一种用于活细胞成像的荧光探针方法
【专利摘要】本发明是一种用于活性细胞中Zn2+成像的荧光探针方法，其特征是以1,5-二(7-羟基-8-香豆素亚甲基)-二氨基脲，简称探针s3，为微量Zn2+的荧光增强型探针，探针s3及Zn2+能分别渗透到活性细胞内，与细胞具有良好的相容性，通过探针s3对细胞内Zn2+染色后，用荧光倒置显微镜检测显现清晰的蓝色荧光细胞图像，探针s3是活性细胞的荧光照影试剂，探针s3的化学结构式为。
【专利说明】一种用于活细胞成像的荧光探针方法
【技术领域】
[0001]本发明属分析化学领域，具体地说是一种用于活体细胞成像的荧光探针方法。
[0002]【背景技术】:突光传感器与突光显微技术的结合，使突光传感器在生物活性物质检测和细胞成像方面得到广泛应用。对生物活性物质而言，检出灵敏度极限是单个分子。活细胞成像技术是生命科学【技术领域】种重要的研究手段，与固定细胞研究结合起来，可以解释活细胞中的多种生命现象。近年来，随着生命科学的不断发展，人们对细胞内的活性物种、细胞信号传导及细胞凋亡等方面的研究越来越深入。美国加州大学戴维斯分校(UC Davis)生物光子学科学技术中心(CBST)的科研人员首次通过荧光标记成功地对活肿瘤细胞内部的纳米尺寸区室的运动进行了成像。这一成果为未来理解癌症和一大批其他疾病的分子原因和生物力学的突破进展带来了希望，它还能促进神经科学和干细胞研究等领域。荧光成像分析是目前广泛应用于活细胞分析的一种高灵敏的可视化分析技术。目前用于活细胞成像分析的荧光探针多为有机荧光染料分子，为活细胞分析提供了有效的探测手段。在实际应用中，这些有机荧光染料分子存在着荧光寿命较短、容易猝灭及稳定性差的缺点。所以，实现长时间的实时动态连续测定，提高可视化分析的选择性和精度是目前迫切需要解决的问题。而金属配合物荧光探针具有荧光寿命长、发射峰窄、稳定性好等发光性质，引起了人们的重视与关注。有机染料具有良好的光稳定性、合适的水溶性及很好的细胞膜通透性，而且在细胞内具有较强的荧光，合成相对简单，收率较高。作为细胞内的成像探针，必须满足(O良好的水溶性；(2)在生理条件下具有良好的热稳定性和动力学惰性；(3)良好的膜穿透性，并且对细胞是无毒的；(4)有较长的激发波长和较高的量子产率。
[0003]细胞内的小分子物种包括各种活性氧物种(单线态氧、过氧化氢、超氧负离子自由基等彡^^+^一+^^人^+等是人们研究关注的焦点’因为它们调控着细胞的诸多功能与性质，在细胞内起着非常重要的作用，因此实现活体细胞内各种生理活性小分子物种的实时在线动态检测对生命科学研究与发展具有重要的价值。
锌是继铁之后人体内含量最丰富的过渡金属离子，是许多生物过程如大脑功能和病理学、基因转录、免疫功能和哺乳动物繁殖中的重要辅助因子，它的新陈代谢紊乱会引起诸多疾病。锌还参与病理过程，如阿尔茨海默氏症、癫痫、缺血性中风和婴儿腹泻等。大多数生物组织中锌离子或是被紧密地绑定于蛋白、或游离、或螯合等多种形态存在，细胞内锌离子的检测是人们研究的热点。荧光传感器的主要目标是对出现在人体各种组织中，包括大脑、肠道、胰腺和视网膜的锌离子的检测。到目前为止，对锌离子的荧光传感器已经成功应用在活体细胞、海马切片的锌离子荧光成像。目前利用探针检测锌离子的相关报道已有不少，但真正能够应用到活细胞内成像的却不多。文献报道了一种以双(2-吡啶甲基)胺为Zn2+螯合基团、二乙基三胺五乙酸为配体的稀土铕探针，并将其用于HeLa细胞内Zn2+的成像分析。
[0004]
【发明内容】
:本发明的目的在于研究一种能高灵敏、高选择的对活体细胞成像的荧光探针新方法。通过发明人研制合成的新的荧光探针，是一种对Zn2+高灵敏、高选择性检测识别的荧光探针，并能实现对活体细胞中微量Zn2+的荧光染色和成像。
[0005]本发明一种用于活细胞成像的荧光探针方法，是以1，5_ 二(7-羟基-8-香豆素亚甲基)-二氨基脲，简称探针s3，为细胞内微量Zn2+的荧光增强型探针，探针s3及Zn2+能分别渗透到活细胞内，与细胞具有良好的相容性，通过探针s3对细胞内Zn2+染色后，用荧光倒置显微镜检测出清晰的蓝色荧光细胞图像，探针s3是一种活细胞中Zn2+的荧光成像试剂。
[0006]本发明所述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，是用探针S3对细胞内Zn2+进行染色，用荧光倒置显微镜观测活体细胞，染色成像的具体方法为:活性PC3细胞经复苏接种于含10%胎牛血清以及含1%双抗的培养基(RPMI 1640)中，在温度为37°C，5% CO2及饱和湿度为100%的培养箱中培养，每隔2-3天传代I次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2X 14个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次，将细胞浸入含10μ mol ?171探针83(90(^1^咅养基+10(^11101 ?I/1 探针 s3 的 DMFAI2C^eI合溶液 100 μ L)中，在37°C，5%C02、饱和湿度100%的培养箱中孵育30 min，吸出含探针s3的培养液，用新鲜培养基清洗细胞三次，荧光倒置显微镜下观察并进行亮场和暗场拍照；再浸入含50 μ mol.L—1Zn2+ 溶液(900 μ L 培养基 +500 μ mol.171 Zn2+ 溶液 100 μ L)，在 37°C、5%C02、饱和湿度 100%的培养箱中孵育30 min,进行细胞内探针对Zn2+染色，吸出含Zn2+溶液的培养液，染色后的细胞再用新鲜培养基清洗三次，在荧光倒置显微镜下观察探针对细胞内Zn2+染色后的荧光成像，对细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像。
[0007]上述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，是细胞成像中，探针S3和Zn2+都能渗透到活体PC3细胞内，细胞呈圆滑饱满状，探针与细胞具有良好的相容性，未见细胞凋亡，对细胞无毒性；探针与Zn2+离子在细胞内染色后，荧光倒置显微镜检测显示了清晰的蓝色荧光细胞分布，染色具有特定区域的选择性聚集能力。
[0008]上述的一种用于活细胞成像的荧光探针技术，是所用的试剂为分析纯或生化试齐U，所用水为二次蒸馏水或生理盐水；所用活体PC3细胞为人体前列腺癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。
[0009]上述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，是所述探针S3化学结构式为:
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分子式:C21H14N4O7
分子量:434.09
熔点:大于300°C
溶解性:微溶于氯仿、二甲亚砜、N, N- 二甲基甲酰胺等，不溶于乙醇。
[0010]光谱性质:在N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液与水的混合溶剂(v/v，2/3)中的荧光激发波长是310nm,发射波长是454nm,紫外吸收波长是310nm。
[0011]上述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，是作为细胞成像的荧光探针S3，化学名称为1，5_ 二(7-羟基-8-香豆素亚甲基)-二氨基脲，是本发明人合成。
[0012]本发明合成的荧光探针s3作为细胞内的成像探针，满足了(I)良好的水溶性；(2)在生理条件下具有良好的热稳定性；(3)良好的膜穿透性，并且对细胞是无毒的；(4)与Zn2+有选择性、高灵敏的荧光增强作用，有较长的激发波长和较高的发光产率。利用探针s3在活体细胞内与Zn2+的染色作用，用荧光倒置显微镜能清晰获得发射蓝色荧光的细胞图像。发明了一种新颖的活体细胞的荧光成像技术。
[0013]本发明合成的荧光探针S3的结构经核磁共振波谱、质谱和红外光谱进行了表征。结构表征数据列于表1。
【权利要求】
1.一种用于活细胞成像的荧光探针方法，其特征是以1，5-二(7-羟基-8-香豆素亚甲基)-二氨基脲，简称探针s3，为细胞内微量Zn2+的荧光增强型探针，探针s3及Zn2+能分别渗透到活细胞内，与细胞具有良好的相容性，通过探针s3对细胞内Zn2+染色后,用荧光倒置显微镜检测出清晰的蓝色荧光细胞图像，探针s3是一种活细胞中Zn2+的荧光成像试剂。
2.根据权利要求1所述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，其特征是用探针s3对细胞内Zn2+进行染色，用荧光倒置显微镜观测活体细胞，染色成像的具体方法为:活性PC3细胞经复苏接种于含10%胎牛血清以及含1%双抗的培养基(RPMI 1640)中，在温度为370C，5% CO2及饱和湿度为100%的培养箱中培养，每隔2-3天传代I次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2 X 14个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次，将细胞浸入含10 μ mo I. 1探针s3 (900 μ L培养基+100 μ mo I.L—1探针s3的DMF/H20混合溶液100 μ L)中，在37°C，5%C02、饱和湿度100%的培养箱中孵育30 min，吸出含探针s3的培养液，用新鲜培养基清洗细胞三次，荧光倒置显微镜下观察并进行亮场和暗场拍照；再浸入含 50 μ mol. 1 Zn2+溶液(900 μ L 培养基+500 μ mol. 1 Zn2+溶液 100 μ L)，在 37°C、5%C02、饱和湿度100%的培养箱中孵育30 min,进行细胞内探针对Zn2+染色，吸出含Zn2+溶液的培养液，染色后的细胞再用新鲜培养基清洗三次，在荧光倒置显微镜下观察探针对细胞内Zn2+染色后的荧光成像，对细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像。
3.根据权利要求1所述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，其特征是细胞成像中，探针s3和Zn2+都能渗透到活体PC3细胞内，细胞呈圆滑饱满状，探针与细胞具有良好的相容性，未见细胞凋亡，对细胞无毒性；探针与Zn2+离子在细胞内染色后，荧光倒置显微镜检测显示了清晰的蓝色荧光细胞分布，染色具有特定区域的选择性聚集能力。
4.根据权利要求2所述的一种用于活细胞成像的荧光探针技术，其特征是所用的试剂为分析纯或生化试剂，所用水为二次蒸馏水或生理盐水；所用活体PC3细胞为人体前列腺癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。
5.根据权利要求1所述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，其特征是所述探针s3化学结构式为:
熔点:大于300 °C溶解性:微溶于氯仿、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺等，不溶于乙醇，光谱性质:在N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液与水的混合溶剂(v/v，2/3)中的荧光激发波长是310nm,发射波长是454nm,紫外吸收波长是310nm。
6.根据权利要求1所述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，其特征是作为细胞成像的荧光探针s3，化学名称为1，5-二(7-羟基-8-香豆素亚甲基)-二氨基脲，是本发明人合成。
【文档编号】C07D311/16GK104198449SQ201410387054
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】李丽, 牟兰, 曾晞, 沈韵 申请人:贵州大学