专利名称：N末端聚唾液酸化的制作方法
N末端聚唾液酸化本申请是2009年3月11日提交的名称为“N末端聚唾液酸化”的200780033741.8发明专利申请的分案申请。本发明涉及胰岛素的新型多糖衍生物以及用于产生这种衍生物的方法。所述衍生物可用于改良胰岛素的稳定性、药代动力学及药效学。糖尿病是一种碳水化合物代谢紊乱，由胰岛素产生不足或对胰岛素敏感性降低导致。胰岛素在胰脏朗格罕氏岛(islets of Langerhans)的β细胞中合成，是体内大多数细胞正常利用葡萄糖所必需的。在患有糖尿病的人中，利用葡萄糖的正常能力受到抑制，从而增加了血糖水平(高血糖症)。有两种不同类型的糖尿病。I型是胰岛素依赖型糖尿病即IDDM。IDDM在以前指的是青少年型糖尿病。在IDDM中，胰脏不分泌胰岛素，必须通过外源来提供。II型成年型糖尿病通常可通过饮食进行控制，但在某些重症病例中需要胰岛素。在20世纪20年代胰岛素被分离之前，大多数患者在疾病发作后短时间内死去。未治疗的糖尿病会导致酮症一酮(脂肪分解的产物)在血液中积聚；随后是具有恶心和呕吐症状的酸中毒(酸在血液中积聚)。随着紊乱的糖代谢和脂肪代谢的毒性产物的持续积累，患者会发生糖尿病昏迷。糖尿病 的治疗一般需要定期地注射胰岛素。这产生显著的、挽救生命的临床改良。然而，由于胰岛素注射的不便，大量努力聚焦于提高胰岛素的给药及生物同化。胰岛素分子由两条通过二硫键连接的氨基酸链组成(mw5804)。胰岛[β ]细胞分泌单链的胰岛素前体——被称为胰岛素原。胰岛素原的蛋白酶解导致4个碱性氨基酸(胰岛素原链的31、32、64和65位:分别为Arg、Arg、Lys、Arg)以及连接(“C，，)多肽被除去。在形成的双链胰岛素分子中，在A链氨基末端具有甘氨酸，在B链氨基末端具有苯丙氨酸。胰岛素可以以单体、二聚体或由三个二聚体形成的六聚体的形式存在。该六聚体与两个Zn2+原子络合。生物活性位于单体中。虽然直至最近几乎只有牛胰岛素和猪胰岛素被用于治疗人糖尿病，但是现有技术已知胰岛素在物种之间的许多不同。猪胰岛素与人胰岛素最相似，它与人胰岛素仅有的不同是B链C末端为丙氨酸残基而非苏氨酸残基。尽管有这些差异，但是大多数哺乳动物胰岛素具有相当的特异性活性。直至最近，动物提取物提供了所有用于治疗该疾病的胰岛素。重组技术的出现使得可以商业规模制造人胰岛素(例如Humulin(TM)胰岛素,可从印第安纳州印第安纳波利斯的Eli Lilly and Company购得)。已经进行衍生胰岛素的尝试来改良其药代动力学性质。在市场上有一种产品，即PEG-膜岛素(PEG-1nsulin) (Nektar Therapeutics)。PEG是一种中性、溶于水的无毒聚合物，它包含任意数目的环氧乙烷的重复单元。设计聚乙二醇化(PEGylation)来增加活性分子大小，并最终通过如下途径来改良药物性能:优化药代动力学；增加生物利用度；以及降低免疫原性和给药频率。PEG-胰岛素的设计和开发在W02004091494中被进一步描述。现有技术已知大量用于产生聚乙二醇化胰岛素衍生物的方法。Davis等人(美国专利4，179,337)描述PEG-胰岛素构建体的合成，他们使用三氯-S-三嗪(三聚氰氯(cyanuric chloride))作为PEG和蛋白之间的衔接物。他们遵循这样的合成方案，即大过量的(50X)三聚氰氯活化的PEG(2000Da)在硼酸盐缓冲液(ρΗ9.2)中与胰岛素反应2小时。该发明的技术能够产生具有部分活性(约50%)的PEG-胰岛素轭合物，这种轭合物是非免疫原性的和非抗原性的。Obermeier等人(加拿大专利1,156,217)发现,依照上文引用的Davis的专利制备PEG-胰岛素轭合物产生了一种包含大约50%的三-PEG-胰岛素的轭合物的不均匀混合物，并且其他可能的PEG-胰岛素衍生物结合物(单-PEG-胰岛素或双-PEG-胰岛素)在残基PheBl位置是未被取代的。Obermeier等人(加拿大专利1，156，217)描述了专门在残基PheBl位置作出改进的PEG-胰岛素轭合物的合成。他们发明的基础涉及，用有机溶剂(例如DMF、DMS0、吡啶等)中的叔丁氧轻基(t-boc)或甲磺酰乙氧羰基(methylsulfonylethyloxycarbonyl) (Msc)在碱性条件下保护残基GlyAl和LysB29位置的活性胺。从(单_、双-及三_)保护的胰岛素的复杂混合物中,通过常规的色谱技术分离了 Ν°Α1，ΝεΒ29-双-保护的胰岛素种类(N.sup..alpha.Al, N.sup..epsilon.B29-bis-protected_insulin species)。在分离之后，将所述纯Ν°Α1，ΝεΒ29-双-保护的胰岛素与活化的(例如酸性氯化物或异氰酸盐)PEG衍生物反应，随后使用肽化学的通用技术去除保护基团。该发明人观察到，GlyAl和LysB29的氨基在碱性反应条件下比PheBl的氨基活性大。他们已经确定，其位点专一性mPEG(1500)-B1-胰岛素轭合物对降低兔的血糖水平有100%的胰岛素效应(基于摩尔数计算)。Geiger等人(1980)和Ehrat等人(1983)描述了专门在残基PheBl位置作出改进的PEG-胰岛素加合物,他们使用的保护/轭合/脱保护法与Obermeier等人、Geiger等人和Ehrat等人描述的多步法相似，并观察到，PEG(1500)-B1-胰岛素轭合物有比天然胰岛素小得多的抗原性以及大得多的稳定性(对于肝酶)。其他PEG-胰岛素制备法(Calicetiet al.，1999; Uchio et al.，1999; Hinds et al.，2002)具有以下特征之一:1)以上文所述的基本的保护/轭合/脱保护三步法为核心，2)形成所述胰岛素分子的非特异性改良，或者3)不能产生最有效的轭合物，即PEG-Bl-胰岛素。Liu等人(美国专利6，323，311 BI)描述了一种可用于合成PEG-Bl-胰岛素轭合物的方法。该方法是Obermeier的保护/轭合/脱保护三步法的外延，但不需要在步骤之间分离反应中间体(即一锅式合成)。因此，将胰岛素在残基GlyAl和LysB29位置保护，立即与PEG反应，随后在分离任何种类之前进行脱保护。该发明人声称，他们的一锅式反应可以得到最多达50%正确位置的异构体(即PEG-Bl-胰岛素)及30%未反应胰岛素，未反应胰岛素可再循环用于后续的衍生化中。假定快速地进行了这些构建体的制备，那也需耗时至少5天才能完成。另外，该发明需要大过量的PEG试剂来得到合意的结果。虽然该发明的产品可能是有效的，但是它们的制备仍需要蛋白质长时间在不利于蛋白质的环境中(高pH和低pH)经历三个反应步骤。申请US2007083006中的发明通过提供一种简单制备高纯度胰岛素衍生物——胰岛素B链的N端(PheBl)在单个步骤中被特异性聚乙二醇化——的方法，克服了现有技术中聚乙二醇化咦岛素的方法的缺陷。与表明在PheBl位置聚乙二醇化为至少可能的反应产物的在先经验(例如Ca liceti et al.，1999,见上文)不同，该专利方法通过控制特异性PH条件，应用金属离子螯合剂并添加有机溶剂，来增强PheBl氨基末端的相对反应性，该PheBl氨基末端变成聚乙二醇化的主要位点。考虑到在残基PheBl位置的位点特异性聚乙二醇化所赋予胰岛素的大量有利性质(例如减少免疫原性/抗原性；增加蛋白水解、化学和物理的稳定性；增加循环半衰期；增加水性的/有机的溶解度；完全生物活性)，用于得到这种结果的简单、低成本且易于规模化的方法将是对现有技术的一项显著进步。由现有技术看来，需要提供这样的改良胰岛素衍生物，即其可用于人和动物治疗，具有优化的稳定性、半衰期和低毒性。我们已发现将PSA连接至胰岛素上会赋予这些性质。聚唾液酸(PSA)是由某些细菌菌株和哺乳动物某些细胞产生的天然存在的无支链的唾液酸聚合物。通过限制性酸解或用神经氨酸酶消化，或者通过对天然的、细菌源形式的聚合物进行分级，可产生各种聚合度的聚唾液酸:从η=约80或更多个唾液酸残基，至下限 η=2。近些年，PSA的生物学性质，特别是α -2，8_连接的均聚聚唾液酸的生物学性质，被用于改良蛋白质和低分子量药物分子的药代动力学性质。聚唾液酸衍生化使许多治疗型蛋白包括过氧化氢酶和天冬酰胺酶的循环半衰期得到了显著的提高，并且使得在应用这些蛋白质时不用考虑已经存在的抗体，这些抗体是先前暴露于该治疗型蛋白而产生的一种不需要的(而且有时是不可避免的)结果[Fernandes and Gregoriadis, 1996andl997]。所述α -2，8-连接的聚唾液酸成为了使人关注的PEG替代物，它作为人体的天然部分是免疫系统不可见的生物可降解聚合物，而且可由组织神经氨酸酶降解为唾液酸，而唾液酸是一种无毒的糖类。我们在以前已经描述了将多糖(特别是PSA)连接到治疗药剂如蛋白质上的方法[US-A-5846，951;WO-A-0187922]。这些方法中有一些是依赖于聚合物‘非还原端’的化学衍生化来产生在伯胺基位置反应的蛋白质反应活性醛基部分。由于含有邻二醇，非还原的唾液酸末端单元可以容易地(且选择性地)被高碘酸盐氧化而生成单醛形式，这种形式与蛋白质的反应活性更高，并且含有适宜的活性元件，用于通过还原性氨基化和其他化学作用将蛋白质连接。这一反应在
图1 和图2中进行了阐述，其中:图1显示了用高碘酸钠氧化多聚唾液酸(colominic acid)(源自大肠杆菌的α _2，8-连接的PSA)，从而在非还原端形成一个有蛋白质活性的醛，和图2显示了用氰基硼氢化钠选择性地还原希夫碱，从而与蛋白质氨基生成一个稳定、不可逆的共价键。本发明人在以前的出版物(例如Biochimica et Biophysica Acta(2003))已描述了聚唾液酸化咦岛素的合成。在该参考文献中，22kDa和39kDa多聚唾液酸被氧化，并与重组人胰岛素的氨基反应。所使用CA的多分散度为1.33和1.40，这样的多分散度对于治疗用途来说是太大的。在我们以前的专利申请(以W02005/016974公开)中，我们还描述了胰岛素-多聚唾液酸轭合物的合成。然而，在该申请中，所述轭合物并非都具有特异性N末端，从而形成了多种轭合物。例如，在上述常规轭合反应过程中，通过多聚唾液酸与氨基酸侧链的反应可能产生预期之外的副产物。这对于制备化学结构已知的轭合物来说足以成为问题，而化学结构已知的轭合物是监管机构对人和动物治疗用途所要求的。从多种预期之外的产物中纯化预期的反应产物(例如单多聚唾液酸化的产物)是不容易做到的，这是因为大多数的反应产物的物理化学性质是类似的。这意味着，诸如离子交换色谱和凝胶渗透色谱(它们分别基于电荷和大小进行分离)的技术将产生较弱的纯化P曰。根据本发明的第一方面，我们提供了包含蛋白质的多糖衍生物群的组合物，其中所述蛋白质为胰岛素或胰岛素样蛋白质，所述多糖是阴离子型并包含2-125个糖单元，并且其中所述群基本上仅由所述蛋白质的N末端衍生物组成。在下文中使用术语胰岛素时。我们还意在涵盖胰岛素样蛋白质。我们所指的胰岛素样蛋白质是指具有与胰岛素等效活性的蛋白质。胰岛素通常降低血糖浓度。它还增加单糖、氨基酸和脂肪酸的细胞通透性，并加速糖酵解、戊糖磷酸循环和肝中的糖原合成。优选地，胰岛素样蛋白质具有至少35%(更优选至少50%)的Swissprot登记号为P01308的人胰岛素的活性。还可以使用上文详细描述的具有必需活性的胰岛素突变体。“胰岛素样”蛋白质还可以指“胰岛素同源物”。两个序列是否是同源的可使用相似性或同一性百分数来常规地进行计算，术语相似性和同一性在本领域中是熟知的。应将序列与SEQ 1.D.N0.1比较，后者是未加工的人胰岛素前体。残基25-54对应于胰岛素B链，90-110残基对应于胰岛素A链。同源序列还可以与活性类型的人胰岛素比较。同源优选具有等于或大于50%的核酸水平或氨基酸水平的相似性或同一性，更优选等于或大于60%、70%、80%，更优选等于或大于90%，例如95%或99%的核酸水平或氨基酸水平的相似性或同一性。现有的多种程序可计算相似性或同一性；优选的程序为BLASTn、BLASTp和BLASTx程序，以默认参数运行,可从www.ncb1.nlm.nih.gov获取这些程序。例如，可以使用默认参数(score(分值)=100、word length(字长)=ll、expectation value(期望值)=11、lowcomplexity filtering(低复杂性过滤)=on(开))的BLASTn程序比较两个氨基酸序列。使用这些默认参数计算上述的同源性水平。所述胰岛素可以是天然的，即源自人或动物，或者是合成的，例如通过重组方法制备的。如本领域中所熟知的，胰岛素包含两条肽链。优选地，本发明中的所述胰岛素是在其B链的N末端被多糖衍生的。我们所指的“群”是在所述组合物中有多于一种的多糖衍生物。所述衍生物可包含相同或不同数目的糖单元。优选地，在所述组合物中的多糖的多分散度低于1.3，更优选低于1.1。在所述群中，基本上所有蛋白都仅在N末端被衍生化。因为在胰岛素中有两条肽链，所以有两个N末端单元。在所述群中，优选至少85%、更优选至少90%、最优选至少95%的B链在N末端被阴离子多糖衍生化。所述A链的N末端无需被衍生化。可以使用本领域中的标准技术例如肽图谱(peptide mapping)或埃德曼降解(Edman Degradation)确定所述N末端的衍生化程度。优选地，所述多糖具有至少2个，更优选至少5个，最优选至少10个例如至少50
个的糖单元。所述阴离子多糖优选选自聚唾液酸、肝素、透明质酸和硫酸软骨素。优选地，所述多糖是聚唾液酸并且基本上仅由唾液酸单元组成。然而，在所述多糖分子中可以有唾液酸之外的单元。例如， 唾液酸单元可以与其他糖单元交替出现。然而，所述多糖优选基本上仅由唾液酸单元组成。
优选地，所述多糖具有一个末端唾液酸基团，并且如上文详细描述的，更优选为一个聚唾液酸，它是包含至少2个通过α -2-8或α -2-9键相互连接的唾液酸单元的多糖。适宜的聚唾液酸具有的重量平均分子量介于2-100kDa之间，优选介于l-35kDa之间。最优选的聚唾液酸具有的分子量介于10-20kDa之间，通常约14kDa。最优选的,所述聚唾液酸来源于细菌，例如来自大肠杆菌K1、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)、液化性摩拉克氏菌(Maraxella Iiquefaciens)或铜绿巴斯德杆菌(Pasteurella aeruginosa)的多糖 B,或者来自大肠杆菌株K92的K92多糖。最优选来自大肠杆菌Kl的多聚唾液酸。所述阴离子多糖优选聚唾液酸)可以为盐的形式或者为游离酸的形式。它可以为水解的形式，从而使得从细菌源回收后分子量已降低。所述多糖(优选聚唾液酸)可以是具有很宽分子量范围的材料，例如具有超过1.3例如高达2或更高的多分散度。优选地，所述分子量的多分散度小于1.3或1.2,优选小于1.1,例如低至1.01。本发明的化合物通常为胰岛素的聚唾液酸衍生物，并包含2-125个唾液酸单元。所述化合物更常见包含10-80个唾液酸单元，优选20-60个唾液酸单元，最优选40-50个唾液酸单元。在本发明的第一方面中的所述多糖衍生物可以是在胰岛素N末端和阴离子多糖之间共价连接的轭合物。所述多糖和所述胰岛素之间的其他联合方式包括静电吸引。但优选共价结合。所述共价键可以是羧基和胺基之间的酰胺键。所述胰岛素可共价结合于所述多糖的另一种键是通过希夫碱。用于轭合胺的合适基团在W02006/016168中有进一步的描述。在本发明中，所述多糖可以是天然存在的多糖，或者天然存在多糖的衍生物，例如通过糖残基上一个或多个活性基`团的反应所衍生的多糖，或者在多糖链末端已共价连接有衍生基团的多糖。 所述多糖可以经其还原的或非还原的末端单元连接至所述胰岛素上。用于将多糖连接至蛋白质的方法是本领域中熟知的，并且在W092/22331和WO-A-0187922中有更详细的描述。在本发明中优选的方法在下文有更详细的描述。在本申请的图1和图2中也描述了这些方法。所述多糖可以经其还原末端单元及非还原末端单元连接至所述胰岛素上。这意味着一个多糖链可连接有两个胰岛素蛋白质，即在其还原末端和非还原末端都被衍生。所述多糖可直接连接至所述胰岛素肽(即如图1和图2中所示)，或者经一个衔接物连接至所述胰岛素肽。合适的衔接物来自N-马来酰亚胺、乙烯基砜、N-碘乙酰胺、正批唳(orthopyridyl)或含N-轻基琥拍酰亚胺的试剂。所述衔接物还可以是生物稳定的或生物可降解的，并包含例如多肽或合成的寡聚物。所述衔接物可来自双官能部分，如W02005/016973中进一步描述的。合适的双官能试剂为例如Bis_NHS。该试剂可以具有通式Z-R1-Z，其中每个Z为可以相同或不同的官能基团，R1为双官能有机基。优选地，R1选自烷二基(alkanediyl)、亚芳基(arylene)、烧亚芳基(alkarylene)、杂亚芳基(heteroarylene)和烧基杂亚芳基(alkylheteroarylene),它们中的任一个都可被羰基、酯、硫化物、醚、酰胺和/或胺键取代及/或间断。特别优选C3-C6烷二基。R1最优选对应于所述合适的双官能试剂的适当部分。优选的多糖衍生物具有通式(I)
权利要求
1.一种包含蛋白质的多糖衍生物群的组合物，其中所述蛋白质为胰岛素或胰岛素样蛋白质，所述多糖包含2-125个糖单元，并且其中至少85%的所述蛋白质的衍生物群仅在B链的N末端衍生化， 其中所述胰岛素样蛋白质是胰岛素在核酸或氨基酸水平上具有90%或大于90%的序列相似性或同一性的同源物。
2.根据权利要求1的组合物，其中至少90%的所述蛋白质的衍生物群仅在B链的N末端衍生化。
3.根据权利要求2的组合物，其中至少95%的所述蛋白质的衍生物群仅在B链的N末端衍生化。
4.根据权利要求1-3任一项的组合物，其中所述胰岛素或胰岛素样蛋白质被所述多糖在所述多糖的还原末端单元衍生化。
5.根据权利要求1-3任一项的组合物，其中所述多糖衍生物具有通式(I)
6.根据权利要求5的组合物，其中L是一个键或者一个一
7.根据权利要求1-3任一项的组合物,其中所述多糖的多分散度低于1.3。
8.根据权利要求7的组合物，其中所述多糖的多分散度低于1.2。
9.根据权利要求8的组合物，其中所述多糖的多分散度低于1.1。
10.根据权利要求1-3任一项的组合物，所述组合物是一种药物组合物并且包含一种或多种可药用赋形剂。
11.根据权利要求1-10任一项的组合物用于治疗糖尿病的用途。
全文摘要
本发明涉及一种包含蛋白质的多糖衍生物群的组合物，其中所述蛋白质为胰岛素或胰岛素样蛋白质，所述多糖是阴离子型并包含2-125个糖单元，并且其中所述群基本上仅由所述蛋白质的N末端衍生物组成。所述多糖通常为PSA。本发明还涉及包含所述新型化合物的组合物，以及用于制备该新型化合物的方法。
文档编号A61K38/28GK103169984SQ20131002263
公开日2013年6月26日 申请日期2007年7月25日 优先权日2006年7月25日
发明者S·杰因, 张荣升 申请人:利普生技术有限公司