耳廓软骨组织的制造方法和耳廓软骨组织的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种能够制造具有充分的厚度和力学强度的耳廓软骨组织的耳廓软骨组织的制造方法、以及由该耳廓软骨组织的制造方法制得的耳廓软骨组织。本发明的耳廓软骨组织的制造方法具有：在平均纤维直径为0.90～7.00μm的由生物吸收性材料构成的无纺布上接种耳廓软骨细胞的细胞接种工序；和将接种有上述耳廓软骨细胞的无纺布，与由非生物吸收性材料构成的网状的框架复合、调整形状的成形工序。
【专利说明】耳廓软骨组织的制造方法和耳廓软骨组织
【技术领域】
[0001]本发明涉及能够制造具有充分的厚度和力学强度的耳廓软骨组织的耳廓软骨组织的制造方法、以及由该耳廓软骨组织的制造方法制得的耳廓软骨组织。
【背景技术】
[0002]由于近年来细胞工程技术的发展，使得培养包括人细胞在内的多种动物细胞成为可能，另外，希望使用这些细胞重建人的组织和器官的、所谓的再生医疗的研究迅速发展。在再生医疗中，细胞是否能够增殖分化以构建三维的类生物体组织的构造物是重点，有使用细胞、生长因子的方法、将作为组织或器官的再生的基础的支撑体移植至患者的方法等。作为这样的支撑体，例如，专利文献I中公开了由胶原单丝构成的移植用基材。
[0003]另外，专利文献2和专利文献3中公开了生物吸收性材料的发泡体、由同样材料加强的心血管类组织培养基材、以及管状的神经再生基材。
[0004]另外，专利文献4中公开了在海绵状或无纺布状的由高分子材料成形物构成的骨架的内部具有分散有细胞的凝胶的医用材料。
[0005]作为再生医疗的对象之一，可以列举耳廓软骨组织的再生。耳廓软骨组织是大型且具有厚度的组织，除此以外，还要求比较高的力学强度。但是，利用使用现有的支撑体的生物体组织的制造方法，难以制造这样的大型且具有厚度的耳廓软骨组织。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:日本特开2003-193328号公报
[0009]专利文献2:日本特开2001-78750号公报
[0010]专利文献3:日本特开2003-19196号公报
[0011]专利文献4:日本特开2003-204807号公报
【发明内容】
[0012]发明要解决的技术问题
[0013]本发明的目的在于提供一种能够制造具有充分的厚度和力学强度的耳廓软骨组织的耳廓软骨组织的制造方法、以及由该耳廓软骨组织的制造方法制得的耳廓软骨组织。
[0014]用于解决技术问题的手段
[0015]本发明的耳廓软骨组织的制造方法具有:在平均纤维直径为0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料构成的无纺布上接种耳廓软骨细胞的细胞接种工序；和将接种有上述耳廓软骨细胞的无纺布，与由非生物吸收性材料构成的网状的框架复合、调整形状的成形工序。
[0016]以下对本发明进行详细说明。
[0017] 本发明的发明人尝试了在具有各种材质和形状的支撑体上接种耳廓软骨细胞来再生耳廓软骨组织。结果发现:在使用平均纤维直径为0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料构成的无纺布的情况下，与使用具有其他材质和形状的支撑体的情况相比，耳廓软骨组织的再生得到显著促进。进一步研究的结果发现:通过在平均纤维直径为0.90~7.0O μ m的由生物吸收性材料构成的无纺布上接种耳廓软骨细胞后，将其与由非生物吸收性材料构成的网状的框架复合、进行成形，能够制造具有充分的厚度和力学强度的耳廓软骨组织，从而完成了本发明。
[0018]在使用平均纤维直径为0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料构成的无纺布的情况下，耳廓软骨组织的再生特别被促进的理由尚不清楚。本发明的发明人尝试在由不同平均纤维直径的多种聚乙醇酸交酯构成的无纺布上接种耳廓软骨细胞后，测定细胞的附着数。但是，在平均纤维直径为0.90~7.00 μ m的情况下，并没有细胞特别有意地附着。
[0019]本发明的耳廓软骨组织的制造方法具有在平均纤维直径为0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料构成的无纺布(以下，也简称为“无纺布”)上接种耳廓软骨细胞的细胞接种工序。通过使用这样的特定的平均纤维直径、由特定的材质构成的无纺布，能够制造具有充分的厚度和力 学强度的耳廓软骨组织。
[0020]上述生物吸收性材料没有特别限定，例如可以列举聚乙醇酸交酯、聚丙交酯(D、L、DL体)、聚己内酯、乙醇酸-丙交酯(D、L、DL体)共聚物、乙醇酸-ε -己内酯共聚物、丙交酯(0、1^、01^体)-￡-己内酯共聚物、聚(对二氧杂环己酮)等。它们可以单独使用，也可以将2种以上一并使用。其中，优选聚乙醇酸交酯或丙交酯(D、L、DL体)-ε-己内酯共聚物，更优选聚乙醇酸交酯。
[0021]上述无纺布的平均纤维直径为0.90~7.00 μ m。在上述无纺布的平均纤维直径在该范围的情况下，能够促进耳廓软骨组织的再生。其中，在上述无纺布的平均纤维直径为0.90 μ m的情况下，耳廓软骨组织的再生能够得到特别促进。
[0022]其中，在本说明书中，无纺布的平均纤维直径是指:切取无纺布的布料的中央的一部分，使用电子显微镜观察，随机抽取焦点合适的纤维，一边改变部位一边测定纤维的直径，直至测定的纤维合计达到100根以上，将此时得到的100根以上的纤维的直径取平均而得到的值。
[0023]上述无纺布的单位面积重量的优选的下限为lg/m2，优选的上限为100g/m2。当单位面积重量在该范围外时，有时无法再生充分的耳廓软骨组织。上述无纺布的单位面积重量的更优选的下限为5g/m2，更优选的上限为50g/m2。
[0024]上述平均纤维直径为0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料构成的无纺布的制造方法没有特别限定，例如能够使用静电纺丝沉积法、熔喷法、针刺法、纺粘法、瞬时纺丝法、水流交络法、气流成网法、热粘法、树脂粘合法、湿式法等现有公知的方法。其中，优选熔喷法。
[0025]在上述细胞接种工序中，在上述无纺布上接种耳廓软骨细胞。
[0026]上述耳廓软骨细胞可以利用现有公知的方法采集。例如，可以从由人或动物等得到的耳廓，将皮肤、结缔组织、软骨膜除去后，细切成5mmX5mm左右的小片后，进行胶原酶处理，由此分离耳廓软骨细胞。分离出的耳廓软骨细胞，可以直接用于本发明的耳廓软骨组织的制造方法，也可以在通过培养使其增殖后用于本发明的耳廓软骨组织的制造方法。
[0027]上述接种的方法没有特别限定，能够使用现有公知的接种方法。
[0028]上述接种时的接种密度没有特别限定，优选的下限为2.0X107CellS/Cm2，优选的上限为1.0X 108cells/cm2。当细胞接种密度小于2.0X 107cells/cm2时，有时形成具有充分的厚度和力学强度的耳廓软骨组织需要花费大量的时间，而即使以超过1.0X 108cellS/cm2
的密度接种细胞，也看不到更好的效果。细胞接种密度的更优选的下限为5.0X107cells/
2
cm ο
[0029]接种了上述耳廓软骨细胞的无纺布，优选静置10分钟左右，直至耳廓软骨细胞充分地附着。另外，也可以根据需要进行数小时到数天左右的培养。作为进行培养时的培养液，例如能够使用在MEM、DMEM等通常的培养液中添加有I~10重量％左右的胎牛血清的添加血清的培养基。
[0030]本发明的耳廓软骨组织的制造方法具有将接种有上述耳廓软骨细胞的无纺布，与由非生物吸收性材料构成的网状的框架复合、调整形状的成形工序。
[0031]耳廓软骨组织的再生，需要形成大型且具有厚度的组织。另外，调整为与移植部位匹配的形状也很重要。由上述非生物吸收性材料构成的网状的框架，起到将得到的耳廓软骨组织调整为任意形状、任意厚度的作用。
[0032]形成上述网状的框架的非生物吸收性材料，只要对生物体没有毒性、并且具有适度的硬度和弹性，就没有特别限定，优选聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯(PTEF)、尼龙等。
[0033]上述网状的框架优选具备与想要再生的耳廓软骨组织相对应的形状。例如，在需要将整个耳廓再生的情况下，优选具备与整个耳廓相对应的形状。或者，也可以将整个耳廓分割为多个部分，做成与其各个部分相对应的形状，然后组合来构成整个耳廓。
[0034]作为接种有上述耳廓软骨细胞的无纺布与网状的框架的复合的方法，没有特别限定，可以将接种有耳廓软骨细胞的无纺布夹在2片网状的框架间成形为任意形状，也可以以包入任意形状的网状的框架的方式卷绕接种有耳廓软骨细胞的无纺布。
[0035]通过将由本发明的耳廓软骨组织的制造方法制得的耳廓软骨组织移植到生物体内，能够再生具有充分的厚度和力学强度的耳廓软骨组织。
[0036]另外，包括接种有耳廓软骨细胞的平均纤维直径为0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料构成的无纺布、和由非生物吸收性材料构成的网状的框架的耳廓软骨组织，也是本发明之一。
[0037]发明效果
[0038]根据本发明，提供一种能够制造具有充分的厚度和力学强度的耳廓软骨组织的耳廓软骨组织的制造方法、以及由该耳廓软骨组织的制造方法制得的耳廓软骨组织。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1是实验例中制作的样品III的无纺布的布料的中央部的电子显微镜照片。
[0040]图2是移植5周后的组织再生确认用样品的组织切片的照片。
【具体实施方式】
[0041]以下列举实施例对本发明的方式更详细地进行说明，但是本发明并不仅限定于这些实施例。
[0042](实验例)
[0043](I)无纺布的制备
[0044]通过将由熔喷法得到的无纺布进行拉伸、或者将纺丝而得到的筒编布利用针刺法制成无纺布的方法，得到由平均纤维直径为0.67μπι(样品Ι)、0.90μπι(样品II)、
3.10 μ m (样品II I)、7.0O μ m (样品I V)和20.60 μ m (样品V)的聚乙醇酸交酯构成的、厚度
0.13~0.30mm的无纺布。
[0045]并且，切取样品III的无纺布的布料的中央的一部分，将使用电子显微镜观察到的图像示于图1 (照片下的横杠表示30 μ m)。
[0046]如图1所示，随机抽取电子显微镜照片中的焦点合适的纤维，测定各纤维的直径。一边改变部位一边测定纤维的直径，直至测定的纤维合计达到100根，将得到的100根纤维的直径平均，得到3.10 μ m的平均纤维直径。对于其他的样品1、I1、IV、V也通过同样的方法得到平均纤维直径。
[0047](2)耳廓软骨细胞的分离和接种
[0048]将小猎兔 犬(雌性、6~8周龄)的两耳廓在麻醉下切断。从得到的耳廓，将皮肤、结缔组织、软骨膜除去后，细切成5mmX 5mm左右的小片。将得到的小片在浓度0.3%的胶原酶溶液中处理I晚后，分离耳廓软骨细胞。使分离出的耳廓软骨细胞悬浮在磷酸缓冲液中，得到1.0X 108cellS/mL的细胞悬浮液。
[0049](3)与网状的框架的复合
[0050]准备由聚丙烯构成的大小为2cmX2cm、厚度为0.34±0.007mm的片状的网。
[0051]作为弯曲强度测定用样品，将接种有耳廓软骨细胞的无纺布夹在2片片状网之间进行复合，制作出平板型的支架。
[0052]另一方面，作为三维形状维持确认用样品，将接种有耳廓软骨细胞的无纺布夹在片状网之间，将得到的部件成形为耳廓形状，得到人耳廓形状的支架。
[0053](4)移植
[0054]将得到的平板型的支架和人耳廓形状的支架自体移植至同一个体(小猎兔犬、雌性、6~8周龄)。在全身麻醉后，在后颈部切开，将支架移植至头部肌肉膜间并固定。在移植后5周后将其宰杀，取出各个样品。
[0055](评价)
[0056](I)弯曲强度的测定
[0057]对取出的弯曲强度测定用样品，按照ROY等的方法，使用自动绘图仪测定弯曲强度。即，将夹钳间调整为Icm后,将做成20mmX5mm大小的样品固定在台座上,在使垂直板以0.02mm/sec的速度下降的条件下测定弯曲强度。将结果示于表1。
[0058][表 I]
【权利要求】
1.一种耳廓软骨组织的制造方法，其特征在于，具有: 在平均纤维直径为0.90~7.0O μ m的由生物吸收性材料构成的无纺布上接种耳廓软骨细胞的细胞接种工序；和 将接种有所述耳廓软骨细胞的无纺布，与由非生物吸收性材料构成的网状的框架复合、调整形状的成形工序。
2.如权利要求1所述的耳廓软骨组织的制造方法，其特征在于: 由生物吸收性材料构成的无纺布的平均纤维直径为0.90 μ m。
3.如权利要求1或2所述的耳廓软骨组织的制造方法，其特征在于: 生物吸收性材料为聚乙醇酸交酯或丙交酯(D、L、DL体)-ε -己内酯共聚物。
4.一种耳廓软骨组织，其特征在于，包括: 接种有耳廓软骨细胞的、平均纤维直径为0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料构成的无纺布；和由非生物吸收性材料构成的网状的框架。
【文档编号】A61L27/00GK103957950SQ201280058451
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2011年12月2日
【发明者】矶贝典孝, 伊谷善仁, 萩原明郎, 森田真一郎, 泽井恒祐, 畠山紘一 申请人:郡是株式会社