专利名称：岗松总黄酮的制备及其质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种黄酮提取物制备领域，具体涉及一种岗松总黄酮的制备及其质量控制方法。
背景技术：
天然植物提取物是以植物为原料，按照提取的目的需要，经过物理化学提取分离过程，定向获取和浓集植物中的某一种或多种有效成分，而不改变其有效成分结构而形成的产品。与传统草药和中成药相比，中药提取物至少知道一种或一类有效成分，有明确的定量指标，有害成分大部分被除去，从而在安全性上比传统植物药和中成药大大提高。此外，中药提取物还融合了现代制药新技术，属于新型中药产品，具有广阔的国际市场空间，其产业化有良好的发展前景，体现了中药产业的技术进步，适应了中药现代化的要求。岗松为桃金娘科植物岗松feecfca frutescens L.带有花果的干燥莖叶,现收载于《广西壮族自治区壮药材质量标准汇编》第一卷，曾收载于《中国药典》1977版。其功能主治为清利湿热，杀虫止痒。用于泄泻，腹痛，急性胃肠炎；外治滴虫性阴道炎，皮肤湿疹。研究表明岗松主要成分含有黄酮、有机酸、挥发油等类化合物，黄酮是植物中具有生物活性的一大类化合物，岗松含6，8- 二甲基山奈酚-3-0- α -鼠李糖苷、槲皮素、槲皮素-3-0- α -鼠李糖苷、杨梅素、杨梅素-3-0-α -鼠李糖苷等黄酮成分(题名岗松中的一个新黄酮醇苷类化合物作者卢文杰，牙启康，陈家源，刘布鸣，广西中医药研究院刊名药学学报，2008年，40 (10)，1032 1035)，槲皮素含量达O. 1% (题名高效液相色谱法测定岗松药材中槲皮素的含量作者林霄，刘布鸣，陈明生.等，广西中医药研究院刊名时珍国医国药，2009，20 (I) :102-103.)，杨梅素含量达O. 6% (题名岗松中杨梅素的含量测定作者陈明生，刘布鸣，林霄，等，广西中医药研究院刊名时珍国医国药，2010，21 (11):2771-2772.)。
岗松植物在我国分布广泛，资源相当丰富，但目前对岗松的应用不多，应用大多局限于提取挥发油，提油后的植物部分被作为废弃物丢弃，而岗松黄酮提取物未能得到应用，岗松药材未能得到充分的开发利用，严重地浪费了药材资源。所以研发一种岗松总黄酮的制备及其质量控制方法是有必要的，利于开发岗松新的药用途径，并为药材资源的充分利用及提高其应用价值提供科学的依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方法合理、稳定、生产周期短，适合工业化生产，具有抗炎、抑菌、镇痛等药理作用的岗松总黄酮的制备方法，及岗松总黄酮的质量控制方法。本发明是这样实现的
本发明岗松总黄酮的制备方法，包括以下步骤1、乙醇加热回流提取
①取岗松干燥茎叶，粉碎，按重量配比加10 - 15倍量30 - 70%体积浓度的乙醇；②加热回流提取3次，每次I一 3小时，滤过，合并滤液；
③滤液回收乙醇，并浓缩至无乙醇味，加水稀释得到浓度为O.3 — O. 8g生药量/mL的岗松提取液，待上柱用。2、大孔吸附树脂分离纯化
①选择弱极性的AB — 8或DlOl大孔吸附树脂。②吸附上柱岗松提取液浓度为O. 3 — O. 8g生药量/mL，上柱岗松提取液体积为填充大孔吸附树脂体积的2 - 5倍，上柱流速为O. 5 — 2 BV/h注BV/h表示柱内单位时间(h)流经单位体积树脂平均液量。③洗脱洗脱剂为50 - 70%乙醇，洗脱剂用量为填充大孔吸附树脂体积的5 - 10倍，洗脱流速为2 - 5BV/h ;收集5 — 8倍洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干，60°C真空干燥，得岗松总黄酮提取物。本发明岗松总黄酮的质量控制方法，包括以下步骤1、总黄酮的薄层色谱鉴别
取岗松总黄酮提取物约20mg，精密称定，置IOmL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取芦丁对照品适量，加甲醇制成每ImL含Img的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录W B)试验，取供试品溶液、对照品溶液各5 - 10 μ 1，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯一甲酸一水一甲醇(8:1:1:0.4)为展开剂,展开,取出，晾干，喷以1%三氯化铝试液,在105°C加热5分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2、总黄酮的含量测定
①对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每ImL含O. 05 mg的溶液，即得。②标准曲线的制备精密量取芦丁对照品溶液l、2、3、5、10mL，分别置IOmL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2010版一部附录V A)在360±lnm测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。③测定法取岗松总黄酮提取物约10mg，精密称定，置20mL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取lmL，置IOmL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇勻，以甲醇作为空白，在360±lnm测定吸光度，含总黄酮以芦丁(C27H3tlO16)计算，即得。岗松总黄酮含量以芦丁(C27H3tlO16)计算不得少于50. 0%。④结果采用本发明的制备和质量控制方法，经验证试验，制备的岗松总黄酮含量以芦丁计，可达50%以上。所述的岗松总黄酮应用于抗炎、抑菌、镇痛的药物中的。与现有技术相比，本发明突出的实质性特点和显著的进步是1、本发明首次从岗松中制备出含量50%以上的岗松总黄酮提取物，为药材资源的充分利用及提高其应用价值提供科学的依据。2、本发明设计合理，制备方法合理、稳定、可行，耗能低，利用醇水溶剂提取，经过一次大孔吸附树脂柱分离纯化即可得到含量较高的岗松总黄酮提取物，方法简便易行。
3、本发明提取、分离速度快，生产周期短，适合工业化生产，有很好的应用前景。4、本发明采用薄层色谱法鉴别总黄酮，紫外-可见分光光度法直接测定岗松总黄酮含量，方法准确、简单，能适应工业生产的需要，可有效的控制岗松总黄酮提取物的质量。5、通过对岗松总黄酮进行研究，建立了一种岗松总黄酮的制备和质量控制方法，有利于岗松相关产品的进一步开发利用，而且对于开发广西特色药材，开发具有高技术、高附加值的产品，提高市场竞争能力，将会产生潜在而不可估量的社会效益与经济效益。目前在国际市场，中药提取物商品形态包括以下三类
①纯度达到95%以上，以单一化合物为检测对象的中药提取物。②经过柱色谱分离、沉淀分离、萃取分离等分离工艺所获得的部分成分较为集中的多组分中药提取物，被测组分一般为活性成分，含量在20% - 50%之间。③经水或醇提取、未加分离的单一中药浸膏粉或流浸膏。我国的植物提取物总体上是属于中间体的产品，目前的用途非常广泛，主要用于药品、保健食品、烟草、化妆品的原料或辅料等。用于提取的原料植物的种类也非常多，目前进入工业提取的植物品种在300种以上。我国植物提取物的出口额早在1999年就已超过中成药的出口额。在欧美国家，植物提取物及其制品(植物药或食品补充剂)有着广泛的市场前景，已发展成一个年销售额近80亿美元的新兴产业。因此，建立了一种岗松总黄酮的制备和质量控制方法，使之科学化、规范化，增强国际竞争力，为中药进入国际市场创造条件，具有重大的实际意义和学术价值。
图1是岗松总黄酮的制备工艺流程图。图2是岗松总黄酮提取物、芦丁对照品紫外吸收光谱图。从图2看出，岗松总黄酮提取物的紫外光谱在360± I nm处有最大吸收，与芦丁对照品最大吸收一致，因此选择以芦丁为对照品，在360± Inm测定吸光度。
具体实施例方式实施例一
取岗松干燥茎叶IOOOgJp IOL 30%乙醇，加热回流提取3次，每次I小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收至无乙醇味，加水溶解至3000mL，摇匀，得浓度为O. 33g生药量/mL的岗松提取液。取已处理好的AB-8大孔吸附树脂150mL，湿法装柱，将300mL岗松提取液以
O.5BV/h的上样流速进行吸附，用2BV的水洗脱至洗脱液基本澄清，水洗脱液弃去，用5BV50%乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集5BV洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干，60°C真空干燥，得到岗松总黄酮提取物，测定，计算，总黄酮含量为52. 3%。实施例二
取岗松干燥茎叶lOOOg，加15L 50%乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收至无乙醇味，加水溶解至2000mL，摇匀，得浓度为O. 5g生药量/mL岗松提取液。取已处理好的DlOl大孔吸附树脂IOOmL,湿法装柱，将400mL岗松提取液以lBV/h的上样流速进行吸附，用2BV的水洗脱至洗脱液基本澄清，水洗脱液弃去，用6BV 70%乙醇以3BV/h的流速洗脱，收集6BV洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干，60°C真空干燥，得到岗松总黄酮提取物，测定，计算，总黄酮含量为51. 1%。实施例三
取岗松干燥茎叶lOOOg，加15L 70%乙醇，加热回流提取3次，每次3小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收至无乙醇味，加水溶解至1250mL，摇匀，得浓度为O. 8 g生药量/mL岗松提取液。取已处理好的AB-8大孔吸附树脂IOOmL,湿法装柱，将500mL岗松提取液以2BV/h的上样流速进行吸附，用2BV的水洗脱至洗脱液基本澄清，水洗脱液弃去，用10BV 50%乙醇以5BV/h的流速洗脱，收集8BV洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干，60°C真空干燥，得到岗松总黄酮提取物，测定，计算，总黄酮含量为54. 0%。岗松总黄酮的质量控制方法
总黄酮的薄层色谱鉴别
取岗松总黄酮提取物约20mg，精密称定，置IOmL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取芦丁对照品10mg，加甲醇制成每ImL含Img的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录W B)试验，取供试品溶液、对照品溶液各10 μ 1，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯一甲酸一水一甲醇(8:1:1:0.4)为展开剂,展开,取出，晾干，喷以I %三氯化铝试液,在105°C加热5分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。总黄酮的含量测定 精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每ImL含0.05 mg的对照品溶液。精密量吸取芦丁对照品溶液l、2、3、5、10mL，分别置IOmL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2010版一部附录V A，)在360nm测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。取岗松总黄酮提取物约10mg，精密称定，置20mL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取lmL，置IOmL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，在360nm测定吸光度，计算，即得。含量测定方法学试验如下1、标准曲线的制备精密量取芦丁对照品溶液l、2、3、5、10mL，分别置IOmL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2010版一部附录V A，)在360nm测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。得回归方程 Υ = 0·0281Χ - 0. 0131, r=0. 999 8，表明在 5· 2 — 52. 4 μ g/mL 范围内时，芦丁线性关系良好。2、精密度试验取同一供试品溶液，连续测定5次，结果RSD为0. 26 %。3、稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0，30，45、60、90，120 min测定，结果RSD为0. 39 %，表明供试品溶液在120分钟内稳定
4、重复性试验取同一批样品制备供试品溶液6份，按拟定方法测定，结果RSD为2. 41 %。5、回收率试验取已知含量的岗松提取液，分别精密加入芦丁对照品适量，按拟定方法测定含量，并计算回收率，回收率平均值为97. 8%，RSD为2. 25%。方法学试验结果表明该方法准确、稳定、操作简单，可确保产品的质量。岗松提取物毒性小，同时具有抗炎、抑菌、镇痛等药理作用，用岗松提取物进行毒理学、药效学试验，结果如下试验动物昆明种小鼠，18 - 22g，雌雄兼用，清洁级，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK桂2003-0003。1、急性毒性试验
取小鼠预试验后，另选取18 - 22g小鼠40只，分为2组，雌雄各半。以岗松提取物的最大给药浓度和最大给药体积给小鼠灌胃给药，24小时给药3次，连续观察7天，记录小鼠活动行为，大小便和饮食情况。结果未见动物有行为异常、死亡等情况，体重增长正常。2、抗炎作用试验
2.1对巴豆油引起小鼠耳廓肿胀的影响
取昆明种雄性小鼠40只，随机分为正常对照组，阿司匹林(O. 2g/kg)组，岗松提取物大、小剂量(10. 36g生药/kg和5. 18g生药/kg)组,每天灌胃给药I次,正常对照组给予等体积蒸馏水，连续7d。于末次给药后lh，用量注射器取O. 05ml 2%巴豆油涂于小鼠右耳，待4小时后通过拉颈椎处死小鼠。立即用口径为6_的打孔器，沿小鼠左右耳廓相同部位打孔取材，然后分别称重，以两耳片重量(mg)的差值作为肿胀程度指标，求出每只小鼠的平均值，采用T检验统计学处理，并求出百分抑制率(％)。结果见表I。结果表明，岗松提取物大剂量和小剂量均能显著抑制巴豆油引起的小鼠耳廓肿胀，提示岗松提取物对早期炎症具有较强的抑制作用。
权利要求
1.一种岗松总黄酮的制备方法，其特征在于所述的岗松总黄酮的制备方法包括以下步骤(1)乙醇加热回流提取①取岗松干燥茎叶，粉碎，按重量加10- 15倍量30 - 70%体积浓度的乙醇；②加热回流提取3次，每次I一 3小时，滤过，合并滤液；③滤液回收乙醇，并浓缩至无乙醇味，加水稀释至浓度为O.3 — O. 8g生药量/mL的岗松提取液，待上柱用；(2)大孔吸附树脂分离纯化①选择大孔吸附树脂；②吸附上柱岗松提取液浓度为O.3 — O. 8g生药量/mL，上柱岗松提取液体积为填充大孔吸附树脂体积的2 — 5倍，上柱流速为O. 5 — 2 BV/h ；③洗脱洗脱剂为50- 70%乙醇，洗脱剂用量为填充大孔吸附树脂体积的5 - 10倍， 洗脱流速为2 - 5 BV/h ;收集5 — 8倍洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干，60°C真空干燥，即得岗松总黄酮提取物。
2.根据权利要求1所述的岗松总黄酮的质量控制方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂选择弱极性的AB-8或DlOl大孔吸附树脂。
3.根据权利要求1所述的岗松总黄酮的质量控制方法，其特征在于所述的总黄酮的薄层色谱定性鉴别是取岗松总黄酮提取物约20mg，精密称定，置IOmL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，另取芦丁对照品适量，加甲醇制成每ImL含 Img的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，取供试品溶液、对照品溶液各5 10 μ L， 分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯一甲酸一水一甲醇8:1:1:0. 4为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝试液，在105°C加热5分钟，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑
4.根据权利要求1所述的岗松总黄酮的质量控制方法，其特征在于所述的总黄酮的含量测定包括以下步骤(1)对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每ImL含O.05 mg的溶液，即得；(2)标准曲线的制备精密量吸取芦丁对照品溶液l、2、3、5、10mL，分别置IOmL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，照紫外-可见分光光度法在360土 Inm测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线；(3)测定法取岗松总黄酮提取物约10mg，精密称定，置20mL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取ImL，置IOmL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，在360土 Inm测定吸光度，含总黄酮以芦丁计算，即得；本岗松总黄酮含量以芦丁计算不得少于50. 0%。
5.根据权利要求1所述的岗松总黄酮，其特征在于，所述的岗松总黄酮在制备抗炎、抑菌、镇痛的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种从植物岗松干燥茎叶经提取、浓缩、分离、干燥而制得的总黄酮提取物，本发明采用薄层色谱法定性鉴别总黄酮，采用紫外-可见分光光度法测定岗松总黄酮含量，方法准确、稳定、操作简单，能适应工业生产的需要，可有效的控制岗松总黄酮提取物的质量。本发明岗松总黄酮提取物毒性小，具有抗炎、抑菌、镇痛等药理作用，制备方法合理、稳定、生产周期短，适合工业化生产。具有良好的开发前景。
文档编号A61P31/04GK103040945SQ20131002296
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者刘布鸣, 邱宏聪, 黄艳, 林霄, 孙翠 申请人:广西壮族自治区中医药研究院