双重可变结构域免疫球蛋白及其用途的制作方法

专利名称：双重可变结构域免疫球蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及多价和多特异性结合蛋白、制备方法、和具体而言涉及其在诊断、预防和/或治疗急性和慢性炎性疾病、癌症及其他疾病中的用途。
背景技术：
工程改造的蛋白，例如能够结合2种或更多抗原的多特异性抗体是本领域已知的。此种多特异性结合蛋白可以使用细胞融合、化学缀合、或重组DNA技术来产生。基于2种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合，已使用四源杂交瘤(quadroma)技术 (参见 Milstein，C.和 A. C. Cuello (1983) Nature, 305 (5934)第 537-40 页)生产了双特异性抗体，所述杂交瘤细胞系表达具有双特异性抗体的所需特异性的鼠单克隆抗体 (mAbs)。因为2种不同免疫球蛋白(Ig)重和轻链在所得到的杂种-杂交瘤(或四源杂交瘤) 细胞系内随机配对，所以产生最高达10种不同Ig种类，其中只有一种是功能性双特异性抗体。错配对副产品的存在和显著减少的生产得率意味着需要复杂的纯化程序。双特异性抗体也可以通过2种不同mAbs的化学缀合来生产(参见，Staerz, U. D.， 等人(1985)，Nature 314 (6012)第628-31页)。这种方法不产生均质制剂。其他方法已使用2种不同mAbs或较小抗体片段的化学缀合(参见Brennan，Μ.，等人(1985)，Science 229 (4708)第 81-3 页)。用于产生双特异性抗体的另一种方法是用异双功能交联剂偶联2种亲本抗体，但所得到的双特异性抗体经受显著的分子异质性，因为交联剂与亲本抗体的反应不是定点的。为了获得更均质的双特异性抗体制剂，2种不同Fab片段已以定点方式在其铰链半胱氨酸残基上进行化学交联(参见Glennie，M. J.，等人(1987)，J Immunol 139 (7):第2367-75 页)。但这种方法产生Fab’ 2片段，而不是全IgG分子。已开发了广泛多样的其他重组双特异性抗体形式(参见Kriangkum，J.，等人 (2001), Biomol Eng 18 (2)第31-40页)。在它们当中，串联单链Fv分子和双抗体 (diabody)、及其各种衍生物是最广泛使用的。常规地，这些分子的构建从识别不同抗原的 2 个单链 Fv (scFv)片段开始(参见 Economides，A. N.，等人(2003)，Nat Med 9 (1):第 47-52页)。串联scFv分子(taFv)代表用另外的肽接头简单连接2个scFv分子的简单形式。这些串联scFv分子中存在的2个scFv片段形成分开的折叠实体。各种接头可以用于连接2个scFv片段和接头具有最高达63个残基的长度(参见Nakanishi，K.，等人(2001)， Annu Rev Immunol 19 第423-74页)。尽管亲本scFv片段可以以可溶形式在细菌中正常表达，然而，常常观察到串联scFv分子在细菌中形成不溶性聚集体。因此，重折叠规程或哺乳动物表达系统的使用常规应用于生产可溶性串联scFv分子。在近期研究中，报道了通过转基因兔和牛体内表达针对⑶观的串联scFv和黑素瘤相关蛋白聚糖(参见Gracie，J. Α.， 等人(1999)，J Clin Invest. 104 (10)第 1393-401 页)。在这个构建体中，2 个 scFv 分子通过CHl接头进行连接，且得到最高达100 mg/L的双特异性抗体血清浓度。使用各种策略包括结构域顺序变化或使用具有变化长度或柔性的中间接头，以允许在细菌中可溶性表达。少数研究现在已报道了使用非常短的Ala3接头或长的富甘氨酸/丝氨酸接头，在细菌中表达可溶性串联scFv分子(参见Leung，B. P.，等人(2000)，J Immunol 164 (12) 第 6495-502 页；Ito，A.，等人(2003)，J Immunol 170 (9)第 4802-9 页；Karni，Α.，等人 (2002)，J Neuroimmunol 125 (1-2)第134-40页)。在另一个研究中，包含长度为3或6 个残基的随机化中间接头的串联scFv谱(r印ertoire)噬菌体展示，用于富集以可溶和活性形式在细菌中生产的那些分子。这种方法导致分离具有6个氨基酸残基接头的串联scFv 分子(参见 Arndt，Μ.和 J. Krauss (2003)，Methods Mol Biol 207 第 305-21 页)。这种接头序列是否代表串联scFv分子可溶性表达的一般解决方案仍不清楚。然而，这项研究证明串联scFv分子的噬菌体展示与定向诱变组合是富集这些分子的有力工具，所述分子可以以活性形式在细菌中表达。双特异性双抗体(Db)利用双抗体形式用于进行表达。通过使连接VH和VL结构域的接头长度减少至约5个残基，由scFv片段生产双抗体(参见Peipp，M.和T. Valerius (2002)，Biochem Soc Trans 30 (4)第507-11页)。接头尺寸的这种减少通过使VH和VL 结构域交换配对促进2条多肽链的二聚化。双特异性双抗体通过在相同细胞内表达2条多肽链来生产，所述2条多肽链具有结构VHA-VLB和VHB-VLA (VH-VL构型)、或VLA-VHB和 VLB-VHACVL-VH构型)。在过去已生产了大量品种繁多的不同双特异性双抗体，并且它们中的大多数以可溶形式在细菌中表达。然而，近期的比较研究证明可变结构域的方向可以影响活性结合位点的表达和形成(参见Mack，M.，等人(1995)，Proc Natl Acad Sci U S A 92 (15):第7021-5页)。然而，在细菌中的可溶性表达代表超过串联scFv分子的重要优点。然而，因为2条不同多肽链在单个细胞内表达，所以可以生产无活性同二聚体连同活性异二聚体。这使另外纯化步骤的执行成为必需，以获得双特异性双抗体的均质制剂。促使双特异性双抗体产生的一种方法是结进孔(knob-into-hole)双抗体的生产(参见Holliger，P.，Τ. Prospero 和 G. Winter (1993), Proc Natl Acad Sci U S A 90 (14)第 6444-8. 18 页)。 该方法对于针对HER2和⑶3的双特异性双抗体进行了证明。通过用Phe交换Val37和用 Trp交换Leu45将大结引入VH结构域内，且在抗HER2或抗⑶3可变结构域中，通过使Phe98 突变为Met和使Tyr87突变为Ala在VL结构域中产生互补孔。通过使用这种方法，双特异性双抗体的生产可以从经由亲本双抗体的72%增至经由结进孔双抗体的超过90%。重要的是，作为这些突变的结果生产得率的确只有轻微减少。然而，对于几种分析的构建体观察到抗原结合活性的减少。因此，这种相当精细的方法需要分析各种构建体，以鉴定产生具有不变结合活性的异二聚分子的那些突变。此外，此种方法需要免疫球蛋白序列在恒定区的突变修饰，因此生成非天然和非自然形式的抗体序列，这可以导致免疫原性增加、体内稳定性差、以及不希望有的药物代谢动力学。单链双抗体(scDb)代表改善双特异性双抗体样分子形成的可替代策略(参见 Holliger, P.禾口 G. Winter (1997)，Cancer Immunol Immunother 45 (3-4) ·.% 128-30 页；ffu, A.M.，等人(1996)，Immunotechnology 2 (1)第 21-36 页)。双特异性单链双抗体通过用另外的中间接头连接2条双抗体形成多肽链来产生，所述另外的中间接头长度为约 15个氨基酸残基。因此，分子量对应于单体单链双抗体(50 — 60 kDa)的所有分子都是双特异性的。几项研究已证明双特异性单链双抗体在细菌中以可溶和活性形式表达，其中大多数纯化的分子呈现为单体(参见Holliger，P.和G. Winter (1997)，Cancer Immunol Immunother 45 (3-4):第 128-30 页；Wu，A.M.，等人(1996)Immunotechnol. 2 (1):第 21-36 M ；Pluckthun,A.禾口 P. PackC 1997) Immunotechnol. 3(2):第 83—105 页；Ridgway，J. B.， 等人(1996)，Protein Engin. 9 (7)第617-21页)。因此，单链双抗体组合了串联scFvs (所有单体都是双特异性的)和双抗体(在细菌中可溶性表达)的优点。更近地，双抗体已与Fc融合以产生更Ig样的分子，称为双-双抗体 (di-diabodies)(参见 Lu，D.，等人(2004)，J Biol Chem 279 (4)第沘56_65 页)。此外， 已描述了在IgG重链中包含2个Fab重复且能够结合4个抗原分子的多价抗体构建体(参见 WO 0177342A1，和 Miller，K.，等人(2003)，J Immunol 170 (9)第 4854-61 页)。本领域需要能够结合2种或更多抗原的改良的多价结合蛋白。美国专利申请系列号11/507，050提供了能够以高亲和力结合2种或更多抗原的结合蛋白新家族，其被称为双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig )。本发明提供能够结合2种或更多抗原的另外的新结合蛋白ο发明概述
本发明涉及能够结合2种或更多抗原的多价结合蛋白。本发明提供了能够以高亲和力结合2种或更多抗原的结合蛋白新家族。在一个实施方案中，本发明提供了包含多肽链的结合蛋白，其中多肽链包含 VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个可变结构域，VD2是第二个可变结构域，C是恒定结构域，Xl代表氨基酸或多肽，X2代表区和η是0或1。在一个实施方案中，结合蛋白中的VDl和VD2是重链可变结构域。在另一个实施方案中，重链可变结构域选自鼠重链可变结构域、人重链可变结构域、CDR嫁接的重链可变结构域、和人源化重链可变结构域。 在另一个实施方案中，VDl和VD2能够结合相同抗原。在另一个实施方案中，VDl和VD2能够结合不同抗原。在另一个实施方案中，C是重链恒定结构域。例如，Xl是接头，条件是Xl 不是CHl。例如，Xl是选自下述的接头AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1)； AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID N0: 2) ；AKTTPKLGG (SEQ ID N0: 3) ；SAKTTPKLGG (SEQ ID N0: 4) ；SAKTTP (SEQ ID N0: 5) ；RADAAP (SEQ ID N0: 6) ；RADAAPTVS (SEQ ID N0: 7)； RADAAAAGGPGS (SEQ ID N0: 8) ；RADAAAA (G4S)4 (SEQ ID NO: 9) ;SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10) ；ADAAP (SEQ ID NO: 11) ；ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12) ；TVAAP (SEQ ID NO: 13) ；TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14) ；QPKAAP (SEQ ID NO: 15) ；QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16);AKTTPP(SEQ ID NO: 17);AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18)；AKTTAP (SEQ ID NO: 19) ；AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20) ；ASTKGP (SEQ ID NO: 21)；ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22),GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23);GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO: 24)； GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25) ；GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26) ；GGGGGGGP (SEQ ID NO: 27);GGGGGGGGP (SEQ ID NO: 28);PAPNLLGGP (SEQ ID NO: 29);PNLLGGP (SEQ ID NO: 30)；GGGGGGP (SEQ ID NO: 31 );PAPELLGGP (SEQ ID NO: 32);PTISPAPNLLGGP (SEQ IDNO: 33)；TVAADDDDKSVFIVPP (SEQ ID NO: 34)；TVDDDDKAAP (SEQ ID NO: 35)；LVPRGSAAP (SEQ ID NO: 36)；ASDDDDK GGP (SEQ ID NO: 37)；ALVPR GSGP (SEQ ID NO: 38);ASTDDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 39);TVALVPR GSVFIFPP (SEQ ID NO: 40);ASTLVPR GSVFPLAP (SEQ ID NO: 41) ；TVAADDDK SVFIVPP (SEQ ID NO: 42) ；ASTDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 43)； LEVLFQ GP (SEQ ID NO: 44);TVAALEVLFQ GPAP (SEQ ID NO: 45);ASTLEVLFQ GPLAP (SEQ ID NO: 46) ；PAPLEVLFQ GP (SEQ ID NO: 47) ；TAENLYFQ GAP (SEQ ID NO: 48) ；AENLYFQ GA (SEQ ID NO: 49) ；PGPFGR SAGGP (SEQ ID NO: 50) ；PGPFGR SAGG (SEQ ID NO: 51)； PQRGR SAG (SEQ ID NO: 52);PHYGR SGG (SEQ ID NO: 53);GPFGR SAGP (SEQ ID NO: 54)； GDDDDK GGP (SEQ ID NO: 55);AGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 56);GGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 57);AS ； TVA ； ASTK (SEQ ID NO: 58);ASTKGPSV (SEQ ID NO: 59);ASTKGPSVFP (SEQ ID NO: 60)；TVAAPSV (SEQ ID NO: 61)，以及 TVAAPSVFI (SEQ ID NO: 62)。在一个实施方案中，X2是Fc区。在另一个实施方案中，X2是变体Fc区。在一个实施方案中，此处公开的结合蛋白包含多肽链，其中多肽链包含VDl- (Xl) n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，Xl是接头，条件是它不是CHl，且X2是Fc区。在一个实施方案中，结合蛋白中的VDl和VD2是轻链可变结构域。在一个实施方案中，轻链可变结构域选自鼠轻链可变结构域、人轻链可变结构域、CDR嫁接的轻链可变结构域、和人源化轻链可变结构域。在一个实施方案中，VDl和VD2能够结合相同抗原。在另一个实施方案中，VDl和VD2能够结合不同抗原。在一个实施方案中，C是轻链恒定结构域。 在另一个实施方案中，Xl是接头，条件是Xl不是CL1。在一个实施方案中，Xl是选自下述的接头AKTIPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1)； AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2) ；AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3) ；SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4) ；SAKTTP (SEQ ID NO: 5) ；RADAAP (SEQ ID NO: 6) ；RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7)； RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8);RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9)；SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10) ；ADAAP (SEQ ID NO: 11) ；ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12) ；TVAAP (SEQ ID NO: 13);TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14)；QPKAAP (SEQ ID NO: 15);QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16);AKTTPP (SEQ ID NO: 17);AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18);AKTTAP (SEQ ID NO: 19);AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20)；ASTKGP (SEQ ID NO: 21);ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) ；GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23) ；GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24)； GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25) ；GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26) ；GGGGGGGP (SEQ ID NO: 27);GGGGGGGGP (SEQ ID NO: 28);PAPNLLGGP (SEQ ID NO: 29);PNLLGGP (SEQ ID NO: 30)；GGGGGGP (SEQ ID NO: 31 );PAPELLGGP (SEQ ID NO: 32);PTISPAPNLLGGP (SEQ ID NO: 33)；TVAADDDDKSVFIVPP (SEQ ID NO: 34)；TVDDDDKAAP (SEQ ID NO: 35) ；LVPRGSAAP (SEQ ID NO: 36)；ASDDDDK GGP (SEQ ID NO: 37)；ALVPR GSGP (SEQ ID NO: 38);ASTDDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 39);TVALVPR GSVFIFPP (SEQ ID NO: 40);ASTLVPR GSVFPLAP (SEQ ID NO: 41) ；TVAADDDK SVFIVPP (SEQ ID NO: 42) ；ASTDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 43)； LEVLFQ GP (SEQ ID NO: 44);TVAALEVLFQ GPAP (SEQ ID NO: 45);ASTLEVLFQ GPLAP (SEQ ID NO: 46) ；PAPLEVLFQ GP (SEQ ID NO: 47) ；TAENLYFQ GAP (SEQ ID NO: 48) ；AENLYFQ GA (SEQ ID NO: 49) ；PGPFGR SAGGP (SEQ ID NO: 50) ；PGPFGR SAGG (SEQ ID NO: 51)；PQRGR SAG (SEQ ID NO: 52);PHYGR SGG (SEQ ID NO: 53);GPFGR SAGP (SEQ ID NO: 54)； GDDDDK GGP (SEQ ID NO: 55);AGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 56);GGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 57) ；AS; TVA; ASTK (SEQ ID NO: 58) ；ASTKGPSV (SEQ ID NO: 59) ；ASTKGPSVFP (SEQ ID NO: 60) ；TVAAPSV (SEQ ID NO: 61)，以及 TVAAPSVFI (SEQ ID NO: 62)。在一个实施方案中，结合蛋白不包含X2。在一个实施方案中，可变重链和可变轻链均包含相同接头。在另一个实施方案中， 可变重链和可变轻链包含不同接头。在另一个实施方案中，可变重链和可变轻链均包含短 (约6个氨基酸)接头。在另一个实施方案中，可变重链和可变轻链均包含长(多于6个氨基酸)接头。在另一个实施方案中，可变重链包含短接头而可变轻链包含长接头。在另一个实施方案中，可变重链包含长接头而可变轻链包含短接头。在一个实施方案中，此处公开的结合蛋白包含多肽链，其中所述多肽链包含 VDl- (Xl) n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，Xl是接头，条件是它不是CH1，且X2不包含Fc区。在另一个实施方案中，本发明提供了包含2条多肽链的结合蛋白，其中所述第一条多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，Xl是接头，条件是它不是CH1，且X2是Fc区；且所述第二条多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是第一个轻链可变结构域， VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，Xl是接头，条件是它不是CHl，且X2不包含Fc区。在具体实施方案中，双重可变结构域(DVD)结合蛋白包含4条多肽链，其中首先 2条多肽链分别包含VDl- (Xl) n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是第一个重链可变结构域，VD2 是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，Xl是接头，条件是它不是CHl，且X2是Fc 区；且其次2条多肽链分别包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，Xl是接头，条件是它不是CH1， 且X2不包含Fc区。此种双重可变结构域(DVD)蛋白具有4个抗原结合部位。在另一个实施方案中，此处公开的结合蛋白能够结合一种或多种靶。在一个实施方案中，靶选自细胞因子、细胞表面蛋白、酶和受体。在另一个实施方案中，结合蛋白能够调节一种或多种靶的生物学功能。在另一个实施方案中，结合蛋白能够中和一种或多种靶。 本发明的结合蛋白能够结合选自淋巴因子、单核因子、多肽激素、受体或肿瘤标记的细胞因子。例如，本发明的DVD-Ig能够结合下述的两种或更多种VEGF，NRP1, SOST和TNF (也见表4)。在具体实施方案中，结合蛋白能够结合选自下述的靶对VEGF和NRPl ；以及TNF和 SOST。在一个实施方案中，能够结合NRPl (seq. 1)和VEGF (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 84的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0: 85的DVD轻链氨基酸序列。在第二个实施方案中，能够结合NRPl (seq. 1)和VEGF (seq. 1)的结合蛋白包含 SEQ ID N0: 86的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0: 87的DVD轻链氨基酸序列。在第三个实施方案中，能够结合NRPl (seq. 1)和VEGF (seq. 1)的结合蛋白包含 SEQ ID N0: 88的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0: 89的DVD轻链氨基酸序列。在第四个实施方案中，能够结合NRPl (seq. 1)和VEGF (seq. 1)的结合蛋白包含 SEQ ID N0: 90的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0: 91的DVD轻链氨基酸序列。
在第五个实施方案中，能够结合NRPl (seq. 1)和VEGF (seq. 1)的结合蛋白包含 SEQ ID NO: 92的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 93的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合SOST和TNF (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID NO: 94的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 95的DVD轻链氨基酸序列。在第二个实施方案中，能够结合SOST和TNF (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID NO: 96的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0: 97的DVD轻链氨基酸序列。在第三个实施方案中，能够结合SOST和TNF (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 98的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0: 99的DVD轻链氨基酸序列。在第四个实施方案中，能够结合SOST和TNF (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 100的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0: 101的DVD轻链氨基酸序列。在第五个实施方案中，能够结合SOST和TNF (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 102的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0: 103的DVD轻链氨基酸序列。在第六个实施方案中，能够结合SOST和TNF (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 104的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0: 105的DVD轻链氨基酸序列。在第七个实施方案中，能够结合SOST和TNF (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 106的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0: 107的DVD轻链氨基酸序列。在第八个实施方案中，能够结合SOST和TNF (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 108的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0: 109的DVD轻链氨基酸序列。在第九个实施方案中，能够结合SOST和TNF (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 110的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 111的DVD轻链氨基酸序列。在第十个实施方案中，能够结合SOST和TNF (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 112的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0: 113的DVD轻链氨基酸序列。在第^^一个实施方案中，能够结合SOST和TNF (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 114的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0: 115的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合TNF (seq. 3)和IL-13 (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 116 - 122中任一个的DVD重链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合TNF (seq. 3)和IL-13 (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 123 - 128中任一个的DVD轻链氨基酸序列。SEQ ID N0: 116 - 122的重链中的任一个可以与SEQ ID N0: 123 - 128 的轻链中的任一个组合来制备本发明的DVD-Ig。在一个实施方案中，能够结合TNF (seq. 2)和IL-13 (seq. 2)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 129 - 130中任一个的DVD重链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合TNF (seq. 3)和IL-13 (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID N0: 131 - 132中任一个的DVD轻链氨基酸序列。SEQ ID N0: 129 - 130的重链中的任一个可以与SEQ ID N0: 131 - 132 的轻链中的任一个组合来制备本发明的DVD-Ig。在另一个实施方案中，本发明提供包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含 VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2) η是Fc区，其中所述(Χ2) η存在或不存在。在一个实施方案中，Fc区不存在于结合蛋白中。在另一个实施方案中，本发明提供包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含 VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2) η不包含Fc区，其中所述(Χ2) η存在或不存在。在一个实施方案中，(Χ2)η不存在于结合蛋白中。在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白包含第一个和第二个多肽链，其中所述第一个多肽链包含第一个VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2) η是Fc区，其中所述(Χ2) η存在或不存在；且其中所述第二个多肽链包含第二个VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CH1， 其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)η存在或不存在。在另一个实施方案中，结合蛋白包含两个第一个多肽链和两个第二个多肽链。在另一个实施方案中，(Χ2)η不存在于第二个多肽中。在另一个实施方案中，Fc区如果存在于第一个多肽中，则其选自天然序列Fc区和变体序列Fc区。在另一个实施方案中，Fc区选自来自IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE 和 IgD 的 Fc 区。在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白是能够结合两个抗原、包含四个多肽链的DVD-Ig，其中，第一个和第三个多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(Xl) η是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(Χ2)η是Fc区，其中所述(Χ2)η存在或不存在；且其中所述第二个和第四个多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(Xl) η是接头， 条件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(Χ2)η不包含Fc区，其中所述(Χ2)η 存在或不存在。本发明提供通过预选择亲本抗体制备DVD-Ig结合蛋白的方法。在一个实施方案中，制备能够结合两个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白的方法包含步骤a)获得能够结合第一个抗原的第一个亲本抗体或其抗原结合部分；b)获得能够结合第二个抗原的第二个亲本抗体或其抗原结合部分；c)构建包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2) η的第一个和第三个多肽链，其中VDl是从所述第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从所述第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(Χ2)η 是Fc区，其中所述(Χ2) η存在或不存在；d)构建包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n的第二个和第四个多肽链，其中VDl是从所述第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻
19链可变结构域；VD2是从所述第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2) η不包含Fc区，其中所述(Χ2) η存在或不存在；e)表达所述第一个、第二个、第三个和第四个多肽链；从而生成能够结合所述第一个和所述第二个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供生成具有所需特性的能够结合两个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白的方法，包含步骤a)获得第一个亲本抗体或其抗原结合部分，其能够结合第一个抗原且具有至少一个由双重可变结构域免疫球蛋白表现的所需特性；b)获得第二个亲本抗体或其抗原结合部分，其能够结合第二个抗原且具有至少一个由双重可变结构域免疫球蛋白表现的所需特性；c)构建包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n的第一个和第三个多肽链，其中VDl是从所述第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从所述第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2) η是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；d)构建包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n的第二个和第四个多肽链，其中VDl是从所述第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从所述第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CHl，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2) η不包含Fc区，其中所述(Χ2) η存在或不存在；e)表达所述第一个、第二个、第三个和第四个多肽链；从而生成具有所需特性的能够结合所述第一个和所述第二个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白。在一个实施方案中，在此公开的第一个和第二个多肽链的VDl是从相同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在另一个实施方案中，在此公开的第一个和第二个多肽链的VDl 是从不同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在另一个实施方案中，在此公开的第一个和第二个多肽链的VD2是从相同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在另一个实施方案中， 在此公开的第一个和第二个多肽链的VD2是从不同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分与第二个亲本抗体或其抗原结合部分是相同抗体。在另一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分与第二个亲本抗体或其抗原结合部分是不同抗体。在一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分结合第一个抗原，而第二个亲本抗体或其抗原结合部分结合第二个抗原。在具体实施方案中，第一个和第二个抗原是相同抗原。在另一个实施方案中，亲本抗体结合相同抗原上的不同表位。在另一个实施方案中，第一个和第二个抗原是不同抗原。在另一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分结合第一个抗原，其结合能力不同于第二个亲本抗体或其抗原结合部分结合第二个抗原的能力。在另一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分结合第一个抗原， 其结合亲和力不同于第二个亲本抗体或其抗原结合部分结合第二个抗原的亲和力。在另一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分和第二个亲本抗体或其抗原结合部分选自人抗体、⑶R嫁接的抗体(⑶R grafted antibody)和人源化抗体。在一个实施方案中，抗原结合部分选自Fab片段、F(ab’)2片段、包含由铰链区的二硫键连接的 2个Fab片段的二价片段；由VH和CHl结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补性决定区(CDR)、单链抗体和双抗体。在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白具有至少一个由第一个亲本抗体或其抗原结合部分、或第二个亲本抗体或其抗原结合部分表现的所需特性。可替代的，第一个亲本抗体或其抗原结合部分和第二个亲本抗体或其抗原结合部分具有至少一个由双重可变结构域免疫球蛋白表现的所需特性。在一个实施方案中，所需特性选自一个或多个抗体参数。在另一个实施方案中，抗体参数选自抗原特异性、对抗原的亲和力、能力、生物学功能、 表位识别、稳定性、可溶性、生产效率、免疫原性、药物代谢动力学、生物利用率、组织交叉反应性、以及直向同源抗原结合。在一个实施方案中，结合蛋白是多价的。在另一个实施方案中，结合蛋白是多特异性的。此处所述的多价和或多特异性结合蛋白具有特别从治疗观点来看需要的特性。例如，多价和或多特异性结合蛋白可以(1)经由细胞比二价抗体更快速内在化(和/或发生分解代谢)，所述细胞表达抗体与之结合的抗原；(2)是激动剂抗体；和 /或(3)诱导表达多价抗体能够与之结合的抗原的细胞的细胞死亡和/或细胞凋亡。提供多价和或多特异性结合蛋白的至少一种抗原结合特异性的“亲本抗体”可以是，经由表达抗体与之结合的抗原的细胞内在化(和/或发生分解代谢)的抗体；和/或可以是激动剂、细胞死亡诱导、和/或细胞凋亡诱导性抗体，且如本文所述的多价和或多特异性结合蛋白可以展示这些特性中的一种或多种中的改善。此外，亲本抗体可以缺乏这些特性中的一种或多种，但如此处所述构建为多价结合蛋白时可以赋予这些特性。在另一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白具有的对于一种或多种靶的结合速率(on rate)常数(Kon)选自至少约IO2M4iT1 ；至少约 IO3M-1S.1 ；至少约ΙΟ 1 ；至少约ΙΟΙ、—1 ；和至少约IO6M"1 S^10在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白对于一种或多种靶具有的结合速率常数 (Kon)为 IO2IT1S-1 至 IO3IT1S-1 ； IO3IT1S-1 至 IO4IT1S-1 ； IO4IT1S-1 至 IO5IT1S-1 ；或 IO5IT1S-1 至 IO6M-1S-1 之间。在另一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，结合蛋白具有的对于一种或多种靶的解离速率(off rate)常数(Koff)选自至多约ΙΟ、—1 ；至多约ΙΟ、—1 ；至多约KT5iT1 ；和至多约ΙΟΛΛ在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白具有的对于一种或多种靶的解离速率常数(Koff)为ΙΟ、—1 - IO-4S-1 ；IO-4S-1 -IOY1 ；或 IOY1 — ΙΟΥ1。在另一个实施方案中，结合蛋白具有的对于一种或多种靶的解离常数(Kd)选自 至多约1(Γ7 M ；至多约1(Γ8 M ；至多约1(Γ9 M ；至多约10, M ；至多约1(Γ" M ；至多约1(Γ12 Μ;和至多10_13 Μ。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白具有的对于其靶的解离常数(Kd) 为 10" M — 1(Γ8 M ;1(Γ8 M — 1(Γ9 M ;1(Γ9 M — 1(Γ10 M ； 1(Γ10 — 1(Γ" M ； 1(Γ" M — 1(Γ12 M ；或 1(Γ12 - M 1(Γ13 Μ。在另一个实施方案中，此处所述的结合蛋白是进一步包含选自下述的试剂的缀合物免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。在一个实施方案中，显像剂选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记、和生物素。在另一个实施方案中，显像剂是选自下述的放射性标记3H、14C、35S、9°Y、99TC、mIn、125I、131I、177LU、16fiH0、和 153Sm0 在另一个实施方案中，治疗或细胞毒性剂选自抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、 抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素、和细胞凋亡剂。
在另一个实施方案中，此处所述的结合蛋白是结晶结合蛋白且作为晶体存在。在一个实施方案中，晶体是无载体的药学控释晶体。在另一个实施方案中，结晶结合蛋白具有比所述结合蛋白的可溶性配对物更长的体内半衰期。在另一个实施方案中，结晶结合蛋白保留生物学活性。在另一个实施方案中，此处所述的结合蛋白是糖基化的。例如，糖基化是人糖基化模式。本发明的一个方面涉及编码此处公开的任何一种结合蛋白的分离的核酸。进一步的实施方案提供包含此处公开的分离的核酸的载体，其中所述载体选自pcDNA;pTT (Durocher ^K, Nucleic Acids Research 2002，第 30 卷，No. 2) ;pTT3 (具有另外的多克隆位点的 pTT ;pEFB0S (Mizushima，S.和 Nagata，S.，(1990)M/c7eic acids Research 第 18 卷，No. 17) ；pBV ；pJV ；pcDNA3. 1 TOPO, pEF6 TOPO 和 pBJ。在一个实施方案中，该载体是在美国专利申请系列号61/021，282中公开的载体。在另一个方面，宿主细胞用此处公开的载体转化。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(E. coli)。在相关实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于，CH0, COS ； NS0、SP2、PER. C6或真菌细胞例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae);或昆虫细胞例如 Sf9 ο在一个实施方案中，在单个重组宿主细胞中生产例如具有不同特异性的两个或更多个DVD-Ig。例如，已将抗体混合物的表达称为Oligoclonics ，(Merus B. V.，荷兰)美国专利号 7，262，028 ；7，429，486。本发明的另一个方面提供了生产此处公开的结合蛋白的方法，所述方法包括在足以生产结合蛋白的条件下，在培养基中培养同样在此处公开的任何一种宿主细胞。在一个实施方案中，通过这种方法生产的50 % — 75 %的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。在具体实施方案中，通过这种方法生产的75% — 90%的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。在具体实施方案中，生产的90 % — 95 %的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。一个实施方案提供了用于释放结合蛋白的组合物，其中所述组合物包含制剂，所述制剂本身又包含如此处公开的结晶结合蛋白和成分，以及至少一种聚合载体。例如， 聚合载体是选自下述的一种或多种的聚合物聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮(poly(dioxanone))、聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、清蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖 (glycaminoglycans)、硫酸化多糖、掺合物及其共聚物。例如，成分选自清蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇(lactitol)、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一个实施方案提供了用于治疗哺乳动物的方法，所述方法包括给哺乳动物施用有效量的此处公开的组合物的步骤。本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含如此处公开的结合蛋白和药学可接受的载体。在进一步的实施方案中，药物组合物包含用于治疗病症的至少一种另外的治疗剂。例如，另外的试剂选自治疗剂，显像剂，细胞毒性剂，血管发生抑制剂(包括但不限于抗VEGF抗体或VEGF-trap)，激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)，共刺激分子阻断剂(包括但不限于抗B7. 1、抗B7. 2、CTLA4-Ig、抗⑶20)，粘附分子阻断剂(包括但不限于抗LFA-I抗体、抗E/L选择蛋白抗体、小分子抑制剂)，抗细胞因子抗体或其功能片段 (包括但不限于抗IL-18、抗TNF、和抗IL-6/细胞因子受体抗体)，氨甲蝶呤，环孢菌素，雷帕霉素，Π(506，可检测标记或报道分子，TNF拮抗剂，抗风湿剂，肌肉弛缓剂，麻醉药，非类固醇消炎药(NSAID)，止痛剂，麻醉剂，镇静剂，局部麻醉剂，神经肌肉阻断剂，抗微生物剂，抗牛皮癣剂，皮质类固醇，促蛋白合成类固醇，促红细胞生成素，免疫接种，免疫球蛋白，免疫抑制剂，生长激素，激素替代药物，放射性药物，抗抑郁药，抗精神病药，刺激剂，哮喘药物治疗，β激动剂，吸入类固醇，肾上腺素或类似物，细胞因子，和细胞因子拮抗剂。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗患有病症的人受试者的方法，在所述病症中能够由此处公开的结合蛋白结合的一种或多种靶是有害的，所述方法包括给人受试者施用此处公开的结合蛋白，从而使得人受试者中的一种或多种靶的活性被抑制，并且多种症状之一减轻或达到治疗。例如，病症选自关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、 皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、 肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、 传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、秃头、斑秃(alopecia areata)、血清反应阴性关节病(arthopathy)、 关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病(spondyloarthopathy)、动脉粥样化疾病 /动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、 原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、 全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、Sjogren氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症
23的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少(leucopaenia)、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病N0S、肾小球肾炎 (glomerulon印hritides)、肾显微血管炎(vasulitis)、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或N0S、精子自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、SjSrgren氏综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性(goitrous)自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性(phacogenic)葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积(choleosatatis)、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神分裂症)、Th2型和Thl型介导的疾病、急性和慢性痛(不同形式的疼痛)、以及癌症例如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症(Abetalipoprotemia)、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房(aerial)异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞(horn cell)变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤(aneuryisms)、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(C0PD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆(Dementia pugilistica)、 脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症(diabetes)、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性(ateriosclerotic)疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性(hematophagocytic)淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、 Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律失常(arrythmias)、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、流行性感冒a、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿(lymphederma)、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性疾病、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Jos印h)、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、 肾变病、神经变性疾病、神经原性I肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、 腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎(印idydimitis)、 睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合征/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化(atherlosclerotic)疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征)、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性核上(supranucleo)麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、 中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、 特殊心律失常(arrythmias)、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、 亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应(anaphalaxis)、全身炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、 不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞(hemaphagocytic)综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合征、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人^ill氏病、斑秃、过敏反应、抗磷脂抗体综合征、 再生障碍性贫血、动脉硬化、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性过早卵巢衰竭、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合征(clinically isolated syndrome) (cis)、结膜炎、 儿童期发病性精神病(childhood onset psychiatric disorder)、慢性阻塞性肺部疾病 (C0PD)、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、糖尿病、椎间盘突出(disk herniation)、盘脱垂(disk prolaps)、药物诱导的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、Guillain-Barre综合征(GBS)、枯草热、Hughes综合征、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、 IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎(keratojuntivitis sicca), Kussmaul病或 Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯(Langerhan，s)细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、morbus bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、 多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合征、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病(PA0D)、周围血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)、多软骨炎、风湿性多肌痛、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合征、多肌炎、风湿性多肌痛 (PMR)、泵后综合征(post-pump syndrome)、原发性帕金森综合征、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、 复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、sapho (滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、sneddon-wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎(spondilitis ankylosans)、Stevens-Johnson综合征(SJS)、全身性炎症应答综合征、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS (肿瘤坏死因子受体，I型变态反应，II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎(UIP)、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vo gt-Koyanag i -Harada综合征(VKH综合征)、湿黄斑变性、伤口愈合、耶尔森氏菌 (yersinia)和沙门氏菌(salmonella)相关的关节病。在一个实施方案中，可以用本发明的组合物和方法治疗或诊断的疾病包括但不限于原发性和转移性癌症，包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰、肝、胆囊和胆管、小肠、尿道(包括肾、膀胱和尿道上皮)、女性生殖道(包括子宫颈、子宫和卵巢，以及绒毛膜癌和妊娠性滋养层细胞病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺(包括甲状腺、肾上腺和脑下垂体)和皮肤的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(包括从骨和软组织产生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤)，脑、神经、眼和脑膜(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、 成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤(SctWarmomas)和脑膜瘤)的肿瘤，从造血恶性肿瘤例如白血病和淋巴瘤(何杰金与非何杰金淋巴瘤)产生的实体瘤。在一个实施方案中，将本发明的抗体或其抗原结合部分在单独地或与放射治疗和 /或其他化疗剂组合地使用时，用于治疗癌症或预防此处所述肿瘤的转移。在另一个方面，本发明提供了治疗患有病症的患者的方法，所述方法包括在如此处讨论的第二种试剂施用之前、同时或之后，施用此处公开的任何一种结合蛋白的步骤。在具体实施方案中，第二种试剂选自布地萘德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-I受体拮抗剂，抗IL-I β mAbs,抗IL-6或IL-6 受体mAbs，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF.LT, IL-I、IL_2、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II, GM-CSF、FGF 和 PDGF 的抗体或激动剂，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90 或其配体的抗体，氨甲蝶呤，环孢菌素，Π(506，雷帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAIDs，布洛芬， 皮质类固醇，强的松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗凝剂，补体抑制剂，肾上腺素能药，IRAK，NIK, IKK, p38，MAP激酶抑制剂，IL-I β转换酶抑制剂，TNFa转换酶抑制剂，T 细胞发信号抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转换酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL_lRI、 sIL-lRII、sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4、IL-10、IL-IU IL-13 和 TGFβ。在具体实施方案中，此处公开的药物组合物经由选自下述的至少一种模式给患者施用肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内(intrarticular)、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、 腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速灌注(bolus)、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内、和经皮。本发明的一个方面提供针对本发明的至少一种结合蛋白的至少一种抗独特型抗体。抗独特型抗体包括包含分子的任何蛋白或肽，所述分子包含至少部分免疫球蛋白分子， 例如但不限于，重或轻链的至少一个互补性决定区(CDR)或其配体结合部分，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，构架区，或其可以掺入本发明的结合蛋白内的任何部分。另一方面，本发明提供改善本发明结合蛋白的特征的方法，包括步骤(a)在改变之前测定结合蛋白的特征；(a)改变重和/或轻链的(Xl)工的长度和/或序列，从而提供改变的重和/或轻链；以及(b)测定改变的结合蛋白的改善的特征，所述改变的结合蛋白含有改变的重和轻链。在另一个实施方案中，本发明提供改善本发明结合蛋白的特征的方法， 包括步骤(a)在改变之前测定结合蛋白的特征；(b)改变第一个和第二个多肽链，以致于 VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n 变为 VD2- (Xl)n-VDl-C- (X2) n，从而提供改变的重和轻链; 以及(c)测定改变的结合蛋白的改善的特征，所述改变的结合蛋白包含改变的重和轻链。在另一个实施方案中，本发明提供改善本发明结合蛋白的特征的方法，包括步骤(a)在改变之前测定结合蛋白的特征；(b)改变第一个和/或第二个多肽链，以致于重和/或轻链的仅一个VDl或VD2的序列被改变；和(c)测定改变的结合蛋白的特征，所述改变的结合蛋白含有改变的重和轻链。特征选自结合靶抗原、从宿主细胞的表达得率、体外半衰期、体内半衰期、 稳定性、可溶性、亲和力、抗体亲抗原性(avidity)、以及改善的效应子功能。在一个实施方案中，增加改变的重链的接头长度。在另一个实施方案中，减少改变的重链的接头长度。在一个实施方案中，增加改变的轻链的接头长度。在另一个实施方案中，减少改变的轻链的接头长度。在本发明方法和组合物的另一个实施方案中，改变的重和/或轻链含有切割位点。在一个实施方案中，切割位点位于至少一个VDl和VD2之间。在另一个实施方案中，切割位点在至少一个接头中。在一个实施方案中，用酶或试剂切割重和/或轻链，所述酶或试剂选自肠激酶、凝血酶、!Rescission、烟草蚀斑病毒蛋白酶(TEV)、以及组织纤溶酶原激活物(tPA) +脯氨酸。在另一个实施方案中，用酶或试剂切割结合蛋白，所述酶或试剂选自锌依赖性的内肽酶、基质金属蛋白酶(MMP)、沙雷氏菌溶素(serralysin)、虾红素、蛇毒蛋白酶、MMP-I、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、 MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-18、MMP-19、MMP-20、MMP-21、MMP-22、MMP-23A、MMP-23B、 MMP-24、MMP-25、MMP-26、MMP-27、MMP-28、解联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)、ADAM17、ADAMTS1、 ADAMU ADAMlO, ADAM8、ADAMTS4、ADAMTS13、ADAMl2, ADAMl5, ADAM9、ADAMTS5、ADAM33、ADAMl 1、ADAM2、ADAMTS2、ADAMTS9、ADAMTS3、ADAMTS7、ADAM22、ADAM28、ADAMTS12、ADAM19、 ADAMTS8、ADAM29、ADAM23、ADAM3A、ADAM18、ADAMTS6、ADAM7、ADAMDES1、ADAM20、ADAM6、 ADAM2UADAM3B, ADAMTSL3、ADAMTSL4、ADAM30、ADAMTS20、ADAMTSL2、胱天蛋白酶、胱天蛋白酶1-12、胱天蛋白酶14、组织蛋白酶、组织蛋白酶G、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶Ll、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、组织蛋白酶H、组织蛋白酶A、组织蛋白酶 E、组织蛋白酶L、组织蛋白酶Z、组织蛋白酶F、组织蛋白酶G样2、组织蛋白酶L样1、组织蛋白酶W、组织蛋白酶L样2、组织蛋白酶L样3、组织蛋白酶L样4、组织蛋白酶L样5、组织蛋白酶L样6、组织蛋白酶L样7、组织蛋白酶0、钙激活中性蛋白酶、钙激活中性蛋白酶3、钙激活中性蛋白酶10、钙激活中性蛋白酶1 (mu/1)大亚基、钙激活中性蛋白酶小亚基1、钙激活中性蛋白酶2 (mu/1)大亚基、钙激活中性蛋白酶9、钙激活中性蛋白酶11、钙激活中性蛋白酶5、钙激活中性蛋白酶6、钙激活中性蛋白酶13、钙激活中性蛋白酶8、钙激活中性蛋白酶小亚基2、钙激活中性蛋白酶15、钙激活中性蛋白酶12、钙激活中性蛋白酶7以及钙激活中性蛋白酶8。在一个实施方案中，VDl或VD2中至少一个直到VDl和VD2之间发生切割才与其靶结合。在另一个实施方案中，结合蛋白的接头已由酶选择性切割。在另一个实施方案中，结合蛋白的接头在生产过程中已由酶选择性切割。在另一个实施方案中，结合蛋白的接头在 DVD-Ig与至少一个靶接近时已由酶选择性切割。在另一个实施方案中，结合蛋白在DVD-Ig 与至少一个靶结合时由酶选择性切割。另一方面，本发明提供治疗受试者的疾病或病症的方法，其通过下述实现给受试者施用本发明的结合蛋白，从而实现治疗。在一个实施方案中，VDl或VD2的至少一个直到结合蛋白被切割时才结合其靶。在另一个实施方案中，VD2直到结合蛋白被切割时才结合其靶。在另一个实施方案中，VDl在结合蛋白被切割时得到释放。在另一个实施方案中，VDl 在VD2与其靶结合时得到释放。附图
简述
图IA是双重可变结构域(DVD) -Ig构建体的示意图示，且显示了从2种亲本抗体产生 DVD-Ig的策略；
图IB是构建体DVD1-Ig、DVD2-Ig，以及2种嵌合单特异性抗体的示意图示。发明详述
本发明涉及能够结合2种或更多抗原的多价和/或多特异性结合蛋白。具体而言， 本发明涉及双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)、及其药物组合物、以及用于制备此种 DVD-Igs的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明还包含了使用本发明的DVD-Igs在体外或体内检测特异性抗原的方法。除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。同样，除非另有具体说明，术语例如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分。—般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学
28以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。 除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。使用标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送、以及患者治疗。 为了本发明可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。 如本文使用的，术语“多肽”指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白，，可与术语多肽互换使用，且同样指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包含天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。除非另外与上下文矛盾，此处使用 “多肽”意在包含多肽和其片段及变体(包括变体的片段)。对于抗原多肽，多肽片段任选含有至少一个连续或非线性多肽表位。可以使用本领域普通方法确定至少一个表位片段的精确边界。该片段包含至少约5个邻接氨基酸，例如至少约10个邻接氨基酸、至少约15个邻接氨基酸、或至少约20个邻接氨基酸。多肽变体如此处所述。术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是这样的蛋白或多肽，其由于其衍生起源或来源不与天然结合的组分结合，所述天然结合的组分在其天然状态下与其伴随；基本上不含来自相同物种的其他蛋白；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分“分离的”。还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得蛋白基本上不含天然结合的组分。如本文使用的，术语“回收”指通过分离，例如使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得化学种类例如多肽基本上不含天然结合的组分的过程。如本文使用的，“生物学活性”指分子的任一项或多项固有生物学特性(无论是如体内发现的那样天然存在的，还是通过重组方法提供或使成为可能的)。生物学特性包括但不限于结合受体；诱导细胞增殖，抑制细胞生长，诱导其他细胞因子，诱导细胞凋亡，和酶促活性。生物学活性也包括Ig分子的活性。如本文使用的，关于抗体、蛋白、或肽与第二种化学种类相互作用的术语“特异性结合”或“特异地结合”，意指相互作用取决于化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别且与特定蛋白结构结合而不是一般地与蛋白结合。如果抗体对表位“A”特异，那么在包含标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。如本文使用的，术语“抗体”广泛地指包含4条多肽链一 2条重(H)链和2条轻(L) 链的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子的基本表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体或衍生。此种突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。其非限制性实施方案在下文讨论。在全长抗体中，每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CHI、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分成称为互补性决定区(CDR)的高变区，用称为构架区(FR)的较保守区域点缀。每个 VH和VL由3个⑶Rs和4个FRs组成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列FR1、⑶R1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、种类(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亚类。术语“Fe区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，它可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区一般包含2个恒定结构域一 CH2结构域和CH3结构域，且任选包含CH4结构域。Fc部分中改变抗体效应子功能的氨基酸残基替换是本领域已知的(Winter等人，美国专利号5，648，260和 5，624，821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、依赖补体的细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。取决于治疗目的，在一些情况下这些效应子功能对于治疗用抗体是所需的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至有害的。某些人IgG同种型，特别是IgGl和IgG3，经由分别与Fc y Rs和补体Clq结合介导ADCC和⑶C。新生Fc受体(Fcfoi)是决定抗体循环半衰期的关键组分。 在另外一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在抗体恒定区例如抗体Fc区中进行替换，从而使得抗体的效应子功能被改变。免疫球蛋白的2条相同重链的二聚化由CH3结构域的二聚化来介导，且通过铰链区内的二硫键来稳定(Huber等人，Nature ；264 :415-20 ；Thies等人，1999 J Mol Biol ；293 :67-79.)。铰链区内的半胱氨酸残基突变以阻止重链-重链二硫键将使CH3结构域的二聚化不稳定。负责CH3 二聚化的残基已得到鉴定(Dall'Acqua 1998 Biochemistry 37 :拟66_73.)。因此，可能产生单价半_Ig。有趣的是，已在自然界中发现关于 IgG 和 IgA 亚类的这些单价半 Ig 分子(Seligman 1978 Ann Immunol 129 :855-70 ； Biewenga 等人，1983 Clin Exp Immunol 51:395-400)。FcRn Ig Fc 区的化学计量已测定为 2:1 (West 等人，2000 Biochemistry 39 :9698_708)，且半 Fc 足以介导 FcRn 结合(Kim 等人，1994 Eur J Immunol ；24 :542-548.)。破坏CH3结构域二聚化的突变可能对其Fcfoi 结合没有更大的不利作用，因为对于CH3 二聚化重要的残基位于CH3 b折叠结构的内界面上，而负责Fcfoi结合的区域位于CH2-CH3结构域的外界面上。然而，由于其比常规抗体的那种更小的尺寸，半Ig分子可以在组织穿透中具有某些优点。在一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在本发明的结合蛋白的恒定区例如Fc区中进行替换，从而使得重链的二聚化被破坏，从而产生半DVD Ig分子。IgG的抗炎症活性完全取决于IgG Fc片段N-联聚糖的唾液酸化作用。已经确定了对抗炎症活性准确的聚糖要求，这样就可以生成合适的IgGl Fc片段，从而生成具有大大增强的能力的完全重组的唾液酸化IgGl Fc (Anthony, R. Μ.， 等人(2008) kience 320:373-376)。如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)，指保留与抗原特异性结合的能力的一种或多种抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。此种抗体实施方案也可以是双特异性、双重特异性、或多特异性形式；与2 种或更多不同抗原特异性结合。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括(i ) Fab片段，由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii ) F (ab’)2片段，包含由铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v) dAb片段(Ward等人，(1989) NatureMl :544-546, Winter等人，PCT公开WO 90/05144 Al，在此引入作为参考)，它包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域 VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，所述合成接头使得它们能够作为单条蛋白链制备，在所述单条蛋白链中VL和VH区配对以形成单价分子 (称为单链 Fv (scFv)；参见，例如，Bird 等人，(1988)^^/7^242 :423-426 ；和 Huston 等人，(1988)/￥oc. Natl. Acad. Sci. 迎5879_5883)。此种单链抗体也预期包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。也包含其他形式的单链抗体例如双抗体。双抗体是二价、 双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许相同链上的2个结构域之间的配对，从而促使结构域与另一条链的互补结构域配对且产生2 个抗原结合部位(参见例如，HolIiger，P.等人，(1993)Natl. Acad. Sci. USA9Q 6444-6448 ；Poljak, R.J.等人，(1994) Siri/ctoreZ :1121_1123)。此种抗体结合部分是本令页域已知的(Kontermann 禾口 Dubel 编，Antibody EnRineerinR (2001) Springer-Verlag. New York.第790页(ISBN 3-540-41354-5)o此外，单链抗体还包括包含一对串联Fv区段 (VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，所述串联Fv区段连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区域(Zapata 等人，Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995);和美国专利号 5，641，870)。术语“多价结合蛋白”在本说明书自始至终用于指包含2种或更多抗原结合部位的结合蛋白。在一个实施方案中，多价结合蛋白经工程改造为具有3个或更多抗原结合部位，且一般不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”指能够结合2种或更多相关或无关靶的结合蛋白。本发明的双重可变结构域(DVD)结合蛋白包含2个或更多抗原结合部位，且是四价或多价结合蛋白。DVDs可以是单特异性的，即能够结合一种抗原，或多特异性的，即能够结合2种或更多抗原。包含2条重链DVD多肽和2条轻链DVD多肽的DVD结合蛋白称为DVD-Ig。每一半DVD-Ig包含重链DVD多肽，和轻链DVD多肽，和2个抗原结合部位。每个结合部位包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中每个抗原结合部位总共6 个涉及抗原结合的CDRs。如本文使用的，术语“双特异性抗体”指通过下述产生的全长抗体，四源杂交瘤技术(参见 Milstein，C.和 Α. C. Cuello,Nature, 1983. 305 (5934):第 537-40 页)，2 种不同单克隆抗体的化学缀合(参见Maerz，U. D.等人，Nature，1985. 314(6012):第628-31页)， 或结进孔或在Fc区中引入突变的类似方法(参见Holliger，P.，T. Prospero和G. Winter, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90 (14):第 6444-8. 18 页)，从而导致其中只有一种是功能性双特异性抗体的多种不同免疫球蛋白种类。通过分子功能，双特异性抗体结合其2 个结合臂之一(1对HC/LC)上的一种抗原(或表位)，且结合其第二个臂(不同对的HC/LC)上的不同抗原(或表位)。通过这个定义，双特异性抗体具有2个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列中)，且对于其结合的每种抗原是单价的。如本文使用的，术语“双重特异性抗体”指可以在其2个结合臂的每一个中(一对 HC/LC)结合2种不同抗原(或表位)的全长抗体(参见PCT公开WO 02/02773)。因此，双重特异性结合蛋白具有2个相同的抗原结合臂，具有相同的特异性和相同的CDR序列，且对于其结合的每种抗原是二价的。结合蛋白的“功能性抗原结合部位”是能够结合靶抗原的结合部位。抗原结合部位的抗原结合亲和力不必与抗原结合部位由其衍生的亲本抗体一样强，但结合抗原的能力必须是可使用已知用于评价与抗原结合的抗体的多种方法中的任何一种测量的。此外，本文的多价抗体的每个抗原结合部位的抗原结合亲和力无需在量上相同。术语“细胞因子”是由一种细胞群体释放的蛋白的一般术语，所述蛋白作为细胞间介质作用于另一种细胞群体。此种细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子、和传统的多肽激素。在细胞因子中包括的是生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促卵胞激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)，和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子α和β ；米勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-α ；血小板生长因子；胎盘生长因子；转化生长因子(TGFs)例如TGF-α和 TGF-β ；胰岛素样生长因子-1和-11 ；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α、-β和-Y集落刺激因子(CSFs)例如巨噬细胞-CSF (M-CSF)；粒细胞巨噬细胞-CSF (GM-CSF);和粒细胞-CSF (G-CSF);白细胞介素(ILs)例如 IL_1、IL-2、IL-3、IL_4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、 IL-23、IL-33 ；肿瘤坏死因子例如TNF- α或TNF- β ；及其他多肽因子包括LIF和kit配体 (KL)0如本文使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养的蛋白，以及天然序列细胞因子的生物学活性等价物。术语“接头”用于指包含通过肽键连接的2个或更多氨基酸残基的多肽，且用于连接一个或多个抗原结合部分。此种接头多肽是本领域众所周知的(参见例如，Holliger, P.等人，(1993)/￥oc. Natl. Acad. Sci. 迎6444-6448 ;Poljak，R. J.等人，(1994) Structure!-.\\2\-\\2 >)0 示例性接头包括但不限于，AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID N0:1)； AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:2);AKTTPKLGG(SEQ ID NO:3)；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:4); SAKTTP (SEQ ID N0:5);RADAAP (SEQ ID N0:6);RADAAPTVS (SEQ ID NO:7);RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO:8)；RADAAAACG4S)4(SEQ ID NO:9)；SAKTTPKLEEGEFSEARVCSEQ ID N0:10);ADAAP (SEQ ID NO:11) ；ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO:12) ；TVAAP (SEQ ID NO:13) ；TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO:14) ；QPKAAP (SEQ ID NO:15) ；QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO:16) ；AKTTPP (SEQ ID N0:17);AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18);AKTTAP (SEQ ID NO: 19);AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO:20)；ASTKGP (SEQ ID NO:21 );ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22)，GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23) ；GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24) ；GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25);GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26);GGGGGGGP (SEQ ID NO: 27);GGGGGGGGP (SEQ ID NO: 28) ；PAPNLLGGP (SEQ ID NO: 29)；PNLLGGP (SEQ ID NO: 30)；GGGGGGP (SEQ ID NO: 31)；PAPELLGGP (SEQ ID NO: 32) ；PTISPAPNLLGGP (SEQ ID NO: 33) ；TVAADDDDKSVFIVPP (SEQ ID NO: 34) ；TVDDDDKAAP (SEQ ID NO: 35) ；LVPRGSAAP (SEQ ID NO: 36) ；ASDDDDK GGP (SEQ ID NO: 37) ；ALVPR GSGP (SEQ ID NO: 38) ；ASTDDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 39)；TVALVPR GSVFIFPP (SEQ ID NO: 40);ASTLVPR GSVFPLAP (SEQ ID NO: 41);TVAADDDK SVFIVPP (SEQ ID NO: 42) ；ASTDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 43) ；LEVLFQ GP (SEQ ID NO: 44) ；TVAALEVLFQ GPAP (SEQ ID NO: 45) ；ASTLEVLFQ GPLAP (SEQ ID NO: 46) ；PAPLEVLFQ GP (SEQ ID NO: 47) ；TAENLYFQ GAP (SEQ ID NO: 48) ；AENLYFQ GA (SEQ ID NO: 49)； PGPFGR SAGGP (SEQ ID NO: 50)；PGPFGR SAGG (SEQ ID NO: 51);PQRGR SAG (SEQ ID NO: 52);PHYGR SGG (SEQ ID NO: 53);GPFGR SAGP (SEQ ID NO: 54)；GDDDDK GGP (SEQ ID NO:
3255);AGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 56);GGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 57);AS; TVA; ASTK (SEQ ID NO: 58);ASTKGPSV (SEQ ID NO: 59);ASTKGPSVFP (SEQ ID NO: 60);TVAAPSV (SEQ ID NO: 61), TVAAPSVFI (SEQ ID NO: 62)。在一些情况下，DVD-Ig结构，尤其是连接VLl - VL2和VHl - VH2的接头，可以对结合内部(C末端)结构域的配体加以制约。在一个实施方案中，DVD-Ig可由酶切割，从而改善或去除该制约。在一个实施方案中，DVD-Ig可由酶在重链和轻链的至少之一的VDl (VH1，VLl)和VD2 (VH2，VL2)结构域之间切割。在一个实施方案中，可切割接头将重链和轻链的至少之一的VDl和VD2结构域连接。在一个实施方案中，DVD-Ig由肠激酶、凝血酶、 !^rescission、烟草蚀斑病毒蛋白酶(TEV)和组织纤溶酶原激活物(tPA) +脯氨酸切割。在一个实施方案中，为了试图克服这种潜在制约，对DVD-Ig的外部可变结构域(N 末端)和内部可变结构域(C末端)之间的可切割接头、或DVD-Ig的外部可变结构域通过 VHl - VH2或VLl - VL2连接与内部可变结构域的单链(VH/VL无接头)附着进行测试。 内部结构域结合也可以通过接头长度调节。VHl - VH2和VLl - VL2接头可以由衍生自 CH1/CL的序列、IgG的铰链区、以及例如甘氨酸-丝氨酸重复的序列组成但不限于此。提供这种可替代的接头可以(1)给DVD-Ig内部抗原结合部位恢复完全抗原亲和力；(2)调节 DVD-Ig内部抗原结合部位的亲和力；(3)在作用部位活化DVD-Ig内部抗原结合部位；(4) 增加DVD-Ig对抗原的抗体亲抗原性；和/或(5)将外部可变结构域作为Fv单位释放。以许多方法实现外部结构域Fv的附着。首先，将蛋白酶切割位点工程改造到接头序列中。这在连接DVD-Ig内部或外部可变结构域的重或轻链接头之一或两者上进行。蛋白酶切割序列选自任何数目的蛋白酶切割序列(例如，见表1、2、5、6和实施例2. 3)。理想的，选择蛋白酶以切割特定序列，而不易切割DVD-Ig中的其他位点。含有蛋白酶切割序列的DVD-Ig构建体在生产过程自身中受到蛋白水解切割，或者，如果选择的蛋白酶由靶细胞类型表达，那么DVD-Ig在靶组织或通过另一种内源蛋白酶切割。因此将DVD - Ig认为是在预期治疗位点活化的前体药物。另外，这种机制允许DVD - Ig掩盖内部结合位点的特定抗原结合亲和力直到其在靶向的治疗位点被活化。本发明的组合物和方法的另一个优点是以位点特异性方式增加对特定靶向的抗原的亲和力的能力。这是以下列方式通过抗体亲抗原性实现的。如果DVD-Ig含有结合相同抗原上两个不同表位的抗原结合结构域，那么其可能具有外部可变结构域增加的灵活性使其与相同抗原在不同位置结合两次，从而通过抗体亲抗原性增加对该特定抗原的表观亲和力。也可以设计靶向(相同细胞或不同细胞上)两个不同抗原的具有可切割接头的DVD-Ig，以便以位点特异的方式(通过抗体亲抗原性)增强亲和力。例如两个目的抗原可以同时在肿瘤上、但是单独在正常细胞上表达。因此，两个 DVD - Ig结构域以增加的抗体亲抗原性在肿瘤细胞上的结合将改善肿瘤结合特异性，并降低DVD-Ig对正常细胞的副作用(毒性)。也可以预见，可以工程改造重和轻链之间的二硫键、或外部可变结构域的VH和VL中的特定突变，来保持其体内连接性。在一些情况下，使用相同的切割技术从DVD-Ig切割整个外部Fv从而导致产生游离Fv和IgG也是有利的。Fv 切割可以发生在靶与外部结构域结合之前或之后。表1:在VLl - VL2或VHl - VH2接头中具有蛋白酶切割位点(表示为缺口)的接头实例
权利要求
1.一种包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中；VDl是第一个重链可变结构域； VD2是第二个重链可变结构域； C是重链恒定结构域； Xl是接头，条件是其不是CHl ； X2是Fc区；(Xl)n 是(Xl)O 或(Xl) 1 ；且 (X2)n 是(X2)0 或(X2) 1 ； 其中重链包含切割位点。
2.一种包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中；VDl是第一个轻链可变结构域； VD2是第二个轻链可变结构域； C是轻链恒定结构域； Xl是接头，条件是其不是CHl ； X2不含Fc区； (Xl)n 是(Xl)O 或(Xl) 1 ；且 (X2)n 是(X2)0 或(X2) 1 ； 其中轻链包含切割位点。
3.一种包含第一个和第二个多肽链的结合蛋白，其中所述第一个多肽链包含第一个 VDl- (Xl) n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个重链可变结构域； VD2是第二个重链可变结构域； C是重链恒定结构域； Xl是接头，条件是它不是CHl ；且 X2是Fc区；且其中所述第二个多肽链包含第二个VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个轻链可变结构域；VD2是第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；Xl是接头，条件是它不是CHl ；X2不包含Fc区；(Xl)n 是(Xl)O 或(Xl) 1 ；且(X2) η是(X2) 0或(Χ2) 1，其中重链和轻链的至少一个包含切割位点。
4.一种包含四个多肽链的能够结合两个抗原的结合蛋白，其中两个多肽链包含 VDl- (Xl) n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个重链可变结构域； VD2是第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；Xl是接头，条件是它不是CHl ；且X2是Fc区；且其中两个多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个轻链可变结构域；VD2是第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；Xl是接头，条件是它不是CHl ；X2不包含Fc区；(Xl)n 是(Xl)O 或(Xl) 1 ；且(X2) η是(X2) 0或(Χ2) 1 ；其中重链和轻链的至少一个包含切割位点。
5.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中η是0。
6.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中Xl或Χ2是选自SEQID NOs 1-62, TVA和AS的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是可切割的，从而与VDl 和VD2的至少一个的结合得到增强。
8.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是由酶或试剂切割的， 所述酶或试剂选自肠激酶、凝血酶、!Rescission、烟草蚀斑病毒蛋白酶(TEV)、以及组织纤溶酶原激活物(tPA) +脯氨酸。
9.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是由酶或试剂切割的， 所述酶或试剂选自锌依赖性的内肽酶、基质金属蛋白酶(MMP)、沙雷氏菌溶素、虾红素、蛇毒蛋白酶、MMP-U MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-IU MMP-12、MMP-13、 MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18、MMP-19、MMP-20、MMP-21、MMP-22、MMP-23A、 MMP-23B、MMP-24、MMP-25、MMP-26、MMP-27、MMP-28、解联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)、ADAM17、 ADAMTSU ADAMl, ADAMlO, ADAM8、ADAMTS4、ADAMTS13, ADAMl2, ADAMl5, ADAM9、ADAMTS5、 ADAM33、ADAMl 1、ADAM2、ADAMTS2、ADAMTS9、ADAMTS3、ADAMTS7、ADAM22、ADAM28、ADAMTS12、 ADAM19、ADAMTS8、ADAM29、ADAM23、ADAM3A、ADAM18、ADAMTS6、ADAM7、ADAMDES1、ADAM20、 ADAM6、ADAM21、ADAM3B、ADAMTSL3、ADAMTSL4、ADAM30、ADAMTS20、ADAMTSL2、胱天蛋白酶、胱天蛋白酶1-12、胱天蛋白酶14、组织蛋白酶、组织蛋白酶G、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶Ll、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、组织蛋白酶H、组织蛋白酶A、组织蛋白酶E、组织蛋白酶L、组织蛋白酶Z、组织蛋白酶F、组织蛋白酶G样2、组织蛋白酶L样 1、组织蛋白酶W、组织蛋白酶L样2、组织蛋白酶L样3、组织蛋白酶L样4、组织蛋白酶L样 5、组织蛋白酶L样6、组织蛋白酶L样7、组织蛋白酶0、钙激活中性蛋白酶、钙激活中性蛋白酶3、钙激活中性蛋白酶10、钙激活中性蛋白酶1 (mu/1)大亚基、钙激活中性蛋白酶小亚基 1、钙激活中性蛋白酶2 (mu/1)大亚基、钙激活中性蛋白酶9、钙激活中性蛋白酶11、钙激活中性蛋白酶5、钙激活中性蛋白酶6、钙激活中性蛋白酶13、钙激活中性蛋白酶8、钙激活中性蛋白酶小亚基2、钙激活中性蛋白酶15、钙激活中性蛋白酶12、钙激活中性蛋白酶7、以及钙激活中性蛋白酶8。
10.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中所述切割位点在至少一个VDl和VD2之间。
11.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中所述切割位点在至少一个接头内。
12.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中VDl或VD2的至少一个直到VDl和 VD2之间发生切割时才结合其靶。
13.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白的接头已由酶选择性切割。
14.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白的接头在生产过程中已由酶选择性切割。
15.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白的接头在DVD-Ig与至少一个靶接近时已由酶选择性切割。
16.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白在DVD-Ig与至少一个靶结合时由酶选择性切割。
17.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中所述Fc区选自天然序列Fc区和变体序列Fc区。
18.根据权利要求17的结合蛋白，其中所述Fc区选自来自IgGUIgG2、IgG3、IgG4、 IgA, IgM, IgE 和 IgD 的 Fc 区。
19.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白对所述一个或多个靶具有的结合速率常数(Kon)选自至少约詹1 s-1 ；至少约IO3M-1S-1 ；至少约IO^rV1 ；至少约IO5M4iT1 ；以及至少约IO6M4iT1,如通过表面等离振子共振测量的。
20.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白对所述一个或多个靶具有的解离速率常数(Koff)选自最多约ΙΟ、—1 ；最多约KT4iT1 ；最多约KT5iT1 ；以及最多约IO-fV1,如通过表面等离振子共振测量的。
21.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白对所述一个或多个靶具有的解离常数(Kd)选自最多约10_7 M ；最多约10_8 M ；最多约10_9 M ；最多约10, M ；最多约ΙΟ—11 M ；最多约10_12 M ；以及最多10_13 Μ。
22.包含根据权利要求1-4任一项的结合蛋白的结合蛋白缀合物，所述结合蛋白缀合物另外包含选自下述的试剂免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。
23.根据权利要求22的结合蛋白缀合物，其中所述试剂是选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记、和生物素的显像剂。
24.根据权利要求22的结合蛋白缀合物，其中所述显像剂是选自下述的放射性标记 3H、14C、35S、9°Y、99TC、mh、125I、131I、177LU、166Ho、和 153Sm0
25.根据权利要求22的结合蛋白缀合物，其中所述试剂是选自抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素、和细胞凋亡剂的治疗或细胞毒性剂。
26.根据权利要求1-4任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是结晶结合蛋白。
27.根据权利要求沈的结合蛋白，其中所述晶体是无载体的药学控释晶体。
28.分离的核酸，其编码根据权利要求1-11中任一项的结合蛋白氨基酸序列。
29.载体，其含有根据权利要求18的分离的核酸。
30.根据权利要求四的载体，其中所述载体选自pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、ρJV,pcDNA3. 1 T0P0、pEF6 Τ0Ρ0、和 pBJ。
31.宿主细胞，其含有根据权利要求四的载体。
32.根据权利要求31的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
33.根据权利要求32的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
34.根据权利要求31的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
35.根据权利要求34的宿主细胞，其中所述真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。
36.根据权利要求35的宿主细胞，其中所述动物细胞选自哺乳动物细胞、鸟类细胞和昆虫细胞。
37.根据权利要求34的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
38.根据权利要求34的宿主细胞，其中所述宿主细胞是COS。
39.根据权利要求34的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
40.根据权利要求39的宿主细胞，其中所述酵母细胞是啤酒糖酵母。
41.根据权利要求36的宿主细胞，其中所述宿主细胞是昆虫Sf9细胞。
42.产生结合蛋白的方法，包括在足以生产结合蛋白的条件下，在培养基中培养权利要求31 — 41中任一项中所述的宿主细胞。
43.根据权利要求42的方法，其中生产的50%- 75%的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白ο
44.根据权利要求42的方法，其中生产的75%- 90%的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白ο
45.根据权利要求42的方法，其中生产的90%— 95%的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白ο
46.根据权利要求42的方法生产的蛋白。
47.药物组合物，包含权利要求1一 27中任一项的结合蛋白、以及药学可接受的载体。
48.根据权利要求47的药物组合物，另外包含至少一种另外的治疗剂。
49.根据权利要求48的药物组合物，其中所述另外的治疗剂选自治疗剂，显像剂， 细胞毒性剂，血管发生抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻断剂；粘附分子阻断剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；氨甲蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素；Π(506 ；可检测标记或报道分子； TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉弛缓剂，麻醉药，非类固醇消炎药(NSAID)，止痛剂，麻醉剂，镇静剂，局部麻醉剂，神经肌肉阻断剂；抗微生物剂，抗牛皮癣剂，皮质类固醇，促蛋白合成类固醇，促红细胞生成素，免疫接种，免疫球蛋白，免疫抑制剂，生长激素，激素替代药物，放射性药物，抗抑郁药，抗精神病药，刺激剂，哮喘药物治疗，β激动剂，吸入类固醇，肾上腺素或类似物，细胞因子，和细胞因子拮抗剂。
50.治疗受试者的疾病或病症的方法，其通过下述实现给受试者施用权利要求1一 27 中任一项的结合蛋白，从而实现治疗。
51.权利要求50的方法，其中所述病症选自类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、 肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、khmidt氏综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、秃头、斑秃、血清反应阴性关节病、关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、 获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、 全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、Sjogren氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、 具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病N0S、肾小球肾炎、肾显微血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或N0S、精子自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、SjSrgren 氏综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神分裂症)、Th2型和Thl型介导的疾病、急性和慢性痛(不同形式的疼痛)、以及癌症例如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、 变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(C0PD)、 慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfe 1 dt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、 Hallervorden-Spatz病、hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、流行性感冒a、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager 禾口 Machado-Jos印h)、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性I肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合征/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征)、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性核上麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应、全身炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、 静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合征、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人Mill氏病、斑秃、过敏反应、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、动脉硬化、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、 自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性过早卵巢衰竭、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合征(cis)、结膜炎、儿童期发病性精神病、慢性阻塞性肺部疾病(C0PD)、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、糖尿病、椎间盘突出、盘脱垂、药物诱导的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、Guillain-Barre综合征(GBS)、枯草热、Hughes综合征、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎、 Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、morbus bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、 多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合征、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病(PA0D)、周围血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)、多软骨炎、风湿性多肌痛、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合征、多肌炎、风湿性多肌痛 (PMR)、泵后综合征、原发性帕金森综合征、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、sapho (滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、 sneddon-wiIkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎、Stevens-Johnson综合征(SJS)、全身性炎症应答综合征、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS (肿瘤坏死因子受体，I型变态反应，II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎(UIP)、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合征(VKH综合征)、湿黄斑变性、伤口愈合、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关的关节病。
52.根据权利要求50的方法，其中经由选自下述的至少一种模式进行给受试者的者施用肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速灌注、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内、和经皮。
53.生成能够结合两个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白的方法，包括下列步骤a)获得能够结合第一个抗原的第一个亲本抗体或其抗原结合部分；b)获得能够结合第二个抗原的第二个亲本抗体或其抗原结合部分；c)构建含有VDl-(Xl)n-VD2-C- (X2) η的第一个和第三个多肽链，其中VDl是从所述第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域； VD2是从所述第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域； C是重链恒定结构域； Xl是接头，条件是它不是CHl ； Χ2是Fc区；(Χ1)η 是(Xl)O 或(Xl) 1 ；且 (Χ2)η 是(Χ2)0 或(Χ2) 1 ；且d)构建含有VDl-(Xl)n-VD2-C- (X2) η的第二个和第四个多肽链，其中VDl是从所述第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从所述第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；Xl是接头，条件是它不是CHl ；Χ2不包含Fc区；(Χ1)η 是(Xl)O 或(Xl) 1 ；且(Χ2)η 是(Χ2)0 或(Χ2) 1 ；且e)表达所述第一个、第二个、第三个和第四个多肽链；从而生成能够结合所述第一个和所述第二个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白，其中至少一个重和轻链包含切割位点。
54.权利要求53的方法，其中所述Fc区选自天然序列Fc区和变体序列Fc区。
55.权利要求53的方法，其中所述Fc区选自来自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、 IgE和IgD的Fc区。
56.生成具有所需特性的能够结合两个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白的方法，包括下列步骤a)获得第一个亲本抗体或其抗原结合部分，其能够结合第一个抗原，并具有至少一个由双重可变结构域免疫球蛋白表现的所需特性；b)获得第二个亲本抗体或其抗原结合部分，其能够结合第二个抗原，并具有至少一个由双重可变结构域免疫球蛋白表现的所需特性；c)构建包含VDl-(Xl)n-VD2-C- (X2) η的第一个和第三个多肽链，其中；VDl是从所述第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域； VD2是从所述第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域； C是重链恒定结构域； Xl是接头，条件是它不是CHl ； Χ2是Fc区；(Χ1)η 是(Xl)O 或(Xl) 1 ；且 (Χ2)η 是(Χ2)0 或(Χ2) 1 ；d)构建包含VDl-(Xl)n-VD2-C- (X2) η的第二个和第四个多肽链，其中；VDl是从所述第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从所述第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；Xl是接头，条件是它不是CHl ；X2不包含Fc区；(Xl)n 是(Xl)O 或(Xl) 1 ；且(X2)n 是(X2)0 或(X2) 1 ；e)表达所述第一个、第二个、第三个和第四个多肽链；从而生成具有所需特性的能够结合所述第一个和所述第二个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白，其中至少一个重和轻链包含切割位点。
57.改善根据权利要求3或4的结合蛋白的特征的方法，该方法包括步骤 (a)在改变之前测定结合蛋白的特征；(a)改变重链和/或轻链的(Xl)！的长度和/或序列，从而提供改变的重和/或轻链；(b)测定改变的结合蛋白的改善的特征，所述改变的结合蛋白含有改变的重和轻链；其中至少一个重和轻链含有切割位点。
58.改善根据权利要求3或4的结合蛋白的特征的方法，该方法包括步骤(a)在改变之前测定结合蛋白的特征；(b)改变第一个和第二个多肽链，以致于VDl-(Xl)n-VD2-C- (X2)n变为VD2- (Xl) n-VDl-C- (X2)n，从而提供改变的重和轻链；(c)测定改变的结合蛋白的改善的特征，所述改变的结合蛋白含有改变的重和轻链；其中至少一个重和轻链含有切割位点。
59.改善根据权利要求3或4的结合蛋白的特征的方法，该方法包括步骤(a)在改变之前测定结合蛋白的特征；(b)改变第一个和/或第二个多肽链，以致于重和/或轻链的仅一个VDl或VD2的序列被改变；以及(c)测定改变的结合蛋白的特征，所述改变的结合蛋白含有改变的重和轻链；其中至少一个重和轻链含有切割位点。
60.根据权利要求57- 59中任一项的方法，其中所述特征选自结合靶抗原、从宿主细胞的表达得率、体外半衰期、体内半衰期、稳定性、可溶性、亲和力、抗体亲抗原性、以及改善的效应子功能。
61.根据权利要求57的方法，其中改变的重链的接头长度增加。
62.根据权利要求57的方法，其中改变的重链的接头长度减少。
63.根据权利要求57的方法，其中改变的轻链的接头长度增加。
64.根据权利要求57的方法，其中改变的轻链的接头长度减少。
65.根据权利要求65的方法，其中所述切割位点在至少一个VDl和VD2之间。
66.根据权利要求65的方法，其中所述切割位点位于至少一个接头内。
67.治疗受试者的疾病或病症的方法，其通过下述实现给受试者施用权利要求58-66中任一项的结合蛋白，从而实现治疗。
68.根据权利要求67的方法，其中VDl或VD2的至少一个直到结合蛋白被切割时才结合其靶。
69.根据权利要求67的方法，其中VD2直到结合蛋白被切割时才结合其靶。
70.根据权利要求67的方法，其中VDl在结合蛋白被切割时得到释放。
71.根据权利要求67的方法，其中VDl在VD2与其靶结合时得到释放。
72.一种包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个重链可变结构域； VD2是第二个重链可变结构域； C是重链恒定结构域； Xl是接头，条件是其不是CHl ； X2是Fc区；(Xl)n 是(Xl)O 或(Xl) 1 ；且 (X2)n 是(X2)0 或(X2) 1 ；其中VDl和VD2重链可变结构域包含选自SEQ ID NOs: 64、66、68、70、72、74、76和78的氨基酸序列。
73.一种包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个轻链可变结构域；VD2是第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；Xl是接头，条件是其不是CHl ；X2不包含Fc区；(Xl)n 是(Xl)O 或(Xl) 1 ；且(X2)n 是(X2)0 或(X2) 1 ；其中VDl和VD2轻链可变结构域包含选自SEQ ID NOs: 65、67、69、71、73、75、77和79的氨基酸序列。
74.—种包含第一个和第二个多肽链的结合蛋白，其中所述第一个多肽链包含第一个 VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个重链可变结构域； VD2是第二个重链可变结构域； C是重链恒定结构域； Xl是接头，条件是它不是CHl ；且 X2是Fc区；且其中所述第二个多肽链包含第二个VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个轻链可变结构域；VD2是第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；Xl是接头，条件是它不是CHl ；X2不包含Fc区；(Xl)n 是(Xl) 0 或(Xl) 1 ；且(X2)n 是(X2)0 或(X2) 1，其中VDl和VD2重链可变结构域包含选自SEQ ID NOs: 64、66、68、70、72、74、76和78 的氨基酸序列，且其中VDl和VD2轻链可变结构域包含选自SEQ ID NOs: 65、67、69、71、73、 75、77和79的氨基酸序列。
75. —种包含四个多肽链的能够结合两个抗原的结合蛋白，其中两个多肽链包含 VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中 VDl是第一个重链可变结构域； VD2是第二个重链可变结构域； C是重链恒定结构域； Xl是接头，条件是它不是CHl ；且 X2是Fc区；且其中两个多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个轻链可变结构域；VD2是第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；Xl是接头，条件是它不是CHl ；X2不包含Fc区；(Xl)n 是(Xl)O 或(Xl) 1 ；且(X2)n 是(X2)0 或(X2) 1 ；其中VDl和VD2重链可变结构域包含选自SEQ ID NOs: 64、66、68、70、72、74、76和78 的氨基酸序列，且其中VDl和VD2轻链可变结构域包含选自SEQ ID NOs: 65、67、69、71、73、 75、77和79的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及工程改造的多价和多特异性结合蛋白，制备方法，和具体而言涉及其在疾病预防、诊断和/或治疗中的用途。
文档编号A61K39/00GK102300879SQ200980155756
公开日2011年12月28日 申请日期2009年12月4日 优先权日2008年12月4日
发明者G. 雅各布 C., A. 沃特 K., 加于尔 T., 吴辰冰 申请人:雅培制药有限公司