5-HT_2C受体特异性阻断剂对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电的调节作用的制作方法

专利名称：5-HT_2C受体特异性阻断剂对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电的调节作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及5-HT2。受体特异性阻断剂对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电的调节作用。
背景技术：
哺乳动物延髓神经网络能够产生节律性呼吸放电，已有研究证实面神经后核内侧区(the medial region of Nucleus Retrofacialis, mNRF)是呼吸节律发生的关键位置，
也有研究发现延髓腹外侧区前包钦格复合体(preBtitzinger complex, PBC)是呼吸节律产
生部位。这两个部位虽不完全相同，但有部分重叠。大鼠5羟色胺能神经元从中缝核尾部投射到舌下神经核参与调整呼吸，5-羟色胺受体(5-HT受体)存在于新生大鼠和新生小鼠腹侧呼吸组。除了 5-HT3受体是配体门控离子通道外其余5-HT受体均为G蛋白偶联受体
发明内容
本发明的目的是提供5-HT2。受体特异性阻断剂的新用途，即5-HT2。受体特异性阻断剂对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电的调节作用。本发明提供了 5-HT2。受体特异性阻断剂在制备产品中的应用，所述产品的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c): (a)缩短舌下神经根基本节律性呼吸放电的吸气时程；(b)延长舌下神经根基本节律性呼吸放电的呼吸周期；(C)降低舌下神经根基本节律性呼吸放电的放电积分幅度。所述5-HT2。受体特异性阻断剂具体可为RS102221。本发明还保护5-HT2。受体特异性阻断剂的应用，为如下(a)和/或(b)和/或(c):(a)缩短舌下神经根基本节律性呼吸放电的吸气时程；(b)延长舌下神经根基本节律性呼吸放电的呼吸周期；(C)降低舌下神经根基本节律性呼吸放电的放电积分幅度。所述5-HT%受体特异性阻断剂具体可为RS102221。本发明还保护5-HT%受体特异性阻断剂在对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电的调节作用。所述5-HT2。受体特异性阻断剂具体可为RS102221。所述哺乳动物可为大鼠，具体可为Sprague - Dawley大鼠,具体可为1_3天新生大鼠。本发明还保护5-HT%受体特异性阻断剂在制备产品中的应用，所述产品的功能为:对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电进行调节。所述5-HT2。受体特异性阻断剂具体可为RS102221。所述哺乳动物可为大鼠，具体可为Sprague-Dawley大鼠，具体可为1_3天新生大鼠。吸气神经元是产生吸气模式的基本组成成分，是呼吸节律形成的前提。本发明发现MK212可以显著延长T1、缩短RC、增加IA，证明在吸气神经元细胞膜上存在5_HT2C受体调节RRDA。本发明发现RS102221可以显著缩短T1、延长RC、降低IA，证明在mNRF有内源性5-羟色胺能神经元释放5-羟色胺调节RRDA，阻断5-HT2。受体对吸气神经元有抑制作用。MK212缩短RC和RS102221延长RC提示在呼吸中间神经元和呼气神经元细胞膜上同样存在5-HT2。受体，通过调节这两类神经元兴奋性影响呼吸的时相转换。激活或阻断5-HT2C受体影响RC说明通过影响呼吸中间神经元的兴奋性影响了呼气-吸气时相转换从而影响呼吸周期。5-HT2C受体被激活后催化4，5-磷脂酰肌醇二磷酸酯水解成为1，4，5_三磷酸肌醇和二酯酰甘油。1，4，5-三磷酸肌醇通过内质网增加胞浆内[Ca2+]，二酯酰甘油激活胞浆内PKCo PKC通过磷酸化钠通道增加钠通道开放几率，PKC还可以增加活性氧族浓度。活性氧族也可增加钠通道开放几率。本发明推测5-HT2。受体对吸气神经元和呼吸中枢的调节作用是通过增高的钠通道开放几率依次增加了吸气神经元和呼吸中枢的兴奋性。本发明发现并从功能上证实了在新生大鼠离体延髓脑片上存在5-肌2。受体参与对基本节律性呼吸放电的调节，5-HT2。受体通过调节延髓呼吸神经元兴奋性来调节延髓呼吸中枢基本节律性呼吸。


图1为对照组的结果。图2为MK212组的结果。图3为RS102221组的结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。将每次吸气性放电开始至放电结束的时间作为吸气时程(inspiratorytime, TI),以一次吸气性放电开始至下一个放电开始的时间作为呼吸周期(respiratorycycle, RC),把一次放电的原始图进行积分获得放电积分幅度(integral amplitude, ΙΑ)。实验数据以Mean± SD表示，使用SPSS13.0软件(SPSS, Chicago, USA)重复测量方差分析进行统计学处理，检验水准a =0.05, P<0.05认为有统计学差异。2-Chloro-6-(1-piperazinyl)-pyrazine hydrochloride,6-Chloro-2-(1-piperazinyl)pyrazine hydrochloride (简称 MK212,是一种5-HT2C受体特异性激动剂)=Sigma, USA。4-dionehydrochloridehydrate, 8-[5-(2, 4-Dimethoxy-5-(4~trifluoromethylphenylsulphonamido) phenyl-5-oxopentyl] -1, 3, 8-triazaspiro [4.5] decane-2 (简称 RS102221,是一种5-HT2。受体特异性阻断剂)=Sigma, USA。直流前置放大器(FZG-81DCpreamplifier):Shanghai Jialong TeachingApparatus, China。BL-420 生物信号采集和处理系统(BL-420F intelligent biologicalsignal collection and management system):成都泰盟科技公司(Chengdu TMETechnology, China)。
Sprague - Dawley大鼠(1-3天SPF级新生大鼠):购自郑州大学实验动物中心，
5.47±1.53g，许可证号为 SCXK(YU) 2010-0002。人工脑脊液(artificialcerebrospinal fluid, ACSF):将 NaC1124mmol、KC15mmol>CaCl2 2.4mmol、MgS04 1.3mmol、NaHC03 26mmol 和 Glucose30mmol 溶于双蒸水并用双蒸水定容至IL ;使用前用95% O2和5% CO2平衡Ih以上。MK212和RS102221均先溶于少量二甲基亚砜后加入人工脑脊液至所需浓度(需保证二甲基亚砜浓度低于0.1%)。所有的实施例中的实验步骤均经过新乡医学院动物伦理委员会批准。实施例1、一、制备包含面神经后核内侧区的新生大鼠离体延髓脑片(保留脑片腹侧面的舌下神经根)USprague _ Dawley大鼠用乙醚麻醉后在C3-C4节段断头,在延髓-脑桥之间迅速横断脑干，去除颅骨及脑桥以上的脑组织，剪开延髓背侧颅骨，小心分离至C1-C2段脊髓，游离出延髓-脊髓，完整保留舌下神经根。整个过程均在持续充以95% O2和5% CO2的0°C人工脑脊液中进打，3min内完成标本制作。2、迅速将标本头端向上移至切片槽内，腹侧面朝向刀刃，刀刃朝向头端倾斜20°，在闩前600 μ m至闩后100 μ m间切下延髓脑片(含舌下神经根)。二、分组处理取60只步骤 一制备的脑片，随机分为10组(每组6只)，分别进行以下平行处理:对照组:将脑片置于灌流槽内，用人工脑脊液以2-4mL/min持续灌流60min, pH保持7.35-7.45，温度保持27-29°C;用内含银-氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电(RRDA)经直流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；MK212-1组:将脑片置于灌流槽内，用含有I μ mol/L MK212的人工脑脊液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29 °C ;用内含银-氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；MK212-1I组:将脑片置于灌流槽内，用含有5μπι01/1 ΜΚ212的人工脑脊液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29 °C ;用内含银-氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；MK212-1II组:将脑片置于灌流槽内，用含有10 μ mol/L MK212的人工脑脊液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27_29°C ;用内含银-氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；MK212-1V组:将脑片置于灌流槽内，用含有20 μ mol/L MK212的人工脑脊液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27_29°C ;用内含银-氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；
RS102221-1组:将脑片置于灌流槽内，用含有I μ mol/L RS102221的人工脑脊液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29 °C;用内含银-氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；RS102221-1I组:将脑片置于灌流槽内，用含有5 μ mol/L RS102221的人工脑脊液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29 °C;用内含银-氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；RS102221-1II组:将脑片置于灌流槽内，用含有10 μ mol/L RS102221的人工脑脊液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29 °C;用内含银-氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；RS102221-1V组:将脑片置于灌流槽内，用含有20 μ mol/L RS102221的人工脑脊液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29 °C;用内含银-氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；MK212+RS102221组:将脑片置于灌流槽内，先用人工脑脊液以2_4mL/min持续灌流lOmin，然后用含有10 μ mol/L MK212的人工脑脊液以2_4mL/min持续灌流15min，然后用人工脑脊液冲洗20min，然后 用含有10 μ mol/L RS102221和10 μ mol/L MK212的人工脑脊液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29 °C;用内含银-氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析。三、结果分析1、对照组的结果分析对照组脑片的RRDA在60min内无变化，说明本模型稳定可靠。0_60分钟内，每10分钟的检测结果见图1和表2 (均为从该检测时间点开始连续6个呼吸的平均值)。表I中，将IOmin时间点的检测结果作为100，表格中显示的是其它各个时间点的检测结果与IOmin时间点的检测结果的比值。IOmin时间点的检测结果为:TI=0.69s，IA=349.26 μ V.s,RC=18.92s。表I对照组的RRDA在60min内的变化(Γ 土S，n=6)
权利要求
1.5-HT2。受体特异性阻断剂在制备产品中的应用，所述产品的功能为为如下(a)和/或(b)和 / 或(C): Ca)缩短舌下神经根基本节律性呼吸放电的吸气时程； (b)延长舌下神经根基本节律性呼吸放电的呼吸周期； (c)降低舌下神经根基本节律性呼吸放电的放电积分幅度。
2.如权利要求2所述的应用，其特征在于:所述5-HT2。受体特异性阻断剂为RS102221。
3.5-HT2C受体特异性阻断剂的应用，为如下(a)和/或(b)和/或(c): Ca)缩短舌下神经根基本节律性呼吸放电的吸气时程； (b)延长舌下神经根基本节律性呼吸放电的呼吸周期； (c)降低舌下神经根基本节律性呼吸放电的放电积分幅度。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述5-HT2。受体特异性阻断剂为RS102221。
5.5-HT2C受体特异性阻断剂在对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电的调节作用。
6.如权利要求5所述的调节作用，其特征在于:所述5-HT2。受体特异性阻断剂为RS102221。
7.5-HT2C受体特异性阻断剂在制备产品中的应用，所述产品的功能为:对哺乳动物延髓的基本节律性呼 吸 放电进行调节。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于:所述5-HT2。受体特异性阻断剂为RS102221。
全文摘要
本发明公开了5-HT2C受体特异性阻断剂的新用途，即5-HT2C受体特异性阻断剂对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电的调节作用。本发明提供了5-HT2C受体特异性阻断剂在制备产品中的应用，所述产品的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)(a)缩短舌下神经根基本节律性呼吸放电的吸气时程；(b)延长舌下神经根基本节律性呼吸放电的呼吸周期；(c)降低舌下神经根基本节律性呼吸放电的放电积分幅度。本发明发现并从功能上证实了在新生大鼠离体延髓脑片上存在5-HT2C受体参与对基本节律性呼吸放电的调节。
文档编号A61P11/16GK103239445SQ20131015069
公开日2013年8月14日 申请日期2013年4月26日 优先权日2013年4月26日
发明者千智斌, 姬明丽, 王洪兴, 李生莹, 杨秀丽, 李霞飞, 官立萍, 吴云红 申请人:新乡医学院