可注射蛋白基花样结构载药微纳材料与内耳跨膜给药缓释制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明介绍一种以白蛋白来制备两种以上花样结构微纳材料方法及其在内耳跨膜载药方面的应用。涉及花样结构蛋白基载药微纳材料的制备技术与内耳跨圆窗膜给药缓释制剂及其制备方法。内耳跨膜给药缓释载药平台的建立，涉及一系列药物如激素类、神经营养因子类、抗自由基类、氨基糖甙类、颅内抗肿瘤类等药物的内耳转运。具体为：取血清白蛋白溶于含有一定浓度的碳酸盐水溶液中，在一定速度的磁力搅拌下加入无水乙醇溶液，经戊二醛交联固化或在高温水浴下热变性固化后离心、水洗干燥得到花样结构的微纳米载药材料。以罗丹明B为模型药物与该微纳米材料共混依靠物理吸附形成粉红色复合缓释微纳载药制剂，并进行小动物活体成像和离体跨圆窗膜转运实验。
【专利说明】可注射蛋白基花样结构载药微纳材料与内耳跨膜给药缓释制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明介绍一种以白蛋白来制备多种花样结构微纳材料的方法及其在内跨膜载药方面的应用。涉及两种以上花样结构蛋白基载药微纳材料的制备技术与内耳跨圆窗膜给药缓释制剂及其制备方法。并指出可以携带一系列药物如激素类、神经营养因子类、抗自由基类、氨基糖甙类、颅内抗肿瘤类等药物。
【背景技术】
[0002]内耳病(包括耳蜗与前庭系统)的临床发病率约占耳科疾病的近1/3，如突发性耳聋、自身免疫性内耳病及梅尼埃病等，可导致不同程度的感音神经性耳聋和平衡机能障碍，严重影响患者的工作能力与生活质量。
[0003]长期以来临床上常采用全身给药治疗内耳病，其中糖皮质激素为有效的治疗药物之一。因高血压、糖尿病等系统性疾病则为全身激素治疗的禁忌，使得此类药物的应用受到限制。同时由于血一迷路屏障的存在，阻抑了药物在内耳的分布与扩散，导致治疗效果并不理想。内耳局部给药的研究一直受到耳科医师的关注。由于内耳与中耳之间存在一种膜性间隔即圆窗膜，其具有生物半透膜的性质，能允许多种药物通过，这使得药物可以不经过体循环而直接进入内耳即避免了血迷路屏障。目前常用的方法是通过鼓膜向鼓室内注射药物溶液的策略最具微创性。但该方法的局限性在于不能调控到达圆窗膜的药物浓度及难以有效控制药物与圆窗膜的接触时间，而后者是决定耳蜗内药物浓度的重要因素。结合近年来药物缓释剂型的发展，向鼓室内注射药物的缓释剂型体现了缓释技术与微创技术的结合，可能成为内耳疾病最优化的治疗方式，成为近年研究热点领域，鼓室跨膜给药缓释剂的研究尤为重要。迄今鼓室内药物治疗尚无标准方案，临床应用亟待规范。因此，研制新型跨圆窗膜缓释制剂在耳内科学中具有十分重要的应用前景。在生物制药和组织工程迅猛发展的今天，控释系统作为新型的药物载体具有缓释、靶向、生物利用度高等特点，是一种非常有前途的控释系统。血清白蛋白是血浆中的蛋白质是当前的研究热点之一。其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量为66kD。其可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等。本发明利用改良去溶剂法制备了两种以上花样结构蛋白基载药微纳材料并应用于内耳跨圆窗膜缓定向给药。
[0004]由于迄今为止临床上还没有一种真正的内耳局部跨膜给药的缓释制剂在应用，而应用白蛋白制备蛋白基花样结构载药微纳材料作为新型跨圆窗膜的缓释药物载体在国内外均未见报道，故本发明有着广泛的应用前景。
[0005]理想的耳用跨圆窗膜缓释制剂应具备以下特点:①药物迅速在内耳达到理想有效浓度，并维持此浓度适当时间；②在机体其它部位无药物分布或药物浓度仅在最低范围；③一旦治疗目的达到，药物立即从内耳消除选择的缓释辅料对机体无毒副作用；⑤可注射性；⑥可实现商品化生产，使用简便，易于推广。
[0006]蛋白基非球微纳材料是一种相当有前途的药物载体，本发明是在以往制备白蛋白微纳米球工艺技术基础上进行改良，优化了制备工艺，即不再进行旋转蒸发法将乙醇挥发出去，而是改用戊二醛交联或高温水浴热变性的固化方法后利用离心和干燥技术制备出两种以上蛋白基花样结构的微纳材料，并加入模型药物制备出具有缓释效果的缓释载药制齐U。这样有利于减少材料的细胞毒性使产物更安全，同时还保留了白蛋白表面大量的有用基团，增强其对细胞的营养作用和对细胞增殖的促进作用。另外，本发明将其引入到跨圆窗膜内耳给药领域，不仅能很好发挥白蛋白自身的营养作用，同时由于其表面结构的特殊性使其更易于吸附携带其他药物而发挥缓释转运作用。因此本发明最大的特点在于制备的蛋白基花样结构微纳材料结构完整，制备方法简单、可重复性良好，极低毒性、有很好的载药、缓释功能。
【发明内容】
[0007]基于目前国内外尚无对内耳病(如突发性耳聋、梅尼埃病、噪声性耳聋)局部用药的缓释制剂在临床上应用。本发明的目的旨在针对现有技术的缺点，提供一种可在鼓室腔内注射给药、并能跨圆窗膜实现内耳药物转运的缓释载药微球的制备技术和工艺。这样既减少了给药量，增加了内耳局部的药物浓度，同时也大大降低了传统给药方式给患者带来的全身毒副作用。
[0008]本发明所述的可注射蛋白基花样结构载药微纳材料与内耳跨圆窗膜给药缓释制剂及其制备方法如下:
[0009]I)取血清白蛋白溶于一定浓度碳酸盐水溶液中，得到含有血清白蛋白的水溶液；
[0010]2)在一定速度的磁力搅拌下加入无水乙醇溶液,形成乳白色白蛋白混悬液；
[0011]3)放入水浴锅中在高温下进行热变性固化处理，离心、干燥后形成稳定的蛋白基花样结构的微纳材料；
[0012]4)以罗丹明B为模型药物与蛋白基花样结构的微纳材料共混依靠物理吸附形成粉红色复合缓释微球载制剂。
[0013]可以包载一系列药物如激素类、神经营养因子类、抗自由基类、氨基糖甙类、颅内抗肿瘤类等药物。制备过程中血清白蛋白配制的浓度是I?100mg/ml，所述的碳酸盐水溶液的浓度为0.1M?2M。按体积比碳酸盐水溶液与无水乙醇的加入比例为1:1?1: 20。无水乙醇的加入速度控制在0.1?10.0ml/min。磁力转动速度在100?2000rpm。热变性温度控制在50?100°C，固化时间控制在1rnin?24h。而采用50%戊二醛交联固定时间控制在30min?24h。离心后处理为真空干燥或冷冻干燥。加入的模型药物为物理混合吸附方式形成复合缓释制剂。
[0014]总之，本发明采用改良去溶剂方法制备可注射白蛋白基花样结构缓释载药体，制备过程中血清白蛋白配制的浓度是I?100mg/ml，碳酸盐水溶液的浓度控制在0.1M?2M之间，碳酸盐水溶液与无水乙醇溶液的体积比为1:1?1: 20。磁力转动速度控制在100?2000rpm。无水乙醇的加入速度控制在0.1?10.0ml/min。可应用热变性固化法或戊二醛交联法来进行后处理。本发明经过改良优化工艺制备的白蛋白基花样结构微纳材料结构稳定，制备方法简单、毒性低、可以很好的携带药、并具有缓释功能，可望实现更大的经济效益。【专利附图】
【附图说明】:
[0015]图1:放射状花样结构白蛋白扫描电镜下观察⑴。
[0016]图2:放射状花样结构白蛋白扫描电镜下观察(2)。
[0017]图3:扁平状花样结构白蛋白扫描电镜下观察。
[0018]图4:以FITC标记的白蛋白制备的花样结构在荧光显微镜下观察。
[0019]图5:以罗丹明B标记的白蛋白花样结构的荧光显微镜下观察。
[0020]图6:花样结构白蛋白的透射电镜下观察。
[0021]图7:花样结构白蛋白的透射电镜下进一步放大照片，可见更微细结构为管状，其上有多孔。
[0022]图8:花样结构白蛋白的扫描电镜下进一步放大照片，可见更微细结构为管状。
[0023]图9:花样结构白蛋白的扫描电镜下进一步放大照片，可见更微细结构为管状，并可见其表面有微孔结构。
[0024]图10:载有罗丹明b的花样结构白蛋白在豚鼠圆窗膜表面附着的荧光显微镜下所见。
[0025]图11:载有罗丹明b的花样结构白蛋白在豚鼠圆窗膜表面附着的荧光显微镜下所见，进一步放大，可见花样牛血清白蛋白。
[0026]图12:载有罗丹明b的花样结构白蛋白行豚鼠听泡内注射后，在豚鼠圆窗膜表面附着的扫描电镜下所见。
[0027]图13:载有罗丹明b的花样结构白蛋白行豚鼠听泡内注射后，在豚鼠圆窗膜表面附着的扫描电镜下所见。
[0028]图14:花样结构白蛋白在豚鼠离体状态下的圆窗膜附着实验，并在扫描电镜下观察。(包括圆窗膜大体观、圆窗膜表面附着的低倍和高倍下所见)
[0029]图15:材料的细胞(L929细胞、Hale细胞)毒性(MTT法)
[0030]图16:载有激素类药物如泼尼松龙的花样结构白蛋白的扫描电镜观察。
[0031]图17:以FITC标记的牛血清白蛋白作为模型药物与花样结构白蛋白相互吸附的扫描电镜下观察。
[0032]图18:①豚鼠听泡内注入以罗丹明B为模型药物的花样结构白蛋白水凝胶IH时的活体成像；②豚鼠听泡内注入以罗丹明B为模型药物的花样结构白蛋白水凝胶48H时的活体成像；
[0033]图19:花样结构白蛋白与兔原代培养的软骨细胞共培养的镜下影象。
[0034]图20:花样结构白蛋白与HELA细胞共培养的镜下影象。
[0035]图21:花样结构白蛋白与成纤维细胞L929共培养的镜下影象。
【具体实施方式】
:
[0036]具体实施例一:
[0037]取白蛋白溶于0.1M碳酸盐水溶液中，得到含有血清白蛋白的水溶液；在速度为1200rpm的磁力搅拌下加入无水乙醇溶液,加入速度为lml/min,形成乳白色白蛋白混悬液；放入水浴锅中在90°C下进行热变性固化处理lOmin，离心、水洗、干燥后形成稳定的蛋白基花样结构的微纳材料。(图1、图6)
[0038]具体实施例二:
[0039]取白蛋白溶于0.1M碳酸盐水溶液中，得到含有血清白蛋白的水溶液；在速度为1200rpm的磁力搅拌下加入无水乙醇溶液,加入速度为lml/min,形成乳白色白蛋白混悬液；加入50%戊二醛进行交联固化处理12H，离心、水洗、干燥后形成稳定的蛋白基花样结构的微纳材料。(图2、图7)
[0040]具体实施例三:
[0041]取白蛋白溶于IM碳酸盐水溶液中，得到含有血清白蛋白的水溶液；在速度为100rpm的磁力搅拌下加入无水乙醇溶液,加入速度为1.5ml/min,形成乳白色白蛋白混悬液；放入水浴锅中在90°C下进行热变性固化处理lOmin，离心、水洗、干燥后形成稳定的蛋白基花样结构的微纳材料。(图3)
[0042]具体实施例四:
[0043]取白蛋白溶于IM碳酸盐水溶液中，得到含有血清白蛋白的水溶液；在速度为100rpm的磁力搅拌下加入无水乙醇溶液,加入速度为1.5ml/min,形成乳白色白蛋白混悬液；加入50%戊二醛进行交联固化处理12H，离心、水洗、干燥后形成稳定的蛋白基花样结构的微纳材料。(图3)
[0044]具体实施例五:
[0045]取白蛋白溶于2M碳酸盐水溶液中，得到含有血清白蛋白的水溶液；在速度为600rpm的磁力搅拌下加入无水乙醇溶液,加入速度为2ml/min,形成乳白色白蛋白混悬液；放入水浴锅中在90°C下进行热变性固化处理lOmin，离心、水洗、干燥后形成稳定的蛋白基花样结构的微纳材料。并与泼尼松龙共混形成载药制剂(图16)。与FITC标记的白蛋白共混后扫描电镜下观察(图17)。
[0046]具体实施例六:
[0047]取FITC标记的白蛋白溶于2M碳酸盐水溶液中，得到含有血清白蛋白的水溶液；在速度为600rpm的磁力搅拌下加入无水乙醇溶液,加入速度为2ml/min,形成乳白色白蛋白混悬液；加入50%戊二醛进行交联固化处理12H，离心、水洗、干燥后形成稳定的蛋白基花样结构的微纳材料。(图4)
[0048]具体实施例七:
[0049]取白蛋白溶于1.5M碳酸盐水溶液中，得到含有血清白蛋白的水溶液；在速度为800rpm的磁力搅拌下加入无水乙醇溶液,加入速度为1.2ml/min,形成乳白色白蛋白混悬液；放入水浴锅中在70°C下进行热变性固化处理30min，离心、水洗后形成稳定的蛋白基花样结构的混悬液。取1ml该混悬液加入罗丹明B5mg共混孵育IH形成载药制剂(图5)。
[0050]具体实施例八:
[0051]取白蛋白溶于1.5M碳酸盐水溶液中，得到含有血清白蛋白的水溶液；在速度为800rpm的磁力搅拌下加入无水乙醇溶液,加入速度为1.2ml/min,形成乳白色白蛋白混悬液；加入50%戍二醒进行交联固化处理24H,离心、水洗后形成稳定的蛋白基花样结构的混悬液。取1ml该混悬液加入罗丹明B5mg共混孵育IH形成载药制剂(图5)。
[0052]具体实施例九:
[0053]将载有罗丹明B的花样结构白蛋白微纳材料加入PBS中形成混悬液装入4mlEP管中备用。给予豚鼠腹腔内注射麻醉，麻醉成功后放置解剖台，取耳后切口，暴露听泡，在显微镜下分离解剖出完整的耳蜗，可见圆窗膜。并将其放入EP管中，在37°C摇床中10rpm速度下共混30min后取出，干燥后在扫描电镜下观察(图14)。
[0054]具体实施例十:
[0055]将载有罗丹明B的花样结构白蛋白微纳材料加入PBS中形成混悬液装入2ml注射器中备用。给予豚鼠腹腔内注射麻醉，麻醉成功后放置解剖台，取左耳后切口，暴露听泡，在显微镜下在听泡上打孔，用自制弯注射针头向听泡内注入0.1ml上述制备的混悬液。缝合封闭切口，碘伏消毒。以同法行右耳操作。之后在小动物活体呈像中按1H，24H进行动态观察及记录(图18)。之后将豚鼠处死解剖内耳，暴露圆窗膜，在荧光显微镜下进一步观察该处圆窗膜的表面花样结构白蛋白微纳材料附着情况(图10、图11)。并在扫描电镜下进一步观察附着情况，可见花样结构白蛋白(图12、图13)。
【权利要求】
1.可注射白蛋白基花样结构载药微纳材料与内耳跨膜给药缓释制剂及其制备方法，其特征在于其步骤如下: 1)取白蛋白溶于一定浓度的碳酸盐水溶液中，得到含有白蛋白的水溶液； 2)在磁力搅拌下加入无水乙醇溶液，形成乳白色白蛋白混悬液； 3)经过戊二醛交联固化或放入水浴锅中在高温下进行热变性固化处理，离心、干燥后形成稳定的花样结构的蛋白基微纳材料； 4)以罗丹明B为模型药物与花样结构的蛋白基微纳材料共混依靠物理吸附形成粉红色复合缓释花样微纳材料载药体。
2.如权利要求1所述的内耳跨膜给药即可注射蛋白基花样结构载药微纳缓释材料的制备方法，其特征为可以包载一系列药物如激素类、神经营养因子类、抗自由基类、治疗美尼埃病的氨基糖甙类、颅内抗肿瘤类等药物。无论水溶性和非水溶性药物均可被吸附。
3.如权利要求1所述的内耳跨膜给药即可注射蛋白基花样结构载药微纳缓释材料的制备方法，其特征在于所述的制备过程中血清白蛋白配制的浓度是I?100mg/ml。
4.如权利要求1所述的内耳跨膜给药即可注射蛋白基花样结构载药微纳缓释材料的制备方法，其特征在于所述的碳酸盐水溶液中的主要成分为碳酸氢钠和无水碳酸钠，配制的浓度为0.1M?2M。
5.如权利要求1所述的内耳跨膜给药即可注射蛋白基花样结构载药微纳缓释材料的制备方法，其特征在于按体积比碳酸盐水溶液与无水乙醇的加入比例为1:1?1: 20。
6.如权利要求1所述的内耳跨膜给药即可注射蛋白基花样结构载药微纳缓释材料的制备方法，其特征在于无水乙醇的加入的速度控制在0.1?10.0ml/min。
7.如权利要求1所述的内耳跨膜给药即可注射蛋白基花样结构载药微纳缓释材料的制备方法，其特征在于磁力转动速度在100?2000rpm。
8.如权利要求1所述的内耳跨膜给药即可注射蛋白基花样结构载药微纳缓释材料的制备方法，其特征在于热变性温度控制在50?100°C，固化时间控制在1min?24h。
9.如权利要求1所述的内耳跨膜给药即可注射蛋白基花样结构载药微纳缓释材料的制备方法，其特征在于亦可采用50%戊二醛交联固定30min?24h，加入的剂量为10 μ I?Iml0
10.如权利要求1所述的内耳跨膜给药即可注射蛋白基花样结构载药微纳缓释材料的制备方法，其特征在于离心、水洗后处理为真空干燥或冻干。
11.如权利要求1所述的内耳跨膜给药即可注射蛋白基花样结构载药微纳缓释材料的制备方法，其特征在于加入的模型药物为物理混合吸附方式形成复合缓释制剂。
【文档编号】A61K9/16GK104368007SQ201310348097
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月12日 优先权日:2013年8月12日
【发明者】于湛 申请人:于湛