专利名称：依帕司他在制备防治高血压肾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及依帕司他的新用途，具体提供了其在制备治疗高血压肾病的药物中的应用。
背景技术：
肾脏是血压调节的重要器官，也是高血压最常累及的靶器官。血压上升是高血压肾损害最重要的独立危险因素。高血压肾损伤最终可发展为终末期肾病(End stage renaldiease, ESRD )。据报道，2009年在美国ESRD患者中约有28%为高血压肾损害所致，因此而支出的医疗费用高达56亿美元。在我国13%的ESRD患者由高血压发展而来。高血压肾病已严重威胁人类的健康。因此，深入研究高血压引起肾损害的机制及探讨有效防治措施具有重要意义。肾小球硬化是高血压肾功能衰竭的主要病理基础，其中心环节为肾小球系膜细胞异常增殖和细胞外基质(Extracellular matrix, ECM )沉积。肾小球系膜细胞在肾小球固有细胞中功能最为活跃，是肾小球ECM产生与降解的主要场所。正常肾小球内，系膜细胞增殖缓慢，ECM产生与降解处于动态平衡状态。但在高血压等病理因素刺激下，系膜细胞异常增殖，分泌大量细胞因子和生长因子，ECM成分合成增加、降解减少，发生ECM沉积，最终导致肾小球硬化。在高血压肾小球硬化中，血管紧张素II ( Angiotensin II，Ang II )发挥着重要作用。高血压病理条件下，Ang II通过多种途径参与高血压肾损害过程:
① Ang II 诱导表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR )表达，通过 PI3K/Akt、MAPK 通路使激活蛋白 I ( Activator protein I, AP-1 )活化，促进转化生长因子 β1( ·Transforming growth factor - β I, TGF - β I)转录及表达[14-22]。TGF - β I通过下游Smads通路和结缔组织生长因子(Connective tissuegrowth factor, CTGF )刺激系膜细胞增殖及细胞外基质成分表达。②Ang II活化NAD ( P ) H氧化酶、抑制诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitricoxide synthase, iNOS)和氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD),生成过量活性氧族(Reactive oxygen species, ROS ),形成氧化应激,改变酪氨酸激酶活性及磷酸化,激活细胞内信号通路，活化核转录因子κΒ ( Nuclear factor κ B, NF - κΒ )和AP - 1，促进相关基因转录，致使系膜细胞增殖及细胞外基质成分合成过量。③Ang II 促使血小板源性生长因子(Plateletderived growth factor, F1DGF)、单核细胞趋化蛋白_1 (Monocyte chemotactic protein I, MCP -1 )和肿瘤坏死因子_a (Tumor necrosis factor - α , TNF - α )等炎性因子产生，激活NF - κ B,引起炎症促进胶原产生形成纤维化。依帕司他为醛糖还原酶抑制剂，主要用于预防、改善和治疗糖尿病并发的末梢神经障碍(麻木感、疼痛)等，也有研究报道其可用于糖尿病肾病的治疗。但目前国内外均未发现有在高血压肾病方面的研究报道。糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)主要微血管病变之一，常见于病史超过10年的患者，是糖尿病致死的主要原因之一。糖尿病肾病与自由基介导的氧化损伤有关。糖尿病患者机体中氧化自由基产生增加或抗氧化剂和抗氧化酶活力下降，可导致自由基的生成与机体抗氧化能力间失衡，肾组织发生氧化应激引起肾损伤，导致DN。高血压肾病是一种完全不同于糖尿病肾病，机理上完全不同，高血压肾病是原发性高血压引起的良性小动脉肾硬化(又称高血压肾小动脉硬化)和恶性小动脉肾硬化，并伴有相应临床表现的疾病。目前临床治疗上需要采取综合治疗措施，给患者健康带来了较大的影响，同时给患者也带来了较大的心里负担和经济负担。因此，开发有效的防治高血压肾病的药物具有重要意义。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种依帕司他的新用途。为实现上述目的，本发明提供了依帕司他在制备防治高血压肾病药物中的应用。本发明还提供了依帕司他的组合物在制备防治高血压肾病药物中的应用。所述依帕司他的组合物是以依帕司他为原料，与其它任何能增强依帕司他疗效或利于依帕司他发挥作用的物质制备而成的物质。本发明还提供了依帕司他经过加工制备的适合服用的任何单位剂量形式的药物制剂，这些药物制剂选自以下剂型:片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂，需要时可以制成缓释制剂、肠溶制剂。下面对本发明做进一步解释和说明:
依帕司他在制备成药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自:抗氧剂、鳌合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、分散剂、润滑剂溶剂、缓释材料、肠溶材料、PH调节剂、矫味剂、色素等，常用的载体如:甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素及纤维素衍生物、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、聚乙二醇、环糊精、β -环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。醒糖还原酶(Aldose reductase, AR )属于醒酮还原酶超家族中重要的一员，是糖代谢途径中多元醇通路的限速酶。我们研究发现，在自发性高血压大鼠(SHR)肾脏组织中醛糖还原酶(AR)表达升高，而AR抑制剂依帕司他能够降低SHR的N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖苷酶(N N-acetyl-β -D-glucosaminidase, NAG)活性，白蛋白与肌酐比值(Albumin/Urine creatinine, ALB/UCR)，改善高血压所致的基底膜损伤及抑制肾皮质微血管外ColIII的表达。这为将依帕司他开发成为一种具有防治高血压肾病的新型降压药物提供了实验依据。
具体实施例方式实施例1
1.1目的:研究依帕司他对血管紧张素II ( Ang II )诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质合成的 影响，阐明依帕司他保护高血压肾损害的具体机制。1.2方法:采用大鼠肾小球系膜(HBZY-1 )细胞，实验分为3组:对照组、Ang II诱导组(10-8 mol/L Ang II)、依帕司他组(10-8 mol/L Ang II + 20 ymol/L依帕司他)。各组细胞在含1%新生牛血清培养基中孵育48 h，采用MTT —步法检测A490值来评估细胞数；采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT - qPCR )法和蛋白质印迹(Western blot )法检测细胞外基质I型胶原蛋白(Col I )、III型胶原蛋白(Col III )、IV胶原蛋白(Col IV )、纤连蛋白(FN )以及醛糖还原酶(AR )的mRNA和蛋白表达水平。1.3 结果:
①与对照组相比，10-8 mol/L Ang II组细胞数增加，差异具有统计学意义(1.76 土
0.06 vs 1.67 土 0.05，P〈 0.05 )。与 Ang II 组比较，依帕司他组(1.65 土 0.04 vs
1.76 土 0.06，P < 0.01 )细胞数减少，差异具有统计学意义。②与对照组相比，10-8 mol/L Ang II能够显著增加Col IV ( 2.33 土 0.13vs 1.00 土 0.31，P < 0.01)、FN ( 1.17 土 0.04 vs 1.00 土 0.08，P < 0.01 ), ColI (1.36 土 0.05 vs 1.00 土 0.05，P < 0.01 )、Col III ( 1.31 土 0.03 vs 1.00 土
0.04, P〈 0.01 )和 AR ( 1.35 土 0.04 vs 1.00 土 0.11，P < 0.01 ) mRNA 水平。与Ang II 组相比，依帕司他组 FN ( 0.76 土 0.03 vs 1.17 土 0.04，P〈 0.01),Col I ( 1.25 土 0.05 vs 1.36 土 0.05，P < 0.05 )和Col III ( 0.68 土 0.02 vs
1.31 土 0.03，P < 0.01 ) mRNA水平明显下降，差异具有统计学意义；AR ( 3.78 土 0.13vs 1.35 土 0.04，P < 0.01 )，差异具有统计学意义；Col IV ( 2.54 土 0.14 vs 2.33土 0.13，P = 0.275 ) mRNA水平上升，但差异不具有统计学意义。
③与对照组相比，10-8 mol/L Ang II能够显著增加Col IV ( 2.18 ± 0.26 vs1.00 土 0.02，P〈 0.01 )、FN ( 2.43 土 0.03 vs 1.00 土 0.07，P〈 0.01 )、Col I(1.29 土 0.05 vs 1.00 土 0.04，P < 0.01 )、Col III ( 5.08 土 0.21 vs 1.00 土0.43, P〈 0.01 )和 AR ( 2.02 土 0.08 vs 1.00 土 0.08，P < 0.01 )蛋白水平。与Ang II 组相比，依帕司他组 FN ( 2.07 土 0.06 vs 2.43 土 0.03，P〈 0.01),Col I ( 1.07 土 0.02 vs 1.29 土 0.05，P < 0.01 )和Col III ( 1.12 土 0.46 vs5.08 土 0.21，P < 0.01 )蛋白水平下降，差异具有统计学意义；Col IV ( 2.71 土 0.42vs 2.18 土 0.26，P〈 0.01 )和 AR ( 3.13 土 0.24 vs 2.02 土 0.08，P〈 0.01 )蛋白水平上升，差异具有统计学意义。1.4结论:Ang II促进HBZY-1中Col III和AR表达，依帕司他能够抑制Ang II诱导的HBZY-1增殖和细胞外基质成分(FN、Col I和Col III )表达。实施例2
2.1目的:研究依帕司他对血管紧张素II诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响及其机制。2.2方法:采用大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)作为实验材料，实验共分为3组，每组重复5次(η = 5):空白对照组、Ang II诱导模型组(10_8 mol/L Ang II)、醒糖还原酶抑制剂依帕司他组(10-8 mol/L Ang II + 20 μ mol/L依帕司他)。各组细胞在含10 %胎牛血清培养基中孵育24、36、48 h，采用MTT—步法检测0D490值来评估细胞数目；采用流式细胞仪检测各组细胞周期和细胞凋亡情况；采用用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法和蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂_P21、P27、细胞凋亡相关基因-Bax、Bcl-2和醛糖还原酶(Aldose Reductase, AR)的mRNA和蛋白表达水平；采用紫外测定法检测细胞内AR的活性。2.3 结果:
(I)与对照组相比，10-8 mol/L Ang II模型组在含10 %胎牛血清培养基中孵育48 h后，细胞数目显著增加，差异具有统计学意义(1.91 土 0.06 vs 1.49 土 0.08，P < 0.01，48 h);与 Ang II 模型组比较，依帕司他组(1.60 土 0.04 vs 1.91 土 0.06 ;P < 0.01,48h)细胞数目减少，差异具有统计学意义。(2)与对照组相比，10-8 mol/L Ang II模型组Gl期细胞比例明显减少(69.17土 0.25 vs 73.90 土 0.58，P < 0.05)，S 期细胞明显增多(22.41 土 1.06 vs 12.64 土0.23，P < 0.05)，差异具有统计学意义；与Ang II模型组相比，依帕司他组可抑制细胞进入 S 期，S 期细胞比例明显下降(11.09 土 0.38,13.95 土 0.57，10.08 土 0.20，7.05 土0.69 vs 22.41 土 1.06 ;P < 0.05，P < 0.05，P < 0.05，P < 0.01)。(3)与对照组相比，10-8 mol/L Ang II模型组P21、P27 mRNA水平显著降低(P21:0.0020 土 0.000098 vs 0.0063 土 0.00017，P < 0.01 ；P27:0.0013 土 0.00011 vs0.0041 土 0.00007，P < 0.01 )，差异具有统计学意义；与Ang II模型组相比，依帕司他组P21、P27 mRNA 水平均显著高于 Ang II 模型组(P21:0.0087 土 0.00047 vs 0.0020 土
0.000098,P < 0.01 ；P27:0.0060 土 0.00020 vs 0.0013 土 0.00011，Ρ < 0.01)，差异具有统计学意义。(4)与对照组相比，10-8 mol/L Ang II模型组P21、P27蛋白水平显著降低(P21:0.51 土 0.03 vs 1.00 土 0.00，P < 0.05 ；P27:0.72 土 0.02 vs 1.00 土 0.00，P <
0.05)，差异具有统计学意义；与Ang II模型组相比，依帕司他组和不同浓度杜仲木脂素组Ρ21、Ρ27 蛋白水平均显著高于 Ang II 模型组(Ρ21:3.21 土 0.12 vs 0.51 土 0.03，P <0.01 ；P27:2.36 土 0.04 vs 0.`72 土 0.02，P < 0.01 )，差异具有统计学意义。(5)与对照组相比，10-8 mol/L Ang II模型组细胞的凋亡率显著高于对照组(10.47 土 0.27 vs 8.68 土 0.31，P < 0.05)，差异具有统计学意义；与Ang II模型组相t匕，依帕司他组凋亡率显著增强(17.89 土 0.62 vs 10.47 土(λ 27 ;P < (λ 01)，差异具有统计学意义。(6)与对照组相比，10-8 mol/L Ang II模型组Bax、Bcl_2 mRNA水平显著增高(Bax:0.0054 土 0.00006 vs 0.0032 土 0.00026，P〈 0.01 ;Bcl_2:0.0055 土 0.00025vs 0.0041 土 0.00014，P < 0.01 )，差异具有统计学意义；与Ang II组相比，依帕司他组Bax mRNA 水平均显著高于 Ang II 模型组(0.0071 土 0.00005 vs 0.0054 土 0.00006 ;P< 0.01)，差异具有统计学意义；而依帕司他组的Bcl-2 mRNA水平与Ang II模型组无统计学差异(0.0059 土 0.00010 vs 0.0055 土 0.00025 ;P > 0.05)。(7)与对照组相比，10-8 mol/L Ang II模型组Bax、Bcl_2蛋白水平显著增高(Bax:1.81 土 0.04 vs 1.00 土 0.00，P < 0.01 ;Bcl_2:2.24 土 0.10 vs 1.00 土 0.00，P < 0.05)差异具有统计学意义；与Ang II组相比，依帕司他组的Bax蛋白水平均显著高于Ang II模型组(2.29 土 0.05 vs 1.81 土(λ 04 ;P < (λ 01 )，差异具有统计学意义；而依帕司他组和不同浓度杜仲木脂素组的Bcl-2蛋白水平与Ang II模型组无统计学差异(2.21土 0.09 vs 2.24 土 0.10 ;P > 0.05)。(8)与对照组相比，10-8 mol/L Ang II模型组细胞内AR活性相对于对照组明显增强(0.19 土 0.03 vs 0.14 土 0.01，P < 0.05)，差异具有统计学意义；与Ang II模型组相比，依帕司他组细胞内AR活性显著下降(0.11 土 0.01 vs 0.19 土(λ 03 ;P < 0.01)。(9)与对照组相比，10-8 mol/L Ang II模型组能够显著增加AR (1.35 ±0.04 vs1.00 土 0.00，P < 0.01) mRNA水平，差异具有统计学意义；与Ang II模型组相比，依帕司他组的AR mRNA水平较Ang II模型组增加，差异具有统计学意义(3.78 土 0.13 vs 1.35± 0.04，P < 0.01)o(10)与对照组相比，10-8 mol/L Ang II模型组AR蛋白水平显著升高(2.02 土
0.08 vs 1.00 土 0.00，P < 0.01)，差异具有统计学意义；与Ang II模型组相比，依帕司他组的AR蛋白水平较Ang II模型组显著增加(3.13 土 0.24 vs 2.02 土 0.08，P < 0.01)。2.4结论:依帕司他能明显抑制Ang II诱导的系膜细胞增殖；其机制可能与其影响细胞周期调节基因P21和P27及细胞凋亡调节基因Bax和Bcl_2的表达有关；AR可能在此过程中发挥了 重要作用。
权利要求
1.依帕司他在制备防治高血压肾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征是，所述防治高血压肾病药物的剂型包括片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂，缓释制剂和肠溶制 剂。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，涉及依帕司他的新用途，具体提供了其在制备治疗高血压肾病的药物中的应用。经实验研究，依帕司他能够抑制AngII诱导的HBZY-1增殖和细胞外基质成分(FN、ColI和ColIII)表达，且能明显抑制AngII诱导的系膜细胞增殖，可以用于制备治疗高血压肾病的药物。
文档编号A61P9/12GK103239443SQ201310183759
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月17日 优先权日2013年5月17日
发明者邓晓兰, 景贤, 严谨, 郭成贤, 李振宇, 欧阳冬生 申请人:欧阳冬生