专利名称：从地皮菜中提取抗肠癌活性蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质的提取，具体属于从地皮菜中提取抗肠癌活性蛋白的方法。
背景技术：
地皮菜，又名地耳、地衣、地木耳、地软儿、地瓜皮等，是真菌和藻类的结合体。在山西有很高的产量。一般生长在多雨潮湿的地方，暗黑色，有点像泡软的黑木耳。地皮菜富含蛋白质、多种维生素和磷、锌、钙等矿物质。以色列魏茨曼研究所的科学家们研究发现，地皮菜所含的一种成分可以抑制人大脑中的乙酰胆碱酯酶的活性，从而能对老年痴呆症产生疗效。地皮菜还具有很好的营养保健价值1.降脂明目，是一种很好的低脂肪营养保健菜， 能降脂减肥，对目赤、夜盲、脱肛等病症有一定疗效。2.补充营养，地耳含有丰富的蛋白质、 钙、磷、铁等，可为人体提供多种营养成分，具有补虚益气，滋养肝肾的作用。3.清热解毒， 内服外用，可辅助治疗烧伤、烫伤及疮疡肿毒。
经对现有文献的检索，未见关于地皮菜抗肿瘤活性蛋白的报道。发明内容
本发明的目的在于提供一种从地皮菜中提取具有抗肠癌活性的蛋白以及提取方法，该方法简单易行、成本低。
本发明提供的一种从地皮菜中提取的具有抗肠癌活性的蛋白，是地皮菜经PBS缓冲液提取，硫酸铵分离沉淀，Q-阴离子柱纯化，得到的分子量为35-40kDa的活性蛋白。
本发明提供的一种从地皮菜中提取具有抗肠癌活性蛋白的方法，包括如下步骤
第一步将地皮菜粉碎后，加入PBS缓冲液，4°C下搅拌、浸泡12-16小时，离心后取上清液，即为地皮菜蛋白粗提液；
第二步将_20°C预冷的丙酮加入地皮菜蛋白粗提液，沉淀蛋白，离心，收集沉淀，-20°C下放置30-60min完全挥发丙酮，冷冻干燥，即得到地皮菜粗蛋白；
第三步将地皮菜粗蛋白用PBS缓冲液溶解，离心后取上清液，加入10%和60%饱和度的两种硫酸铵粉末，充分搅拌后静置，分级沉淀蛋白，离心；收集10%至60%硫酸铵粉末饱和度区段的沉淀，用PBS缓冲液溶解、透析、浓缩即得到地皮菜抗肠癌活性蛋白的粗提液；
第四步将地皮菜抗肠癌活性蛋白的粗提液，过Q-阴离子柱，收集穿透液即得到具有抗肠癌活性的蛋白。SDS-PAGE电泳检测表明，该穿透液经过Q柱纯化后所得样品有一条明显主带。
所述的PBS 缓冲液，其含 O. 80%NaCl、0. 2gKCl、3. 63gNa2HP04 · 12H20、 O.24gKH2P04, ρΗ7· 4。
所述的第一步中，加入地皮菜粉末3-6倍体积的PBS缓冲液。
所述的第三步中，透析用的透析袋的规格为MD34，截留分子量为3000。
所述的第三步中，浓缩用的浓缩管的体积为50ml，截留分子量为3000。
本发明获得的一种活性蛋白，采用SDS-PAGE凝胶电泳技术，通过与标准分子量比对，地皮菜抗肠癌活性蛋白的分子量为35-40kDa。
该活性蛋白经体外抗肿瘤活性检测，该蛋白具有良好的抗大肠癌细胞的活性，对大肠癌细胞增殖有明显抑制作用，而对正常细胞没有明显毒副作用。
本发明提供的从地皮菜中提取具有抗肠癌活性的蛋白的方法，简单易行、成本低。 在本发明的基础上，可将该地皮菜活性蛋白制备成抗癌药物或保健品，服务于人类健康。
图1实施例1经Q阴离子柱纯化后所得的地皮菜抗肠癌活性蛋白SDS-PAGE电泳图
图2地皮菜活性蛋白对DLDl、SW620、HL-7702细胞生长的影响具体实施方式
实施例1 :
地皮菜抗肠癌活性蛋白的制备方法，步骤如下
(I)将天然地皮菜烘干，用粉碎机粉碎成粉末。
(2)取25g地皮菜粉末，加入400ml的PBS缓冲液，置于搅拌器上搅拌，4°C过夜浸泡12小时，IlOOOrpm离心25min，取上清液，滤渣再次加入150ml的PBS缓冲液，同上操作， 合并两次提取液即为地皮菜蛋白粗提液。
(3)将(2)中获得的地皮菜蛋白粗提液中缓慢加入2倍体积_20°C下预冷的丙酮， 缓慢搅拌，然后将其置于_20°C下沉淀I小时，IIOOOrpm离心30min，弃上清，收集沉淀，将沉淀置于_20°C下30min，完全挥发丙酮，将沉淀冷冻干燥，即得地皮菜粗蛋白48mg。
(4)将(3)得到的地皮菜粗蛋白用pH7. 4的PBS缓冲液溶解，离心后取上清液， 向溶液中逐渐缓慢加入硫酸铵粉末，当饱和度达到10%后，4°C放置30min，IlOOOrpm离心 30min,弃沉淀，收集上清。将上清液中再缓慢加入硫酸铵固体,达到60%的饱和度后，室温放置30min，IlOOOrpm,离心30min，收集沉淀。将沉淀用PBS缓冲液溶解、透析、浓缩即得地皮菜抗肠癌活性粗蛋白。
(5)将含地皮菜抗肠癌蛋白的粗提液，用Q阴离子柱交换层析，依次用含有0、0.1、O.2、0. 3 和 O. 5mol/LNaCl 的 pH8. 0、20mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液洗脱，紫外检测仪于 280nm 波长处检测，收集穿透液，获得地皮菜抗肠癌活性蛋白。该活性蛋白SDS-PAGE电泳图(见图1)。
实施例2
将处于对数生长期的DLDl、SW620、HL-7702细胞，以I X IO4个/孔传入96孔培养板。37。C含5%的CO2培养箱孵育24h后，分别加入浓度为O. 08,0. 16,0. 24,0. 32mg/ml 的地皮菜活性蛋白，设五个复孔，并用PBS缓冲液作为对照。孵育48h后吸弃孔内培养基， 用PBS洗涤2次后加入新的培养基，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 201，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入1501 DMS0，摇床振荡lOmin，使结晶物充分溶解。 于570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。
本发明所得地皮菜活性蛋白，对人大肠癌细胞株进行上述体外抗肿瘤活性检测，当蛋白含量为8、16、24、32 μ g时，处理DLDU SW620、HL-7702细胞各48h ;当含量为24 μ g 时，对DLDl细胞生长的抑制率最大为 40% ;当含量为32 μ g时，对SW620细胞生长抑制率最大为32% ;而对人正常肝细胞HL-7702生长基本无影响(见图2)。
权利要求
1.一种从地皮菜中提取的具有抗肠癌活性的蛋白，特征在于，它是地皮菜经PBS缓冲液提取，硫酸铵分离沉淀，Q-阴离子柱纯化，得到的分子量为35-40kDa的活性蛋白。
2.一种从地皮菜中提取具有抗肠癌活性蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤 第一步将地皮菜粉碎后，加入PBS缓冲液，4°C下搅拌、浸泡12-16小时，离心后取上清液，即为地皮菜蛋白粗提液；第二步将-20°C预冷的丙酮加入地皮菜蛋白粗提液，沉淀蛋白，离心，收集沉淀，-20°C下放置30-60min完全挥发丙酮，冷冻干燥，即得到地皮菜粗蛋白；第三步将地皮菜粗蛋白用PBS缓冲液溶解，离心后取上清液，加入10%和60%饱和度的两种硫酸铵粉末，充分搅拌后静置，分级沉淀蛋白，离心；收集10%至60%硫酸铵粉末饱和度区段的沉淀，用PBS缓冲液溶解、透析、浓缩即得到地皮菜抗肠癌活性蛋白的粗提液； 第四步将地皮菜抗肠癌活性蛋白的粗提液，过Q-阴离子柱，收集穿透液即得到具有抗肠癌活性的蛋白。
3.如权利要求2所述的一种从地皮菜中提取具有抗肠癌活性蛋白的方法，其特征在于，所述的 PBS 缓冲液，含 O. 80%NaCl、0. 2gKCl、3. 63gNa2HP04 ·12Η20、0. 24gKH2P04, ρΗ7. 4。
4.如权利要求2所述的一种从地皮菜中提取具有抗肠癌活性蛋白的方法，其特征在于，所述第一步中PBS缓冲液的加入量为地皮菜粉末体积的3-6倍。
5.如权利要求2所述的一种从地皮菜中提取具有抗肠癌活性蛋白的方法，其特征在于，所述第三步中透析用的透析袋规格为MD34，截留分子量为3000。
6.如权利要求2所述的一种从地皮菜中提取具有抗肠癌活性蛋白的方法，其特征在于，所述第三步中浓缩用的浓缩管的体积为50ml，截留分子量为3000。
全文摘要
本发明提供了一种从地皮菜中提取具有抗肠癌活性的蛋白及其提取方法，是将纯天然地皮菜粉碎，加入PBS缓冲液低温过夜提取，随后加入预冷的丙酮低温处理，得到地皮菜粗蛋白提取液。在粗蛋白提取液中加入不同饱和度的硫酸铵粉末，分级沉淀蛋白，其中饱和度为10%-60%的硫酸铵沉淀中含地皮菜抗肠癌活性蛋白；再将该粗蛋白进行Q阴离子柱纯化，穿透液中含有效活性蛋白。用该蛋白处理大肠癌细胞48小时，IC50值约为35μg，而对正常细胞生长无明显毒副作用，该蛋白可有效抑制大肠癌细胞增殖。
文档编号A61P35/00GK103059112SQ20131002351
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者李卓玉, 晋小婷, 宋莉, 赵君宇, 李砧, 李文玲, 郭松佳 申请人:山西大学