和/或DNA的磷酸二酯键，可用于反 义疗法中。病毒靶下面描述了重要的病毒病原体的例子，它们属于不同的系统类型、利用不同的复 制策略和不同的靶组织，并描述了针对这些病毒的抗病毒疗法所具有的问题。AIDS(获得性免疫缺陷综合征)由人类免疫缺陷病毒(HIV)弓丨起。通过杀死或损 伤身体免疫系统的细胞，HIV逐步破坏身体对抗感染和某些癌症的能力。目前，全世界大约 有四千二百万人携带HIV/AIDS。2002年，总共有三百一"h万人死于HIV/AIDS相关原因。抗 HIV药物疗法的最终目标是阻止病毒增殖和破坏免疫系统。尽管在过去的15年，在对抗HIV 的战斗中已经取得了显著的进展，但医学仍无法治愈。今天，医生们已经拥有属于三种不同 药物类别的超过十几种抗反转录病毒药剂用于控制疾病。典型情况下，来自两种或三种类 别的药物以各种不同的组合开出处方，这被称为HAART(高效抗反转录病毒治疗)。HAART 疗法典型地包含两种核苷反转录酶抑制剂药物以及第三种药物，该第三种药物是蛋白酶抑 制剂或非核苷类反转录酶抑制剂。临床研究显示，HAART是降低病毒载量和最小化药物抗 性的可能性的最有效手段。对于开发其他有效对抗HIV的抗病毒药剂，这些药剂通过病毒还未发展出抗性的 其他作用机制发挥作用，存在着极大的需求。这正变得尤其重要，因为最近的数据显示，在 欧洲，在每10个新诊断出带有HIV的患者中，就有1个感染有已经对市场上至少一种批准 的药物具有抗性的HIV株。丙型肝炎病毒(HCV)感染是美国最常见的慢性血源性感染，受感染的患者数量可 能超过4百万，全世界可能超过1亿5千万。这种常见的病毒感染是肝硬化和肝癌的主要 病因，目前在美国是肝脏移植的主要原因。从感染复原是罕见的，大约85%受感染的患者 变成病毒的慢性携带者，10到20%发展成肝硬化。据估计，目前全世界有1亿7千万人是 慢性携带者。按照疾病控制和预防中心(Centers for DiseaseControl and Prevention) 的说法，仅在美国，慢性丙型肝炎每年就引起8，000到10，000例死亡，并导致大约1，000例
13肝脏移植。丙型肝炎没有疫苗可用。使用α-干扰素或干扰素与利巴伟林的组合的长期疗 法，仅在大约40%的患者中有效，并引起严重的副作用。在这个家族中存在一百多种人类感染性病毒(人类乳头瘤病毒，HPVs)。HPV引起 良性皮肤疣，或乳头瘤。许多HPVs通过性接触传播。生殖器HPV感染非常常见，估算推测 高达75%的女性在成年期的某些时间点，将被一种或多种性传播类型的HPV感染。“高风 险”性传播HPVs(HPV-16、-18以及某些其他的HPVs)的持续感染，可能导致宫颈癌的发生。 因此HPVs在医学上是重要的(高达500，000个癌症病例/年)。在2006/2007年，针对四 种最流行的HPV种的有效疫苗已经可用，但是许多HPV株和种没有被这些疫苗覆盖。甲病毒是主要引起急性感染的病毒的代表。该属中有10个以上的成员是已知 的人类病原体。它们通常分布广泛，但它们的医学重要性被认为是中等的，因此，没有有 效的用于人类的抗甲病毒疫苗。在留尼汪岛(Reunion Island)和印度的基孔肯雅病毒 (Chikungunya virus)的强烈爆发，彻底改变了这种观点。据估计，仅在留尼汪岛，由基孔肯 雅病毒引起的全部经济损失将超过1亿欧元(235，000例感染，大约200个死亡病例)，而该 病毒在印度引起的损害，达到了国家医疗灾难的程度(据估计高达6百万例感染)。基孔肯 雅病毒仍在快速传播，在2007年底，首次在欧洲(意大利)探查到了蚊媒性爆发。考虑到 由甲病毒引起的爆发的不可预测性，大规模预防接种似乎是不现实的，因为无法预测哪些 病毒将出现，以及下次爆发将在何处发生。相反，理想地有效对抗许多种甲病毒的抗病毒疗 法，将更为有用。上面列举的病毒仅仅代表了已知的人类和家畜病毒病原体的一部分，但是它们基 本上覆盖了所有种类的不同病毒基因组类型(DNA、RNA、反转录病毒)；靶组织(上皮、免疫 系统、肝特异性和具有广范围靶细胞的病毒)和复制位点(细胞质或核)，特异性和感染类 型(急性、慢性或潜伏)。这些病毒也代表了引起细胞死亡(甲病毒，HIV)、没有明显的细 胞损伤(HCV)或细胞转化(乳头瘤病毒)的典型病毒。因此，通过研究这些代表性病毒所 获得的数据，能够扩展到所有已知类型的人类和动物病毒病原体。显然，对于任何正开发的新出现的抗病毒药物来说，合并下列三个特点将是非常 理想的(1)改进的功效；(2)降低的副作用风险，以及(3)病毒难以通过突变来克服的作 用机制。已经进行了通过各种不同的反义手段抑制特定病毒的尝试。Zamecnik等已经使用了特异性靶向反转录酶引物位点和剪接供体/受体位点的 寡核苷酸(ONs) (Zamecnik 等，(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :4143_) (Goodchild & Zamecnik (1989)，美国专利 No. 4，806, 463)。Anderson等(1997)(美国专利No. 5，591，720)报道了靶向CMV(巨细胞病毒)编 码IEl、IE2或DNA聚合酶的mRNAs的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。Hanecak等(1999)(美国专利No. 5，952，490)描述了具有保守的G四重体序列和 足够数量的侧翼核苷酸的修饰的寡核苷酸，它显著抑制了病毒例如HSV-I (单纯性疱疹病 毒)的活性。Qi 等(中华实验和临床病毒学杂志(Zhonghua Shi Yan He LinChuang Bing Du Xue Za Zhi) (2000) 14 :253_256)报道了在科赛奇病毒B3中测试反义硫代磷酸酯寡核苷酸 (PS-ONs)。
国际公布WO 9203051 (Roizman和Maxwell)描述了与HSV病毒基因组的生命区域 或其mRNA转录本互补的甲基膦酸酯反义寡聚体，它表现出抗病毒活性。已报道鸟苷/胸苷或富含鸟苷的硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(GT-PS-ONs)具有 抗病毒活性。该研究报道，“几种长度均为26或27nt的不同的含有PS的富含GT的 ONs (B106-140,1100-12 和 G106-57)，在降低 HIV-2 滴度方面与 36 个(B106-96, B106-97)或 45 个nt 组成的富含 GT 的 ONs 同样有效(表 4)。”(Fennewald 等，Antiviral Res. (1995)26 37-54)。Cohen等(美国专利Nos. 5，264，423和5，276，019)描述了 HIV复制的抑制，更具 体来说涉及PS-0DN(寡脱氧核苷酸)类似物，其能够用于在正常活细胞的存在下阻止外来 核酸的复制。Cohen等描述了特异性针对病毒序列的反义PS-ODNs的抗病毒活性。他们也 描述了 14、18、21和28-mers的polyA、polyT和polyC PS-0DN序列的试验，并显示了这些 PS-ODNs的抗病毒效应。Gao 等((1989) J Biol Chem 264:11521-11526)描述了通过对尺寸为 7、15、21 和 28个核苷酸的polyA、polyT和polyC PS-ODN序列进行试验，用PS-ODNs抑制HSV-2的复 制。Stein 和 Cheng (Stein 等，(1993) Science 261 1004-1012)讨论了 28 个核苷酸的 非特异性ODNs的抗病毒活性，指出了 “PS寡聚物的抗HIV性质受到非序列特异性效应的显 著影响，也就是说，抑制效应不依赖于碱基序列。，，在综述文章中，Lebedeva和 Stein (Lebedeva 等，(2001) Annul RevPharmacol 41: 403-419)报道了 PS-ODNs的各种非特异性蛋白结合活性，包括病毒蛋白。他们指出，“这些 分子具有高度生物活性，通常相当容易地误解成反义的假象。”Rein等(美国专利No. 6，316，190)报道了与融合配偶体相连并与HIV核衣壳结合 的富含GT的ON诱饵(decoy)，可用作抗病毒化合物。同样地，Campbell等(Campbell等， (1999) J. Virol. 73 :2270_2279)报道了具有 TGTGT 基序的 P0-0DN，TGTGT 基序与 HIV 的核 衣壳特异性结合，但是没有提到抗病毒活性。被开发用作抗癌剂、抗病毒剂或用于治疗其他疾病的反义ODNs，典型长度为大约 20 个核苷酸。在综述文章中(Stein, C A, (2001) J. Clin. Invest. 108 :641_644)，肯定了“反 义寡核苷酸的长度必须被最适化如果反义寡核苷酸太长或太短，将失去特异性的要素。目 前，反义寡核苷酸的最适长度看来是大约16-20个核苷酸”。同样地，在另一篇综述文章中 (Crooke，S T (2000)Methods Enzymo 1. 313 :3_45)，指出 了“与 RNA 和 RNA 双链体形成相比， 硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸具有每个单位低大约-2. 2°C的Tm。这意味着为了在体外有效，硫 代磷酸酯寡脱氧核苷酸的长度典型必须为17-到-20-mer......”。Caruthers 和同事(Marshall 等，(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :6265_6269) 就 12-mer 的聚胞苷-PS2-0DN 和 14_mer 的 PS2-0DN 报道了二硫代磷酸酯 ODNs (PS2_0DNs) 的抗HIV活性。没有试验其他尺寸的抗HIV活性。他们也报道了 12-、14-、20-和28-111吐 的聚胞苷-PS2-0DNs的抑制HIV反转录酶(RT)。后来，该团队(Marshal等，(1993) Science 259:1564-1570)报道的结果显示了 HIV RT的序列特异性抑制。同一个团队在几篇专利中 公布了 PS2-0DNs的数据。在美国专利Nos. 5，218，103和5,684. 148中，描述了 PS2-0DN的 结构和合成。在美国专利Nos. 5，452，496,5, 278，302和5，695，979中，描述了不长于15个碱基的PS2-0DNs对HIV RT的抑制。在美国专利Nos. 5，750，666和5，602，244中，描述了 PS2-0DNs的反义活性。所有出版物在此以其全文引为参考。已经评估了在核糖的2’位处修饰的寡核苷酸及其在反义策略中的应用，例如在下 面引用的参考文献中描述的。Inoue 和同事(Inoue 等，(I985)Nucleic Acids Res. I6 :165168)描述了寡聚物 (2’-0_甲基核糖核苷酸)的合成和性质。同一个团队(Inoue等，(1987)FEBS Letter 215 327-330)报道了当寡核苷酸含有的全部是2’-0_甲基核糖核苷酸时，没有发生RNAse H介 导的mRNA切开。使用混合的寡核苷酸，即含有未修饰和2’ -0-甲基核糖核苷酸的寡核苷 酸，Inoue报道了由RNA和2’ -0-甲基核糖核苷酸形成的核酸复合物的序列特异性RNAse H水解。不支持RNase H介导的靶mRNA切开的全2’ _0_甲基化和硫代磷酸酯化的寡核 苷酸，被用于确定活性反义寡核苷酸是否通过RNase H依赖性机制抑制ICAM-I的表达 (Chiang等，(1991)J. Biol. Chem. 266 18162-18171)。他们指出，这些反义寡核苷酸可能可 用作治疗药剂。分析了具有2’ -糖修饰、包括2’ -0-甲基、2’ -0-丙基、2’ _0_戊基和2’ -氟的寡 核苷酸的反义活性。统一 2’ -修饰的寡核苷酸的反义活性评估，揭示出这些化合物对于抑 制基因表达来说完全无效。如果化合物含有一段至少5个2’ -脱氧核糖核苷酸残基，则活 性得到恢复。该最小脱氧核糖核苷酸长度与体外RNase H有效活化所需的最小长度全然相 关(Monia 等，1993，J. Biol. Chem. 268 14514.)。Yu 等((1996)Bioorganic. Med. Chem. 4 1685-1692)报道了具有硫代磷酸酯、磷酸 二酯或带有一部分2’ -0甲基修饰的糖的混合骨架的杂合反义寡核苷酸，通过P24ELISA定 量来测量，具有特异性抗HIV活性。Agrawal ((1999) Biochem. Biophys. Acta 1489:53-68)的综述文章建议，为了优 化活性，反义寡核苷酸应该具有各种不同性质的组合，而不只是对核酸酶的稳定性增加 或对靶RNA的高亲和性。这样的性质包括RNAse H活化。在后来的综述中，Agrawal和 KandimalIa ((2000)Mol. Med. Today 6 :72_81)叙述了包含2，-0_甲基修饰的混合骨架寡核 苷酸，由于它们的改进的性质、包括RNAse H活化，已经成为第二代反义寡核苷酸的选择。反 义寡聚物应该具有某些重要的特性，例如与靶RNA结合后活化RNAse H的能力。(Agrawal 禾口 Kandimal la，2001，Current Cancer Drug Target 1:197—209)。对于大多数反义方法 来说，为了增加反义效力，通过RNAse H的定向RNA切开是理想的。(Kurreck，2003，Eur. J.Biochem. 270 1628-1644)。许多研究描述了在反义寡核苷酸中使用2’ -0-甲氧基乙基修饰。一个例子是在 Zellweger 等((2001)J. Pharmacol. Experimental Therapeutics298 934-940)中描述 的使用有缺口的2’ -修饰的寡核苷酸反义的研究。另一个例子显示了使用RNase H不依 赖性2’-0-甲氧基乙基反义对形成翻译起始复合物的抑制。(Baker等，(1997)J.Biol. Chem. 272 1994-2000)。Kuwasaki 等，(2003) J. Antimicrob. Chemother. 51 :813_819，描述 了高核酸酶抗 性的二聚发夹鸟苷四链体的设计，它在核苷上含有2’ -0-甲基基团，在核苷间键上含有硫 基团，并描述了它在培养细胞中的抗HIV-I活性。
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Mou 和 Gray(2002) (Nucleic Acids Res. 30 :749_758)指出，与典型的硫代 磷酸酯-DNA寡聚物相比，添加2’ -0-甲基修饰降低了非特异性蛋白结合性质。对于 36-mer的寡核苷酸来说，g5p的蛋白结合亲和性按照dA36 < rA36 < 2’ -O-MeA36 < StA36 << S-2，-O-Me-A36 < S-dA36(其中 d =脱氧，r =核糖，2，-O-Me = 2，-0-甲基，S =硫 代磷酸酯)的次序增加。该次序与 Kandimalla 等((1998)Bioorganic Med Chem Lett. 8 2103-2108)中报道的这些寡聚物修饰对血浆蛋白例如人血清白蛋白、Y-球蛋白和纤维蛋 白原的非特异性结合的次序S-RNA << S-2’ -O-MeRNA < S-DNA相一致。在本技术领域中还存在着另外的知识，涉及与寡核苷酸类似但是具有不同作用机 制的药剂的使用，这些药剂包括小干扰RNAs (siRNAs)、它们的前体和类似物，以及被设计用 于特异性结合和切开靶核酸的核酶。考虑用于本发明的靶病毒包括但不限于引起急性感染的正链RNA病毒(例如塞姆 利基森林病毒(Semliki Forest virus), SFV,甲病毒属，披膜病毒科(Togaviridae))、引起 慢性感染的正链RNA病毒(例如丙型肝炎病毒，HCV，丙型肝炎病毒属(Hepacivirus)，黄病 毒科(Flaviviridae))、引起急性感染以及长期持续的慢性疾病的反转录病毒(例如人类1 型免疫缺陷病毒，HIV-I，慢病毒属(Lentivirus)，反转录病毒科(Retroviridae))和具有 DNA基因组的病毒(例如牛1型乳头瘤病毒，BPV-I，乳头瘤病毒科(Papillomaviridae))。本公开证明了向感染了这些病毒、用它们的基因组转染或含有它们的基因表达单 元的细胞培养物单次施用修饰的寡核苷酸，导致了它们的基因表达和(在RNA病毒和乳头 瘤病毒的情况下)复制的特异性抑制。这些效应与寡核苷酸抑制剂的量成比例，被化合物 中存在的修饰碱基的存在所增强，并被有机核酸酶复合物的存在进一步增强。本公开还证明，如果修饰的碱基从羟基核碱基变成巯基核碱基，则抗病毒效应增 加，抑制剂的有效浓度降低。寡核苷酸在本发明的背景中，术语“寡核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或多聚 物，或其模拟物、嵌合体、类似物和同系物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价的核 苷间(骨架)连键组成的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分的寡核苷酸，这些非天然存 在的部分在例如与靶核酸杂交或与互补寡核苷酸相互作用时，以与天然存在的寡核苷酸相 似的方式发挥作用。这样的修饰的或取代的寡核苷酸与天然形式相比通常是优选的，因为 它们具有理想的性质，例如增强细胞摄入、增加对靶核酸的亲和性和在核酸酶存在下的稳 定性增加。本发明的化合物与生物学配对物(例如RNA和/或DNA)结合的效率，是通过掺入 修饰的核碱基或其他具有两性离子或离子互变异构体的类似物来获得的。本发明的化合物 有至少一个核碱基具有修饰的核碱基或其他具有两性离子或离子互变异构体的类似物。在 优选实施方案中，修饰的核碱基是选自5-羟基胞嘧啶和8-羟基鸟嘌呤的羟基核碱基，或选 自5-巯基胞嘧啶、5-巯基尿嘧啶、8-巯基鸟嘌呤和8-巯基腺嘌呤的巯基核碱基。正如在 美国专利公布US 20070259830和W02007/125173中证明的，羟基核碱基或巯基核碱基与靶 核酸的核碱基之间可以发生更稳定的氢键结合，因此可以被认为与互补核酸链更有效地结
I=I O修饰的核碱基中酸性互变异构基团可以是任何其他的酸性基团，例如-SH、-C00H、-SO3H 等。在一个实施方案中，寡核苷酸包含5-羟基尿嘧啶阴离子的一种或多种互变异构 形式。在另一个实施方案中，本发明的化合物包括羟基碱基5-羟基胞嘧啶。在另一个实施 方案中，羟基碱基是8-羟基腺嘌呤及其阴离子的互变异构形式。本发明的另一个实施方案 提供了由8-羟基鸟嘌呤及其阴离子的互变异构形式修饰的本发明的化合物。这些核碱基 的互变异构形式在WO 2007/125173中更详细地描述。本文中考虑到的其他修饰的核碱基包括巯基修饰的核碱基。巯基修饰的嘧啶和 嘌呤的合成在本技术领域中是已知的(参见例如《杂环化合物化学嘧啶》，增补本1，第16 册(Chemistry of HeterocyclicCompounds :The Pyrimidines, “ Supplement 1, Volume 16)，D. J. Brown 主编，John Wiley & Sons, Inc.，1970，pp. 202-229 ；以及 Khalyullin 等 "if ^ 白勺 B Πφ，， (Condensed purines), Pharmaceutical Chemistry Journal,1992,26 270-284)。考虑到的巯基核碱基包括5-巯基胞嘧啶、5-巯基尿嘧啶、8-巯基鸟嘌呤和8-巯 基腺嘌呤。在共同拥有和共同待决的申请号_(代理人案号28113/43435A)中，
以及美国临时申请60/985，552中，也已考虑到了在聚合酶链反应(PCR)、核酸杂交和siRNA 介导的基因沉默中使用修饰的核碱基，这些申请在此以其全文引为参考。在本文中使用时，每个羟基核碱基当与相对的核碱基稳定地形成氢键时，被认为 与该核碱基互补。因此，在某些情况下，5-羟基尿嘧啶与腺嘌呤互补，5-羟基胞嘧啶与鸟嘌 呤互补，8-羟基腺嘌呤与尿嘧啶和/或胸腺嘧啶互补，和8-羟基鸟嘌呤与胞嘧啶互补。羟 基核碱基与靶核酸的核碱基可以发生其他稳定的氢键键合，因此羟基核碱基被认为与发生 稳定的氢键键合的靶核酸的核碱基互补。在本发明的给定化合物中，羟基核碱基和/或巯基核碱基的数量，是化合物寡核 苷酸部分的核碱基总数的至少直至100%。在本发明的化合物中存在一种以上羟基核 碱基或巯基核碱基的情况下，羟基核碱基或巯基核碱基可以是相同的或不同的(以不同碱 基和/或修饰类型的任何组合)。考虑到了在本文描述的寡核苷酸中，10%到90%、20%到 80%,30%到70%、40%到60%或50%的核碱基是修饰的核碱基。此外，考虑到了 10、20、 30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99% 的核碱基是修饰的核碱基。本发明的化合物优选包含大约5到大约150个核碱基(即从大约5到大约150 个连接的核苷)。本技术领域的普通专业人员将会认识到，本发明包含了长度为5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147、148、149和150个核碱基的化合物。在优选实施方案中，本发明的化合物长度为10到100个核碱基。本技术领域的普 通专业人员将会认识到，这包含了长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、
1849、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或100个核碱基的化合物。在另一个优选实施方案中，本发明的化合物长度为10到50个核碱基。本技术领 域的普通专业人员将会认识到，这包含了长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49或50个核碱基的化合物。在另一个优选实施方案中，本发明的化合物长度为20到30个核碱基。本技术领 域的普通专业人员将会认识到，这包含了长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个 核碱基的化合物。特别优选的化合物是大约10到大约50个核碱基的寡核苷酸，更优选是含有大约 20到大约30个核碱基的寡核苷酸，在样品测试中用作抗病毒剂的化合物由21或23个核碱 基构成。正如上面陈述的，寡核苷酸可以包含100%修饰的核碱基。照此，依赖于寡核苷酸 的长度，寡核苷酸可以包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、 136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149 或 150 个修饰的核碱基， 其中修饰的碱基是巯基核碱基或羟基核碱基。本发明的化合物任选还包含螯合性部分。螯合性部分起到金属配体的作用。它们 能够稳定地螯合金属离子。某些金属配体复合物已显示出能够有效地切开磷酸二酯键。通 过在具有反义活性的寡核苷酸中引入螯合性部分，由于其降解或切开靶核酸的一个或多个 磷酸二酯键的能力，增加了寡核苷酸抑制靶核酸的功效。因此，本发明的化合物进一步包含 了能够螯合金属离子的螯合性部分。金属离子选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、 铒、铥、镱和镥。在一个方面，优选的离子是铕或镧离子。金属离子可以是任何稳定的离子， 例如 +1、+2、+3、+4 或 +5 离子。优选的离子是 La(III)、Eu (III)、Ho (III)和 Ce (IV)。考虑到的螯合性部分包括由下面描述的式所表示的螯合性部分
权利要求
一种在对象中抑制病毒复制的方法，包括向对象施用5到150个核碱基的寡核苷酸，其中至少一个核碱基是巯基修饰的互变异构或离子型碱基(巯基核碱基)或羟基修饰的互变异构或离子型碱基(羟基核碱基)。
2.寡核苷酸在对象中抑制病毒复制的应用，其中所述寡核苷酸被配制用于向对象施 用，并含有5到150个核碱基，其中至少一个核碱基是巯基修饰的互变异构或离子型碱基 (巯基核碱基)或羟基修饰的互变异构或离子型碱基(羟基核碱基)。
3.一种抑制靶核酸的翻译的方法，所述方法包括将靶核酸与含有寡核苷酸的组合物在 允许寡核苷酸与靶核酸杂交的条件下接触，其中杂交的寡核苷酸抑制靶核酸的翻译，其中 所述靶核酸与病毒复制相关，并且其中所述寡核苷酸含有至少一个修饰的核碱基，所述修 饰的核碱基选自巯基修饰的互变异构或离子型碱基(巯基核碱基)和羟基修饰的互变异构 或离子型碱基(羟基核碱基)。
4.寡核苷酸在制造用于抑制靶核酸翻译的药物中的应用，其中将靶核酸与含有寡核苷 酸的组合物在允许寡核苷酸与靶核酸杂交的条件下接触，其中杂交的寡核苷酸抑制靶核酸 的翻译，其中所述靶核酸与病毒复制相关，并且其中所述寡核苷酸含有至少一个修饰的核 碱基，所述修饰的核碱基选自巯基修饰的互变异构或离子型碱基(巯基核碱基)和羟基修 饰的互变异构或离子型碱基(羟基核碱基)。
5.一种在对象中抑制病毒基因组复制的方法，所述方法包括预测或测定对象或病毒病原体中靶核酸的核苷酸序列，其中靶核酸与病毒复制相关，以及向对象施用含有5到150个核碱基的寡核苷酸的组合物，其中至少一个核碱基是巯基 修饰的互变异构或离子型碱基(巯基核碱基)或羟基修饰的互变异构或离子型碱基(羟基 核碱基)，并且其中在对象的生理条件下，所述化合物与靶序列的核苷酸序列充分互补，从 而在对象中与靶序列的核苷酸序列杂交并抑制病毒复制。
6.寡核苷酸在制造用于在对象中抑制病毒基因组复制的药物中的应用，所述病毒基因 组或对象包含预测或测定的与病毒复制相关的靶核酸的核苷酸序列，其中所述寡核苷酸有 5到150个核碱基，其中至少一个核碱基是巯基修饰的互变异构或离子型碱基(巯基核碱基)或羟基修饰 的互变异构或离子型碱基(羟基核碱基)，并且其中在对象的生理条件下，所述化合物与靶 序列的核苷酸序列充分互补，从而在对象中与靶序列的核苷酸序列杂交并抑制病毒复制。
7.一种化合物，其含有5到150个核碱基的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含与来自病毒的核苷酸序列至少80%互补的核苷酸序列，其中至少一个核碱基是巯基修饰的互变异构或离子型碱基(巯基核碱基)或羟基修饰 的互变异构或离子型碱基(羟基核碱基)。
8.权利要求1-7任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸包含至少一个巯基核碱基。
9.权利要求8的方法或应用或化合物，其中巯基核碱基选自5-巯基胞嘧啶、5-巯基尿 嘧啶、8-巯基鸟嘌呤和8-巯基腺嘌呤。
10.权利要求1-8任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸包含至少一个羟基修 饰的互变异构或离子型碱基。
11.权利要求10的方法或应用或化合物，其中羟基核碱基选自5-羟基胞嘧啶、5-羟基 尿嘧啶、8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤。
12.权利要求1-11任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸还包含与其连接的有 机核酸酶。
13.权利要求12的方法或应用或化合物，其中有机核酸酶包含与镧系金属复合的螯合 性有机部分。
14.权利要求13的方法或应用或化合物，其中镧系金属选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、 钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥。
15.权利要求14的方法或应用或化合物，其中金属是铕。
16.权利要求1-15任一项的方法或应用或化合物，其中病毒是快速急性病毒。
17.权利要求1-15任一项的方法或应用或化合物，其中病毒是慢性病毒。
18.权利要求1-15任一项的方法或应用或化合物，其中病毒是正链RNA病毒。
19.权利要求18的方法或应用或化合物，其中病毒是甲病毒。
20.权利要求18的方法或应用或化合物，其中病毒是塞姆利基森林病毒(SFV)。
21.权利要求18的方法或应用或化合物，其中病毒是丙型肝炎病毒。
22.权利要求1-15任一项的方法或应用或化合物，其中病毒是DNA病毒。
23.权利要求22的方法或应用或化合物，其中病毒是乳头瘤病毒。
24.权利要求23的方法或应用或化合物，其中乳头瘤病毒选自牛1型乳头瘤病毒和人 乳头瘤病毒。
25.权利要求22-24任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸与编码转录或调控 因子的病毒基因杂交，并抑制具有DNA基因组的病毒的复制。
26.权利要求22-24任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸与病毒复制因子杂 交，并抑制具有DNA基因组的病毒的复制。
27.权利要求1-21任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸与在其复制周期中使 用反转录的病毒杂交。
28.权利要求27的方法或应用或化合物，其中病毒是反转录病毒。
29.权利要求28的方法或应用或化合物，其中反转录病毒是人类1型免疫缺陷病毒。
30.权利要求27-29任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸与编码转录或调控 因子的病毒基因杂交，以抑制利用反转录进行复制的病毒的复制。
31.权利要求1-30任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸长度为10-100个核碱基。
32.权利要求1-30任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸长度为10-50个核碱基。
33.权利要求1-30任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸长度为10-30个核碱基。
34.权利要求1-30任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸长度为20-30个核碱基。
35.权利要求34的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸长度为21到23个核碱基。
36.权利要求1到35任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸中到100%的核碱基是修饰的核碱基。
37.权利要求36的方法或应用或化合物，其中10%到90%的核碱基是巯基修饰的或羟 基修饰的核碱基。
38.权利要求36的方法或应用或化合物，其中20%到80%的核碱基是巯基修饰的或羟 基修饰的核碱基。
39.权利要求36的方法或应用或化合物，其中30%到70%的核碱基是巯基修饰的或羟 基修饰的核碱基。
40.权利要求36的方法或应用或化合物，其中40%到60%的核碱基是巯基修饰的或羟 基修饰的核碱基。
41.权利要求36的方法或应用或化合物，其中50%的核碱基是巯基修饰的或羟基修饰 的核碱基。
42.权利要求1到41任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸含有至少一个巯基 修饰的核碱基和至少一个羟基修饰的核碱基。
43.权利要求1到42任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸与宿主的与病毒复 制相关的因子杂交并抑制病毒复制。
44.权利要求1到43任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸与病毒基因组的非 编码区杂交。
45.权利要求1到43任一项的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸与病毒基因组的编 码区杂交。
46.权利要求45的方法或应用或化合物，其中寡核苷酸与RNA病毒的编码区杂交。
47.权利要求1、3、5和8-46任一项的方法，其中将至少两种具有不同序列的寡核苷酸 施用于对象，其中所述寡核苷酸与不同的靶序列杂交。
48.权利要求2、4、6和8-46任一项的应用，其中使用至少两种不同的所述寡核苷酸，其 中所述寡核苷酸与不同的靶序列杂交。
49.一种组合物，其包含权利要求7-45任一项的两种化合物的混合物，其中寡核苷酸 与不同的靶序列杂交。
50.权利要求49的组合物，其还包含可药用载体。
51.权利要求47-50任一项的方法或应用或组合物，其中至少两种寡核苷酸对同一个 病毒基因组中的不同靶序列是特异性的。
52.权利要求47-50任一项的方法或应用或组合物，其中寡核苷酸对同一个功能单位 中的靶序列是特异性的。
53.权利要求47-50任一项的方法或应用或组合物，其中至少两种寡核苷酸对不同功 能单位中的靶序列是特异性的。
54.权利要求1-6、8-48和51-53任一项的方法或应用，其中组合物还包含药物载体或 赋形剂。
55.一种组合物，其包含权利要求7-45任一项的化合物和可药用载体。
56.至少两种具有不同序列的寡核苷酸在制造向对象施用的药物中的应用，其中所述 至少两种寡核苷酸与不同的靶序列杂交。
57.权利要求56的应用，其中两种不同的寡核苷酸被施用于对象。
58.权利要求57的应用，其中寡核苷酸对同一个病毒基因组中的不同靶序列是特异性的。
59.权利要求56的应用，其中寡核苷酸对同一个功能单位中的靶序列是特异性的。
60.权利要求56的应用，其中寡核苷酸对不同功能单位中的靶序列是特异性的。
61.权利要求56-60任一项的应用，其中药物还包含药物载体或赋形剂。
62.权利要求1-6、8-48、51-54和56-61任一项的方法或应用，其中对象是哺乳动物。
63.权利要求62的方法或应用，其中对象是人类。
64.权利要求1-63任一项的方法、应用、化合物或组合物，其中寡核苷酸在脂质体中。
65.权利要求1-6、8-48、51-54和56-64任一项的方法或应用，其中寡核苷酸与靶序列 的杂交诱导靶核酸的切开。
66.权利要求1-6、8-48、51-54和56-65任一项的方法或应用，其中寡核苷酸的序列表 现出与靶核酸或其互补体至少70%的序列同一性。
67.权利要求66的方法或应用，其中寡核苷酸的序列表现出与靶核酸或其互补体至少 90%的序列同一性。
68.权利要求7、49-50、55和64任一项的化合物或组合物，其中寡核苷酸包含与来自病 毒的核苷酸序列至少90%互补的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及使用具有修饰的核碱基的寡核苷酸在对象中抑制病毒的基因表达和/或复制。修饰的核碱基可以是巯基修饰的碱基或羟基修饰的核碱基。考虑到了寡核苷酸还包含核酸酶复合物，其增强寡核苷酸的抗病毒活性。
文档编号C12N15/113GK101970662SQ200880123455
公开日2011年2月9日 申请日期2008年11月5日 优先权日2007年11月5日
发明者安德烈斯·梅利茨, 马特·萨尔玛, 马蒂·卡拉尔森 申请人:波罗的科技发展有限公司