用于使损伤的组织和器官再生的生物复合材料、用于制造所述生物复合材料的试剂盒、制...的制作方法

用于使损伤的组织和器官再生的生物复合材料、用于制造所述生物复合材料的试剂盒、制...的制作方法【专利摘要】本发明提供一种包括细胞、基因构建体和支架的生物复合材料，以及用所述生物复合材料修复哺乳动物中的组织和器官的方法。所述生物复合材料的组分的相互作用对修复再生过程提供复杂的影响。本发明还提供向受体施用基因-细胞治疗性构建体的方法，其可以在医学和兽医学中用于提供修复过程。在将所述生物复合材料施用到受体后，所述支架结构释放核酸，所述核酸进入受植床的细胞和移植产品的细胞中。所述核酸得以表达，从而使得负责修复过程的目标产物的浓度增加。【专利说明】用于使损伤的组织和器官再生的生物复合材料、用于制造所述生物复合材料的试剂盒、制造所述生物复合材料的方法和治疗损伤的方法【
技术领域：
】[0001]本发明的目的涉及在医学和兽医学中用于恢复哺乳动物中损伤的组织和器官的生物复合材料，涉及用于制造生物复合材料的试剂盒、制造生物复合材料的方法、治疗损伤的方法以及递送核酸的方法。【
背景技术：
】[0002]已知的组织和器官恢复方法是基于含有不同的细胞群体或不同的基因构建体(construction)(核酸）的工程化组织构建体。尽管细胞和基因两种趋势均有前途，但它们具有中等且有限的功效。[0003]-种使用超声仅来施用基因构建体的方法描述于例如（Greenleafff.J.,BolanderΜ.Ε.,SarkarG.等人，Artificialcavitationnucleisignificantlyenhanceacousticallyinducedcelltransfection.UltrasoundinMedicineandBiologyl998;24(4):587-595;SchratzbergerP.，KraininJ.G.，SchratzbergerG.等人，TranscutaneousultrasoundaugmentsnakedDNAtransfectionofskeletalmuscle.MolecularTherapy2002,6(5):576-583)中。然而，当使用对于受体安全的超声辐射参数时，基因构建体的施用效率较低。递送必需量的基因构建体仅可以在组织经受超声暴露损害的情况下实现（参见例如Duvshani-EshetM.，MachlufM.Therapeuticultrasoundoptimizationforgenedelivery:akeyfactorachievingnuclearDNAlocalization.JournalofControlledRelease2005；108(2-3):513-528；KimH.J.,GreenleafJ.F.,KinnickR.R.Ultrasound-mediatedtransfectionofmammaliancells.HumanGeneTherapyl996；7(11):1339-1346)〇[0004]另一种施用与脂质体成复合物形式的核酸的方法描述于例如（FraleyR.,SubramaniS.,BergΡ·等人，Introductionofliposome-encapsulatedSV40DNAintocells.JBiolChem.1980;255(21):10431-5)中，并且改进的方法，也就是，使用物理因素(例如超声）施用脂质体结合物与基因构建体的组合描述于例如（RoosA.K.,ErikssonF.,TimmonsJ.A..Skinelectroporation:effectsontransgeneexpression,DNApersistenceandlocaltissueenvironment.PLoSOne.2009;4(9):e7226)中。然而，当暴露于组织中的脂肪分解酶时，显著比例的脂质体遭受破坏，从而降低诸如核酸的活性物质的递送效率。核酸的剩余部分几乎被同时递送，从而不容许实现延长效应。此外，当转运到目标细胞中时，复合物"脂质体-基因构建体"不遭受破坏，而是脂质体进入细胞中，从而降低方法的安全性。[0005]一种经由电穿孔施用核酸的方法描述于例如（RoosA.K.，ErikssonF.，TimmonsJ.A..Skinelectroporation:effectsontransgeneexpression,DNApersistenceandlocaltissueenvironment.PLoSOne.2009；4(9):e7226；SchertzerJ.D.,LynchG.S.Plasmid-basedgenetransferinmouseskeletalmusclebyelectroporation.MethodsMolBiol.2008;433:115-25)中。然而，这种方法是基于施加电场以推动基因构建体（单独地，或与诸如佐剂的其它组分一起存在于复合物中）穿过生物膜。作为这种方法的结果，显著部分的基因构建体受损害。这种方法不容许实现延长效应，因此需要重复使用这种方法。[0006]局部施用包括三维支架和粘着到其表面的细胞的工程化组织构建体的方法描述于例如（DeevR.V.，TsipkinaN.V.，BozoI.Ya.，PinaevaG.P.，TuhilivR.M.，Amethodofcombiningculturedosteogeniccellsandathree-dimensionalmatrix-carrier，RUN〇2008150694,2008年12月22日公布）中。然而，在这个方案中，细胞需要有效的血液供应。距血液微循环血流的临界距离是200μΜ到500μΜ，超出这个距离，细胞不可避免地死亡（参见例如PolykandriotisΕ.，ArkudasA.，HorchR.等人，Autonomouslyvascularizedcellularconstructsintissueengineering:openinganewperspectiveforbiomedicalscience.J.CellMol.Med.2007;11(1):6-20)。鉴于这个原因，组织工程化构建体的尺寸应不小于lcm3,在这个尺寸下，在移植到受体中之后，所述构建体的细胞可以保持存活。[0007]这个尺寸的缺损不需要另外最优化再生过程，因此，可以使用显著较大尺寸的组织工程化构建体（从lcm3起）。然而，移植这样大的构建体可能损害组织部位，并且不可避免地导致较大比例的所施用细胞（尤其位于生物复合材料的中心部分的细胞）死亡，从而显著降低方法效率。组织工程化构建体在修复骨缺损（或其它应用）中的效力主要取决于生物复合材料中所包含的细胞的存活率。然而，组织工程化构建体的细胞需要氧合作用，并且因此，组织工程化构建体越大，在移植后越多的细胞（尤其位于组织工程化构建体的中心部分（更靠近"核"）的细胞）可能死亡。因此，在大的组织工程化构建体（大于lcm3)中，许多所包括的细胞可能死亡，并且修复效率可能不高（例如，其效率可以与不含细胞的支架的效率相同）。因此，与不含细胞的相同支架相比，对于骨置换，小尺寸的组织工程化构建体更有效。这个氧合作用问题是公知的。[0008]另外，组织工程化构建体的尺寸的选择由欲修复的骨缺损的尺寸决定；组织工程化构建体的尺寸应与骨缺损的尺寸匹配。因此，小的组织工程化构建体可能无法被有效用来修复大的缺损。小的骨缺损的天然再生非常优良，并且不需要诸如组织工程化构建体的高度有效的成骨材料。在这种情况下，由于大多数所包括的细胞存活并且执行其功能，因此再生是有效的。因此，组织工程化构建体优选用于修复大的骨缺损；然而，在这种情况下，不得不使用大尺寸的组织工程化构建体，并且所述构建体的大多数细胞可能死亡，因此最终效率变得较低。[0009]活化基质、制造所述基质的方法和将核酸局部施用到由各种材料制成的生物相容性基质中以提供修复过程描述于例如（GoldsteinS.A.,Methodsofinvivogenetransfectionforreparativewoundregeneration,RUN〇2170104,2001年6月10日公布）中。然而，这些技术方法涉及包括支架和基因构建体的两组分产品。在这种方法中，缺少组织和器官的最佳组织型恢复所需要的基本成分细胞，因此，产品的应用效率中等。[0010]因此，存在多种制造提供组织和器官的修复再生的生物复合材料的方法。[0011]一种已知的方法是将支架和细胞组合在生物复合材料中（组织工程化方法）。然而，当复合物含有大体积的生物复合材料（大于lcm3)时，包括在生物复合材料中的细胞在移植到受体中之后会由于血流供应不充分而死亡。生物复合材料越大，越多包括在生物复合材料中和位于支架内部的细胞死亡。仅位于外围的细胞存活。组织工程化生物复合材料的血液供应的这个问题一直存在，并且迄今尚未解决。[0012]另一种已知的方法是组合支架与核酸。然而，"最安全"的核酸（也就是，由诸如质粒的非病毒递送系统携载的核酸）在活体内的转染效率水平较低，也就是，在将这种生物复合材料植入受体中之后，仅2%到5%的核酸转染细胞。包括在病毒递送系统中的核酸提供较高水平的转染（例如，转染效率高达40%到45%);然而，基于病毒的系统较不"安全"，因为它们经由病毒粒子（例如，反转录病毒、腺病毒或慢病毒）引入。[0013]因此，需要不具有已知方法的缺陷的生物复合材料。【
发明内容】[0014]本发明的目的涉及在医学和兽医学中用于恢复哺乳动物中损伤的组织和器官的生物复合材料，涉及用于制造生物复合材料的试剂盒、制造生物复合材料的方法、治疗损伤的方法以及递送生物复合材料中所含有的核酸的方法。本发明的目的已由本发明的【发明者】实现，本发明的第一实施方案包括生物复合材料，所述生物复合材料包含支架、至少一种核酸和提供修复再生的细胞。所述生物复合材料适于在损伤的哺乳动物中提供修复过程。[0015]在另一个实施方案中，支架是固体的有机或无机材料，其选自：金属性材料、胶原、壳聚糖、磷酸钙、羟磷灰石、生物陶瓷、生物玻璃、铝酸盐材料、纯化的蛋白质、细胞外基质产物或它们的组合。[0016]在一个不同的实施方案中，支架是至少一种选自以下的液体：0.9%NaCl溶液、葡聚糖溶液、盐水溶液、透明质酸溶液和软骨素-硫酸。优选地，支架是至少一种选自以下的材料：胶原、藻酸盐、明胶凝胶、胶态溶液、软膏和乳霜。在再一个实施方案中，支架包含至少一种选自以下的材料：固体、液体、凝胶、软膏和乳霜材料。支架还可以为纳米结构。[0017]在一个实施方案中，至少一种核酸呈至少一种选自以下的形式：DNA编码基因、DNA非编码基因、包括在载体分子中的DNA、游离线性DNA、单链RNA、双链RNA、具有至少一个经修饰核糖核苷酸的RNA、5'-端帽-依赖性/非依赖性RNA、3'-聚（A)-依赖性/非依赖性RNA、微RNA和siRNA。优选地，核酸编码至少一种基因。[0018]生物复合材料可以包含自体细胞和/或同种异体细胞。在一个实施方案中，细胞是一种或多种细胞生成性细胞系的衍生物。优选地，生物复合材料包含干细胞、祖细胞或分化细胞、或不同分化的细胞的组合。[0019]在一个实施方案中，细胞在将所述细胞添加至生物复合材料之前立即衍生自哺乳动物，或者是预暴露于实验室细胞处理技术的细胞。[0020]在一个不同的实施方案中，制造生物复合材料的方法包括：将至少一种核酸与支架组合，由此产生复合物，并将提供组织型修复再生的细胞添加至所产生的、支架与至少一种核酸的复合物。[0021]在再一个实施方案中，制造生物复合材料的方法包括：将至少一种核酸与支架组合，由此产生复合物，随后将细胞添加至所产生的复合物，其中细胞用至少一种核酸预转染，所述至少一种核酸和与支架组合的至少一种核酸可以相同或不同，并且其中细胞提供组织型修复再生。[0022]另一个实施方案是制造生物复合材料的方法，所述方法包括用至少一种核酸预转染提供组织型修复再生的细胞，随后将转染的细胞与支架组合。[0023]在一个实施方案中，提供治愈哺乳动物中的损伤的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用根据例示性实施方案的生物复合材料。优选地，将生物复合材料作为外科手术或操作（manipulation)的一部分直接施用到损害的组织部位。在一个不同的实施方案中，生物复合材料经静脉内、动脉内、肌内、真皮内、皮下、骨内、腰椎内（endolumbar)、硬膜下、关节内或延髓内（endobulbar)注射施用。在另一个实施方案中，生物复合材料局部施用。[0024]本发明还提供递送包含在生物复合材料中的至少一种核酸的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用生物复合材料。[0025]在一个实施方案中，用于制备生物复合材料的试剂盒包括：包含支架与至少一种核酸的复合物的容器以及单独容器，所述单独容器用于组合复合物与具有提供修复再生的细胞的生物流体或培养基。在一个优选的实施方案中，至少一种核酸是包括在载体分子中的DNA，其中载体是质粒、病毒、附加体或转座子。[0026]细胞可以在将所述细胞添加到生物复合材料中之前立即衍生自哺乳动物，或者细胞预暴露于实验室细胞处理技术。[0027]在一个实施方案中，制造生物复合材料的方法包括：将至少一种核酸与支架组合，由此产生复合物，随后将细胞添加至所产生的复合物，其中细胞包含（i)用至少一种核酸预转染的细胞，所述至少一种核酸和与支架组合的至少一种核酸可以相同或不同，和（ii)未预转染的细胞，其中细胞（i)和（ii)提供组织型修复再生。[0028]在一个不同的实施方案中，用于在损伤的哺乳动物中提供修复过程的生物复合材料包含支架、至少一种核酸和提供修复再生的细胞。[0029]在下文的随附描述中陈述本发明的一个或多个实施方案的细节。尽管任何类似或等效于本文中所述的方法和材料都可以用于例示性实施方案的实践或测试，但目前所述是优选的方法和材料。根据描述和权利要求，例示性实施方案的其它特征、目的和优点将显而易见。在说明书和权利要求中，除非上下文另外明确指出，否则单数形式包括复数形式。实施方案的实例仅出于例示说明的目的。【专利附图】【附图说明】[0030]通过参考结合附图考虑的以下详细描述可以更好地理解实施方案，因此，将容易地获得对实施方案和其多个伴随优点的更全面理解，其中：[0031]图1示出了生物复合材料，它包括细胞和核酸与由成骨材料制成的支架的组合。A-光学显微镜术，B-扫描电子显微镜术。[0032]图2示出了实验中医用品（生物复合材料）的移植阶段。A显示在施用生物复合材料之前的骨缺损，其中放置基尔希i内钢丝（Kirschner'swire)以固定脱骨介和肢体轴。B显示施用到骨缺损的生物复合材料。[0033]图3示出了兔子的胫骨。用生物复合材料产生的骨再生限定于中心部分（用白色箭头标记）。[0034]图4示出了在施用化学上划分的遗传物质和细胞后形成的骨再生。示出了组织学照片。染色：苏木素和曙红。光学显微镜术：放大倍率X100。【具体实施方式】[0035]本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容都以引用的方式并入本文中。此外，除非另有说明，否则材料、方法和实例仅为例示性的，并不意欲具有限制意义。[0036]本发明的【发明者】已经发现一种组织型治愈哺乳动物中的损伤的新方法，所述方法通过向受体施用均质的基因-细胞复合物以实现目标作用的最佳（明显且延长）表现来进行。[0037]新颖基因-细胞材料的产生和应用容许向目标部位引入由基本成分细胞构成的组织和器官的最佳恢复所需要的最大量的核酸，从而实现活性组分的协同和延长效应，并且容许防止在类似产品中发现的缺点。[0038]新方法尤其由于以下原因而增加组织和器官恢复的功效和效率：[0039]?核酸的最佳递送，核酸经保护而不受受体中的受植床的损害因素影响，以及从支架结构的延长释放，也就是，延长的祀向效应；[0040]?向受体施用必需的细胞群体，从而提供组织和器官完整性的组织型恢复；和[0041]?包括在均质的医用生物复合材料（医用品）中的核酸与细胞的协同效应。[0042]因此，本申请的例示性实施方案的目的是用于在损伤的哺乳动物中提供修复过程的新颖生物复合材料，其包含支架、细胞和至少一种核酸。[0043]这种生物复合材料中的细胞与核酸的相互作用类似于共生，也就是，细胞使核酸的表达水平增加并作为递送样媒介，而游离的核酸（位于支架上，而不是位于生物复合材料的细胞中）转染受体的细胞（在移植生物复合材料之后），并且，取决于用于制造生物复合材料的核酸的类型（例如，含有血管生成基因、营养基因和任何其它因子的核酸），核酸的表达产物使生物复合材料的细胞的存活率增加和/或调节其形态功能活性。[0044]在一个实施方案中，生物复合材料包括支架、至少一种核酸和至少一种类型的提供组织型修复再生的细胞，所述生物复合材料作为在损伤的哺乳动物中提供修复过程的药剂。[0045]实例性核酸选自：DNA编码基因、DNA非编码基因、载体分子（例如，质粒、病毒、附加体、转座子）中含有的DNA、游离线性DNA、单链RNA、双链RNA、具有经修饰核糖核苷酸的RNA、5'-端帽-依赖性/非依赖性RNA、3'-聚（A)-依赖性/非依赖性RNA、微RNA、siRNA和它们的组合。取决于相关支架的组分，核酸可以以若干种可能的变体纳入组合物中。用于恢复组织和器官的生物复合材料含有至少一种核酸或其不同组合，其中至少一种核酸可任选地编码至少一种基因。在一个实施方案中，使用至少一种多盒（polycassete)基因构建体。[0046]用于产生生物复合材料的一种类型的核酸中含有的一种靶基因或若干种靶基因的选择，或含有不同靶基因的若干种类型的核酸的选择取决于所选择的用于组织和器官恢复的材料，它与由核酸的靶基因编码的某些因子的生物效应有关。在一个实施方案中，适合使用编码血管内皮生长因子（VEGF)或基质细胞衍生因子-l(SDF-l)的核酸来恢复组织和器官，因为这些因子诱导血管生成。[0047]支架可以具有固体有机或无机性质，并且可以为至少一种选自以下的材料：金属性材料、胶原、壳聚糖、磷酸钙、羟磷灰石、生物陶瓷、生物玻璃、铝酸盐材料、纯化的蛋白质、细胞外基质产物和它们的组合。在一个实施方案中，支架是三维的。[0048]支架可以为液体。在一个实施方案中，支架是至少一种选自以下的溶液：0.9%NaCl溶液、葡聚糖溶液、盐水溶液（例如，林格氏溶液（Ringer'ssolution)、汉克斯氏溶液(Hank'ssolution))和有机酸溶液（例如，细胞外基质的无定形物质的组分（例如，透明质酸或软骨素-硫酸））。[0049]在一个实施方案中，支架呈至少一种选自以下的形式：凝胶（例如，胶原、藻酸盐或明胶）、胶态溶液、软膏和乳霜形式。[0050]在另一个实施方案中，支架可以为含有固体、液体、凝胶、软膏和乳霜材料以及它们的不同组合的复合材料。[0051]在再一个实施方案中，支架可以含有至少一种纳米结构材料。细胞群体的选择由组织的组织发生性质决定，所获得的生物复合材料针对所述组织进行完整性修复。为产生生物复合材料，适合使用如下类型的细胞：能够在移动到受损组织的细胞的同时进行分化的细胞，或者是对应于受损组织的细胞的已经分化的细胞，以及能够提供组织型修复再生过程的细胞。此类细胞包括几乎任何能够通过例如刺激和/或血管生成产生所需生长因子或间接最优化修复过程的细胞。[0052]在一个实施方案中，生物复合材料含有自体细胞和/或同种异体细胞。细胞可以衍生自一种或多种细胞生成性细胞系。[0053]在另一个实施方案中，生物复合材料含有干细胞、祖细胞或分化细胞，或它们的组合。[0054]在一个不同的实施方案中，生物复合材料所含有的细胞直接衍生自哺乳动物，也就是，细胞在从哺乳动物获得后在未施加进一步实验室细胞处理技术（例如，未使用进一步培养、免疫表型分型和/或诱导分化）的情况下立即用于生物复合材料，也就是，所谓的"新鲜的"细胞。在一个实施方案中，新鲜的细胞是如下的细胞：从哺乳动物获得，并且仅最低限度地进行处理，例如离心和/或过滤，随后立即施用到哺乳动物。[0055]在一个不同的实施方案中，生物复合材料所含有的细胞已经被暴露于实验室细胞处理技术（例如，进一步培养、免疫表型分型、诱导分化和/或用至少一种基因构建体转染）。在一个实施方案中，可以在从哺乳动物获得后对细胞进行冷冻。[0056]本发明还提供制造生物复合材料的方法。对产生生物复合材料的组分进行组合的例示性实施方案为：[0057]1.将至少一种核酸与支架组合，然后，向所获得的含有至少一种核酸和支架的复合物添加提供组织型修复再生的细胞。[0058]2.将至少一种核酸与支架组合，然后，向所产生的、支架与至少一种核酸的复合物添加已经用至少一种核酸（其和与支架组合的核酸相同或不同）预转染的细胞，其中细胞为所产生的复合物提供组织型修复再生。[0059]3.将至少一种核酸与支架组合，其中核酸与提供组织型修复再生的细胞预组合，然后，将转染的细胞添加到支架。[0060]4.首先将细胞与支架组合，然后添加核酸。[0061]5.将一个细胞群体与支架组合，同时另一个细胞群体用基因构建体转染，然后，将转染的细胞和包括细胞与支架的组合的产物组合在生物复合材料中。[0062]6.将至少一种核酸与支架组合，然后将细胞添加至复合物，其中细胞包含（i)用至少一种核酸预转染的细胞，所述至少一种核酸和与支架组合的至少一种核酸可以相同或不同，和（ii)未预转染的细胞，其中细胞（i)和（ii)提供组织型修复再生。[0063]核酸与支架的相互作用可以为基因构建体与支架组分的可逆的相互作用，它借助在支架组分和核酸之间形成弱的（暂时的）化学键，借助核酸浸渍到支架结构（例如，液体、软膏或凝胶载体）中，或通过用各种粘性物质将核酸施加到固体支架的表面来实现。由于核酸与支架之间的可逆的相互作用，在生物复合材料与生物流体接触（相互作用）之后（具体来说，在施用到受体之后），由于受植床的某些因子，并且由于支架的生物吸收（当支架包含生物吸收性材料时），基因构建体随后被释放。能够与核酸形成化学键的支架的组分可以由例如以下物质代表：例如，轻磷灰石、氟磷灰石（例如，GiovanniniR.,FreitagR.ComparisonofdifferenttypesofceramichydroxyapatiteforthechromatographicseparationofplasmidDNAandarecombinantanti-RhesusDantiorganism·Bioseparation2001;9:359-368)、撰基咪唑（例如，SousaA.,TomazC.T.,SousaF.等人，SuccessfulapplicationofmonolithicinnovativetechnologyusingacarbonyldiimidazoledisktopurifysupercoiledplasmidDNAsuitableforpharmaceuticalapplications.JChromatogrA.2011;1218(46):8333-43)、聚丙烯酉先亚胺（ZhangY.S.,BaiX.F.Asimple,rapidandhigh-resolutionbandingmethodinpolyacrylamidegels.YiChuan.2008;30(2):251_4)和/或甲基丙烯酸的聚合物(SmrekarF.,PodgornikA.,CiringerM.等人，Preparationofpharmaceutical-gradeplasmidDNAusingmethacrylatemonolithiccolumns.Vaccine2010;28(8):2039-45)〇支架保护活性物质，也就是被分隔开的核酸，不受受体的破坏性组织因子影响，并且由于与基因构建体的暂时的化学键而容许延长效应。核酸与支架之间的化学键的强度可以取决于支架材料和核酸的类型而有所不同。化学键的强度在不存在键到几乎不可逆的键之间变化。[0064]形成生物复合材料的核酸与细胞的相互作用通过用基因构建体转染细胞来实现。核酸可以在与支架组合之前在活体外引入细胞中，以及在首先组合核酸与支架然后添加细胞的情况下，作为支架的一部分引入细胞中。[0065]用于获得生物复合材料的核酸的数量由支架的容量限定，它是可以位于支架的表面上或在其容积内的核酸的最大数量，以及由可转染与用于制造生物复合材料的支架组合的细胞群体的核酸数量限定。用于获得生物复合材料的核酸的数量取决于具体情况，并且可以由本领域的技术人员确定。[0066]形成生物复合材料的细胞由于细胞-基质和细胞-细胞相互作用的不同机制粘着到固体支架的表面，或局部化于液体、凝胶或软膏载体的内部。制造生物复合材料所需要的细胞的数量由支架的表面积（对于固体支架）或支架的容积（对于液体和凝胶支架）以及使损害的组织修复再生所需要的最低浓度限定，并且还可基于某些条件确定。[0067]取决于核酸和细胞与支架组合成均质的医用品的技术，以及取决于基因构建体和细胞的类型，核酸与细胞的协同效应可能有所不同。协同效应在两个阶段执行：在获得生物复合材料（产品）时和在将其移植到受体中之后即刻。当制备生物复合材料时，通过用核酸（在活体外在转染中的核酸的整个池或在与支架组合后在转染中的核酸的一部分）转染细胞获得协同作用，它使得所引入的核酸的数量增加，并且通过诱导靶基因的表达而最优化细胞群体的性质，所述靶基因位于所引入的核酸上。获得协同效应的有效技术是：活体外细胞转染（细胞和核酸组合）并且支架与已经转染的细胞组合、细胞与复合物"支架-核酸"组合、活体外细胞转染然后与复合物"支架-核酸"组合。获得协同效应的较不有效的变化形式包括细胞与支架组合，然后添加核酸。这种添加核酸的技术使用对细胞有损害的试剂和物理因素（例如，干燥）。当施用到受体时，由受植床的细胞和移植产品的细胞转运的基因构建体得以表达，并且表达产物诱导并且保持形态功能活性，包括引入生物复合材料中的细胞的活性。[0068]在一个不同的实施方案中，提供应用生物复合材料的方法。生物复合材料可用于将核酸有效地递送到对象，例如哺乳动物。[0069]生物复合材料还可用于提供哺乳动物中的损伤的组织型修复。[0070]生物复合材料的施用方法可以不同，并且取决于组织和器官损伤的形式和类型。例如，生物复合材料可以作为外科手术或手法治疗的一部分直接施用到损害的组织部位。生物复合材料（具有液体或凝胶载体）可以以注射剂的形式（例如，静脉内、动脉内、肌内、真皮内、皮下、骨内、腰椎内、硬膜下、关节内、延髓内）施用到受体，或者可以以敷用物的形式（具有液体、凝胶、乳霜或软膏载体）使用。[0071]本发明还提供用于制造生物复合材料的试剂盒，它包括两个组件/容器：一个组件用于将"支架-核酸"复合物保持在合适的容器中，而另一个组件用于将"支架-核酸"复合物与培养基或培养流体和细胞组合，并且用于细胞的转运。[0072]试剂盒的第一组件是具有两个层的产品：内层，它的内侧和外侧均为无菌的，并且用于保存"支架-核酸"复合物和保持它的无菌性；以及外层，它仅内侧是无菌的，外侧并不是无菌的。外层牢固地固定内层，并且提供内部的无菌性以及抗机械损害的保护。外层可以在与内部无菌部分没有任何接触的情况下容易地打开。[0073]试剂盒的第二组件用于将"支架-核酸"复合物与细胞组合，它是由玻璃或聚合物材料制成的无菌容器，并且具有容纳具有核酸的支架和具有细胞的培养基或生物流体（例如，血液）所需要的容积。无菌容器也装有两个层，内部无菌层的两侧均为无菌的，而外层的内侧是无菌的，外侧并不是无菌的。[0074]因此，用于制造生物复合材料的试剂盒在一个容器中含有支架与至少一种核酸的复合物，并且具有用于将复合物与生物流体或培养基组合的第二容器，所述生物流体或培养基含有提供组织型修复再生的细胞。[0075]上文已经概括描述本发明，通过参考某些具体实施例可以获得进一步理解，除非另有说明，否则本文中提供这些实施例仅出于例示说明的目的，并不意欲具有限制意义。适当的是，给出本发明的可能执行的实施例：通过使含有羟磷灰石和骨胶原的支架与自体血液单核细胞群体和含有具有VEGF基因的核苷酸序列的基因构建体组合，来制造生物复合材料（参见专利RU2297848)，以及其用于骨组织的修复再生的用途（兔子胫骨中长2cm的骨缺损的置换）。[0076]实施例[0077]实施例1.核酸和支架的化学结合.[0078]1.支架的制备.在这个实施例中，使用组合的支架，它包括合成的I型胶原和羟磷灰石（比率分别为60%/40%)。而且，支架的体积为lcm3。对支架进行以下操作：[0079]a)洗涤（在lmlO.5M磷酸盐溶液中，在37°C下，在恒定振荡下温育12小时）；[0080]b)平衡（用lmllOmM磷酸盐，在37°C下，在恒定振荡下处理三次，每次持续10分钟）；和[0081]c)干燥（在37°C下温育，直到完全干燥3小时）。[0082]2.考虑估计的用于核酸的支架容量，施加核酸（用含有DNA质粒的溶液，在ΙΟΟμllOmM磷酸盐中，以lyg/μ1的浓度，在37°C下在恒定振荡下温育12小时），在这个实施例中，支架容量是202.765ng核酸/lmg支架。[0083]3.处理所产生的复合物"支架-基因构建体"。对复合物进行以下操作：[0084]a)洗涤（用lml5mM磷酸盐溶液处理三次）；和[0085]b)干燥（在37°C下温育3小时，直到完全干燥）。[0086]4.将"支架-核酸"复合物与自体血液单核细胞群体组合，其中细胞在即将手术之前（在手术进行期间）获得。将lcm3体积的"支架-核酸"复合物转移到含有5ml患者血液的容器中，所述患者血液在进行手术时用注射器从损害的组织部位抽出。暴露持续若干分钟，也就是，足以用血液填充携载核酸的所有支架孔的时间，所述血液含有提供骨组织的组织型修复再生的自体单核细胞。[0087]实施例2.在实施例1中产生的复合物的移植.[0088]在医用品（生物复合材料）的移植中，使用兔子胫骨中2cm长的骨缺损作为这个实验的模型。首先，放置基尔希讷钢丝以固定脱骱和肢体轴，此后，将生物复合材料施用到骨缺损。[0089]图1到图4示出的数据证实施用化学上划分的遗传物质和细胞以提供修复的骨生成的功效和效率。[0090]为证实在洗涤和干燥所产生的产品后核酸和由成骨材料制成的支架的化学结合，进行解离，也就是，破坏键并将核酸释放到溶液中。为此，将产品用50μ10.5M磷酸盐溶液在37°C下在恒定振荡下处理10分钟，然后，对具有洗脱的核酸的溶液进行分光光度测定(分光光度计Nanodrop-1000)。结果，溶液中核酸的浓度测量为202.765ng/lmg支架（不同的支架具有不同的容量）。[0091]为证实自体血液单核细胞群体与产品，也就是生物复合材料的组合的可行性，对产品进行光学显微镜术，并识别出粘着到支架表面的细胞。光、扫描和透射电子显微镜术的方法显示，粘着到基质的细胞扩散并且几乎覆盖支架的整个空表面（图1)。[0092]这个实施例显示核酸、细胞和支架的组合的可行性、将所产生的医用品施用到受体的可能性，并且展示与最接近的类似物相比，兔子胫骨中的骨完整性的更快速且更有效恢复，其中最接近的类似物的实验结果先于使用新颖生物复合材料一个月获得。[0093]实施例3[0094]制备复合物，所述复合物包括下文所示量的以下支架材料（各材料在不同支架中）和核酸：[0095]-将磷酸钙与72.5ng核酸/lmg这种支架组合；[0096]-将羟磷灰石与347.8ng核酸/lmg这种支架组合；[0097]-将细胞外基质产物（同种异体脱矿质骨基质）与108.4ng核酸/lmg这种支架组合；[0098]-将细胞外基质产物（异种脱蛋白质骨基质）与285.7ng核酸/lmg这种支架组合；和[0099]-将磷酸钙和羟磷灰石的组合物与520.lng核酸/lmg这种支架组合。[0100]借助实施例1中所述的技术（方案）进行这些实施例中的每一者。在第二步骤，将细胞添加至支架和核酸的复合物。[0101]用于特定支架的不同类型的细胞（它们通过不同技术获得）为：多能间充质基质细胞的培养物、成纤维细胞的培养物、骨膜骨原细胞的培养物；或具有细胞的新鲜血液，或用特殊设备（例如，Cytori)获得的基质血管细胞部分。[0102]生物复合材料的这些变体根据实施例1的方案制备，具有骨缺损修复性质，并且在实施例2中所述的模型中进行测试。[0103]实施例4[0104]在颅骨缺损模型中对多种所产生的生物复合材料进行测试。[0105]选择顶骨的颅骨缺损（直径为l〇mm)作为临界尺寸的骨缺损的模型。使每只动物(兔子）双侧相同缺损。在即将植入骨缺损中之前，向生物复合材料（支架和带有vegf基因的质粒的复合物）中添加新鲜的自体血液，将其植入右顶骨的缺损中（实验组），同时将不具有核酸和细胞（新鲜血液）两者的支架（对照1)或仅具有血液细胞的支架（对照2)或仅具有核酸的支架（对照3)用于颅骨左侧。在第15、30、45、60、90天评估结果。[0106]显示，与所有对照组相比，在所有测试时间点，对于实施例组的生物复合材料，带有vegf基因的CDNA的质粒对受植床细胞的转染更高，从而达成更明显的血管生成和修复骨生成。[0107]例示性实施方案可应用于医学实践中，尤其用于刺激组织中的修复过程，以及应用于兽医学中用于治疗哺乳动物。[0108]2011年12月29日提交的RU专利申请No.2011153873以引用的方式并入本文中。[0109]根据上述教导，可以对本发明进行多种改进和变化。因此，应理解，在权利要求的范围内，可以以不同于本文中所述具体内容的方式来实施本发明。【权利要求】1.一种生物复合材料，其适于在损伤的哺乳动物中提供修复过程，所述生物复合材料包含：支架，至少一种核酸，和提供修复再生的细胞。2.根据权利要求1所述的生物复合材料，其中所述支架是固体的有机或无机材料，其选自：金属性材料、胶原、壳聚糖、磷酸钙、羟磷灰石、生物陶瓷、生物玻璃、铝酸盐材料、纯化的蛋白质、细胞外基质产物或它们的组合。3.根据权利要求1所述的生物复合材料，其中所述支架是至少一种选自以下的液体：0.9%NaCl溶液、葡聚糖溶液、盐水溶液、透明质酸溶液和软骨素-硫酸。4.根据权利要求1所述的生物复合材料，其中所述支架是至少一种选自以下的材料：胶原、藻酸盐、明胶凝胶、胶态溶液、软膏和乳霜。5.根据权利要求1所述的生物复合材料，其中所述支架包含至少一种选自以下的材料：固体、液体、凝胶、软膏和乳霜材料。6.根据权利要求1所述的生物复合材料，其中所述支架是纳米结构。7.根据权利要求1所述的生物复合材料，其中所述至少一种核酸呈至少一种选自以下的形式：DNA编码基因、DNA非编码基因、包括在载体分子中的DNA、游离线性DNA、单链RNA、双链RNA、具有至少一个经修饰核糖核苷酸的RNA、5'-端帽-依赖性/非依赖性RNA、3'-聚(A)-依赖性/非依赖性RNA、微RNA和siRNA。8.根据权利要求7所述的生物复合材料，其中所述至少一种核酸是包括在载体分子中的DNA，其中所述载体是质粒、病毒、附加体或转座子。9.根据权利要求1所述的生物复合材料，其中所述核酸编码至少一种基因。10.根据权利要求1所述的生物复合材料，其包含自体细胞和/或同种异体细胞。11.根据权利要求1所述的生物复合材料，其中所述细胞是一种或多种细胞生成性细胞系的衍生物。12.根据权利要求1所述的生物复合材料，其包含干细胞、祖细胞或分化细胞、或分化不同的细胞的组合。13.根据权利要求1所述的生物复合材料，其中所述细胞在将所述细胞添加至所述生物复合材料之前立即衍生自哺乳动物，或者是预暴露于实验室细胞处理技术的细胞。14.一种制造生物复合材料的方法，所述方法包括：将至少一种核酸与支架组合，由此产生复合物，以及向所产生的、支架和至少一种核酸的复合物添加提供组织型修复再生的细胞。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞在将所述细胞添加至所述生物复合材料之前立即衍生自哺乳动物，或者是预暴露于实验室细胞处理技术的细胞。16.-种制造生物复合材料的方法，所述方法包括：将至少一种核酸与支架组合，由此产生复合物，并向所产生的复合物添加细胞，其中所述细胞包含(i)用至少一种核酸预转染的细胞，所述至少一种核酸和与所述支架组合的所述至少一种核酸相同或不同，和(ii)未预转染的细胞，其中所述细胞（i)和（ii)提供组织型修复再生。17.-种制造生物复合材料的方法，所述方法包括：将至少一种核酸与支架组合，由此产生复合物，并向所产生的复合物添加细胞，其中所述细胞用至少一种核酸预转染，所述至少一种核酸和与所述支架组合的所述至少一种核酸相同或不同，并且其中所述细胞提供组织型修复再生。18.-种制造生物复合材料的方法，所述方法包括：用至少一种核酸预转染提供组织型修复再生的细胞，和将转染的细胞与支架组合。19.一种治愈损伤的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用根据权利要求1所述的生物复合材料。20.根据权利要求16所述的方法，其中将所述生物复合材料作为外科手术或操作的一部分直接施用到损害的组织部位。21.根据权利要求16所述的方法，其中所述生物复合材料经静脉内、动脉内、肌内、真皮内、皮下、骨内、腰椎内、硬膜下、关节内或延髓内注射施用。22.根据权利要求16所述的方法，其中所述生物复合材料局部施用。23.-种将包含在根据权利要求1所述的生物复合材料中的至少一种核酸递送到有需要的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用所述生物复合材料。24.-种试剂盒，其用于制备根据权利要求1所述的生物复合材料，所述试剂盒包括：第一容器，所述第一容器包含支架和至少一种核酸的复合物；以及第二单独容器，所述第二单独容器用于组合所述复合物与带有提供修复再生的细胞的生物流体或培养基。25.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述第二容器包含带有提供修复再生的细胞的所述生物流体或培养基。【文档编号】A61K47/48GK104203285SQ201280064772【公开日】2014年12月10日申请日期:2012年12月24日优先权日:2011年12月29日【发明者】阿尔图尔·亚历山德罗维奇·伊萨耶夫,谢尔盖·利沃维奇·基谢廖夫,罗曼·瓦季莫维奇·迪弗,伊尔娅·雅迪格维奇·鲍祖,叶连娜·萨吉乌娜·菲洛年科申请人:奈克斯简尼有限公司