一种具有细胞募集性的凝胶微囊及其制备方法

专利名称：一种具有细胞募集性的凝胶微囊及其制备方法
技术领域：
本发明涉及组织再生材料研发领域，尤其涉及一种携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊及其制备方法，该具有细胞募集性的凝胶微囊应用于牙科牙周病的治疗，可以募集机体内源性干细胞，促进牙周组织再生。
背景技术：
牙周炎(periodontitis)是世界范围内的慢性牙周感染性疾病,发病率高(中老年人发病率70%以上)，危害性大(牙周炎导致的牙周支持组织丧失是成人牙齿脱落的主要原因)。牙周炎的治疗和牙周缺损的修复再生是国际关注的难题，牙周病的防治面临巨大的压力和挑战。传统牙周治疗手段(如洁治术、刮治术、翻瓣术等)虽可有效控制牙周疾病进程，却不能使失去的牙周组织获得良好的再生；牙周骨移植(bone grafting)、引导组织再生(guided tissue regeneration, GTR)和引导骨再生(guided bone regeneration, GBR)技术的广泛开展和临床应用，大大提高了牙周炎治疗的疗效，但在恢复牙周组织的生理结构和功能上还远远没有达到临床所期望的目标。近年来，组织工程(tissue engineering)和再生医学(regenerative medicine)研究取得了突飞猛进的发展，为多种组织、器官缺损治疗带来了新希望。利用组织工程的原理、技术和方法促进牙周组织再生的研究正引起越来越广泛的重视和关注，并日益成为牙周再生研究的重点和核心。牙周组织的再生治疗技术是口腔医学研究领域的热门课题，对牙周炎的临床治疗将产生深远影响。同时，牙周组织涉及牙槽骨(alveolar bone)、牙周膜(periodontalIigament)和牙骨质(cementum)三种完全不同的组织,加上这三种组织之间的复杂结构关系与功能，使牙周组织再生可以作为机体复杂组织器官再生的“模型”，因此，牙周再生研究的意义已经大大超过牙病治疗本身。其实，我们机体组织都不同程度具有一定再生能力，只是多数情况下，这种“ 自发性”再生能力不足以对疾病产生治疗作用。2009年，Discher等在一篇发表于Science (2009 ；324:1673-7)的文章中指出，机体组织干细胞龛中储藏的干细胞，这些干细胞的激活为再生治疗提供了一种全新的设计策略。利用体外设计的再生生物材料或制剂，激活机体内源性干细胞系统，募集机体自身内源性干细胞发挥再生修复作用，是避免体外细胞移植、极大程度实现机体组织内源性再生的基础，将有力推动牙周病临床治疗方法和技术的革新，具有重要的临床意义，同时也必将对再生医学的生物材料设计、研制和开发产生深远影响。牙周缺损区域生理性微环境的破坏和可供组织修复再生利用的干细胞缺乏是牙周组织再生困难的根本原因。如何利用植入生物材料的设计，重建健康组织微环境，模拟生理状态下细胞与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的相互作用，募集机体自体已经存在的干细胞促进缺损组织修复再生是再生医学研究领域近年来新起的热门课题。虽然随着干细胞生物学研究的不断深入，现阶段体外干细胞培养扩增方法和外源性干细胞体内移植(stem cell transplantation)技术为解决组织再生所需干细胞提供了可能,但干细胞移植的临床转化还有很多问题没有得到根本解决，如安全高效的培养技术、细胞植活率低下、细胞体内外生物学性能的调控等都面临诸多挑战，因此，利用体外培养的干细胞治疗临床一些非致死性疾病(如牙周组织缺损)还存在争议。利用生物材料的设计，复合细胞信号分子，模拟干细胞在体内的运动、交通和迁移机制，诱导内源性干细胞募集和“归巢”(stemcell homing)促进牙周组织再生有望解决体外干细胞培养与移植面临的转化困难，具有广阔的研究前景和临床应用空间。2010年，国外学者(Mao JJ)利用生物材料复合细胞归巢诱导因子募集机体自身干细胞在动物体内已经实现了牙周组织、牙髓(J Dent Res2010 ;89:842-7)和兔的关节软骨(Lancet2010 ；376:440-8)的再生，为干细胞“归巢”实现内源性组织再生研究奠定了基础。然而，在上述研究结果向大动物和人的转化过程中，进一步优化支架材料的细胞募集性和功能化设计至关重要。发明人认为，借助药物控释系统(drug delivery system, DDS),携带多种关键的外源性信号分子并稳定有效释放，动员激活机体干细胞系统，募集内源性干细胞实现功能性组织再生，是组织工程生物材料研究的新方向，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-l, SDF-1)是属于 CXC 类趋化蛋白一种细胞因子，系统命名CXCL12(CXC chemokine ligand-12)，是已知唯一能与受体CXCR4结合并激活的天然趋化因子。最近研究表明SDF-1/CXCR4轴在干细胞归巢中具有关键作用。SDF-1在正常情况下主要由骨髓基质细胞释放，确保CD34+的HSCs向骨髓的趋化黏附。研究表明，静脉注射SDF-1 a能促进HSCs的动员，抗CXCR4和SDF-1的中和抗体能抑制其趋化作用。HSCs、内皮祖细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)等均能表达其特异性受体CXCR4，组织损伤时局部SDF-1上调，是调节干细胞归巢并募集到损伤组织的一个关键因素。因此SDF-1可以作为干细胞“归巢”的首选诱导因子，其生理机能与效果也得到了很多实验的证实。血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, F1DGF)是人体血小板中含的一种蛋白质生长因子 ，为促细胞分裂剂，可刺激成纤维细胞和其他多种细胞分裂增殖。PDGF最初从血小板中发现，在损伤早期从血小板a颗粒释放出来，启动并加速组织创伤修复。TOGF生物学活性主要有几方面:(1)趋化活性:诱导巨噬细胞与成纤维细胞的游走，对中性粒细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞有趋化性。在创伤早期，可以促进周围细胞向创伤部位聚集，配合血小板的凝血作用，激活创伤部位的免疫系统，为创伤修复奠定基础；(2)具有缩血管活性:H)GF能引起血管收缩，是比血管紧张素II更强的血管活性物质。在创伤初期，可以刺激创伤部位的毛细血管迅速收缩，降低创伤部位的血压与流速，促进血液凝固，为创伤修复创造条件。同时，PDGF可以诱导受损的上皮细胞与内皮细胞分裂增殖，促进血管的形成与再生，为创伤修复提供保证；(3)促分裂效应:H)GF能刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶质细胞的分裂增生。I3DGF通过激活TOGF受体跨膜蛋白传递细胞信号，刺激停滞于G0/G1期的成纤维细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞等多种细胞进入分裂增殖周期；(4)参与磷酸酯酶激活与前列腺素代谢:H)GF与有受体的细胞作用时，能诱导磷酸酰肌醇循环和花生四烯酸的释放，促进前列腺。最近研究表明，PDGF-BB能够募集平滑肌细胞促进血管的成熟和稳定，基础和临床研究结果均表明I3DGF-BB具有良好促进牙周组织再生的潜能。PDGF的应用在美国等发达国家十分广泛，这方面的研究也不断取得进展。基因重组人类血小板衍生生长因子(recombinant human F1DGF, rhPDGF)是目前所有众多生长因子中唯一通过美国FDA批准被应用，作为临床处方药的生物工程产品。其应用之一就是以重组人血小板衍生生长因子凝胶剂型的REGRANEX Gel用来作为糖尿病晚期肢端溃疡的清创愈合与修复。另外，血小板衍生生长因子TOGF在重度烧伤、皮肤病患、骨骼与牙齿缺损与再生已经关节修复方面的应用也取得了巨大的进展。无论是SDF-1还是TOGF的临床应用，都面临在体内被组织液稀释、代谢或因酶的降解而失活。发明人认为，借助缓/控释系统和再生生物材料设计，也可以使活性因子向缺损组织定位、持续释放，极大刺激缺损区域组织自身的修复再生潜能。细胞因子与多种支架材料直接复合后，虽然可以取得比单纯支架好的效果，但这种简单复合(add-on或absorb-1n)不能实现生长因子的生物缓释，只有借助新型设计的高效药物输送系统的作用，才有望实现良好的组织再生。发明人认为，借助纳米药物载体的控释技术，包封干细胞“归巢”诱导因子(SDF-la和TOGF-BB)，复合到基于细胞黏附、渗透设计的多孔凝胶微囊中，实现细胞因子控制 释放，植入体内时可募集机体自身来源的干细胞，达到促进组织内源性再生的目的，有望开发可供临床选择的商品化产品。

发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于利用纯天然材料，提供一种携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊的材料配方和相应制备方法、以及具有携带基质细胞衍生因子-1 a和血小板源性生长因子-BB的细胞募集性的凝胶微囊制剂和相应制备方法。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。技术方案一:一种具有细胞募集性的凝胶微囊，其特征在于，包含基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球、重均分子量为100-105kDa的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、重均分子量为IOOkDa的明胶、重均分子量为17kDa聚丙基丙烯酰胺，以及助溶剂、乳化剂和稳定剂。上述技术方案的特点和进一步改进在于:优选地，所述基质细胞衍生因子-1 a纳米微球、血小板源性生长因子-BB纳米微球、甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、明胶和聚丙基丙烯酰胺的质量比为(0.6-1.0):(0.6-1.0):(1.6X104-2.0XlO4):( 1.0X IO4-L 6X IO4):(2.2X 103-3.4X 103)。优选地，所述助溶剂包含磷酸盐缓冲液；所述乳化剂包含体积比为(2-4):1的二氯甲烷和丙酮混合溶剂；所述稳定剂包含重均分子量为40-60kDa的海藻酸钠。更优选地，磷酸盐缓冲溶液的PH值为7.1-7.3 ;乳化剂也可选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二氧六环、丙酮、四氢呋喃、冰醋酸、苯、甲苯中的一种或两者以上的混合物。优选地，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐中，右旋糖酐分子量为37-39.6kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯和右旋糖酐的聚合比例为1:(80-120);所述甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1:(0.6-1.2):(0.05-0.09)。优选地，所述具有细胞募集性的凝胶微囊平均粒径为38.46-47.3 ym，孔隙率为74%-90%，平均孔径为 0.4-3.4 u mo
技术方案二:上述携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:步骤1:称取质量为8.0X IO4-L 2X IO5份的磷酸盐缓冲液，将质量为0.6-1.0份的基质细胞衍生因子-1 a纳米微球(载药量为9.6%)、0.6-1.0份的血小板源性生长因子-BB纳米微球(载药量为8.7% ；)分散于磷酸盐缓冲液中(基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球等份)，制成两种纳米微球质量浓度为
1.2X l(T5-6.7 X Kr3%的水相溶液(单种纳米微球质量浓度为6.0X l(T4-3.4X 1(T3%的水相溶液);步骤2:将质量为1.6X104_2.0XlO4份的重均分子量为100_105kDa的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、1.0X 104-1.6X 104份的重均分子量为IOOkDa的明胶、
2.2X103-3.4 X IO3份的重均分子量为17kDa聚丙基丙烯酰胺依次溶于6.0 X IO4-L 0 X IO5份的体积比为(2-4):1的二氯甲烷和丙酮混合溶剂中，冰浴超声分散0.8-1.2min，制成质量浓度为2% -4.5%的油相溶液；步骤3:将所述水相溶液和所述油相溶液制备成油包水型乳液，将质量为4.0 X IO4份的重均分子量为4-6万的海藻酸钠溶于剩余质量份的磷酸缓冲液中，与所述油包水型乳液混合后冰浴超声分散8-12min,制成微乳液；步骤 4:将所述微乳液在室温下低速搅拌60_12min，自然挥发或抽提去除二氯甲烷，制得所述携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊。技术方案三:技术方案一或技术方案二所述的制备方法制得的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊在治疗牙周炎药物中的应用。技术方案四:一种携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊制剂，其特征在于，包括携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊以及药学上可接受的辅料。优选地，所述药学上可接受的辅料为聚氧乙烯聚氧丙烯醚。技术方案五:技术方案四所述的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:在低于20°C的温度下，将技术方案二所述的制备方法制得的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊边搅拌边加入6.0X103-9.0X IO3重量份的聚氧乙烯聚氧丙烯醚，溶解后制得携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊制剂。本发明采用含两种载药纳米微球(分别包封基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球，载药量分别为9.6%和8.7%)的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)/明胶(gelatin)凝胶微囊，可以控制药物在一定时间里以一定的速度释放，延长药物的生理活性作用时间；凝胶微囊具有良好的多孔性和孔隙率，有利于细胞募集后其黏附、生长和增值；将基质细胞衍生因子-1 a和血小板源性生长因子-BB加入到多孔凝胶微囊中制得的凝胶微囊制剂具有募集性的的优点，可有效发挥药理活性。胶原、多糖基水凝胶等天然生物材料来源广泛，具有良好的生物相容性，且大多是美国食品和药物管理局FDA允许临床应用、有些甚至已经应用于临床的生物材料(如:胶原、右旋糖酐)；其作为制备生长因子DDS和多种组织工程支架的原材料，制备方便(可以制备不同的剂型)、工艺简单、反应条件温和，是较为理想的用来制备细胞因子等活性药物DDS和组织工程支架的原材料，具有广阔的临床应用前景。明胶(gelatin)是来源于动物胶原的一种天然生物材料,其等电点可以通过制备工艺进行调节，从而制备成酸性明胶和碱性明胶。不同等电点的明胶会与荷电相反的信号分子通过离子间的相互作用而结合，这种结合可以使生长因子的释放得到有效的延长，由此可见明胶基生物材料可以作为不同生长因子的载体。例如等电点为5.0的酸性明胶与碱性的碱性成纤维细胞因子、转化生长因子-P结合，而等电点为9.0的碱性明胶可与显酸性的骨形态发生蛋白_2、血管内皮生长因子、SDF-1结合，才能使细胞因子有效释放。然而水性环境中，单纯明胶的快速增溶作用会破坏这种静电吸附，仍然导致生长因子产生极为明显的“突释”效应，体外24h内释药甚至可达70%以上，达不到预期的缓释效果，这在我们的前期实验中已经得到证实。右旋糖酐(dextran)是一种可溶性多糖，主要由a-1，6连接的D-葡萄糖残基和少量的a_l，2、a_l，3、a _1，4支链交连而成，长期以来被作为血代替品广泛应用于临床。近年来，引入功能基的右旋糖酐凝胶被广泛作为蛋白类药物载体进行研究。为了形成凝胶，必须在右旋糖酐支链中引入交链，引入可以通过化学和物理的方法完成。发明人前期设计合成的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)在葡聚糖酶、胶原酶存在的情况下可以完全降解，而且可以通过制备工艺的改变来控制目标产品溶胀、载药、释药及降解性能，是一种很有前途的载体材料。改良后的右旋糖酐基水凝胶载体材料，可以赋予其温度敏感、PH敏感特性，对周围环境变化具有可“感`知”能力，具有智能给药的材料基础，有望达到智能控释给药的目的。然而作为生长因子载体，右旋糖酐基生物材料缺乏与明胶相似的与生长因子的静电作用，只能形成一种物理的包封与吸附，药物极易通过“扩散、渗透作用”而快速释放，因此“突释”效应也非常明显。但是，利用明胶对生长因子的静电吸附作用和右旋糖酐基水凝胶的酶降解特征，通过物理或化学的方法将这两种材料进行耦合，目标产物的药物释放就会大大延长。材料降解控制释药，包封生物酶控制降解，为减少药物的初期“突释”、实现生长因子的长时间释放提供了新的契机。发明人在前期的实验中，利用甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)和明胶(Gtn)在水成溶液PEG中的不混溶性和甲基丙烯酸激进分子与明胶的交联率禹合作用，在反应促进剂的存在的条件下成功制备了 Dex-GMA/Gtn凝胶纳米微球,避免了有机溶剂的使用，达到了对生长因子的生物缓释作用。我们取得的实验结果主要包括:①首先成功对右旋糖酐基生物材料进行改性，枝接激进分子实现了明胶与右旋糖酐基生物材料的有机结合，其释药主要由材料降解决定；③在国外学者研究的基础上，建立了避免有机溶剂参与的完全水性环境(All-aqueous system)中合成生长因子微载体的方法；④在一定程度上实现了生长因子的生物缓/控释。本发明将上述纳米控释给药的经验引入细胞募集性凝胶微囊的研制，制备具有诱导募集机体内源性干细胞的凝胶微囊，这种多孔微囊仍基于甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐和明胶在的交联耦合作用，目标产品将为内源性组织再生、组织工程、器官移植等多领域的研究提供更为广阔的空间。细胞募集性设计是新型功能化支架研制中面临的重要基础问题。利用药物控释的手段和方法，实现促干细胞“归巢”诱导因子的生物控释，能诱导组织再生所必需的内源性干细胞向缺损区域募集和“归巢”，实现多种组织生理性和功能性再生。新型细胞募集性生物材料的研制将为多种组织内源性再生和体内组织工程提供有效的研究基础，为重建复杂组织和器官的生理结构和功能提供新的治疗方法，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。本发明利用纳米微球包裹技术，以天然生物材料为载体的凝胶微囊不但可以控制负载药物以一定的速度释放，而且可以通过合适的释药途径延长药物的生理活性，提高药物的稳定性，从而使药物的药理活性达到较理想的效果。本发明中采用的天然包埋材料甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA) /明胶(gelatin)，由甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)和明胶(gelatin)按一定比例通过交联聚合得到,为无定型聚合物,共聚物具有更大的亲水性，可用于药物控释载体和组织工程细胞培养支架，具有组织相容性好，对人体安全无害等特点。复合基质细胞衍生因子-1 a和血小板源性生长因子-BB纳米微球的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA) /明胶(gelatin)凝胶微囊具有长时间释放两种细胞因子，募集机体内源性干细胞的特点。本发明采用的明胶是来源于动物胶原的一种天然生物材料，化学性质比较稳定，无毒，具有吸湿性，绝大多数都易溶于水，可溶于乙醇、丙酮、氯仿等多数有机溶剂，通常情况下不活泼、不水解、耐热，可用热压灭菌。在室温条件下，分子量在100以下的明胶通常为无色或几乎无色的透明澄清粘稠液体，分子量在2000以上的为固体。明胶水溶液pH值成微酸性或微碱性，其分子链上两段的羟基都具有反应活性，能发生所有脂肪族羟基所能进行的化学反应。明胶目前应用极为广泛，它可应用于医药、卫生、食品、化工等综合能更多领域，具有以下优点:首先明胶是无毒和低免疫原性亲水聚合物，具有良好的生物相容性；其次，明胶是种两亲性物质，既可以溶解于水，又可以溶解于绝大多数的有机溶剂，明胶具有化学惰性，对绝大多数化学反应稳定，但在其羟基火化后又易于跟含有氨基等化合物进行键合，把许多优良性质转移到结合物中；除此以外，明胶价格相对低廉，适宜规模化生产。本发明采用的右旋糖酐(Dextran, Dex)对人体无毒无害,是经美国FDA批准用作血浆代替品的材料，具有良好的生物可降解性，使用后能被自然界中微生物完全降解，最终生成二氧化碳和水，不污染环境，是公认的环境友好材料。本发明采用的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐由右旋糖酐与甲基丙烯酸缩水甘油酯按一定比例通过共聚得到，为无定型聚合物，玻璃化转变温度为40-55°C，粘度IV (dl/g)范围:0.10 1.0。作为优选，甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)中，右旋糖酐(Dextran T40)分子量为37-39.6kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯和右旋糖酐的聚合比例为1:80-120。甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为
1:(0.6-1.2):(0.05-0.09)。本发明优选稳定剂米用重均分子量为4_6万的海藻酸钠,分子式为(C6H708Na)n,主要由海藻酸的钠盐组成，由a-L-甘露糖醛酸(M单元)与b-D-古罗糖醛酸(G单元)依靠1，4-糖苷键连接并由不同GGGMMM片段组成的共聚物。海藻酸钠是一种天然多糖，具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性。本发明在携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性凝胶微囊制剂中，包括携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性凝胶微囊以及药学上可接受的辅料；优选药学上可接受的辅料为聚氧乙烯聚氧丙烯醚。其中，聚氧乙烯聚氧丙烯醚(泊洛沙姆)是一种高分子非离子型表面活性剂，为美国国家处方集新增加的药物辅助材料，具有在低温下(4_5°C )为液体，体温下为凝胶的独特性质。凝胶具有黏附性能好，不易在骨创伤组织脱落和挥发的优点。本发明提供的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性凝胶微囊制剂在4-5°C为可流动的胶体，20-38°C为凝胶。


下面结合附图和具体实施例，对本发明作进一步详细说明。图1为冻干的本发明携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊的扫描电镜图；图2为单个的本发明携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊的电镜放大电镜图；图3为本发明携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊的局部放大电镜图，其中微孔中复合有纳米微球；图4为本发明携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊的剖面放大电镜图，其中微囊微孔中复合有纳米微球；图5为本发明的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有具有细胞募集性的凝胶微囊粒径分布图。图6为本发明的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊体外释药曲线图。
具体实施例方式本发明中，右旋糖酐购自夏斯生物科技公司；甲基丙烯酸缩水甘油酯购自百灵威科技有限公司，明胶、海藻酸钠、基质细胞衍生因子-1 a和血小板源性生长因子-BB及其Elisa试剂盒购自SIGMA公司；磷酸盐缓冲液，购自西安化学试剂厂；聚氧乙烯聚氧丙烯醚(泊洛沙姆)，购自上海医药公司。实施例1:制备携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊(胶体溶液)分别称取5 U g基质细胞衍生因子-1a和5 ii g血小板源性生长因子-BB纳米微球分散于0.5g磷酸盐缓冲液中，待其全部溶解后作为水相；称取150mg甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐和明胶(甲基丙烯 酸缩水甘油酯右旋糖酐的重均分子量为100-105kDa，明胶的重均分子量为IOOkDa,聚丙基丙烯酰胺的重均分子量为17kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1:0.6:0.05)溶于5g有机溶剂中(二氯甲烷:丙酮=6:2)作为油相；将上述水相、油相混合，超声分散Imin制备乳剂，备用。将上述乳剂缓慢加入20g磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液中含200mg海藻酸钠)，超声分散lmin，并继续在室温低速搅拌3h，除去有机溶剂，即制得携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊。实施例2:制备携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊(胶体溶液)分别称取10 ii g基质细胞衍生因子-1a和10 ii g血小板源性生长因子-BB纳米微球分散于Ig磷酸盐缓冲液中，待其全部溶解后作为水相；称取300mg甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐和明胶(甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐的重均分子量为100-105kDa，明胶的重均分子量为IOOkDa,聚丙基丙烯酰胺的重均分子量为17kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1:1:0.07)溶于IOg有机溶剂中(二氯甲烷:丙酮=6:2)作为油相；将上述水相、油相混合，超声分散Imin制备乳剂，备用。将上述乳剂缓慢加入40g磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液中含400mg海藻酸钠)，超声分散lmin，并继续在室温低速搅拌5h，除去有机溶剂，即制得携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊。实施例3:制备携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊(胶体溶液)分别称取20 ii g基质细胞衍生因子-1a和20 y g血小板源性生长因子-BB纳米微球分散于2g磷酸盐缓冲液中，待其全部溶解后作为水相；称取600mg甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐和明胶(甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐的重均分子量为100-105kDa，明胶的重均分子量为IOOkDa,聚丙基丙烯酰胺的重均分子量为17kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1:1.2:0.09)溶于20g有机溶剂中(二氯甲烷:丙酮=6:2)作为油相；将上述水相、油相混合，超声分散Imin制备乳剂，备用。将上述乳剂缓慢加入80g磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液中含800mg海藻酸钠)，超声分散lmin，并继续在室温低速搅拌4h，除去有机溶剂，即得制得携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊。实施例4:制备携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊(胶体溶液)分别称取4 ii g基质细胞衍生因子-1a和4 ii g血小板源性生长因子-BB纳米微球分散于0.6g磷酸盐缓冲液中，待其全部溶解后作为水相；称取120mg甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐和明胶(甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐的重均分子量为100-105kDa，明胶的重均分子量为IOOkDa,聚丙基丙烯酰胺的重均分子量为17kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1:1:0.09)溶于6g有机溶剂中(二氯甲烷:丙酮=6:2)作为油相；将上述水相、油相混合，超声分散1.2min制备乳剂，备用。将上述乳剂缓慢加入16g磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液中含160mg海藻酸钠)，超声分散
0.8min,并继续在室温低速搅拌3h，除去有机溶剂，即得制得携带基质细胞衍生因子_1 a纳米微球和血小板源 性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊。
实施例5:制备携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊(胶体溶液)分别称取6 ii g基质细胞衍生因子-1a和6 ii g血小板源性生长因子-BB纳米微球分散于0.4g磷酸盐缓冲液中，待其全部溶解后作为水相；称取150mg甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐和明胶(甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐的重均分子量为100-105kDa，明胶的重均分子量为IOOkDa,聚丙基丙烯酰胺的重均分子量为17kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1:1.2:0.07)溶于4g有机溶剂中(二氯甲烷:丙酮=6:2)作为油相；将上述水相、油相混合，超声分散0.Smin制备乳剂，备用。将上述乳剂缓慢加入24g磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液中含240mg海藻酸钠)，超声分散1.2min,并继续在室温低速搅拌5h，除去有机溶剂，即制得携带基质细胞衍生因子_1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊。实施例6:制备携 带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊制剂在实施例1制备的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊胶体溶液中，在低温(温度低于20°C)搅拌下，少量多次共加入3.75g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。实施例7:制备携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊制剂在实施例2制备的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊胶体溶液中，在低温(温度低于20°C)搅拌下，少量多次共加入7.5g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。实施例8:制备携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊制剂在实施例3制备的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊胶体溶液中，在低温(温度低于20°C)搅拌下，少量多次共加入15g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。实施例9:制备携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊制剂在实施例4制备的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊胶体溶液中，在低温(温度低于20°C)搅拌下，少量多次共加入3.0g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。实施例10:制备携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊制剂在实施例5制备的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊胶体溶液中，在低温(温度低于20°C)搅拌下，少量多次共加入4.5g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。实施例11分别取实施例1至5中制备的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊胶体溶液各10 y L，共5份样本，冷冻干燥后用光学显微镜观察微球的表面形态，微囊表面呈多孔状，囊球体大小较均匀。将微球置于载玻片上，尽量对微球进行分散后，在显微镜下随机选取I个视野进行拍照，以照片上的标尺为依据对每一个微囊球的直径进行测量。每5pm为单位，直径±2.5iim的全部计入，平均粒径为38.46-47.3 iim，粒径分布范围较窄。实施例12分别取基质细胞衍生因子-1 a和血小板源性生长因子-BB对照品约10mg，精密称重，置于IOOg量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，依次稀释，使实际配置的对照品溶液浓度分别为0.1，0.2,0.5，l，5，10，20，50ng/L，加入到微量反应板的微孔中。按照SIGMA公司提供的操作程序，采用酶联免疫吸附法(ELISA)在HTS7000紫外荧光高效分析仪测定标准样品在在490nm波长的吸光度(0D)。以OD值为纵坐标，标准的基质细胞衍生因子-1 a和血小板源性生长因子-BB浓度C进行对数直线回归，绘制标准曲线。回归方程为:A=0.48901+0.08603C n=7，r=0.9964，由图像分析可知，在l_600nm范围内为线性关系较好的直线方程，基质细胞衍生因子-1 a和血小板源性生长因子-BB浓度的对数均与吸收度有定量关系。将实施例1制备的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊的胶体溶液在4°C、40000rpm条件下离心,2h后分离样品中上清液，测定基质细胞衍生因子-1 a和血小板源性生长因子-BB浓度，分别计算基质细胞衍生因子-1 a和血小板源性生长因子-BB的载药量和包封率。其中，载药量公式:
权利要求
1.一种具有细胞募集性的凝胶微囊，其特征在于，包含基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球、重均分子量为100-105kDa的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、重均分子量为IOOkDa的明胶、重均分子量为17kDa聚丙基丙烯酰胺，以及助溶齐U、乳化剂和稳定剂。
2.如权利要求1所述的具有细胞募集性的凝胶微囊，其特征在于，所述基质细胞衍生因子-1 a纳米微球、血小板源性生长因子-BB纳米微球、甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、明胶和聚丙基丙烯酰胺的质量比为(0.6-1.0): (0.6-1.0): (1.6X104-2.0XlO4):(1.0XlO4-L 6X IO4):(2.2X 103-3.4X 103)。
3.如权利要求1所述的具有细胞募集性的凝胶微囊，其特征在于，所述助溶剂包含磷酸盐缓冲液；所述乳化剂包含体积比为(2-4):1的二氯甲烷和丙酮混合溶剂；所述稳定剂包含重均分子量为40-60kDa的海藻酸钠。
4.如权利要求1所述的具有细胞募集性的凝胶微囊，其特征在于，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐中，右旋糖酐分子量为37-39.6kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯和右旋糖酐的聚合比例为1:(80-120);所述甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为 I: (0.6-1.2): (0.05-0.09)。
5.如权利要求1所述的具有细胞募集性的凝胶微囊，其特征在于，所述细胞募集性的凝胶微囊的平均粒径为38.46-47.3um,孔隙率为74%_90%，平均孔径为0.4-3.4 Um0
6.如权利要求1所述的具有细胞募集性的凝胶微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:步骤1:称取质量为6.0X IO4-L OX IO5份的磷酸盐缓冲液，将质量为0.6-1.0份的基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和0.6-1.0份的血小板源性生长因子-BB纳米微球分散于磷酸盐缓冲液中，制成两种纳米微球质量浓度分别为6.0X 10_4-3.4X 10_3%的水相溶液； 步骤2:将质量为1.6X 104-2.0X IO4份的重均分子量为100-105kDa的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、1.0X 104-1.6X 104份的重均分子量为IOOkDa的明胶、2.2X103-3.4 X IO3份的重均分子量为17kDa聚丙基丙烯酰胺分别溶于8.0X IO5-L 2 X IO6份的体积比为(2-4):1的二氯甲烷和丙酮混合溶剂中，冰浴超声分散0.8-1.2min，制成质量浓度为2% -4.5%的油相溶液； 步骤3:将所述水相溶液和所述油相溶液制备成油包水型乳液，将质量为4.0X IO4份的重均分子量为4-6万的海藻酸钠溶于剩余质量份的磷酸缓冲液中，与所述油包水型乳液混合后冰浴超声分散8-12min,制成微乳液； 步骤4:将所述微乳液在室温下高速搅拌60-120min，自然挥发或抽提出去二氯甲烷，制得所述所述携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊。
7.如权利要求1至5任一项或如权利要求6所述的制备方法制得的携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊在治疗牙周炎药物中的应用。
8.一种携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊制剂，其特征在于，包括权利要求1至5任一项或权利要求6所述的制备方法制得的具有细胞募集性的凝胶微囊以及药学上可接受的辅料。
9.如权利要求8所述的携带基质细胞衍生因子-1a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊制剂，其特征在于，所述药学上可接受的辅料为聚氧乙烯聚氧丙烯醚。
10.一种携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:在低于20°C的温度下，将权利要求6所述的制备方法制得的具有细胞募集性的凝胶微囊边搅拌边加A 6.0XlO3-Q.0X IO3重量份的聚氧乙烯聚氧丙烯醚，溶解后制得携带基质细胞衍生因子-1 a纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊制剂。
全文摘要
本发明涉及组织再生生物材料研发领域，公开了一种携带基质细胞衍生因子-1α纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球的具有细胞募集性的凝胶微囊及其制备方法、以及具有细胞募集性的凝胶微囊制剂及其制备方法。该具有细胞募集性的凝胶微囊及其制剂可应用于牙科，通过募集机体自身干细胞，促进内源性牙周组织再生。该具有细胞募集性的凝胶微囊，其特征在于，包含基质细胞衍生因子-1α纳米微球和血小板源性生长因子-BB纳米微球、重均分子量为100-105kDa的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、重均分子量为100kDa的明胶、重均分子量为17kDa聚丙基丙烯酰胺，以及助溶剂、乳化剂和稳定剂。
文档编号A61K38/19GK103169951SQ20131008525
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月15日 优先权日2013年3月15日
发明者陈发明, 孙海花, 鲁红, 安莹, 高丽娜 申请人:中国人民解放军第四军医大学