抗体纯化的制作方法
【专利摘要】本发明涉及抗体纯化。本发明提供用以从包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，所述方法包括离子交换步骤，其中将该混合物施加到第一离子交换材料，由此获得HCP降低的抗体制品。
【专利说明】抗体纯化
[0001]本申请是国际申请日为2007年4月4日的国际申请PCT/US2007/008359进入中国、申请号为200780019220.7的题为“抗体纯化”的发明专利申请的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求2006年4月5日提交的美国临时申请系列号60/789，725的优先权和2006年4月6日提交的美国临时申请系列号60/790，414的优先权，每个临时申请的内容通过引用整体结合到本文中。
[0004]【技术领域】和【背景技术】
[0005]大规模且经济地纯化蛋白质对于生物技术产业来说是一个日益重要的问题。通常，蛋白质是使用经工程改造能产生目的蛋白质的哺乳动物细胞系或细菌细胞系通过细胞培养产生的，所述工程改造是将包含编码该蛋白质的基因的重组质粒插入到该细胞系中。由于所用的细胞系是活的生物，必需给它们喂养包含糖类、氨基酸和生长因子的复杂生长培养基，这种培养基通常从动物血清的制品(preparation)供应。要将所需的蛋白质与喂养细胞的化合物混合物和与细胞本身的副产物进行分离，至足够作为人类治疗剂使用的纯度，这是一个极大的难题。
【发明内容】
[0006]对于改进的、用以获得宿主细胞蛋白质(包括组织蛋白酶L酶原(procathepsinL))含量降低的抗体制品的方法 ，人们是有需求的。本发明提供用以纯化宿主细胞表达系统中所表达的抗体的方法，其中所得抗体制品包含的宿主细胞蛋白质(包括组织蛋白酶L酶原)的含量降低。本发明的改进方法还包括准确检测宿主细胞蛋白质的可再现方法的开发，以及动力学测定法。
[0007]本发明提供用以从包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，所述方法包括离子交换步骤，其中将该混合物施加到第一离子交换材料，由此获得HCP降低的抗体制品。在一个实施方案中，该离子交换分离步骤包括使该混合物通过第一离子交换材料，由此获得HCP水平降低的第一洗脱物(eluate)。在一个实施方案中，本发明的该方法还包括第二离子交换分离步骤，其中将第一洗脱物施加到第二离子交换材料，由此获得HCP水平降低的第一流通物(flowthrough)。在另一个实施方案中，本发明的该方法还包括疏水相互作用分离步骤，其中将第一流通物施加到第一疏水相互作用材料，由此获得HCP水平降低的第二洗脱物。
[0008]在本发明的一个实施方案中，该离子交换分离步骤包括第一离子交换层析步骤，其中将该混合物荷载到包含第一离子交换材料的柱子上，由此获得HCP水平降低的第一洗脱物。在一个实施方案中，本发明还包括第二离子交换层析步骤，该步骤包括将第一洗脱物荷载到包含第二离子交换材料的柱子上，由此获得第一流通物。
[0009]在一个实施方案中，本发明还包括疏水相互作用分离步骤，该步骤包括将第一流通物荷载到包含第一疏水相互作用材料的柱子上，由此获得第二洗脱物。在一个实施方案中，疏水相互作用分离步骤包括疏水相互作用层析。在一个实施方案中，疏水相互作用层析是苯基琼脂糖凝胶层析。在又另一个实施方案中，荷载到疏水相互作用材料上的抗体量为约20至约40克抗体/升疏水相互作用材料。在还另一个实施方案中，荷载到疏水相互作用材料上的抗体量为约30至约36克抗体/升疏水相互作用材料。
[0010]在一个实施方案中，离子交换层析步骤是阳离子交换层析。在另一个实施方案中，阳离子交换层析是与磺酸基连接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物树脂。在又另一个实施方案中，本发明还包括以多个洗涤步骤洗涤该离子交换材料。在一个实施方案中，该多个洗涤步骤包括电导率的增加。在一个实施方案中，该离子交换材料用包含约40-50%洗脱缓冲液和约50-60%水(例如注射用水(WFI))的洗液进行洗涤。在一个实施方案中，该洗脱缓冲液是20mM Na2PO4,150mM氯化钠，pH7。
[0011] 在一个实施方案中，将第一洗脱物在进行第一离子交换层析步骤前先进行病毒灭活。在一个实施方案中，该病毒灭活是通过pH病毒灭活(例如降低第一洗脱物的pH，从而使病毒灭活)来实现。
[0012]在本发明的一个实施方案中，第二离子交换层析步骤包括阴离子交换层析。在一个实施方案中，该阴离子交换层析是Q琼脂糖凝胶层析。
[0013]本发明还提供用以从包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，其中该HCP水平降低如下来实现:改变第一洗脱物的pH和电导率，使得第一洗脱物的PH和电导率与第二离子交换材料的pH和电导率基本上相似。在一个实施方案中，第二离子交换材料的PH为约7.7至约8.3。在另一个实施方案中，将第一洗脱物的PH改变至约7.7至约8.3。在又另一个实施方案中，将第一洗脱物的pH改变至约
8.0。在一个实施方案中，第二离子交换材料的电导率为约3.5mS/cm至约5.2mS/cm，或者约3.5mS/cm至约4.9mS/cm。在一个实施方案中，将第一洗脱物的电导率改变至约3.5mS/cm 至约 5.2mS/cm 或者约 3.5mS/cm 至约 4.9mS/cm。
[0014]在本发明的一个实施方案中，经HCP ELISA测定，第一洗脱物包含的HCP比该混合物少约90至约100倍。在另一个实施方案中，经HCP ELISA测定，第一流通物包含的HCP比第一洗脱物少约840至约850倍。在还另一个实施方案中，经HCP ELISA测定，第二洗脱物包含的HCP比第一流通物少约3至约5倍。
[0015]本发明提供用以从包含抗体和组织蛋白酶L酶原的混合物生产组织蛋白酶L酶原降低的抗体制品的方法，所述方法包括离子交换分离步骤，其中将该混合物施加到第一离子交换材料，由此获得组织蛋白酶L酶原降低的抗体制品。
[0016]在一个实施方案中，该离子交换分离步骤包括使该混合物通过第一离子交换材料，由此获得组织蛋白酶L酶原水平降低的第一洗脱物。在一个实施方案中，该离子交换分离步骤包括第一离子交换层析步骤，其中将该混合物荷载到包含第一离子交换材料的柱子上，由此获得组织蛋白酶L酶原水平降低的第一洗脱物。
[0017]在一个实施方案中，本发明还包括第二离子交换分离步骤，其中将第一洗脱物施加到第二离子交换材料，由此获得组织蛋白酶L酶原水平降低的第一流通物。在一个实施方案中，本发明还包括第二离子交换层析步骤，该步骤包括将第一洗脱物荷载到包含第二离子交换材料的柱子上，由此获得第一流通物。
[0018]在一个实施方案中，本发明还包括疏水相互作用分离步骤，该步骤包括将第一流通物荷载到包含第一疏水相互作用材料的柱子上，由此获得组织蛋白酶L酶原水平降低的第二洗脱物。在另一个实施方案中，本发明还包括疏水相互作用分离步骤，该步骤包括将第一流通物荷载到包含第一疏水相互作用材料的柱子上，由此获得第二洗脱物。[0019]在一个实施方案中，离子交换层析步骤是阳离子交换层析，包括但不限于与磺酸基连接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物树脂。
[0020]在另一个实施方案中，离子交换层析步骤还包括以多个洗涤步骤洗涤该离子交换材料。在一个实施方案中，该多个洗涤步骤包括电导率的增加。在一个实施方案中，该离子交换材料用包含约40-50%洗脱缓冲液和约50-60%水(例如注射用水(WFI))的洗涤缓冲液进行洗涤。在又另一个实施方案中，该洗脱缓冲液是20mM Na2PO4,150mM氯化钠，pH7。
[0021]在本发明的一个实施方案中，将第一洗脱物在进行离子交换层析步骤前先进行病毒灭活。在一个实施方案中，该病毒灭活是通过pH病毒灭活(例如降低第一洗脱物的pH,从而使病毒灭活)来实现。
[0022]在一个实施方案中，该离子交换层析步骤包括阴离子交换层析。在一个实施方案中，该阴离子交换层析是Q琼脂糖凝胶层析。
[0023]本发明还描述了这样的方法，其中组织蛋白酶L酶原水平降低如下来实现:改变第一洗脱物的PH和电导率，使得第一洗脱物的pH和电导率与第二离子交换材料的pH和电导率基本上相似。在一个实施方案中，第二离子交换材料的pH为约7.7至约8.3。在另一个实施方案中，将第一洗脱物的PH改变至约7.7至约8.3。在又另一个实施方案中，将第一洗脱物的PH改变至约8.0。在还另一个实施方案中，第二离子交换材料的电导率为约
3.5mS/cm至约5.2mS/cm,或者约3.5mS/cm至约4.9mS/cm。在一个实施方案中，将第一洗脱物的电导率改变至约3.5mS/cm至约5.2mS/cm,或者约3.5mS/cm至约4.9mS/cm。
[0024]在本发明的一个实施方案中，该疏水相互作用分离步骤包括疏水相互作用层析。在一个实施方案中，疏水相互作用层析是苯基琼脂糖凝胶层析。在又另一个实施方案中，荷载到疏水相互作用材料上的抗体量为约20至约40克抗体/升疏水相互作用材料。在还另一个实施方案中，荷载到疏水相互作用材料上的抗体量为约30至约36克抗体/升疏水相互作用材料。
[0025]在一个实施方案中，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第一洗脱物包含的组织蛋白酶L活性为约25至约60RFU/s/mg抗体。
[0026]在另一个实施方案中，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第一流通物包含的组织蛋白酶L活性为约0.4至约4RFU/s/mg抗体。
[0027]在又另一个实施方案中，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第二洗脱物包含的组织蛋白酶L活性为约0.5至约1.5RFU/s/mg抗体
[0028]在本发明的一个实施方案中，组织蛋白酶L酶原的水平有重现性地低下(reproducibly 1ff)。
[0029]在一个特别优选的方面，本发明提供这样的抗体纯化方法，其中可将高含量的抗体-HCP混合物荷载到离子交换树脂上，以实现混合物中HCP的降低。这个方法的优点是，它可用于这样的抗体-HCP混合物，该混合物在被施加到离子交换树脂前未曾被施以A蛋白捕捉。A蛋白捕捉通常被用作抗体纯化程序中的初始纯化步骤，作为除去HCP的手段，其中将抗体-HCP混合物施加到A蛋白柱，使得抗体与A蛋白结合，而HCP则流过。因此，本发明的方法可用来纯化大载量的抗体-HCP混合物，而无需执行A蛋白层析作为初始步骤。[0030]因此，在一个实施方案中，本发明提供用以从包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，所述方法包括以下步骤:
[0031](a)将该混合物施加到在平衡缓冲液中的第一离子交换树脂，其中施加量大于30克抗体/升树脂；
[0032](b)以多个洗涤步骤从该树脂洗涤HCP ;和
[0033](c)用该洗脱缓冲液从该树脂洗脱该抗体形成第一洗脱物，
[0034]由此获得该HCP降低的抗体制品。
[0035]在另一个实施方案中，施加量约为35-70克抗体/升树脂。在还另一个实施方案中，施加量约为70克抗体/升树脂。在一个优选的实施方案中，包含抗体和至少一种HCP的该混合物，在被施加到第一离子交换树脂前，没有被施以A蛋白捕捉(例如没有被施加到A蛋白柱)。
[0036]优选地，该多个洗涤步骤包括至少第一次洗涤和第二次洗涤，其中从第一次洗涤到第二次洗涤电导率有增加。更优选地，第一次洗涤是用平衡缓冲液进行，第二次洗涤是用洗脱缓冲液和水(例如WFT)的混合物进行。例如,洗脱缓冲液和水的混合物可包含约40-50%洗脱缓冲液和约50-60%水。更优选地，洗脱缓冲液和水的混合物可包含约45%洗脱缓冲液和约55%水。在一个优选的实施方案中，洗脱缓冲液包含20mM磷酸钠和150mM氯化钠。在这个情况中，其中含45%洗脱缓冲液和约55%水的洗脱缓冲液和水混合物，是9mM磷酸钠和68mM氯化钠。在一 个优选的实施方案中，第一次洗涤是用包含20mM磷酸盐、25mM氯化钠的平衡缓冲液进行，第二次洗涤是用包含9mM磷酸盐、68mM氯化钠的缓冲液(45 %洗脱缓冲液、55%水)进行，洗脱缓冲液包含20mM磷酸盐、150mM氯化钠。
[0037]在一个实施方案中，该使用第一离子交换树脂的方法在pH7下进行。在另一个实施方案中，该使用第一离子交换树脂的方法在PH5下进行。在还另一个实施方案中，该使用第一离子交换树脂的方法在约PH5至约pH7范围内或者pH5至pH7范围内的某pH下进行。如使用PH7，优选施加约35克抗体/升树脂。如使用pH5，优选施加约70克抗体/升树脂。如使用在约PH5至约pH7范围内(例如pH5至pH7)的某pH，优选施加的抗体量为约35至约70克抗体/升树脂(例如35-70克抗体/升树脂)。
[0038]在一个优选的实施方案中，通过将较多的抗体荷载到树脂上(例如约70克抗体/升树脂)，来实现(例如在PH5下)更好地从抗体-HCP混合物清除HCP，这比将较少的抗体荷载到树脂上(例如约30克抗体/升树脂)所实现的清除更好。据认为这是由于当使用这样的条件时抗体将HCP从树脂上置换下来的结果，在该条件下抗体对树脂的结合亲和力显著大于HCP对树脂的结合亲和力。
[0039]优选地，第一离子交换树脂是阳离子交换树脂。优选地，将该阳离子交换树脂形成柱子，将包含抗体和至少一种HCP的混合物施加到该柱子。优选地，该阳离子交换树脂包含与磺酸基连接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物树脂(例如Fractogel S)。或者，该阳离子交换树脂可包含例如与磺酸基(如锍离子或磺乙基)连接的如下树脂:基于甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯的合成聚合物、二氧化娃、带葡聚糖表面延伸剂(dextran surfaceextender)的高度交联琼脂糖、烯丙基葡聚糖与N, N-亚甲基双丙烯酸树脂的交联共聚物。
[0040]在本发明的另一个方面，在进行上述的使用第一离子交换树脂的方法后，该方法还包括将第一洗脱物进行病毒灭活步骤。例如，其中病毒灭活可通过PH病毒灭活来实现，以形成病毒灭活制品(例如，将第一洗脱物施以低PH条件，如pH约3.5，从而使病毒灭活)。优选地，将病毒灭活制品施加到第二离子交换树脂，其中在将病毒灭活制品施加到第二离子交换树脂前，将病毒灭活制品的PH和电导率调整到与第二离子交换树脂的pH和电导率基本相似。例如，第二离子交换树脂的PH可在约pH7.7至约pH8.3的范围，可将病毒灭活制品的pH调整到约pH7.7至约pH8.3的范围。在另一个实施方案中，第二离子交换树脂的pH可在约PH7.8至约pH8.2的范围，可将病毒灭活制品的pH调整到约pH7.8至约pH8.2的范围。更优选地，第二离子交换树脂的PH为约pH8.0，将病毒灭活制品的pH调整到约pH8.0。此外，第二离子交换树脂的电导率可在约3.5mS/cm至约5.2mS/cm的范围，将病毒灭活制品的电导率调整到约3.5mS/cm至约5.2mS/cm的范围。优选地，第二离子交换树脂的电导率为约5.0mS/cm，将病毒灭活制品的电导率调整到约5.0mS/cm。
[0041]在一个优选的实施方案中，第二离子交换树脂是阴离子交换树脂。例如，阴离子交换树脂可以是Q琼脂糖凝胶树脂。优选地，将第二离子交换树脂形成柱子，将病毒灭活制品施加到该柱子上，由此获得第一流通物。[0042]在本发明的另一个方面，从第二离子交换树脂获得第一流通物后，可将第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此获得第二洗脱物。在一个优选的实施方案中，该疏水相互作用柱是苯基琼脂糖凝胶柱。在一个实施方案中，施加到疏水相互作用柱的第一流通物包含约20至约40克抗体/升疏水相互作用柱材料。在另一个实施方案中，施加到疏水相互作用柱的第一流通物包含约30至约36克抗体/升疏水相互作用柱材料。由于纯化过程中的初始步骤的效率，已发现没有必要将从疏水相互作用柱获得的第二洗脱物进行产物峰分级分离。因此，在一个实施方案中，没有将第二洗脱物进行产物峰分级分离。
[0043]在特别优选的一个实施方案中，本发明的用以从包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，包括以下步骤:
[0044](a)将该混合物施加到在平衡缓冲液中的阳离子交换树脂，其中该混合物在施加到该阳离子交换树脂前未曾被施以A蛋白捕捉，且其中施加量大于30克抗体/升树脂；
[0045](b)以多个洗涤步骤从该阳离子交换树脂洗涤HCP ；
[0046](，c)用该洗脱缓冲液从该阳离子交换树脂洗脱该抗体，以形成第一洗脱物；
[0047](d)将第一洗脱物进行病毒灭活步骤；
[0048](e)将所得病毒灭活制品施加到阴离子交换树脂，以获得第一流通物；和
[0049](f)将第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此获得第二洗脱物；
[0050]从而获得HCP降低的抗体制品。
[0051]在一个实施方案中，该阳离子交换树脂为PH7，施加量约为35克抗体/升树脂。在另一个实施方案中，该阳离子交换树脂为PH5，施加量约为70克抗体/升树脂。在还另一个实施方案中，pH在约pH5至约pH7(例如pH5to pH7)的范围，施加的抗体量为约35至约70克抗体/升树脂(例如35-70克抗体/升树脂)。
[0052]优选地，该多个洗涤步骤包括用采用平衡缓冲液的第一洗液和采用洗脱缓冲液和水混合物的第二洗液来洗涤该树脂。例如，该洗脱缓冲液和水混合物可包含约40-50%洗脱缓冲液和约50-60%水(例如WFI)，更优选约45%洗脱缓冲液和约55%水(例如WFI)。在一个优选的实施方案中，洗脱缓冲液包含20mM磷酸钠和150mM氯化钠。在这个情况中，其中含45%洗脱缓冲液和约55%水的洗脱缓冲液和水混合物，是9mM磷酸钠和68mM氯化钠。在一个优选的实施方案中，第一次洗涤是用包含20mM磷酸盐、25mM氯化钠的平衡缓冲液进行，第二次洗涤是用包含9mM磷酸盐、68mM氯化钠的缓冲液(45%洗脱缓冲液、55%水)进行，洗脱缓冲液包含20mM磷酸盐、150mM氯化钠。
[0053]优选地，在上述的包括步骤(a)到(f)的方法中，在将病毒灭活制品施加到该阴离子交换树脂前(即在步骤(d)和(e)之间)，将病毒灭活制品的pH和电导率调整到与该阴离子交换树脂的PH和电导率基本相似。例如，第二离子交换树脂的pH可在约pH7.7至约PH8.3的范围，将病毒灭活制品的pH调整到约pH7.7至约pH8.3的范围。在另一个实施方案中，第二离子交换树脂的pH可在约pH7.8至约pH8.2的范围，将病毒灭活制品的pH调整到约pH7.8至约pH8.2的范围。更优选地，第二离子交换树脂的pH为约pH8.0，将病毒灭活制品的pH调整到约pH8.0。此外，第二离子交换树脂的电导率可在约3.5mS/cm至约5.2mS/cm的范围，将病毒灭活制品的电导率调整到约3.5mS/cm至约5.2mS/cm的范围。优选地，第二离子交换树脂的电导率为约5.0mS/cm，将病毒灭活制品的电导率调整到约5.0mS/cm。
[0054]在上述的包括步骤(a)到(f)的方法中，优选地该阳离子交换树脂是与磺酸基连接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物树脂(例如Fractogel)，该阴离子交换树脂是Q琼脂糖凝胶树脂，该疏水相互作用柱是苯基琼脂糖凝胶柱。
[0055]优选地，经HCP ELISA测定，第一洗脱物包含的HCP比该混合物少约90至约100倍。优选地，经HCP ELISA测定，第一流通物包含的HCP比第一洗脱物少约840至约850倍。优选地，经HCP ELISA测定，第二洗脱物包含的HCP比第一流通物少约3至约5倍。
[0056]在特别优选的一 个实施方案中，本发明的用以从包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，包括以下步骤:
[0057](a)将该混合物施加到在平衡缓冲液中的阳离子交换树脂，其中该阳离子交换树脂为PH7且施加量大于35克抗体/升树脂，或者该阳离子交换树脂的pH在pH5至pH7的范围且施加量约为35至约70克抗体/升树脂，或者该阳离子交换树脂为pH5且施加量大于70克抗体/升树脂；
[0058](b)以包括第一次洗涤和第二次洗涤的洗涤步骤从该阳离子交换树脂洗涤HCP，该第一次洗涤采用平衡缓冲液，该第二次洗涤采用洗脱缓冲液和水的混合物；
[0059](c)用该洗脱缓冲液从该阳离子交换树脂洗脱该抗体，以形成第一洗脱物；
[0060](d)将第一洗脱物进行病毒灭活步骤，其中病毒灭活是通过pH病毒灭活来实现，以形成病毒灭活制品；
[0061](e)将所得病毒灭活制品施加到阴离子交换树脂，其中在将该病毒灭活制品施加到阴离子交换树脂前，将该病毒灭活制品的PH和电导率调整到与该阴离子交换树脂的pH和电导率基本相似，由此获得第一流通物；和
[0062](f)将第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此获得第二洗脱物；
[0063]从而获得HCP降低的抗体制品。
[0064]优选地，该抗体混合物在被施加到该阳离子交换树脂前未曾被施以A蛋白捕捉。优选地，洗脱缓冲液和水的混合物包含约40-50%洗脱缓冲液和约50-60%水，更优选约45%洗脱缓冲液和约55%水(例如WFI)。在一个优选的实施方案中，洗脱缓冲液包含20mM磷酸钠和150mM氯化钠。在这个情况中，其中含45%洗脱缓冲液和约55%水的洗脱缓冲液和水混合物，是9mM磷酸钠和68mM氯化钠。在一个优选的实施方案中，第一次洗涤是用包含20mM磷酸盐、25mM氯化钠的平衡缓冲液进行，第二次洗涤是用包含9mM磷酸盐、68mM氯化钠的缓冲液(，45%洗脱缓冲液、55%水)进行，洗脱缓冲液包含20mM磷酸盐、150mM氯化钠。优选地，经HCP ELISA测定，第一洗脱物包含的HCP比该混合物少约90至约100倍。优选地，经HCP ELISA测定，第一流通物包含的HCP比第一洗脱物少约840至约850倍。优选地，经HCP ELISA测定，第二洗脱物包含的HCP比第一流通物少约3至约5倍。
[0065]在任何上述纯化方法的一个优选方面，HCP包含组织蛋白酶L酶原，由此获得组织蛋白酶L酶原降低的抗体制品。优选地，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，洗脱物包含的组织蛋白酶L活性为约25至约60RFU/s/mg抗体。优选地，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第一流通物包含的组织蛋白酶L活性为约0.4至约4RFU/s/mg抗体。优选地，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第二洗脱物包含的组织蛋白酶L活性为约0.5至约1.5RFU/s/mg抗体。优选地，组织蛋白酶L酶原的水平有重现性地低下。
[0066]在还另一方面，本发明涉及用以从包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，所述方法包括以下步骤:
[0067](a)将该混合物施加到阳离子交换树脂，以获得第一洗脱物；
[0068](b)将第一洗脱物施加到阴离子交换树脂，以获得第一流通物；和
[0069](c)使第一流通物通过疏水相互作用柱，由此获得第二洗脱物；
[0070]从而获得HCP降低的抗体制品。
[0071]优选地，包含抗体和 至少一种HCP的该混合物在被施加到第一离子交换树脂前不被施以A蛋白捕捉。优选地，该方法还包括在将第一洗脱物施加到该阴离子交换树脂前，将第一洗脱物进行病毒灭活步骤。例如，病毒灭活可通过PH病毒灭活来实现。
[0072]优选地，该阳离子交换树脂包含与磺酸基连接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物树脂(例如该阳离子交换树脂可以是Fractogel S柱)。例如，Fractogel S柱可用包含20mM磷酸钠、25mM氯化钠的平衡缓冲液平衡，可将该混合物施加到该柱，该柱可用平衡缓冲液至少洗涤一次，第一洗脱物可通过用包含20mM磷酸钠、150mM氯化钠的洗脱缓冲液洗脱来获得。
[0073]优选地，阴离子交换树脂是Q琼脂糖凝胶柱。例如，Q琼脂糖凝胶柱可用包含25mM三乙醇胺、40mM氯化钠(pH7.6)的平衡缓冲液平衡。
[0074]优选地，该疏水相互作用柱是苯基琼脂糖凝胶柱。例如，苯基琼脂糖凝胶柱可用包含20mM磷酸钠、1.1M(NH4)2S04(pH7)的平衡缓冲液平衡，可将第一流通物施加到该柱，该柱可用平衡缓冲液至少洗涤一次，第二洗脱物可通过进行盐不连续梯度至IlmM磷酸钠、0.625M (NH4)2SO4 (pH7.0)来获得。
[0075]优选地，pH病毒灭活是通过将第一洗脱物维持在pH3.5大约I小时来实现。
[0076]在还另一方面，本发明涉及用以从包含阿达木单抗和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的阿达木单抗制品的方法，所述方法包括以下步骤:
[0077](a)将该混合物施加到阳离子交换树脂，其中该混合物在被施加到第一离子交换树脂前不被施以A蛋白捕捉，以获得第一洗脱物；
[0078](b)将第一洗脱物施以pH病毒灭活，以获得病毒灭活制品；
[0079](C)将该病毒灭活制品施加到阴离子交换树脂，以获得第一流通物；和
[0080](d)使第一流通物通过疏水相互作用柱，由此获得第二洗脱物；[0081]从而获得HCP降低的阿达木单抗制品。
[0082]优选地，该阳离子交换树脂是Fractogel S柱，该阴离子交换树脂是Q琼脂糖凝胶柱，该疏水相互作用柱是苯基琼脂糖凝胶柱。例如,Fractogel S柱可用包含20mM磷酸钠、25mM氯化钠的平衡缓冲液平衡，可将该混合物施加到该柱，该柱可用平衡缓冲液至少洗涤一次，第一洗脱物可通过用包含20mM磷酸钠、150mM氯化钠的洗脱缓冲液洗脱来获得。还例如，Q琼脂糖凝胶柱可用包含25mM三乙醇胺、40mM氯化钠(pH7.6)的平衡缓冲液平衡。还例如，苯基琼脂糖凝胶柱可用包含20mM磷酸钠、1.1M(NH4)2S04(pH7)的平衡缓冲液平衡，可将第一流通物施加到该柱，该柱可用平衡缓冲液至少洗涤一次，第二洗脱物可通过进行盐不连续梯度至11禮磷酸钠、0.6251(順4)2304诚7.0)来获得。还例如，pH病毒灭活可通过将第一洗脱物维持在PH3.5大约I小时来实现。
[0083]对于所有上述纯化方法，在本发明的一个优选实施方案中，该抗体是抗肿瘤坏死因子-a (TNFa)抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，抗TNF a抗体或其抗原结合部分是嵌合抗体、人源化抗体或多价抗体。在一个实施方案中，抗TNF a抗体或其抗原结合部分是英夫利昔单抗(infliximab)或golimumab。
[0084]在另一个实施方案中，抗TNFa t抗体或其抗原结合部分是人抗体。在一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是这样的分离人抗体，它以1 X10-8M或以下的^和1X 10-3S-1或以下的Ktjff速率常数(均用表面等离振子共振进行测定)从人TNF a上解离下来，在标准的体外L929测定中以1X10_7M或以下的IC5tl中和人TNF a细胞毒性。
[0085]在另一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是具有以下特征的分离人抗体:
[0086]a)以IX 10?或以下的Ktjff速率常数从人TNFa上解离下来，该参数是由表面等离振子共振法测出；
[0087]b)具有包含SEQ ID NO:3氨基酸序列或者从SEQ ID NO:3修饰而成的氨基酸序列的轻链⑶R3结构域，该修饰是位置1、4、5、7或8处的单一丙氨酸置换或者位置1、3、4、6、7、8和/或9处的一至五个保守氨基酸置换；
[0088]c)具有包含SEQ ID NO:4氨基酸序列或者从SEQ ID NO:4修饰而成的氨基酸序列的重链⑶R3结构域，该修饰是位置2、，3、4、5、6、8、9、10或11处的单一丙氨酸置换或者位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12处的一至五个保守氨基酸置换。
[0089]在又另一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是这样的分离人抗体，它的轻链可变区(LCVR)包含SEQ IDNO:1氨基酸序列，重链可变区(HCVR)包含SEQ IDNO:2氨基酸序列。
[0090]在还另一个实施方案中，抗TNF a抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗。
[0091]本发明提供用本发明的任何方法生产的、经HCP ELISA测定基本上不含HCP的抗体制品。本发明还提供包含用本发明的任何方法生产的HCP降低的抗体制品和药物可接受载体的药物组合物。
[0092]本发明包括包含HCP降低的抗体和药物可接受载体的药物组合物，其中经HCPELISA测定，HCP的水平不超过约70ng HCP/mg抗体。在一个实施方案中，经HCP ELISA测定，HCP的水平不超过约13ng HCP/mg抗体。在另一个实施方案中，经HCP ELISA测定，HCP的水平不超过约5ng HCP/mg抗体。[0093]本发明提供包含抗体的组合物，其中经HCP ELISA测定，所述组合物没有可检测水平的HCP。
[0094]本发明还提供用本文描述的任何方法生产的、基本上不合组织蛋白酶L酶原的抗体制品。本发明还包括包含用本文描述的任何方法生产的组织蛋白酶L酶原降低的抗体制品和药物可接受载体的药物组合物。
[0095]本发明提供包含组织蛋白酶L酶原降低的抗体和药物可接受载体的药物组合物，其中组织蛋白酶L酶原的水平不超过约3.0RFU/s/mR抗体的组织蛋白酶活性。
[0096]对于所有上述抗体制品和药物组合物，优选的该抗体是抗肿瘤坏死因子-a (TNFa)抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，抗TNF a抗体或其抗原结合部分选自人源化抗体、嵌合抗体或多价抗体的抗体。在一个实施方案中，抗TNF a抗体或其抗原结合部分是英夫利昔单抗或golimumab。
[0097]在另一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是人抗体。在一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是这样的分离人抗体，它以！※川—^或以下的^和I X KT3iT1或以下的Ktjff速率常数(均用表面等离振子共振进行测定)从人TNF a上解离下来，在标准的体外L929测定中以1X10_7M或以下的IC5tl中和人TNF a细胞毒性。
[0098]在另一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是具有以下特征的分离人抗体:
[0099]a)以IX 10?或以下的Ktjff速率常数从人TNFa上解离下来，这是由表面等离振子共振测出；
[0100]b)具有包含SEQ ID NO:3氨基酸序列或者从SEQ ID NO:3修饰而成的氨基酸序列的轻链⑶R3结构域，该修饰是位置1、4、5、7或8处的单一丙氨酸置换或者位置1、3、4、6、7、8和/或9处的一至五个保守氨基酸置换；
[0101]c)具有包含SEQ ID NO:4氨基酸序列或者从SEQ ID NO:4修饰而成的氨基酸序列的重链⑶R3结构域，该修饰是位置2、3、4、5、6、8、9、10或11处的单一丙氨酸置换或者位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12处的一至五个保守氨基酸置换。
[0102]在又另一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是这样的分离人抗体，它的轻链可变区(LCVR)包含SEQ ID NO:1氨基酸序列，重链可变区(HCVR)包含SEQ IDNO: 2氨基酸序列。
[0103]在还另一个实施方案中，抗TNF a抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗。
[0104]本发明包括治疗其中TNFa活性有害的疾病的方法，所述方法包括将包含用本发明任何方法获得的抗体的药物组合物给予人受试者。在一个实施方案中，将该制剂长时间给予人受试者。在一个实施方案中，该长时间包括至少约3个月，至少约4个月或至少约5个月。
[0105]在一个实施方案中，该其中TNFa活性有害的疾病选自自身免疫疾病、肠道疾病和皮肤疾病。在一个实施方案中，自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风性关节炎、过敏症、多发性硬化、牛皮癣关节炎、自身免疫性糖尿病、自身免疫性色素层炎、肾病综合征和青年期类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，肠道疾病是节段性回肠炎。在又另一个实施方案中，皮肤疾病是牛皮癣。
[0106]在一个实施方案中，将该药物组合物与另外的治疗剂进行组合给予。在一个实施方案中，该另外的治疗剂是甲氨喋呤。
[0107]本发明包括治疗其中TNFa活性有害的疾病的方法，所述方法包括将包含用本发明任何方法获得的抗体的药物组合物给予人受试者。在一个实施方案中，将该制剂长时间给予人受试者。在一个实施方案中，该长时间包括至少约3个月，至少约4个月或至少约5个月。在一个实施方案中，该其中TNFa活性有害的疾病选自自身免疫疾病、肠道疾病和皮肤疾病。在一个实施方案中，自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风性关节炎、过敏症、多发性硬化、牛皮癣关节炎、自身免疫性糖尿病、自身免疫性色素层炎、肾病综合征和青年期类风湿性关节炎。在一个实施方案中，肠道疾病是节段性回肠炎。在一个实施方案中，皮肤疾病是牛皮癣。
[0108]在一个实施方案中，将该药物组合物与另外的治疗剂进行组合给予。在一个实施方案中，该另外的治疗剂是甲氨喋呤。
[0109]本发明提供包含包装材料、阿达木单抗和标签或包装插页的制造品(articleof manufacture),该标签或包装插页装在该包装材料当中，说明该阿达木单抗制剂(formulation)包含不超过约70ng HCP/mg阿达木单抗。在一个实施方案中，该约70ngHCP/mg阿达木单抗是通过HCP ELISA来测量。
[0110]本发明还提供包含包装材料、阿达木单抗和标签或包装插页的制造品，该标签或包装插页装在该包装材料当中，说明该阿达木单抗制剂包含不超过约13ng HCP/mg阿达木单抗。在一个实施方案中，该约13ng HCP/mg阿达木单抗是通过HCP ELISA来测量。
[0111]本发明还提供包含包装材料、阿达木单抗和标签或包装插页的制造品，该标签或包装插页装在该包装材料当中，说明该阿达木单抗制剂包含不超过约5ng HCP/mg阿达木单抗。在一个实施方案中，该 约5ng HCP/mg阿达木单抗是通过HCP ELISA来测量。
[0112]本发明还提供包含包装材料、阿达木单抗和标签或包装插页的制造品，该标签或包装插页装在该包装材料当中，说明该阿达木单抗制剂包含的组织蛋白酶L酶原水平不超过约3.0RFU/s/mg阿达木单抗的组织蛋白酶L活性所指示的水平。在一个实施方案中，组织蛋白酶L活性是通过组织蛋白酶L动力学测定法来测量。
[0113]本发明还提供用以测定衍自哺乳动物细胞表达系统的材料中组织蛋白酶L酶原的量的动力学测定法，该测定法包括使该衍自哺乳动物细胞表达系统的材料与酶接触，以将组织蛋白酶L酶原加工成活性组织蛋白酶L形式，由此获得组织蛋白酶L样品；将该组织蛋白酶L样品与组织蛋白酶L的底物接触；和测定该组织蛋白酶L样品中的组织蛋白酶L活性，作为该衍自哺乳动物细胞表达系统的材料中组织蛋白酶L酶原的量的指标。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞表达系统是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在另一个实施方案中，该加工组织蛋白酶L酶原的酶是肽链内切酶。在又另一个实施方案中，该组织蛋白酶L的底物包含标记(label)。在又另一个实施方案中，该标记是突光剂。在一个实施方案中，该荧光剂包含荧光7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)基团。在一个实施方案中，该组织蛋白酶L的底物包含Z-亮氨酸-精氨酸。在又另一个实施方案中，该Z-亮氨酸-精氨酸包含AMC基团。
【专利附图】
【附图说明】
[0114]图1A和IB显示了每个工艺的Fractogel S层析步骤的典型洗脱曲线，包括本发明的工艺(图1A)和工艺A(图1B)。
[0115]图2A和2B显示了 Q琼脂糖凝胶FF层析步骤的流通物洗涤曲线的比较，包括本发明的工艺(图2A)和工艺A(图2B)。
[0116]图3A和3B显示了苯基琼脂糖凝胶HP层析步骤的洗脱曲线的比较，包括工艺B (图3A)和工艺A(图3B)。
[0117]图4图示了平均工艺B (菱形)和平均工艺A(正方形)的组织蛋白酶L酶原逐步降低。
[0118]图5图示了平均工艺B(菱形)和工艺A(正方形)的HCP逐步降低。
[0119]图6显示出活化的工艺中(in-process)样品的动力学读数指示了反应时间与突光信号的线性关系。
【具体实施方式】
[0120]1.定义
[0121]为了更容易地理解本发明，首先对某些术语进行定义。
[0122]本文所用的术语“混合物”指待进行纯化的有粘度材料，该材料中包含有待从可能也存在于其中的其他物质中纯化出来的至少一种目的抗体。材料可以是例如水溶液、有机溶剂体系或者水/有机溶剂混合物或溶液。混合物往往是包含许多生物分子(如蛋白质、抗体、激素和病毒)、小分子(如盐、糖、脂质等)甚至颗粒状物质的复杂混合物或溶液。虽然生物来源的典型混合物可能一开始是水溶液或水悬浮液，但它也可能含有在较早的分离步骤如溶剂沉淀、提取等中使用到的 有机溶剂。可能含有易于通过本发明各个实施方案进行纯化的有价值生物物质的混合物的实例，包括但不限于生物反应器的培养物上清液、均化后的细胞悬浮液、血浆、血浆级份和奶。
[0123]所谓从包含抗体和一种或多种物质的混合物中“纯化”该抗体，是指通过将至少一种物质从该混合物中(完全或部分)除去来增加该抗体在该混合物中的纯度。该物质可以是杂质或污染物，如但不限于宿主细胞蛋白质(HCP)。
[0124]术语“宿主细胞蛋白质”或“HCP〃指该混合物中的、与目的抗体不同但通常发源于抗体生产的蛋白质。宜将HCP排除出最终抗体制品。
[0125]术语“降低(的)(reduced) ”指减少或缩小物质的数量。降低的制品包括与初始数量相比具有较少的某物质如HCP或组织蛋白酶L酶原的制品。在一个实施方案中，该物质是杂质或污染物。在一个实施方案中，术语“降低(的)”是指该物质显著少(substantiallyless)。在另一个实施方案中，术语“降低(的)”是指没有该物质。在一个实施方案中，没有某物质包括用本文描述的测定法得出“没有可检测的量”。
[0126]术语“基本上没有”包括没有某物质，但也可包括有极微量的某物质。在一个实施方案中，没有某物质的数量包括用本文描述的测定法得出“没有可检测的量”。
[0127]术语“宿主细胞蛋白质(HCP)降低的〃指这样的组合物(包括但不限于洗脱物、制品、流通物)，其在一个或多个纯化步骤后包含抗体和减少或缩小数量的HCP。在一个实施方案中，术语“HCP降低的，，是指在包含抗体的组合物中HCP显著少。在另一个实施方案中，术语“HCP降低的”是指在包含抗体的组合物中没有HCP。在一个实施方案中，术语“HCP降低的”是指经本文描述的测定法测定，在包含抗体的组合物中没有可检测量的HCP。[0128]术语“组织蛋白酶L酶原降低的〃指这样的组合物(包括但不限于洗脱物、制品、流通物)，其在一个或多个纯化步骤后包含抗体和减少或缩小数量的组织蛋白酶L酶原。在一个实施方案中，术语“组织蛋白酶L酶原降低的”是指在包含抗体的组合物中HCP显著少。在另一个实施方案中，术语“组织蛋白酶L酶原降低的，，是指在包含抗体的组合物中没有HCP。在一个实施方案中，术语“组织蛋白酶L酶原降低的"是指经本文描述的测定法测定，在包含抗体的组合物中没有可检测量的组织蛋白酶L酶原。
[0129]术语“有重现性地低下〃指一贯地实现减少或缩小的数量的能力，如至少80%的时间、更优选至少90 %的时间、更优选至少95 %的时间、甚至更优选至少98 %的时间实现减少或缩小的数量的能力。
[0130]术语“离子交换分离步骤"指这样的步骤，在该步骤中，根据目的抗体和不需要的物质或杂质(例如HCP或组织蛋白酶L酶原)分别与带电材料的离子相互作用的差异，将该不需要的物质或杂质与该目的抗体分离开来。离子交换分离步骤的实例包括但不限于离子交换层析，包括阴离子交换层析和阳离子交换层析。
[0131]“离子交换材料”指作为将该不需要的物质或杂质(例如HCP或组织蛋白酶L酶原)与该抗体进行分离的基础来使用的离子材料。离子交换材料的实例包括阴离子树脂和阳离子树脂。
[0132]“阳离子交换材料”指这样的离子交换材料，它具有共价结合的带负电的配体，并因此具有游离阳离子可供与它所接触到的溶液中的阳离子进行交换。有多种阳离子交换树脂为本领域所公知，例如其中共价结合基团是羧酸根或磺酸根的那些阳离子交换树脂。市售的阳离子交换树脂包括CMC-纤维素、SP-S印hadex?和Fast S_S印harose?(后两者为Pharmacia 市售)。
[0133]“阴离子交换材料”指具有共价结合的带正电基团如季氨基基团的离子交换树脂。市售的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、TMAE、QAE Sephadex?和Fast Q琼脂糖凝胶? (后两者为Pharmacia市售)。
[0134]所谓将某分子“结合"到离子交换材料，是指将该分子在适当的条件(pH/电导率)下暴露于该离子交换材料，该适当的条件会使得该分子借助其与该离子交换材料的(一个或多个)带电基团之间的离子相互作用可逆地固定化在该离子交换材料之中或之上。
[0135]术语“疏水相互作用步骤"指这样的步骤，在该步骤中，根据目的抗体和不需要的物质或杂质(例如HCP或组织蛋白酶L酶原)分别与疏水材料的疏水相互作用的差异，将该不需要的物质或杂质与该目的抗体分离开来。
[0136]“疏水相互作用材料"指作为将该不需要的物质或杂质(例如HCP或组织蛋白酶L酶原)与该抗体进行分离的基础来使用的疏水材料。疏水相互作用材料的实例包括疏水配体，如具有约2至约8个碳原子的烷基基团，或者芳基基团如苯基。
[0137]术语“洗涤”或“洗涤步骤”包括使适当的缓冲液从给定材料(例如离子交换材料或疏水相互作用材料)之中或之上流过。
[0138]术语“多个洗涤步骤”包括超过一个的接连洗涤步骤。接连的缓冲液可具有不同的特性如pH、电导率、溶剂浓度等，这些特性是设计来将各种类型的与给定材料(例如离子交换材料或疏水相互作用材料)非特异性缔合的杂质进行解离和除去。在一个实施方案中，该多个洗涤步骤包括中间洗涤，该中间洗涤还包含约40-50%洗脱缓冲液。[0139]所谓将某分子(例如抗体或污染物质)从某材料中“洗脱”下来，是指通过改变该材料周围的缓冲液从而降低该分子与该材料的相互作用，来将该分子从该材料除去。在一个实施方案中，将抗体从离子交换柱上洗脱下来，其中缓冲液与该抗体竞争该离子交换材料上的带电位点。
[0140]术语“洗脱物”指这样的包含分子(例如抗体或污染物质)的液体，它是在使目的抗体与层析材料结合并加入洗脱缓冲液来解离该抗体后获得的。洗脱物可针对纯化过程中的步骤来说明。例如，术语“第一洗脱物"指第一层析步骤的洗脱物，术语“第二洗脱物”指第二层析步骤的洗脱物，依此类推。
[0141]术语“流通物”指这样的包含分子(例如抗体或污染物质)的液体，它是通过使包含该分子的混合物通过层析材料以使该分子通过该材料而不发生结合来获得的。
[0142]“缓冲液〃指这样的物质，由于它在溶液中的存在，使得为引起单位pH变化所必需加入的酸或碱的数量要增加。缓冲溶液是通过其酸-碱共轭物成分的作用来抵抗PH变化的。用于生物试剂的缓冲溶液通常能够维持恒定浓度的氢离子，使得溶液的pH在生理范围内。传统的缓冲成分包括但不限于有机和无机的盐、酸和碱。示例性的用于纯化生物分子(例如抗体)的缓冲液，包括两性离子缓冲液或“Good"缓冲液，参见例如Good etal.(1966) Biochemistry5:467 和 Good and Izawa (1972)Methods Enzymol.24:62。不例性的缓冲液包括但不限于 TES、MES、PIPES、HEPES, MOPS、M0PS0, TRICINE 和 BICINE。
[0143]本文所用的“洗涤缓冲液"在本文中均指用以从结合有抗体的给定材料(例如离子交换材料或疏水相互作用材料)带走杂质的物质。
[0144]“洗脱缓冲液”指用以将抗体从经一种或多种洗涤物质洗涤过的给定材料(例如离子交换材料或疏水相互作用材料)解离下来的物质。洗脱缓冲液起到解离抗体的作用。典型的洗脱物质是本领域公知的，它们可具有较高浓度的盐、游离亲和配体或类似物或者其他能促进靶物质(例如抗体)从给定材料的解离的物质。洗脱缓冲液的电导率和/或PH使得该抗体从该离子交换材料或疏水相互作用材料洗脱下来。
[0145]术语“电导率〃指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流是通过离子运输而流动。因此，水溶液中存在越多的离子，溶液就会有越高的电导率。电导率的测量单位是mmhos (mS/cm),可用例如Orion出售的电导率仪进行测量。溶液的电导率可通过改变其中的离子浓度来改变。例如，可改变溶液中的缓冲剂的浓度和/或盐(e.g.NaCl或KCl)的浓度，以达到所需的电导率。在一个实施方案中，对层析中所用的洗涤缓冲液或任何其他水溶液的盐浓度进行改变，以达到缩小的电导率。
[0146]多肽如抗体的“ρ或“等电点”指该多肽的正电荷与其负电荷平衡时的pH，可从该多肽的氨基酸残基的净电荷来计算，或者可通过等电聚焦来测定。
[0147]术语“病毒灭活〃包括使混合物中所含的病毒失去功能，或者将病毒从待纯化的混合物中除去。该病毒可发源于抗体生产、下游加工步骤或制造环境。使病毒失去功能或除去病毒的方法包括热灭活、PH灭活、化学灭活剂等。术语“pH病毒灭活”包括使病毒经受某足以使它失去功能的pH。
[0148]本文所用的术语“人TNF α ” (本文缩写为hTNF α，或简称hTNF)，意指以17kD分泌形式和26kD膜缔合形式存在的人细胞因子，其生物活性形式由非共价结合的17kD分子的三聚体构成。hTNFa 的结构在例如 Pennica，D.等，(1984)Nature312:724-729 ；Davis,J.M.等，(1987) Biochemisty26:1322-1326 和 Jones，Ε.Y.等，(1989) Nature338:225-228中有进一步的描述。术语人TNF α意在包括重组人TNF a (rhTNF α )，其能通过标准重组表达方法来制备或者能商业购得(R & D Systems, Catalog N0.210-TA, Minneapolis, MN)。TNFa也称作TNF。
[0149]本文所用的术语“抗体”意指由四个多肽链即两个重链(H)和两个轻链(L)通过二硫键相互连接构成的免疫球蛋白分子。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH区和VL区可以进一步细分为称作互补决定区(CDR)的高变区，这些高变区被称作构架区(FR)的更为保守的区所中断。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本发明的抗体在美国专利6，090, 382、6，258，562和6，509, 015中有进一步详细描述，每个专利通过引用整体结合到本文中。在一个实施方案中，本发明的抗体是能干扰TNF α活性的抗TNF α抗体。抗TNF α抗体的实例包括但不限于抗TNFa人抗体和本文描述的抗体部分，以及美国专利6，090, 382,6, 258，562和6，509, 015和美国专利申请系列号09/801185和10/302356中描述的那些抗体和抗体部分，每个专利和专利申请通过引用结合到本文中。在一个实施方案中，用于本发明的TNFa抑制剂是抗TNF α抗体或其片段,包括英夫利昔单抗(Remicade?, Johnson and Johnson ；
在美国专利5，656，272中描述，该专利通过引用结合到本文中)、⑶P571 (人源化的单克隆抗 TNFa 抗体片段)、抗 TNF dAb (Peptech)、CNT0148 (golimumab ；Medarex and Centocor) >W002/12502中描述的抗体,和阿达木单抗(Hnmira(K) Abbott Laboratories, 一种人抗TNFmAb，在US6，090，382中描述为D2E7)。可用于本发明的另外的抗体或其片段描述于美国专利6，593，458,6, 498，237,6, 451，983和6，448，380，每个专利通过引用结合到本文中。该术语包括“目的抗体“，是作为本发明方法的目标的抗体。
[0150]本文所用的术语抗体的“抗 原结合部分”(或简称“抗体部分”)，指抗体的一个或几个保留与抗原(例如hTNFa)特异性结合的能力的片段。已经证明抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来实现。抗体的“抗原结合部分”这个术语所涵盖的结合片段的例子包括(i)Fab片段，是由VL、VH、CL和CHl结构域构成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，是由两个Fab片段通过铰链区的二硫键连接而构成的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域构成的Fv片段，(V) dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)，由VH结构域构成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由不同的基因所编码，但是可使用重组方法通过合成的接头将它们连接起来，所述接头使得它们变成为单一的蛋白质链，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv (scFv);参见例如Bird等(1988) Science242:423-426和Huston等(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85 =5879-5883)。这样的单链抗体也要被涵盖在抗体的“抗原-结合部分”这个术语中。其他形式的单链抗体如双抗体(diabody)也涵盖在内。双抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但是所使用的接头短得不能让同一链上的这两个结构域之间发生配对，从而迫使这两个结构域与另一条链的互补结构域发生配对，产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger, P.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 ；Pol jak, R.J.等，(1994) Structure〗:1121-1123)。本发明的抗体部分在美国专利6，090, 382,6, 258，562和6，509, 015中有进一步的详细描述，
每个专利通过引用结合到本文中。
[0151 ] 结合片段是通过重组DNA技术来生产，或者通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生。结合片段包括Fab、Fab'、F (ab’)2、Fabc、Fv、单链和单链抗体。与“双特异性"或“双功能”免疫球蛋白或抗体不同，免疫球蛋白或抗体被认为其每个结合位点是相同的。“双特异性"或“双功能抗体”是人造杂合抗体，具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点。双特异性抗体可通过多种方法来制备，包括杂交瘤的融合或Fab’片段的连接。参见例如 Songsivilai & Lachmann,Clin.Exp.1mmunol.79:315-321 (1990) ;Kostelny 等，J.1mmunol.148，1547-1553(1992)。
[0152]本文所用的“保守的氨基酸置换”是其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基所置换的置换作用。本领域已经确定了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
[0153]“嵌合抗体”指这样的抗体，其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与衍自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而所述链的其余区段与另一物种的相应序列同源。在一个实施方案中，本发明涉及这样的嵌合抗体或抗原结合片段，其中轻链和重链的可变区都模拟衍自一种哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定区则与衍自另一种物种的抗体中的序列同源。在本发明的一个优选实施方案中，嵌合抗体是通过将小鼠抗体的CDR嫁接到人抗体的构架区上而制备的。
[0154]“人源化抗体”指包含至少一条这样的链的抗体，该链包含基本上来自人抗体链(称为受体方免疫球蛋白或抗体)的可变区构架残基和至少一个基本上来自非人抗体(例如小鼠)的互补决定区(CDR)。除了 CDR的嫁接外，人源化抗体通常进行进一步的改造以改进亲和力和/或免疫原性。
[0155]术语“多价抗体〃指包含超过一个抗原识别位点的抗体。例如，“二价”抗体具有两个抗原识别位点，而“四价"抗体具有四个抗原识别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等指多价抗体中存在的不同抗原识别位点特异性的数量(与抗原识别位点的数量相对)。例如，“单特异性"抗体的抗原识别位点都结合相同的表位。“双特异性"或“二元特异性”抗体具有至少一个结合第一表位的抗原识别位点，和至少一个结合不同于第一表位的第二表位的抗原识别位点。“多价单特异性"抗体具有都结合相同的表位的多个抗原识别位点。“多价双特异性”抗体具有多个抗原识别位点，其中一些结合第一表位，另一些结合不同于第一表位的第二表位。
[0156]本文所用的术语“人抗体”意在包括具有衍自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变引入的突变或者通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。然而，本文所用的术语“人抗体”不意在包括其中衍自另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已被嫁接到人构架序列上的抗体。[0157]本文所用的术语“重组人抗体”意在包括所有通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，例如使用转染到宿主中的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)，从重组、组合人抗体文库分离的抗体(下文进一步描述)，从转人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小、鼠)分离的抗体(参见例如 Taylor，L.D.等，(1992) Nucl.Acids Res.20:6287)，或者通过涉及到将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法来制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有衍自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是在某些实施方案中，将这种人抗体进行体外诱变(或者当使用转人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列，它们虽然衍自人种系VH和VL序列或与之有关，但可能不天然存在于体内人抗体种系库(antibody germline repertoire)当中。
[0158]这种嵌合的、人源化的、人的和二元特异性的抗体可通过本领域公知的重组DNA技术生产，例如使用以下专利和文献中描述的方法来生产:PCT国际申请PCT/USg6/02269 ；欧洲专利申请184，187 ；欧洲专利申请171，496 ；欧洲专利申请173，494 ；PCT国际公开 W086/01533 ;美国专利 4，816，567 ；欧洲专利申请 125，023 ；Better et al (1988)Science240:1041-1043 ；Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sd.USA84:3439-3443 ;Liu et al.(1987)J.1mmunol 139:3521-3526 ;Sun et al.(1987)Proc.Natl.Acad.ScL USA84:214-218 ；Nishimura et al.(1987)Cancer Res.47:999-1005 ；ffood etal.(1985)Nature314:446-449 ；Shaw et al.(1988) J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559)；Morrison(1985)Science229:1202-1207 ；0i et al.(1986)BioTechniques4:214 ；美国专利 5，225，539 ;Jones et al.(1986)Nature321:552-525 ；Verhoeyan et al.(1988)Science239:1534 ；和 Beidler et al.(1988)J.1mmunol.141:4053-4060, Queen etal.，Proc.Natl.Acad.Sd.USA86:10029-10033(1989)，US5, 530，101、US5, 585，089、US5, 693，761、US5, 693，762、Selick et al, W090/07861 和 Winter, US5, 225，539。
[0159]本文所用的“分离抗体”意指基本上脱除了具有不同的抗原特异性的其他抗体的抗体(例如特异性结合hTNFa的分离抗体基本上脱除了特异性结合hTNF α之外的抗原的抗体)。但是，特异性结合hTNFa的分离抗体可能与其他抗原有交叉反应性，例如与来自其他物种的TNFa分子(下面进一步详细讨论)。此外，分离抗体可以基本上脱除了其他细胞材料和/或化学品。
[0160]本文所用的“中和抗体”(或者“中和hTNF α活性的抗体”)意指其与hTNF α的结合导致hTNF α的生物活性被抑制的抗体。这一对hTNF α的生物活性的抑制，可通过测量hTNF α生物活性的一个或几个指标来评价,所述指标例如hTNF α诱导的细胞毒性(体外或体内)、hTNFa诱导的细胞激活和hTNF α与hTNF α受体的结合。这些hTNF α生物活性的指标可通过本领域公知的几个标准体外或体内测定中的一个或几个来评价(参见美国专利6，090, 382)。优选地，通过对L929细胞的hTNF α诱导细胞毒性的抑制，来评价抗体中和hTNFa活性的能力。作为hTNF α活性的附加的或另选的参数，可评价抗体抑制ELAM-1在HUVEC上的hTNF α诱导表达的能力，作为hTNF α诱导细胞激活的一个量度。
[0161]本文所用的术语“表面等离振子共振”指这样的光学现象，该现象使得可以例如使用 BIAcore 系统(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden 和 Piscataway, NJ)对生物传感器矩阵当中的蛋白质浓度的变化进行检测，从而对实时生物特异性相互作用进行分析。更多的描述参见美国专利6，258，562的实施例1和Jonsson等(1993)Ann.Biol.Clin.51:19 ； Jonsson 等，(1991)Biotechniquesll:620-627 ；Johnsson 等(1995) J.Mol.Recognit.8: 125 和 Johnnson 等(1991)Anal.Biochem.198:268。
[0162]本文所用的术语“K-”意指抗体从抗体/抗原复合体解离的离开(Off)速度常数。
[0163]本文所用的术语“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
[0164]本文所用的术语“IC5tl"意指抑制生物学目的终点(如中和细胞毒性活性)所需的抑制剂的浓度。
[0165]本文所用的术语“核酸分子〃意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选双链DNA。
[0166]本文针对编码能结合hTNF α的抗体或抗体部分(例如VH、VL、⑶R3)的核酸所使用的术语“分离核酸分子"，意指这样的核酸分子，其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列脱除了编码能结合hTNFa之外的抗原的抗体或抗体部分的其他核苷酸序列，该其他序列可天然地位于人基因组DNA中的核酸的侧翼。因此例如，本发明的编码抗hTNF α抗体的VH区的分离核酸，不含有编码能与hTNFa之外的抗原结合的其他VH区的其他序列。
[0167]本文所用的术语“载体”意指能转运其所连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，指的是其中可以连接上另外的区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以被连接到病毒基因组中。某些载体在其被引入的宿主细胞中能自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞时能被整合到宿主细胞的基因组中，从而随宿主基因组被复制。此外，某些载体能指导其所操作性连接的基因的表达。这样的载体在本文称作“重组表达载体”(或者简称“表达载体”)。一般情况下，适用于重组DNA技术的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体"可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明意在包括能起着同等功能的其他形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
[0168]本文所用的术语“重组宿主细胞”(或者简称“宿主细胞”)，意指其中导入重组表达载体的细胞。应认识到，这些术语意在不仅指特定的受试者细胞，而且还指这样的细胞的后代。因为由于突变或环境影响而在后续世代中可能发生某些修饰，事实上这样的后代可能与亲代细胞不同，但是仍然包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
[0169]本文所用的术语“药盒”指包含各成分的包装产品或制造品。药盒优选包括盛有药盒的各成分的盒子或容器。盒子或容器中附加有标签或食品和药物管理部的批准方案。盒子或容器装有本发明的各成分，优选装在塑料、聚乙烯、聚丙烯、乙烯或丙烯容器中。容器可以是带盖子的管或瓶。药盒还可以包括施用本发明的TNFa抗体的说明书。在一个实施方案中，本发明的药盒包括包含有如PCT/IB03/04502和美国申请第10/222140号所述的人抗体D2E7的制剂。
[0170]本文进一步描述本发明的各个方面。
[0171]I1.杭体牛产
[0172]本发明提供从包含抗体和一种或多者HCP的混合物中纯化该抗体的方法。初始混合物通常是由抗体的重组生产得到的混合物。或者，初始混合物可得自通过肽合成(或其他合成方法)进行的抗体生产，或者该抗体可从其天然来源纯化。[0173]为表达本发明的抗体或抗体部分，将编码部分或全长轻链或重链的DNA插入到表达载体中，使得基因被操作性连接到转录和翻译控制序列。在这个情形中，术语“操作性连接”指的是抗体基因连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列能发挥其调节抗体基因的转录和翻译的预定功能。选择表达载体和表达控制序列使之与所用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入单独的载体中，或者更典型的是两种基因都插入同一个表达载体中。抗体基因通过标准的方法插入到表达载体中(如将抗体基因片段上的互补限制性酶切位点与载体相连接，或者如果没有限制性酶切位点，则进行钝末端连接)。在插入抗体或抗体相关轻链或重链序列之前，表达载体可能已经携带有抗体恒定区序列。例如，一种将阿达木单抗或阿达木单抗相关VH序列和VL序列转变成全长抗体基因的方法，就是将它们分别插入到已编码重链恒定区的表达载体和已编码轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段操作性连接到载体当中的CH区段，而VL区段操作性连接到载体当中的CL区段。另外，重组表达载体可编码有助于抗体链从宿主细胞中分泌出来的信号肽。可将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽符合读框地连接到(linked in-frame to)抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽，也可以是异源信号肽(即非免疫球蛋白的信号肽)。
[0174]除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体还携带能调控抗体链基因在宿主细胞中的表达的调节序列。术语“调节序列"意指包括能控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子以及别的表达控制元件(如多聚腺苷酸信号)。这些调节序列在例如Goeddel ；Gene Expression Technology !Methods in Enzymologyl85,Academic Press，San Diego,CA(1990)中有描述。本领域技术人员会认识到，表达载体的设计，包括调节序列的选择，要取决于诸如所选择转化的宿主细胞、所需蛋白的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列，包括能指导蛋白在哺乳动物细胞中的高水平表达的病毒元件，如衍自巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿病毒40 (SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))以及多瘤病毒的启动子和/或增强子。有关病毒调节元件及其序列的进一步介绍参看例如Stinski的美国专利5，168，062，Bell等的美国专利4，510，245以及Schaffnet等的美国专利4，968，615。
[0175]除了抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体还可携带别的序列，如能调节载体在宿主细胞中复制的序列(如复制起点)以及选择性标记基因。选择性标记基因有助于挑选出其中已导入载体的宿主细胞(参看美国专利4，399，216,4, 634，665和5，179，017，这三个专利都是Axel等人的)。例如，通常选择性标记基因能给其中已导入了载体的宿主赋予对药物如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在&打_宿主细胞中用于氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(进行G418选择)。
[0176]为了表达轻链和重链，用标准技术将编码重链和轻链的表达载体转入宿主细胞中。不同形式的术语“转染”意在涵盖多种常用于将外源DNA导入到原核或真核宿主细胞中的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽管从理论上说，本发明的抗体可以在原核或真核宿主细胞中表达，但最优选的是在真核细胞、最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体，真核细胞尤其是哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠并具有免疫活性的抗体。抗体基因在原核细胞中的表达据报道不能有效地高产率生产活性抗体(Boss，Μ.A 和 Wood, C.R(1985)，Immunology Today6:12-13)。
[0177]适用于克隆和表达本文所述载体中的DNA的宿主细胞，是原核生物细胞、酵母细胞或上述的高等真核生物细胞。适用于此目的的原核生物包括真细菌如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，例如肠杆菌科细菌如埃希氏菌属细菌(例如大肠杆菌)、肠杆菌属细菌、欧文氏菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌、变形菌(Proteus)属细菌、沙门氏菌属细菌(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属细菌(例如 Serratia marcescans)和志贺氏菌属细菌以及芽孢杆菌属细菌(如B.subtilis和B.1icheniformis (例如1989年4月12日公布的DD266, 710中所公开的B.licheniformis41P)、假单胞杆菌属细菌(如P.aeruginosa)，和链霉菌。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是E.coli294 (ATCC31, 446)，不过其他的菌株 E.coli B、E.coli X1776 (ATCC31, 537)和 E.coli W3110 (ATCC27, 325)如也适合。这些实例是说明性的而非限制性的。
[0178] 除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适用于多肽编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者说普通面包酵母是低等真核宿主微生物当中最常用的。但是，有多种其他的属、种和株是易于得到并可用于本发明的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe);克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如 K.lactis、K.fragilis (ATCC12, 424)、K.bulgaricus (ATCC16,045)、K.wickeramii (ATCC24, 178)、K.waltii (ATCC56, 500)、K.drosophilarum(ATCC36,906)、K.thermotoIerans 和 K.marxianus ;亚罗酵母属(yarrowia) (EP402, 226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) (EP183, 070);假丝酵母属(Candida) ;Trichoderraareesia (EP244, 234) ；Neurospora crassa ；许旺酵母属(Schwanniomyces)如Schwanniomyces occidentalis,和丝状真菌如脉抱菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主如 A.nidulans和 A.niger。
[0179]适用于表达糖基化抗体的宿主细胞衍自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。在诸如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及斑蚊(Aedes aegyPti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蚬(Drosophilamelanogaster)(果蚬)和家蚕(Bombyx mori)的宿主中，已鉴定出多种杆状病毒毒株和变体及相应的允许(permissive)昆虫宿主细胞。有多种转染用病毒株可公开获得，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica) NPV 的 L-1 株和家香(Bombyx mori) NPV 的 Bm_5 株，这种病毒可用作本发明的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
[0180]优选用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括 dhfr-CHO 细胞，在 Urlaub and Chasin, (1980) PNAS USA77:4216-4220 中描述，与例如 Kaufman and Sharp (1982) Mol.Biol.159:601-621 中描述的 DHFR选择性标记一起使用)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被导入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间来生产抗体，该段时间足以使抗体得以在宿主细胞中表达，或者更优选地使抗体得以分泌到宿主细胞生长的培养基中。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例有:被SV40(C0S-7，ATCC CRL1651)转化的猴肾CVl细胞系；人胚胎肾细胞系(被亚克隆以在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Grahamet al.，J.Gen Virol.36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK, ATCC CCL10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CH0.Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77:4216 (1980));小鼠 Sertoli细胞(TM4, Mather, Biol.R印rod.23:243-251 (1980));猴肾细胞(CVl ATCC CCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76, ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2);犬肾细胞(MDCK, ATCC CCL34);布法罗大鼠肝细胞(BRL3A, ATCC CRL1442);人肺细胞(W138, ATCCCCL75);人肝细胞(Hep G2，HB8065);小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562, ATCC CCL51) ;TRI 细胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sc1.383:44-68 (1982)) ;MRC5 细胞；FS4细胞和人肝癌细胞系(Hep G2) ο
[0181]用上述抗体生产用的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将宿主细胞在经适当改进而可诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中进行培养。
[0182]用来生产抗体的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如HamisFlO(Sigma)、极限必需培养基((MEM)，(Sigma)、RPMI640 (Sigma)和 Duibecco 改进分Eagle培养基((DMEM)，Sigma)适用于培养宿主细胞。另外，在以下文献和专利中描述的任何培养基都可用作宿主系的培养基:Ham et al.,Meth.Enz.58:44 (1979), Barnes et al.，Anal.Biochem.102:255 (1980)，美国专利 4，767，704,4, 657，866,4, 927，762,4, 560，655 或5，122，469 ；W090/03430 ；W087/00195或美国专利Re.30, 985。任何这些培养基都可按需补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素药物)、痕量元素(定义为通常以毫摩尔级的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等价的能源。任何其他必需的补充物也可按本领域技术人员会知道的适当浓度加入。培养条件如温度、PH等是之前用于选定进行表达的宿主细胞的那些条件，它们是普通技术人员显而易见的。[0183]宿主细胞也可用来产生完整抗体的部分，如Fab片段或scFv分子。应认识到，上述方法的修改方案也在本发明的范围之内。例如，可能宜用编码本发明抗体的轻链或重链(但不是同时编码两者)的DNA来转染宿主细胞。也可利用重组DNA技术，来去掉编码轻链或重链或两者的DNA中对结合hTNF α没有必要的一些部分或全部。从这种截短的DNA分子表达的分子也涵盖在本发明的抗体范围之内。此外，可通过标准的化学交联方法将本发明的抗体与另一抗体交联，来产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链属本发明的抗体，而另外一条重链和轻链对hTNF α之外的抗原有特异性。
[0184]在一个优选的进行本发明抗体或其抗原结合部分的重组表达的系统中，通过磷酸钙介导转染将编码抗体重链和轻链的重组表达载体导入dhfr-CHO细胞中。在这个重组表达载体当中，抗体重链和轻链各自操作性连接到CMV增强子/AdMLP启动子调节元件，以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带有DHFR基因，该基因使得可以采用氨甲蝶呤选择/扩增来选出转染了载体的CHO细胞。将选出的转化宿主细胞进行培养，以使抗体重链和轻链得以表达，而后从培养基中回收完整抗体。用标准的分子生物学技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化子，培养宿主细胞和从培养基中回收抗体。
[0185]本文公开的本发明重组人抗体，包括阿达木单抗或其抗原结合部分，或者阿达木单抗相关抗体，可以通过筛选用人VL和VH cDNA制备的重组组合抗体文库(优选scFv噬菌体展示文库)进行分离，该人VL和VH cDNA是从衍自人淋巴细胞的mRNA制备的。制备和筛选这样的文库的方法是本领域众所周知的。除了市售的用以产生噬菌体展示文库的试剂盒(例如Pharmacia重组曬菌体抗体系统，目录号27-9400-01 ;和StratageneSurfZAP?噬菌体展示试剂盒，目录号240612)外，特别适用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可见于例如Ladner et al.美国专利5，223，409 ；Kang et al.PCT公开说明书 W092/18619 ;Dower et al.PCT 公开说明书 TO91/17271 ;Winter et al.PCT 公开说明书 W092/20791 ;Markland et al.PCT 公开说明书 TO92/15679 ;Breitling et al.PCT公开说明书 W093/01288 ；McCafferty et al.PCT 公开说明书 W092/01047 ；Garrard etal.PCT 公开说明书W092/09690 ；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology9:1370-1372 ；Hay etal.(1992)Hum Antibod Hybridomas3:81-85 ；Huse et al.(1989)Science246:1275-1281:McCaffertv et al., Nature (1990) 348:552-554 Griffiths et al.(1993) EMBO ]12:725-734 ；Hawkins et al.(1992)J Mol Biol226:889-896 ；Clackson et al.(1991)Nature352:624-628:Gram et al.(1992)PNAS89:3576-3580 ；Garrard et al.(1991)Bio/Technology豆:1373-1377 ；Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Resl9:4133-4137 ；和Barbas et al.(1991)PNASM:7978_7982。
[0186]当使用重组技术时，抗体可胞内产生，在周质间隙，或者可直接分泌到培养基中。如果抗体是胞内产生，作为第一个步骤，将颗粒碎片例如通过离心或超滤除去，该颗粒碎片可以是宿主细胞或裂解细胞(例如来自均化操作)。在抗体被分泌到培养基的情况中，通常首先用市售的蛋白质浓缩滤器如Amicon或Millipore Pellicon超滤组件,将得自这种表达系统的上清液进行浓缩。
[0187]在进行本发明方法之前，从细胞碎片纯化抗体的程序最初决定于抗体的表达位点。可以使一些抗体直接从细胞分泌到周围生长培养基中；其他抗体则是胞内产生。对于后一类抗体，纯化方法的第一个步骤涉及到裂解细胞，这可通过多种方法来进行，包括机械剪切、渗透冲击或酶法处理。这种破坏作用会使细胞的全部内容物释放到匀衆(homogenate)中，另外还会产生因尺寸小而难以除去的亚细胞碎片。这些通常是通过差速离心或通过过滤来除去。在抗体不分泌到培养基的情况中，通常首先用市售的蛋白质浓缩滤器如Amicon或MiIlipore Pellicon超滤组件 ,将得自这种表达系统的上清液进行浓缩。在抗体被分泌到培养基的情况中，也可例如通过切向流过滤将重组宿主细胞从细胞培养基中分离出来。还可进一步使用本发明的抗体纯化方法，从培养基中回收抗体。
【权利要求】
1.一种用以从包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，所述方法包括以下步骤: (a)将所述混合物施加到在平衡缓冲液中的第一离子交换树脂，其中施加量大于30克抗体/升树脂； (b)以多个洗涤步骤从所述树脂洗涤HCP;和 (c)用洗脱缓冲液从所述树脂洗脱所述抗体形成第一洗脱物，由此获得所述HCP降低的抗体制品。
2.权利要求1的方法，其中施加量约为35-70克抗体/升树脂。
3.权利要求1的方法，其中施加量约为70克抗体/升树脂。
4.权利要求1的方法，其中包含抗体和至少一种HCP的所述混合物在被施加到第一离子交换树脂前不被施以A蛋白捕捉。
5.权利要求1的方法，其中所述多个洗涤步骤包括至少第一次洗涤和第二次洗涤，其中从第一次洗涤到第二次洗涤电导率有增加。
6.权利要求5的方法，其中第一次洗涤是用平衡缓冲液进行，第二次洗涤是用洗脱缓冲液和水的混合物进行。
7.权利要求6的方法，其中洗脱缓冲液和水的混合物包含约40-50%洗脱缓冲液和约50-60%水。
8.权利要求7的方法，其中洗脱缓冲液和水的混合物包含约45%洗脱缓冲液和约55% 水。
9.权利要求8的方法，其中洗脱缓冲液包含20mM磷酸钠和150mM氯化钠。
10.权利要求1的方法，所述方法在pH7下进行。
11.权利要求1的方法,所述方法在约PH5至约pH7的pH下进行。
12.权利要求1的方法，所述方法在pH5下进行。
13.权利要求1的方法，其中第一离子交换树脂是阳离子交换树脂。
14.权利要求13的方法，其中将所述阳离子交换树脂形成柱子，将包含抗体和至少一种HCP的混合物施加到所述柱子。
15.权利要求14的方法，其中所述阳离子交换树脂包含与磺酸基连接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物树脂。
16.权利要求1的方法，所述方法还包括将第一洗脱物进行病毒灭活步骤。
17.权利要求16的方法，其中病毒灭活是通过pH病毒灭活来实现，以形成病毒灭活制品O
18.权利要求17的方法，其中将病毒灭活制品施加到第二离子交换树脂，其中在将病毒灭活制品施加到第二离子交换树脂前，将病毒灭活制品的PH和电导率调整到与第二离子交换树脂的PH和电导率基本相似。
19.权利要求18的方法，其中第二离子交换树脂的pH在约pH7.7至约pH8.3的范围，病毒灭活制品的PH调整到约pH7.7至约pH8.3的范围。
20.权利要求19的方法，其中第二离子交换树脂的pH为约pH8.0，病毒灭活制品的pH调整到约PH8.0。
21.权利要求18的方法，其中第二离子交换树脂的电导率在约3.5mS/cm至约5.2mS/cm的范围，病毒灭活制品的电导率调整到约3.5mS/cm至约5.2mS/cm的范围。
22.权利要求21的方法，其中第二离子交换树脂的电导率为约5.0mS/cm，病毒灭活制品的电导率调整到约5.0mS/cm。
23.权利要求18的方法，其中第二离子交换树脂是阴离子交换树脂。
24.权利要求23的方法，其中所述阴离子交换树脂是Q琼脂糖凝胶树脂。
25.权利要求18的方法，其中将第二离子交换树脂形成柱子，将病毒灭活制品施加到所述柱子，由此获得第一流通物。
26.权利要求25的方法，其中将第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此获得第二洗脱物。
27.权利要求26的方法，其中所述疏水相互作用柱是苯基琼脂糖凝胶柱。
28.权利要求26的方法，其中施加到所述疏水相互作用柱的第一流通物包含约20至约40克抗体/升疏水相互作用柱材料。
29.权利要求28的方法，其中施加到所述疏水相互作用柱的第一流通物包含约30至约36克抗体/升疏水相互作用柱材料。
30.权利要求26的方法，其中第二洗脱物不进行产物峰分级分离。
31.权利要求1的方法，所述方法包括: (a)将所述混合物施加到在平衡缓冲液中的阳离子交换树脂，其中所述混合物在施加到所述阳离子交换树脂前未曾`被施以A蛋白捕捉，且其中施加量大于30克抗体/升树脂； (b)以多个洗涤步骤从所述阳离子交换树脂洗涤HCP； (c)用洗脱缓冲液从所述阳离子交换树脂洗脱所述抗体形成第一洗脱物； (d)将第一洗脱物进行病毒灭活步骤； (e)将所述病毒灭活制品施加到阴离子交换树脂，以获得第一流通物；和 (f)将第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此获得第二洗脱物； 从而获得HCP降低的抗体制品。
32.权利要求31的方法，其中所述阳离子交换树脂为pH7，且施加量约为35克抗体/升树脂。
33.权利要求31的方法，其中所述阳离子交换树脂为pH5，且施加量约为70克抗体/升树脂。
34.权利要求31的方法，其中所述多个洗涤步骤包括用采用平衡缓冲液的第一次洗涤和采用洗脱缓冲液和水混合物的第二次洗涤来洗涤所述树脂。
35.权利要求34的方法，其中所述洗脱缓冲液和水的混合物包含约40-50%洗脱缓冲液和约50-60%水。
36.权利要求31的方法，其中在将所述病毒灭活制品施加到所述阴离子交换树脂前，将所述病毒灭活制品的PH和电导率调整到与所述阴离子交换树脂的pH和电导率基本相似。
37.权利要求31的方法，其中经HCPELISA测定，第一洗脱物包含的HCP比所述混合物少约90至约100倍。
38.权利要求31的方法，其中经HCPELISA测定，第一流通物包含的HCP比第一洗脱物少约840至约850倍。
39.权利要求31的方法，其中经HCPELISA测定，第二洗脱物包含的HCP比第一流通物少约3至约5倍。
40.权利要求1的方法，所述方法包括: (a)将所述混合物施加到在平衡缓冲液中的阳离子交换树脂，其中所述阳离子交换树脂为PH7且施加量约为35克抗体/升树脂，或者所述阳离子交换树脂的pH在pH5至pH7的范围且施加量约为35至约70克抗体/升树脂，或者所述阳离子交换树脂为pH5且施加量约为70克抗体/升树脂； (b)以包括第一次洗涤和第二次洗涤的洗涤步骤从所述阳离子交换树脂洗涤HCP，所述第一次洗涤采用平衡缓冲液，所述第二次洗涤采用洗脱缓冲液和水的混合物； (c)用所述洗脱缓冲液从所述阳离子交换树脂洗脱所述抗体，以形成第一洗脱物； (d)将第一洗脱物进行病毒灭活步骤，其中病毒灭活是通过pH病毒灭活来实现，以形成病毒灭活制品； (e)将所得病毒灭活制品施加到阴离子交换树脂，其中在将所述病毒灭活制品施加到阴离子交换树脂前，将所述病毒灭活制品的PH和电导率调整到与所述阴离子交换树脂的pH和电导率基本相似，由此获得第一流通物；和 (f)将第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此获得第二洗脱物； 从而获得HCP降低的抗体制品。
41.权利要求40的方法，其中所述抗体混合物在被施加到该阳离子交换树脂前未曾被施以A蛋白捕捉。
42.权利要求40的方法，其`中所述洗脱缓冲液和水的混合物包含约40-50%洗脱缓冲液和约50-60%水。
43.权利要求40的方法，其中经HCPELISA测定，第一洗脱物包含的HCP比该混合物少约90至约100倍。
44.权利要求40的方法，其中经HCPELISA测定，第一流通物包含的HCP比第一洗脱物少约840至约850倍。
45.权利要求40的方法，其中经HCPELISA测定，第二洗脱物包含的HCP比第一流通物少约3至约5倍。
46.权利要求1-45任一项的方法，其中所述HCP包含组织蛋白酶L酶原，由此获得组织蛋白酶L酶原降低的抗体制品。
47.权利要求46的方法，其中经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第一洗脱物包含的组织蛋白酶L活性为约25至约60RFU/s/mg抗体。
48.权利要求46的方法，其中经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第一流通物包含的组织蛋白酶L活性为约0.4至约4RFU/s/mg抗体。
49.权利要求46的方法，其中经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第二洗脱物包含的组织蛋白酶L活性为约0.5至约1.5RFU/s/mg抗体。
50.权利要求46-49任一项的方法，其中所述组织蛋白酶L酶原的水平有重现性地低下。
51.权利要求1-45任一项的方法，其中所述抗体是抗肿瘤坏死因子-a(TNFa)抗体或其抗原结合部分。
52.权利要求51的方法，其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合部分是人源化抗体、嵌合抗体或多价抗体。
53.权利要求51的方法，其中所述抗TNFa抗体或其抗原结合部分是英夫利昔单抗或goIimumab ο
54.权利要求51的方法，其中所述抗TNFa抗体或其抗原结合部分是人抗体。
55.权利要求54的方法，其中所述抗TNFa抗体或其抗原结合部分是分离的人抗体，它以1x10_8M或以下的&和IxKT3iT1或以下的Ktjff速率常数从人TNF a上解离下来，所述参数均由表面等离振子共振法测出，并在标准的体外L929测定中以1χ10_7Μ或以下的IC5tl中和人TNF a细胞毒性。
56.权利要求54的方法，其中所述抗TNFa抗体或其抗原结合部分是具有以下特征的分离的人抗体: a)以IxKT3iT1或以下的Ktjff速率常数从人TNFα上解离下来，该参数是由表面等离振子共振法测出； b)具有包含SEQID NO:3氨基酸序列或者从SEQ ID NO:3修饰而成的氨基酸序列的轻链⑶R3结构域，该修饰是位置1、4、5、7或8处的单一丙氨酸置换或者位置1、3、4、6、7、8和/或9处的一至五个保守氨基酸置换； c)具有包含SEQID NO:4氨基酸序列或者从SEQ ID NO:4修饰而成的氨基酸序列的重链⑶R3结构域，该修饰是位置2、3、4、5、6、8、9、10或11处的单一丙氨酸置换或者位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12处的一至五个保守氨基酸置换。
57.权利要求54的方法`，其中所述抗TNFa抗体或其抗原结合部分是分离的人抗体，所述抗体的轻链可变区(LCVR)包含SEQ ID NO:1氨基酸序列，重链可变区(HCVR)包含SEQID NO: 2氨基酸序列。
58.权利要求54的方法，其中所述抗TNFa抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗。
59.一种经HCP ELISA测定基本上不含HCP的抗体制品，所述抗体制品用权利要求1_45任一项的方法生产。
60.一种药物组合物，所述药物组合物包含用权利要求1-45任一项的方法生产的HCP降低的抗体制品和药物可接受载体。
61.一种药物组合物，所述药物组合物包含HCP降低的抗体和药物可接受载体，其中经HCP ELISA测定，HCP的水平不超过约70ng HCP/mg抗体。
62.权利要求61的药物组合物，其中经HCPELISA测定，HCP的水平不超过约13ng HCP/mg抗体。
63.权利要求61的药物组合物，其中经HCPELISA测定，HCP的水平不超过约5ng HCP/mg抗体。
64.一种包含抗体的组合物，其中经HCP ELISA测定，所述组合物没有可检测水平的HCP。
65.一种基本上没有组织蛋白酶L酶原的抗体制品，所述抗体制品用权利要求1-45任一项的方法生产。
66.一种药物组合物，所述药物组合物包含用权利要求1-45任一项的方法生产的组织蛋白酶L酶原降低的抗体制品和药物可接受载体。
67.—种药物组合物，所述药物组合物包含组织蛋白酶L酶原降低的抗体和药物可接受载体，其中组织蛋白酶L酶原的水平不超过约3.0RFU/s/mg抗体的组织蛋白酶活性。
68.权利要求59-67任一项的组合物或制品，其中所述抗体是抗肿瘤坏死因子-a (TNFa)抗体或其抗原结合部分。
69.一种治疗其中TNFa活性有害的疾病的方法，所述方法包括将权利要求68的组合物或制品给予人受试者。
70.一种包含包装材料、阿达木单抗和标签或包装插页的制造品,所述标签或包装插页装在该包装材料当中，说明所述阿达木单抗制剂包含不超过约70ng HCP/mg阿达木单抗。
71.—种包含包装材料、阿达木单抗和标签或包装插页的制造品,所述标签或包装插页装在该包装材料当中，说明所述阿达木单抗制剂包含不超过约13ng HCP/mg阿达木单抗。
72.—种包含包装材料、阿达木单抗和标签或包装插页的制造品,所述标签或包装插页装在该包装材料当中，说明所述阿达木单抗制剂包含不超过约5ng HCP/mg阿达木单抗。
73.—种包含包装材料、阿达木单抗和标签或包装插页的制造品，所述标签或包装插页装在该包装材料当中，说明该阿达木单抗制剂包含的组织蛋白酶L酶原水平不超过约3.0RFU/s/mg阿达木单抗的组织 蛋白酶L活性所指示的水平。
【文档编号】A61K39/395GK103509116SQ201310142761
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2007年4月4日 优先权日:2006年4月5日
【发明者】M.W.万, G.阿夫格尼诺斯, G.扎比斯-帕帕斯托伊特西斯 申请人:艾伯维生物技术有限公司