专利名称：一种抑癌肽基因重组及其抗肿瘤应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体是基因重组具有潜在抑癌作用的一段多肽并验证其抑癌功能。
背景技术：
恶性肿瘤又称癌症，已成为危害人类健康的主要疾病，据统计2008年全世界约有1270万癌症新增患者，760万死于癌症，尤其在发展中国家，癌症新增例数达56%。因此，加强治疗肿瘤的研究，探索新的治疗途径具有十分重要的意义。在癌症进展过程中，某些基因的表达发生变化，是癌症发生发展的关键基因，成为癌症治疗的潜在靶点。我们 发现肿瘤组织中的表达蛋白缺少某段多肽序列后不仅丧失了抑癌功能并且促进肿瘤生长，故推测此多肽具有抑癌效应。所以，在此发明中我们利用基因重组技术，将35个氨基酸(amino acid)多肽对应的DNA序列重组到pcDNA3.1真核表达载体。经酶切和序列分析证明重组成功后，将此真核表达重组多肽转染到肿瘤细胞，免疫印迹证明多肽的蛋白表达，实现了多肽的重组。将表达多肽序列的重组真核载体转染到肿瘤细胞和动物体内的肿瘤组织中，证明其独特的抑制肿瘤生长和抑制肿瘤发生的抗肿瘤效应。发明为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。
发明内容
本发明是基于肿瘤发生特点和治疗难点，通过抗肿瘤基因治疗途径发明一段重组多肽，证明其具有抗肿瘤的应用价值，并提供一段抑癌肽的特异的蛋白序列和核酸序列。本发明利用生物工程技术,基因重组一段35个氨基酸(amino acid)多肽对应的DNA序列到pcDNA3.1真核表达载体。经酶切和序列分析证明重组成功后,将此真核表达重组多肽转染到肿瘤细胞，免疫印迹证明多肽的蛋白表达，实现了多肽的重组。接着对多肽的抗肿瘤功能进行了研究，细胞学和小鼠体内实验表明此多肽具有抑制肿瘤细胞活性和抑制小鼠成瘤模型的发生与生长的重要抗癌功能。本发明的多肽重组表达质粒是将此多肽对应DNA序列连接进pcDNA3.1真核表达载体，多肽的氨基酸序列和对应DNA序列见SEQ ID N0.1和N0.2。第一步，重组肽的克隆载体构建
提取人的mRNA，体外逆转录成cDNA，以此为模板，通过PCR方法扩增得到的目的片段与pGEMT-easy载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。第二步:重组肽真核表达载体构建及其表达检测
将克隆质粒和质粒PCDNA3.1双酶切后，利用回收试剂盒获得目的片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组真核表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定；将正确连接的多肽真核表达载体转染LNCaP细胞，48小时后搜集样品，免疫印迹结果证明了此多肽的表达。
第三步:多肽抗肿瘤功能的检测
1.细胞学实验
将重组肽真核表达质粒转染肿瘤细胞后，48小时后检测细胞活性，MTT结果显示此多肽具有显著抑制肿瘤细胞增殖的显著作用
2.小鼠体内成瘤模型
转染重组肽真核表达载体后，构建小鼠皮下肿瘤模型，15天后皮下生长肿瘤，隔日测量肿瘤大小，绘制生长曲线，25天后，处死小鼠，剥离肿瘤，称量重量，实验结果显示此多肽显著抑制肿瘤细胞生长。
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图1.35aa多肽对应DNA序列PCR结果 图2.35aa多肽克隆质粒鉴定 图3.35aa多肽重组真核表达载体酶切鉴定结果 图4.检测35aa多肽的表达，大小为4KD 图5A.MTT实验检测35aa多肽抑制LNCaP细胞增殖 图5B.MTT实验检测35aa多肽抑制DU细145胞增殖 图6A.小鼠成瘤模型肿瘤生长曲线图 图6B.小鼠成瘤模型肿瘤生长大小图。
具体实施方式
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实施例一:35aa多肽重组
1.重组肽的克隆载体构建`
提取人的mRNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板，上游引物为5’ -GGATCCAGATGGTAGGCTCCCCTGGTCCTCTA (含 BamHI 酶切位点)；下游引物为 5’ -CTCGAGTCACTGGGGCAGAGGGGG (含XhoI酶切位点)，应用PCR技术成功扩增出35aa对应的105bp的mRNA序列[图1]。扩增得到的片段与pGEMT-easy载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5 α中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以ECORl酶切鉴定[图2]
2.重组肽的真核表达载体构建
将含有35aa多肽核酸片段的pGEMT-easy质粒经ECORl酶切后，利用回收试剂盒获得该片段，同时用相同的酶处理质粒PCDNA3.1 (约5kbp)，然后将回收多肽核酸片段和经酶切的载体pcDNA3.1在T4 DNA连接酶作用下于16°C连接过夜。酶切鉴定重组体，结果显示该pcDNA3.1片段正确[图3]
3.重组肽的表达鉴定
将正确连接的35aa多肽真核表达载体转染LNCaP细胞，48小时后搜集样品，RIPA细胞裂解液裂解，免疫印迹结果证明了此多肽的表达[图4]
实施例二:重组肽抗肿瘤功能的检测
1.MTT实验证明重组肽细胞水平的抗肿瘤效应
以前列腺癌细胞为例，将前列腺癌细胞LNCaP和DU145分别以20000个/孔的密度接种于96孔培养板,利用Lipofectamin 2000 kit将35aa多肽真核表达载体和其它对照组瞬时转染LNCaP和DU145细胞，48小时后每孔加入IOul 5mg/ml的MTT (MTT用PBS配制，过滤除菌，分装在4°C保存)，4小时后，弃培养基，加入150ul/孔DMS0，震荡IOmin,在490nm测量吸收值。吸收值大小反映了细胞活性，根据实验数据，以时间为横坐标，吸收值为纵坐标做图。MTT结果显示与空载对照相比，35aa多肽真核表达实验组显著抑制了激素依赖性和激素非依赖性前列腺癌细胞的增殖，抑制率达60%以上，如[图5A]和[图5B]前两组柱形图所示。我们也发现了其对包括乳腺癌、结肠癌的多种肿瘤细胞的生长抑制效应，而对人胚肾细胞HEK293，重组肽无细胞毒性
我们又通过另外角度设置对照，同时分别转染包含或缺失此35aa多肽的两个剪切型蛋白来证明此序列对肿瘤生长抑制的必要作用。结果显示，表达包含此多肽的剪切型蛋白显著抑制了前列腺癌细胞的增殖，而缺失此35aa多肽蛋白丧失了抑癌作用，如[图5A]和[图5B]后两组柱形图所示，进一步证明了此35aa多肽显著的抑制肿瘤细胞增殖的功效
2.小鼠成瘤模型证明重组肽体内水平的抗肿瘤效应
以前列腺癌细模型为例，将小鼠前列腺癌细胞RM-1在37°C、95%湿度和5%C02孵箱中培养，利用Lipofectamin 2000 kit将35aa多肽真核表达载体和其它对照组转染RM-1，继续培养48小时后，胰酶消化细胞，无血清DMEM培养基重悬细胞，搜集I X IO6细胞，注射C57小鼠皮下，正常饲养小鼠15天后，观察到皮下开始生长肿瘤，隔天测量肿瘤大小，绘制生长曲线，25天后肿瘤长到一定大小，处死小鼠，剥离肿瘤，称量重量并拍照。实验结果显示，与空载对照组相比，最显著的是转染35aa多肽真核表达载体实验组肿瘤模型始终不能生长，如肿瘤生长曲线图[图6A]和肿瘤生长大小图[图6B]所示，表明此35aa多肽具有显著地抑制肿瘤模型生长的功效
我们又通过另外角度设置对照，证明表达包含35aa多肽的剪切型蛋白能够抑制肿瘤模型生长，而缺失35aa多肽的剪切型蛋白则丧失了抑制肿瘤模型生长的功能，进一步证明了此多肽的抑制肿瘤模型生长的作用[图6]。
权利要求
1.一段抑癌基因编码蛋白序列重组到真核表达载体，其特征为重组人PIAS3 87-121位氨基酸到真核表达载体；重组蛋白序列是PIAS3基因Exon2的特异表达序列，长为35aa多肽，重组蛋白产物具有体内和体外抗肿瘤活性；发明保护重组抑癌多肽序列为:
2.一种如权利I所述抑癌基因编码蛋白序列的真核表达载体，其特征在于将PIAS3Exon2 35aa的核酸序列与pcDNA3.1载体连接而成,该真核重组质粒具有抑制体内和体外肿瘤细胞生长的功效；保护具有抗肿瘤功能多肽对应的核苷酸序列，如下:
3.保护根据权利1、2所述抑癌基因编码蛋白序列和核酸序列的抗肿瘤活性；包括保护此抑癌基因多肽(35aa)序列的蛋白序列和核酸序列和其序列的重组表达质粒，抗肿瘤活性包括抑制癌细胞体外生长和抑制小鼠肿瘤模型生长在内等所有序列有关的肿瘤抑制效应。
全文摘要
本发明是基于肿瘤发生特点和治疗难点，通过抗肿瘤基因治疗途径发明一段重组多肽，证明其具有抗肿瘤的应用价值，并提供一段抑癌肽的特异的蛋白序列和核酸序列。利用生物工程技术基因重组一段35个氨基酸(aminoacid)多肽对应的DNA序列到pcDNA3.1真核表达载体。细胞学和小鼠成瘤模型实验表明此重组多肽具有抑制肿瘤细胞活性和抑制小鼠成瘤模型的发生与生长的重要抗癌功能。发明为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。
文档编号A61P35/00GK103114104SQ20131004586
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者李晓萌, 姜春娃, 赵兵, 秦辉, 王娟婧 申请人:东北师范大学