用于治疗呈现存活蛋白抗原的肿瘤的组合物和方法

专利名称：用于治疗呈现存活蛋白抗原的肿瘤的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于肿瘤治疗的疫苗接种方案。具体地，本发明涉及疫苗组合物，其在人中刺激对人存活蛋白的免疫应答，因此攻击过量表达存活蛋白的肿瘤患病细胞。具体地，本发明涉及疫苗组合物，其包含来自非哺乳动物存活蛋白以及来自修饰的哺乳动物的特别是人的存活蛋白的肽。
背景技术：
免疫系统通过监控细胞的蛋白质组成来部分地实现了其监视功能。在称作T细胞抗原呈递的过程中，细胞内的蛋白质被加工为肽。加工的肽的亚组(抗原)被运出至细胞表面，与一类受体的成员特异性结合，所述一类受体被称作主要组织相容性复合体(MHC)受体。这些MHC肽复合体通过与已知为T细胞受体(TCR)的T细胞表面蛋白质相互作用，由特化的免疫细胞T细胞取样。每个给定的T细胞在其表面携带独特的TCR。当T细胞的TCR与MHC-肽复合体产生性相互作用时，免疫应答被活化，这导致呈递特定MHC-肽复合体的细胞的消除。通常，如果呈递的抗原来自宿主(所谓的“自身”抗原)，相互作用为非生产性的。一般地，免疫应答由与来自外源蛋白质的抗原的相互作用来活化，例如与来自感染病毒的组成性蛋白质的抗原相互作用来活化。通过活化免疫治疗肿瘤的目的是诱导免疫系统识别和消除肿瘤细胞。正如在任何其他细胞中，肿瘤细胞上的肽抗原来自表达的蛋白质的所有组成成分(repertoire)。正如病毒抗原在受感染的细胞中一样，来自肿瘤中差别表达的蛋白质的肿瘤富含的抗原原则上是免疫监视的靶标。因此，为了消除肿瘤的目的，所述抗原可以被用来控制免疫系统的分支，其已经被进化为对抗细胞内感染。一种此类肿瘤富含的蛋白质是存活蛋白。肿瘤细胞通常过量表达存活蛋白蛋白质，这被认为阻断了细胞凋亡并且因此干扰阻止肿瘤细胞异常生长的机制。另一方面，正常细胞表达非常少的存活蛋白。(见例如，Ambrosini等人，(1997)Nat.Med.,3:917-921)。因此，存活蛋白是理想的肿瘤特异性或肿瘤富含的抗原。可以有用地将存活蛋白蛋白质的抗原形式递送到抗原呈递细胞，从而可以刺激对存活蛋白的免疫应答。但是，与病毒感染的细胞相反，存活蛋白与许多其他在肿瘤中差别表达的蛋白质类似，是宿主蛋白质，并且不活化免疫系统。因此，在本领域中仍需要开发引发针对肿瘤细胞，特别是特征为过量表达存活蛋白的那些肿瘤细胞的有效免疫应答的有效组合物和方法。发明概述本发明提供了引发针对肿瘤细胞的有效免疫应答的有效组合物和方法。具体地，本发明提供了使用肿瘤富含的蛋白质的 抗原形式作为T细胞抗原的接种方案。特别地，本发明提供了肿瘤富含的蛋白质存活蛋白的抗原形式。因此，本发明一方面涉及包含核酸的疫苗，所述疫苗编码至少一种来自非哺乳动物存活蛋白的肽。备选地，本发明涉及包括至少一种来自非哺乳动物存活蛋白的肽的疫苗。如本文所用的，“非哺乳动物存活蛋白”包括至少任何具有BIR结构域(或IAP结构域)的存活蛋白蛋白质，所述结构域与人存活蛋白BIR结构域具有多于50%的氨基酸同一性但是少于90%的氨基酸同一性，例如与人存活蛋白BIR结构域具有至少55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的同一性。“非哺乳动物存活蛋白”还包括在本领域普通技术人员已知的非哺乳动物物种中鉴定的任何存活蛋白蛋白质。如本文所用的，“肽”包括具有任何数量氨基酸的肽，包括全长存活蛋白蛋白质。特别地，肽可以包含至少8、9、10、15、20、25、30或更多个氨基酸。在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗包括编码来自非哺乳动物存活蛋白的肽的核酸。核酸可以包括哺乳动物启动子。在一个实施方案中，核酸是裸DNA。在另一个实施方案中，核酸是用增强哺乳动物细胞转染的试剂配制的。本发明的疫苗还可以包括佐剂。在一个实施方案中，核酸是病毒颗粒例如腺病毒颗粒的一部分。适合于本发明的腺病毒颗粒包括来自能够复制的腺病毒的那些，或来自条件复制腺病毒(“CRAD”)(仅在某些细胞或仅在某些条件中复制)的那些，或来自无能力复制的腺病毒的那些。其他适当的病毒颗粒包括但不限于来自慢病毒或其他RNA病毒、腺伴随病毒、轮状病毒或痘苗病毒等的病毒颗粒。

在一个实施方案中，疫苗包括含有核酸的细菌。优选地，细菌是肠细菌，如沙门氏菌属(Salmonella)、埃希氏菌属(Escherichia)或克雷伯氏菌属(Klebsiella)。其他细菌(例如利斯特菌属物种(Listeria species))也可以用来作为此类核酸的宿主。细菌可以是野生型细菌或可以包含突变，所述突变例如减轻了其致病性。通常，优选使用细菌的突变形式，例如营养缺陷型。在另一个优选的实施方案中，本发明的疫苗编码或包括来自非哺乳动物存活蛋白的肽。优选地，来自非哺乳动物存活蛋白的肽包括BIR结构域。通常，来自非哺乳动物存活蛋白的BIR结构域与人存活蛋白BIR结构域具有多于50%的氨基酸同一性，但是少于80%的氨基酸同一性。非哺乳动物存活蛋白来自鸟、鱼、爬行动物、两栖动物或其他脊椎动物。在优选的实施方案中，非哺乳动物存活蛋白来自鸡。在一些实施方案中，本发明的疫苗编码或包括来自非哺乳动物存活蛋白的肽，其具有促进T细胞抗原呈递的突变。例如，非哺乳动物存活蛋白突变肽可以在对应于人存活蛋白Asn97、Thr99、Vall00、或GlnlOl的位置处包含氨基酸取代。更具体地，来自鸡或其他物种的非哺乳动物存活蛋白可以包含下列氨基酸取代之一:N97E、T99M、V100L或Q101G。在另一实例中，来自蛙SIX存活蛋白的肽包含在等价位置ThrllO和/或Serl 12的取代。在具体的实例中，来自蛙SIX存活蛋白的肽包含取代ThrllOMet和/或Serll2Gly。在其他实施方案中，本发明的疫苗编码或包含来自非哺乳动物存活蛋白的肽，其具有可能消除BIR结构域生物学活性的突变。例如，来自非哺乳动物存活蛋白的肽可以包含在对应于人存活蛋白Argl8、Cys57、Cys60、His77或Cys84的位置处的至少一个氨基酸取代。另外，非哺乳动物存活蛋白可以任选地包含氨基酸缺失。在一个实例中，非哺乳动物存活蛋白部分包含C端缺失。在另一个实例中，非哺乳动物存活蛋白包含N端缺失。
在其他实施方案中，本发明的疫苗能够活化T细胞，所述T细胞识别癌细胞上与MHC分子复合的人存活蛋白肽序列。具体地，此类人存活蛋白肽序列可以是例如LTLGEFLKL(SEQ ID NO:1)，CPTENEPDL(SEQ ID NO:2)或EPDLAQCFF(SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，来自非哺乳动物存活蛋白的肽与Fe部分融合或缀合。优选的Fe部分来自哺乳动物Fe区域，更优选来自人Fe区域。Fe部分可以包含突变，所述突变促进装配，例如用丝氨酸取代IgGl铰合部的序列EPKS⑶K (SEQ ID NO: 4)中的半胱氨酸。因此，Fe部分可以包含修饰的序列EPKSSDK(SEQ ID N0:5)。Fe部分也可以包含突变，所述突变减少不需要免疫应答的区域的免疫原性，例如，融合蛋白部分之间的接头。在选择的实施方案中，来自非哺乳动物存活蛋白的肽与效应分子协同作用，所述效应分子有助于免疫应答。例如，此类效应分子可以是细胞因子部分，其包括但不限于IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、IL_23、GM_CSF或任何其他细胞因子，特别是能够活化Thl免疫应答的那种。此类效应分子也可以是阻抑免疫系统的细胞因子的抑制剂，例如STAT3抑制剂(例如显性失活STAT3蛋白质，如STAT3 0 )。细胞因子或其他效应分子还可以包含突变。例如，细胞因子可以在对应于IL-2的Cysl25的位置上包含Ser取代。因此，在优选的实施方案中，本发明的疫苗包括核酸，所述核酸编码来自非哺乳动物存活蛋白的肽和有助于免疫应答的另一种肽，包括上述效应分子。编码非哺乳动物存活蛋白肽和效应分子肽的区域可以在单个转录单元中，或在两个分离的转录单元中。备选地，本发明的疫苗包括编码来自非哺乳动物存活蛋白的肽的核酸和编码另一肽的分离的核酸，所述另一肽包括上述有助于免疫应答的效应分子。在另一个实施方案中，本发明的疫苗包括来自非哺乳动物存活蛋白的肽和另一肽，所述另一肽包括上述有助于免疫应答的效应分子。在一个实施方案中，来自非哺乳动物存活蛋白的肽与包括效应分子的肽融合或缀合。非哺乳动物存活蛋白和效应分子融合蛋白质可以另外与上述Fe部分融合或缀合。在另一方面，本发明涉及疫苗，所述疫苗包括编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽的核酸。备选地，本发明涉及疫苗，所述疫苗包括修饰的哺乳动物存活蛋白肽。修饰的哺乳动物存活蛋白肽是生物学惰性的，但是在免疫上实质上与哺乳动物存活蛋白类似。如本文所用的，“生物学惰性”是指存活蛋白肽，其不能实质上行使或影响通常与正常存活蛋白相关的活性。例如，“生物学惰性”存活蛋白肽不具有实质的抗凋亡活性，其也不能实质上干扰通常与内源存活蛋白蛋白质相关的抗凋亡活性。生物学惰性存活蛋白一般不具有实质的显性失活的效应。如本文用到的，“免疫上实质与哺乳动物存活蛋白类似”是指修饰的存活蛋白肽，如与对应于非修饰的哺乳动物存活蛋白肽一样，所述修饰的存活蛋白肽能够引发针对相同靶序列的至少一种免疫应答。可以例如通过响应靶序列的CD8+T细胞群体或CD8+T细胞的IFNy的释放测量免疫应答。在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗包括编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽的核酸。核酸可以包括哺乳动物启动子，在一个实施方案中，核酸是裸DNA。在另一个实施方案中，核酸用增强哺乳动物细胞转染的试剂配制。本发明的疫苗还可以包括佐剂。在一个实施方案中，编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽的核酸是病毒颗粒例如腺病毒颗粒的一部分。适合用于本发明的腺病毒颗粒包括来自能够复制的腺病毒的那些，或来自条件性复制腺病毒(“CRA D”)(其仅在某些细胞或仅在某些条件下复制)的那些，或来自不能复制的腺病毒的那些。其他适当的病毒颗粒包括但不限于来自慢病毒或其他RNA病毒、腺伴随病毒、轮状病毒或痘苗病毒等的病毒颗粒。在一个实施方案中，疫苗包括含有编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽的核酸的细菌。优选地，细菌是肠细菌，例如沙门氏菌属(Salmonella)、埃希氏菌属(Escherichia)或克雷伯氏菌属(Klebsiella)。其他细菌例如利斯特菌属物种(Listeria species)也可以被用于容纳此类核酸。细菌可以是野生型细菌或可以包含突变，所述突变例如削弱了其致病性。通常优选使用细菌的突变形式，例如营养缺陷型。在另一个优选的实施方案中，本发明的疫苗包括修饰的哺乳动物存活蛋白肽。优选地，修饰的哺乳动物存活蛋白肽包括修饰的BIR结构域。修饰的BIR结构域可以在一定位置上包括至少一个氨基酸取代，所述位置对应于人存活蛋白的Argl8、Cys57、Cys60、His77和Cys84。备选地，或 另外，修饰的哺乳动物存活肽包括修饰的螺旋结构域。修饰的螺旋结构域可以在一定位置上包括至少一个氨基酸取代，所述位置对应于人存活蛋白的Lysl22、Alal28和Ilel35。例如，修饰的螺旋结构域可以在对应于人存活蛋白Alal28的位置上包含Pro。修饰的螺旋结构域还可以在对应于Ilel35的位置上包括Pro。修饰的哺乳动物存活蛋白肽优选包含一个或多个I类MHC T细胞表位。例如，修饰的哺乳动物存活肽可以包括氨基酸序列 LTLGEFLKL (SEQ ID NO:1)或 LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 6)。在一些实施方案中，修饰的哺乳动物存活蛋白肽与Fe部分融合。修饰的Fe部分来自哺乳动物Fe区域，更优选来自人Fe区域。Fe部分可以包含改善装配的突变，例如在IgGl铰合部的序列EPKS⑶K (SEQ ID NO: 4)用丝氨酸取代半胱氨酸。因此，Fe部分可以包含修饰的序列EPKSSDK (SEQ ID N0:5)。Fe部分也可以包含这样的突变，所述突变减少不需要免疫应答的区域的免疫原性，所述区域例如融合蛋白部分之间的接头。在某些实施方案中，修饰的哺乳动物存活蛋白肽与效应分子协调作用，所述效应分子有助于免疫应答。例如，此类效应分子可以是细胞因子部分，其包括但不限于IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、IL-23、GM-CSF或任何其他细胞因子，特别是能够活化Thl免疫应答的一个。此类效应分子也可以是抑制免疫应答的细胞因子的抑制剂，例如STAT抑制剂(例如显性失活的STAT3蛋白质，例如STAT3 0 )。细胞因子或其他效应分子也可以包含突变。例如，细胞因子可以在对应于IL2的Cysl25位置上包含Ser取代。因此，在优选的实施方案中，本发明的疫苗包括核酸，所述核酸编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽和另一种肽，所述另一种肽包括上述有助于免疫应答的效应分子。编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽和效应分子肽的区域可以是在单个的转录单元中，或在两个分别的转录单元中。备选地，本发明的疫苗包括编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽的核酸和编码包括上述描述的有助于免疫应答的效应分子的另一种肽的分离的核酸。在其他实施方案中，本发明的疫苗包括修饰的哺乳动物存活蛋白肽和另一种肽，所述另一种肽包括上述的有助于免疫应答的效应分子。在一个实施方案中，修饰的哺乳动物存活蛋白肽与包括效应分子的肽融合或缀合。修饰的哺乳动物存活蛋白肽和效应分子融合蛋白可以另外与上述的Fe部分融合或缀合。在另一方面，本发明涉及能够引发针对表达人存活蛋白的细胞的免疫应答的核酸。该核酸编码包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与人存活蛋白BIR结构域具有多于50%的同一性，但是少于80%的同一性，并且所述核酸包含能够在哺乳动物细胞中表达肽的启动子。本发明还涉及治疗方法，包括施用上述疫苗或核酸。具体地，本发明提供了治疗癌症和其他疾病的方法，所述疾病包括不希望的细胞增殖。本发明的治疗方法可以任选地包括其他步骤，例如首先测试表达高水平存活蛋白的患者肿瘤的步骤。另一任选的步骤是在施用本发明的疫苗或核酸之前用温和的免疫抑制剂(例如低剂量的环磷酰胺)预治疗患者。不希望被理论束缚，此类预治疗的一个效果是减少T调节细胞的数量。因此，其他具有类似效果的预治疗也包括在本发明中。除了存活蛋白，本发明还可以应用于可以用作抗原的多种蛋白质，例如肿瘤特异性抗原、病毒抗原和其他抗原。在肿瘤特异性抗原中，除了存活蛋白，本发明还可以应用于表皮细胞粘着分子，癌基因例如Ras、癌胚抗原和其他肿瘤特异性或肿瘤富含的蛋白质。在病毒抗原中，本发明可以应用于HIV的p24、流行性感冒血凝素、和其他病毒蛋白质。总体来说，本发明涉及下述: 用于治疗人中肿瘤和肿瘤相关疾病的疫苗，其包含:(a)来自非哺乳动物存活蛋白的肽或编码所述肽的核酸，其中所述非哺乳动物存活蛋白包含BIR结构域，其与跨越人存活蛋白的Aspl6至Leu87的BIR结构域具有50%至90%的氨基酸同一性，或(b)来自修饰的哺乳动物存活蛋白的肽或编码所述肽的核酸，其中所述修饰的哺乳动物存活蛋白包含BIR结构域中的突变，所述突变基本上消除了 BIR结构域的生物学活性，以及(c)任选地佐剂；所述疫苗引发人中对人存活蛋白的免疫应答。 相应的疫苗 ，其中所述由疫苗引起的免疫应答产生攻击表达人存活蛋白的细胞的CD8+T细胞。 相应的疫苗，其中所述肽来自非哺乳动物存活蛋白。 相应的疫苗，其中所述BIR结构域与所述人存活蛋白BIR结构域具有50%至80%的氨基酸同一'I"生。 相应的疫苗，其中非哺乳动物存活蛋白来自鸟、鱼、爬行动物或两栖动物，优选来自鸡。 相应的疫苗，其中来自非哺乳动物存活蛋白的肽包含一个或多个突变，所述突变促进通过结合至MHC分子的T细胞抗原呈递。 相应的疫苗，其中非哺乳动物存活蛋白是鸡的，且突变是在鸡存活蛋白的Asn97、Thr99、VallOO或GlnlOl的一个或多个位置处的氨基酸取代。优选的突变是N97E、和 / 或 T99M、和 / 或 VlOOLJ / 或 QlOlG0.SEQ ID NO: 12 的疫苗，其中突变是 N97E、T99M、V100L 和 Q101G。 相应的疫苗，其中非哺乳动物存活蛋白包含BIR结构域中的突变，所述突变基本上丧失了 BIR结构域的生物学活性。 相应的疫苗，其中所述被消除的生物学活性是细胞凋亡。 相应的疫苗，其中所述来自非哺乳动物存活蛋白的肽在对应于人存活蛋白Argl8、Pro47、Cys57、Cys60、His77和Cys84的一个或多个位置包含氨基酸取代。 相应的疫苗，其中疫苗能够活化识别与MHC分子复合时的人存活蛋白肽序列的T细胞，所述人存活蛋白肽序列选自下列肽:LTLGEFLKL、CPTENEPDL和ETOLAQCFF。
相应的疫苗，其中肽来自修饰的哺乳动物存活蛋白，优选的人存活蛋白。 相应的疫苗，其中所述来自修饰的人存活蛋白的肽包含人的存活蛋白Argl8、Pro47、Cys57、Cys60、His77和Cys84的一个或多个位置处的氨基酸取代。 相应的疫苗，其中来自修饰的哺乳动物存活蛋白的肽包含修饰的螺旋结构域，并且在人存活蛋白的Lysl22和/或Alal28和/或Ilel35的位置包含氨基酸取代。 相应的疫苗，其中突变至少是Alal28P和/或Ilel35P。.SEQ ID NO:56的疫苗，其包含修饰的人存活蛋白，所述人存活蛋白具有下列突变 R18E、P47L、Q56L、H77A、C84A、A128P、和 I135P。 相应的疫苗，其中修饰的哺乳动物存活蛋白肽包含氨基酸序列LTLGEFLKL或LMLGEFLKLο 相应的疫苗，其中来自非哺乳动物存活蛋白的肽和来自修饰的哺乳动物存活蛋白的肽与Fe部分融合。 相应的疫苗，其中疫苗另外编码或包括来自效应分子的肽，优选的选自IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、IL-23 和 GM-CSF 的细胞因子。 相应的疫苗，其中编码来自非哺乳动物存活蛋白或来自修饰的哺乳动物存活蛋白的肽的核酸包含哺乳动物启动子，且优选是裸DNA。 相应的疫苗，其中核酸与增强哺乳动物细胞转染的试剂一起配制。 相应的疫苗，其中核酸是病毒颗粒的部分，优选腺病毒颗粒的部分。 相应的疫苗，其中疫苗包含含有核酸的细菌，其中细菌优选是肠细菌，更优选是沙门氏菌属。 用于针对过量表达存活蛋白的肿瘤细胞免疫人的药物组合物，其包含在权利要求和说明书中说明的疫苗，任选地与可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起。 相应的疫苗的用途，其用于制备针对过量表达人存活蛋白的肿瘤细胞免疫患者的药物。附图简述:


图1是存活蛋白同源物的蛋白质序列的比对。比对通过Clustal W方法进行(见Thompson 等人，(1994)Nucl.Acid Res.22:4673-4680)。序列从 NCBI 数据库获得，使用下列检索号:人存活蛋白(检索号:NM_001168，SEQ ID N0:8)，狗存活蛋白(NP_001003019，SEQID N0:9)，猪存活蛋白(NP_999306, SEQ ID NO:39)，奶牛存活蛋白(NP_001001855, SEQID N0:40)，猫存活蛋白(NP_001009280, SEQ ID N0:41)，小鼠存活蛋白(NP_033819, SEQID N0:10)，大鼠存活蛋白(AAF82586，SEQ ID NO:42)，猩猩存活蛋白(CAH91231，SEQID N0:43)，鸡存活蛋白(NP_001012318, SEQ ID NO: 11)，光滑爪蟾(Xenopus Iaevis)SIX(AA020085, SEQ ID NO: 13)、光滑爪蟾存活蛋白同源物(AAM76714，SEQ ID N0:46)、光滑爪蟾存活蛋白同源物2 (AAH89271, SEQ ID NO:47)、鲶鱼存活蛋白同源物(CK419466，SEQID N0:52)、斑马鱼存活蛋白同源物(NP_919378，SEQ ID NO:48)，斑马鱼存活蛋白同源物2(NP_660196, SEQ ID N0:49)，河豚鱼存活蛋白样同源物(CAG04432, SEQ ID N0:50)、和河豚鱼存活蛋白样同源物2 (CAG07433，SEQ IDN0:51)。BIR结构域下划线；星号指示了涉及Zn配位的标记残基；破折号指示了比对中的空位。在非人序列中，与人残基相同的残基以句号表示；其他残基以单字母氨基酸密码子表示。
图2是多种存活蛋白同源物的BIR结构域比较的氨基酸同一性百分比的表。序列I是人序列；序列2来自狗；序列3来自猪；序列4来自奶牛；序列5来自猫；序列6来自小鼠；序列7来自大鼠；序列8来自猩猩；序列9来自鸡；序列10来自蛙属的光滑爪蟾SIX蛋白质；序列11来自蛙属光滑爪蟾同源物；序列12来自蛙属光滑爪蟾同源物2 ;序列13来自鲶鱼同源物；序列14来自斑马鱼同源物；序列15来自斑马鱼同源物2 ;序列16来自河豚鱼存活蛋白样蛋白质I ;并且序列17来自河豚鱼存活蛋白样蛋白质2。图3是来自脊椎动物的BIR结构域序列与人存活蛋白的比对。人存活蛋白BIR结构域序列显示在SEQ ID NO: 63中。比对通过ClustalW方法进行(见Thompson等人(1994),Nucl.Acid Res.22:4673-4680)。序列从NCBI数据库获得，使用下列检索号:人存活蛋白(NM_001168，BIR 结构域序列，显示在 SEQ ID NO:63 中)，黑腹果蝇(D.melanogaster)(AAF55399, BIR结构域同源物，显示在SEQ ID NO: 53中)和线虫(C.elegans)(NP_505949，BIR结构域同源物，显示在SEQ ID NO: 54中)。BIR结构域加下划线；星号指示了涉及Zn配位的标记残基；破折号指示了比对中的空位。在非人序列中，与人残基相同的残基以句号表示；其他残基以单字母氨基酸密码子表示。图4是用带有编码存活蛋白多肽的质粒的沙门氏菌接种DNA的模式的图示。肠腔中的沙门氏菌通过集合淋巴小结的M细胞侵入肠上皮。一旦穿过上皮，沙门氏菌侵入细胞例如巨噬细胞和树突细胞。细菌死亡并且质粒转移使得质粒通过巨噬细胞表达，导致来自编码的存活蛋白多肽的肽在I类MHC分子中呈递。另外，通过树突细胞对表达存活蛋白多肽的凋亡巨噬细胞的摄取导致由于肽在I类MHC和II类MHC分子中的呈递而得到的交叉引发。图5是柱状图，其描述了暴露给癌细胞时从存活蛋白接种的小鼠分离的T细胞的IFNy释放。IFNy释放在酶联免疫斑点(ELISpot)测定中测量。C57B1/6小鼠用携带鼠或鸡存活蛋白表达质粒的沙门氏菌接种，或不接种(X轴)，在T细胞暴露给B16/KSA (条纹柱)或LLC/KSA(黑柱)癌细胞系后，测量每5X IO5个平板接种细胞的IFNy点数。图6是柱状图，其描述了分`离自存活蛋白接种的小鼠的T细胞暴露给癌细胞时的IFNy释放，所述T细胞。IFNy释放在酶联免疫斑点测定中测量。Balb/c小鼠用携带鼠或鸡存活蛋白表达质粒的沙门氏菌接种，或不接种(X轴)，在T细胞暴露给4T1/KSA (条纹柱)或A20(黑柱)癌细胞系后，测量每5 X IO5个平板接种细胞的IFNy点数。图7是用沙门氏菌SL7207鸡存活蛋白或鼠存活蛋白接种的小鼠的存活图。存活Balb/c小鼠(y轴)的百分比针对小鼠的CT26/KSA攻击后的天数(χ-轴)作图，所述小鼠用携带有鼠存活蛋白(实心三角)或鸡存活蛋白(实心方块)或PBS (实心菱形)表达质粒的沙门氏菌接种。图8是用沙门氏菌SL7207鸡存活蛋白或鼠存活蛋白接种的小鼠的存活图。存活C57B1/6小鼠(y轴)的％针对小鼠的LLC/KSA攻击后的天数(χ-轴)作图，所述小鼠用携带有鼠存活蛋白(实心三角)或鸡存活蛋白突变体——鸡存活蛋白(N97E、T99M、V100L、Q101G)(实心方块)或PBS (实心菱形)表达质粒的沙门氏菌接种。图9是在第10天评估相对于肿瘤攻击的接种计时(vaccination timing)效果的给药日程表的图示。“D”是“天”的缩写。因此，例如，一些小鼠在第I天接受口服接种，在第10天接受肿瘤攻击，在第13天接受口服接种；其他小鼠在第10天接受肿瘤攻击和口服接种，在第18天接受第二次口服接种。在第29天评估肺肿瘤负荷。图10是在第I和13天；7和13天；10和18天；或13和21天接受疫苗；或接受PBS的小鼠肺重量图表。所有小鼠在第10天接受静脉内LLC/KSA细胞的肿瘤攻击。也提供了每只小鼠的肺转移评分。图11是给药日程表的图示，包括在第I和15天用鸡存活蛋白的沙门氏菌介导的接种；在第4天用LLC/KSA细胞的静脉内肿瘤攻击；以及在第11天的腹膜内环磷酰胺(CTX)治疗和在第12-15天的吲哚美辛治疗。在第28天就肿瘤负荷对肺评分。图12是描述了以下小鼠的肺重量的图:所述小鼠只接受肿瘤攻击(载体)；在第一天(引发)和第15天(加强)接受用鸡存活蛋白接种，且在第4天用肿瘤攻击(PCB);接受CTX和吲哚美辛和肿瘤攻击C (Cl);接受引发、攻击、CTX、吲哚美辛和加强(PC(CI)B);接受引发、攻击、CTX和吲哚美辛(PC(CI))或接受攻击、CTX J引哚美辛和加强C(CI)B。也提供了每只小鼠的肺转移评分。图13提供了外周血细胞的流式细胞数据的描述，所述数据表明了在接种了携带编码非哺乳动物存活蛋白的质粒的沙门氏菌后在小鼠中CD44气CD33 细胞的新群体的出现。χ-轴代表了⑶3细胞，y-轴代表了⑶44细胞。图14是剂量方案的图示，包括在第一天皮下肿瘤攻击；在第4、11、18和25天用非哺乳动物存活蛋白的沙门氏菌介导的接种；以及在第8、9和10天的静脉内免疫细胞因子处理。图15是描述了用PBS、免疫细胞因子、非哺乳动物存活蛋白；或免疫细胞因子和非哺乳动物存活蛋白处理的小鼠一定时间内的肿瘤体积。发明详述本发明通过提供有效引发针对疾病细胞的免疫应答的组合物和方法改进了癌症或其他疾病的治疗。癌症是主要的靶标疾病，尽管本发明也可以应用到其他疾病和病症，例如正常细胞例如纤维样组织的不希望的增殖。本发明还涉及用于治疗病毒感染，例如HIV感染、流感病毒感染和其他病毒感染的组合物和方法。具体地，对于癌症或其他肿瘤的治疗，本发明提供了用于将与肿瘤特异性或肿瘤富含的蛋白质相关的肽呈递到抗原呈递细胞以在哺乳动物中引发针对癌症或肿瘤细胞的适应性免疫应答的组合物和方法。其他优选的用于本发明的肿瘤特异性或肿瘤富含的抗原是存活蛋白。
T细胞抗原呈递综述抗原呈递是一种细胞过程，其中将细胞中的蛋白质处理成肽，然后沿着分泌途径运输到细胞表面。处理的肽是作为与特化的肽呈递膜蛋白质(称作MHC)的稳定复合体来运输的。这一过程通过取样MHC-肽复合体，允许免疫系统的组分例如辅助T-细胞(CD4+T细胞)和细胞毒性T-细胞(CTL或⑶8+T-细胞)来视察细胞的组分。辅助T细胞与MHC I1-肽复合体相互作用，而细胞毒性T-细胞与MHC 1-肽复合体相互作用。相互作用通过在T-细胞表面表达的T-细胞受体(TCR)来发生。每个T-细胞表达独特TCR。与抗体类似，通过在染色体TCR基因座的重排产生TCR多样性。与产生抗体的细胞相同，在T-细胞分化过程中与自身抗原(即从细胞中存在的内源蛋白质产生的抗原肽)的相遇导致特定T-细胞的负选择。在负选择中未被消除的那些T细胞进一步发育成成熟T-细胞。最终，与和MHC复合的外源抗原的相互作用导致T细胞活化，特别在二次刺激存在时。存活蛋白存活蛋白的特征在于保守的、大约70个氨基酸结构域，称作BIR结构域(或IAP结构域)。在人存活蛋白中，BIR结构域对应于跨越Aspl6至Leu87的区域。癌症和肿瘤细胞通常过量表达存活蛋白蛋白质，这认为将阻断这些细胞的凋亡并且因此干扰防止癌症或肿瘤细胞的异常生长的机制。另一方面，正常细胞表达非常少的存活蛋白。因此，存活蛋白是理想的肿瘤特异性或肿瘤富含的抗原。因此，本发明的目标是将存活蛋白蛋白质的抗原形式递送到抗原呈递细胞，从而可刺激对表达存活蛋白的肿瘤细胞的免疫应答。人和哺乳动物存活蛋白蛋白质和基因详细描述在美国专利号N0.6，245，523或W02004/067023。非哺乳动物存活蛋白本发明的一个方面围绕着令人惊奇的发现，即非哺乳动物存活蛋白基因和/或蛋白质可以用在癌症和其他疾病的疫苗中。例如，用编码鸡存活蛋白的核酸免疫小鼠或人会产生将分别攻击表达小鼠或人存活蛋白的细胞的CD8+T细胞。这一发现表明鸡存活蛋白在免疫学上与人存活蛋白基本类似，提示鸡存活蛋白可以用作存活蛋白蛋白质的抗原形式，来引发哺乳动物中的免疫应答。

在图1中比对了来自哺乳动物和非哺乳动物物种的存活蛋白蛋白质。包括在比对中的存活蛋白蛋白质是人存活蛋白(Genebank检索号NM_001168或015392，SEQ IDNO: 8)，狗存活蛋白(Genebank 检索号 ΝΡ_001003019，SEQ ID NO: 9)，猪存活蛋白(Genebank检索号 NP_999306, SEQ ID NO:39)，奶牛存活蛋白(Genebank 检索号 NP_001001855, SEQID NO:40)，猫存活蛋白(Genebank 检索号 NP_001009280, SEQ ID N0:41)，小鼠存活蛋白(Genebank检索号NP_033819, SEQ ID NO: 10)，大鼠存活蛋白(Genebank检索号AAF82586, SEQ ID N0:42)，猩猩存活蛋白(Genebank检索号CAH91231, SEQ ID N0:43)，鸡存活蛋白(Genebank 检索号 NP_001012318, SEQ ID NO: 11，“野生型”)，光滑爪蟾 SIX(Xenopuslaevis) SIX存活蛋白(Genebank检索号AA020085，SEQ ID NO: 13)、光滑爪蟾存活蛋白同源物(Genebank检索号AAM76714，SEQ ID NO: 46)、光滑爪蟾存活蛋白同源物2 (Genebank检索号AAH89271，SEQ ID NO: 47)、鲶鱼存活蛋白同源物(Genebank检索号CK419466，SEQID NO: 52)、斑马鱼存活蛋白同源物(Genebank检索号NP_919378，SEQ ID N0:48)，斑马鱼存活蛋白同源物2 (Genebank检索号NP_660196，SEQ ID N0:49)，河豚鱼存活蛋白样同源物(Genebank检索号CAG04432, SEQ ID NO: 50)、河豚鱼存活蛋白样同源物2 (Genebank检索号CAG07433，SEQ IDN0:51)。将通过基因检索号在本文公开的所有序列引入作为参考。包括在图1中的序列也列在说明书的序列表中。另夕卜，两个鸡序列也包括在相应的序列表中，变体I (Genebank检索号NM_001012319, SEQ ID N0:44)和变体 2 (Genebank 检索号 NP_001012317, SEQ ID N0:45),所述变体I与SEQ ID NO: 11显示的野生型鸡存活蛋白序列的差异开始于氨基酸残基116，以给出不同的C端，所述变体2与SEQ ID NO: 11显示的野生型鸡存活蛋白序列的差异开始
于氨基酸残基38。下列额外的序列包括在序列表中:人存活蛋白(Genbank检索号NM_001168.2，SEQID N0:64);人(Homo sapiens)存活蛋白(Genbank 检索号 015392，SEQ ID NO:65);家犬(Canis familiaris)存活蛋白(Genbank 检索号 ΝΜ_001003019.1，SEQ ID NO:66);猪(Susscrofa)存活蛋白(Genbank 检索号 ΝΡ_999306.I，SEQ ID Ν0:67);欧洲牛(Bos taurus)存活蛋白(Genbank 检索号 NP_001001855.2，SEQ ID NO: 68);家猫(Felis catus)存活蛋白(Genbank 检索号 ΝΡ_001009280.1，SEQ ID NO:69);小家鼠(Mus musculus)存活蛋白(Genbank 检索号 NP_033819.1, SEQ ID N0.70);褐家鼠(Rattus norvegicus)存活蛋白(Genbank 检索号 AAF82586.1，SEQ ID NO: 71);猩猩(Pongo pygmaeus)存活蛋白(Genbank 检索号 CAH91231.1，SEQ ID NO: 72);原鸡(Gallus gallus)存活蛋白(Genbank检索号 ΝΡ_001012318.1，SEQ ID NO:73);光滑爪蟾(Xenopus laevis) SIX 存活蛋白(Genbank检索号AA020085.1，SEQ ID NO: 74);光滑爪蟾存活蛋白同源物(Genbank检索号AAM76714.1, SEQ ID NO: 75);光滑爪蟾存活蛋白同源物 2 (Genbank 检索号 AAH89271.1, SEQID NO: 76);编码河内It鱼(Ictalurus punctatus)存活蛋白的核酸(Genbank检索号 CK419466.1，SEQ ID NO: 77);鲐(Danio rerio)存活蛋白同源物(Genbank 检索号ΝΡ_919378.1，SEQ ID NO: 78);鲐存活蛋白同源物 2 (Genbank 检索号 ΝΡ_660196.1，SEQID NO: 79);黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)存活蛋白样同源物(Genbank检索号CAG04432.1, SEQ ID NO: 80);黑青斑河豚存活蛋白样同源物2 (Genbank检索号CAG07433.1, SEQ ID NO: 81);黑腹果妮(Drosophila melanogaster)存活蛋白(Genbank 检索号AAF55399.1，SEQ ID NO:82)和线虫(Caenorhabditis elegans)存活蛋白(Genbank检索号 NP_505949.1, SEQ ID NO:83)。本发明设想不仅使用在天然中发现的存活蛋白序列，例如在图1中公开的存活蛋白序列，而且使用其他氨基酸序列，所述氨基酸序列与在图1中公开的至少一种序列有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性。如在图1中所示，尽管比对中的哺乳动物存活蛋白蛋白质与人存活蛋白超过80%的同一，但是比对中的非哺乳动物存活蛋白同源物与人存活蛋白的同一性不超过60%。但是，在BIR结构域中(图1比对中用下划线表示的区域)，非哺乳动物存活蛋白蛋白质与人存活蛋白的同一性大于60%但是小于80%，而哺乳动物存活蛋白蛋白质与人存活蛋白的同一性超过90%。存活蛋白同源物的BIR结构域的序列对同一性百分比总结在图2中。例如，鸡存活蛋白与人存活蛋白在BIR结构域上有大约78%的同一性。重要地，如图1所示,在鸡存活蛋白中，在BIR结构域中仅有一个9-mer肽(18-26:STRAATFRN) (SEQ ID NO: 7)，所述BIR结构域相对于对应的人序列包含超过50%的氨基酸变异(在此特定的9-mer肽中9个氨基酸中的5个)。鸡存活蛋白的BIR结构域中的大多数9-mer肽包含两个或更少的序列改变(64个肽中的48个)。不希望受到理论限制，要理解这一程度的序列保守性有效使得鸡存活蛋白与人存活蛋白免疫学上基本相似。一般地，图2中显示的鸡存活蛋白BIR结构域和哺乳动物存活蛋白BIR结构域之间的同一性百分比在大约72%和大约78%之间变化。另外，大约75%的来自鸡存活蛋白的BIR结构域的9-mer肽与对应的哺乳动物9-mer肽相比包含两个或更少的序列改变。例如，鸡存活蛋白与小鼠存活蛋白在BIR结构域上有75%的同一性百分比，这与以下结果相一致，即鸡存活蛋白与小鼠存活蛋白在免疫学上基本相似，如在下面实施例6中所描述的。如在下列实施例中所说明的， 非-哺乳动物存活蛋白组合物(例如鸡存活蛋白组合物)在小鼠中诱导针对表达小鼠存活蛋白的肿瘤的免疫应答的功效强调了以下本发明的原理:即用非哺乳动物存活蛋白分子接种哺乳动物可用于诱导针对哺乳动物存活蛋白或针对过量表达哺乳动物存活蛋白的细胞的免疫应答。因此，鸡存活蛋白也可以用于在人中产生针对过量表达人存活蛋白的细胞(例如任何肿瘤细胞)的有效的免疫应答，因为在哺乳动物之间免疫应答是足够保守的。相反，非脊椎动物的BIR结构域与人存活蛋白BIR结构域的比对显示黑腹果蝇(AAF55399, SEQ ID NO: 53)和线虫(NP_505949, SEQ ID NO: 54)BIR结构域与人存活蛋白 BIR结构域序列有50%或更少的同一性，尽管对于Zn螯合作用的关键残基是保守的(见图3中的比对中的星号)。例如，苍蝇存活蛋白BIR结构域与人存活蛋白BIR结构域有约50%的同一性。重要地，苍蝇BIR结构域仅包含3个(64中的3个)这样的9-mer肽，所述肽与对应的人肽相比具有两个或更少的氨基酸取代。根据本发明，如本文所用的，术语“非哺乳动物存活蛋白”至少包括任一具有BIR结构域(或IAP结构域)的存活蛋白蛋白质，所述BIR结构域与人存活蛋白BIR结构域具有至少多于50%的氨基酸同一性，但是少于90%的氨基酸同一性，例如与人存活蛋白BIR结构域有至少 55%、60%、65%、70%、75%、80% 或 85% 的同一性。为了计算同一性百分比，将每个序列的比对的氨基酸顺序比较。如果氨基酸是非同一的，配对同一性分数是0，否则配对同一性分数是1.0。原始同一性得分是同一的比对氨基酸的总和。然后将原始分数除以较小的候选序列或参照序列中的氨基酸数并且将结果乘以100来标准化原始分数。标准化的原始分数是同一性百分比。为了计算百分比同一性的目的，忽略插入和缺失。因此，在此计算中不使用空位罚分。产生多重序列比对的方法是本领域技术人员熟知的。为了比对存活蛋白序列，使用DNASTAR Lasergene 6软件的Megalign6.1模块，应用ClustalV比对算法，使用缺省设置(Higgins 和 Sharp (1989) Comput Appl Biosc1.5:151-3)。对于存活蛋白 BIR 结构域的次级比对，应用ClustalW(“慢准确”)方法,使用缺省设置(Thompson等人.(1994)NucleicAcids Res.22:4673-80)。设想非哺乳动物存活蛋白也包含比哺乳动物存活蛋白更多的肽，所述肽具有产生T辅助细胞应答的潜能。不希望受到理论限制，设想免疫效应可以通过在免疫应答中通过MHC I的细胞毒性T细胞的接合和通过MHC II的T辅助细胞的的接合来实现的。内源人存活蛋白和非哺乳动物存活蛋白之间的序列差异可能引起人免疫系统还没有耐受的一些肽被呈递。可以使用公开可用的预测算法，例如ProPred Analysis (www.1mtech.res.1n/raghava/propred; Singh 等人,(2001) Bio informatics 17:1236-1237，其内容在本文引用作为参考)，分析潜在的MHC II表位的存在。使用此类算法，发现相对于哺乳动物存活蛋白蛋白质，例如人或狗存活蛋白，非哺乳动物存活蛋白蛋白例如鸡存活蛋白或蛙SIX存活蛋白被预测为包含多个与MHC II分子结合的肽和/或与MHC II分子具有更高的结合亲和性的肽(见表I)。 表1:对人HLA-DR的肽结合预测
权利要求
1.用于针对过表达人存活蛋白的肺癌细胞免疫患者的疫苗，其包含: (a)来自突变的鸡存活蛋白的肽或编码所述肽的核酸，其中所述突变的鸡存活蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO: 12, (b)任选地佐剂， 所述疫苗在人中引起针对人存活蛋白的免疫应答。
2.权利要求1的疫苗，其中所述疫苗能够活化T细胞，所述T细胞识别与MHC分子复合时的人存活蛋白肽序列，其中所述人存活蛋白肽序列选自下列肽:LTLGEFLKL、CPTENEH)L和 EPDLAQCFF。
3.权利要求1或2的疫苗，其中所述肽与Fe部分融合。
4.权利要求1一 3任一项的疫苗，其中所述疫苗另外编码或包括选自IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、IL-23 和 GM-CSF 的细 胞因子。
5.权利要求1-4任一项的疫苗，其中编码所述肽的核酸包含哺乳动物启动子。
6.权利要求5的疫苗，其中所述核酸是裸DNA。
7.权利要求1-6任一项的疫苗，其中用增强哺乳动物细胞转染的试剂配制所述核酸。
8.权利要求1-7任一项的疫苗，其中所述核酸是病毒颗粒的部分。
9.权利要求8的疫苗，其中所述病毒颗粒是腺病毒颗粒。
10.权利要求1-9任一项的疫苗，其中所述疫苗包含含有所述核酸的细菌。
11.权利要求10的疫苗，其中所述细菌是沙门氏菌。
12.权利要求1-11任一项中说明的疫苗的用途，用于生产针对过量表达人存活蛋白的肺癌细胞免疫患者的药物。
13.用于治疗肺癌的疫苗，其包含 (a)突变的鸡存活蛋白，其氨基酸序列为SEQID NO:12，和 (b)任选地佐剂， 所述疫苗在人中引起针对人存活蛋白的免疫应答。
全文摘要
本发明提供了疫苗组合物，其在人中刺激对人存活蛋白的免疫应答，因此攻击过量表达存活蛋白的肿瘤患病细胞。具体地，本发明提供了疫苗组合物，其包含来自非哺乳动物存活蛋白以及来自修饰的哺乳动物的特别是人的存活蛋白的肽。
文档编号A61P11/00GK103169959SQ201310057148
公开日2013年6月26日 申请日期2006年9月27日 优先权日2005年9月27日
发明者S·D·吉利斯, T·A·O·黑特曼, P·A·斯泰因, S·G·克林茨 申请人:默克专利有限公司