双特异性抗-cxcr7免疫球蛋白单可变结构域的制作方法
【专利摘要】本发明涉及：特定的多肽、编码这种多肽的核酸；制备这种多肽的方法；表达或能够表达这种多肽的宿主细胞；用于预防、治疗或诊断目的的包含这种多肽的组合物，特别是药物组合物。特别地，本发明提供了抑制CXCR7介导的肿瘤生长的免疫球蛋白单可变结构域。
【专利说明】双特异性抗-CXCR7免疫球蛋白单可变结构域
发明领域
[0001]本发明涉及与CXCR7有关的生物材料和方法，包括多肽、编码这种多肽的核酸；制备这种多肽的方法；表达或能够表达这种多肽的宿主细胞；包含这种多肽的组合物，包括药物组合物，其例如用于预防、治疗或诊断目的。
[0002]发明背景
[0003]虽然现有技术中提出i)CXCR7的阻断配合CXCR4阻断的使用可用于治疗SDF-1依赖的肿瘤发展和转移(RB Maksym 等，2009，The role of stromal-derived factor-1 -CXCR7axis in development of cancer, European Journal of Pharmacology, 625(1-3)，第31-40页)以及ii) 一些小分子抑制剂，例如CCX733或CCX266、siRNA和阻断抗体(克隆 MabllG8，Mab9C4 参见例如 US20070167443;克隆 358426 (R&DSystems) ;Mab8FlI (Biolegend))，可用于治疗性干扰CXCR4-介导的整联蛋白激活(TNHartmann 等,2008, A crosstalk between intracellular CXCR7and CXCR4 involvedin rapid CXCL12_triggered integrin activation but not in chemokine—triggeredmotility of human T lymphocytes and CD34+ceIIs, Journal of Leukocyte Biology, 84,第11301140页)，由于CXCR7的作用机制是不清楚的，因此对CXCR7的生物学仍然知之甚少，因为i)它可能作为一种依赖于细胞类型的诱馆或信号传导受体-前述的RM Maksym等，并且因为ii)与CXCR7结合的1-TAC和SDF-1之间的相互作用是不清楚的。
[0004]对选择性治疗有效的抗-CXCR7试剂的鉴别不仅仅因为对其生物学(例如以下的作用机制:例如相对于拮抗剂而言潜在的激动剂CCX733或CCX266，与CXCR4的相互作用，重要表位的识别，化合物CCX733或CCX266的交叉反应性和相关的毒性)所知甚少而具有挑战性，现有技术中还认为(参见例如Naunyn-Schmied ArchivesPharmacology379:385-388)抗-GPCR治疗剂如抗-CXCR7试剂的产生是困难的，因为i)癌细胞中活性CXCR7的天然构象尚不清楚，ii)预期CXCR7显示低的免疫原性(因为胞外表面暴露的并且另外非常保守的氨基酸残基的数量有限，例如小鼠-人的CXCR7是96%同源的)。
[0005]而且，能选择性阻断CXCLll和CXCL12与CXCR7结合的化合物(CCX733，CCX754)，其功能在同二聚体化方面与趋化因子配体一样，即它们使CXCR7的同二聚体化增加2.5-3.5倍，在10和IOOnM首次检测时即有显著的增加(P〈0.05) (KE Luker等,2009, Imaging chemokine receptor dimerization with firefly luciferasecomplementation, FASEB journal, 23,第 823-834 页)。
[0006]而且，CXCR7在肿瘤发展中具有潜在作用，因为其表达使细胞具有生长和存活优势。最近证明CXCR7促进乳腺和肺肿瘤的生长并增加肺转移(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA2007104:15735-15740)。而且，在前列腺癌中CXCR7的表达与肿瘤的侵入性有关(J.Biol.Chem2008283:4283-4294)。在动物模型中施用CXCR7的小分子拮抗剂导致肿瘤生长的阻碍，证明CXCR7是开 发新的癌症治疗剂的靶标(J.Exp.Med.2006203:2201-2213)。
[0007]头颈癌是世界上最普遍的肿瘤之一。尽管在头颈肿瘤的治疗上取得了进展，但是在过去几十年间患有这些癌症的患者的存活并没有显著提高，因为无法控制这种疾病的局部和向远处扩散且对此所知甚少。头颈癌始终名列世界上六种最常诊断的癌症。单独的口腔和咽部的癌症每年在全世界有大约300，000个新病例以及快到200，000个死亡病例。超过90%的头颈癌是上呼吸消化道，包括口腔、咽部、喉部、和鼻窦的鳞状细胞癌。此外，上皮头颈肿瘤也可能出现在唾液腺和腮腺。尽管我们在头颈癌的认识和头颈癌的预防和治疗上取得了一些进展，但是在过去几十年间头颈癌患者的存活并没有显著提高。
[0008]发明概述
[0009]W02006/116319和TO2008/048519都指出针对G-蛋白偶联受体(GPCRs)的抗体的产生是众所周知地困难。实际上，常规抗-CXCR7抗体的产生仅在为数不多的个案中予以描述，例如在W02006/116319中描述了常规抗体11G8、6E10，在Zabel等中描述了常规抗体 8F11 (Zabel 等，2009，Elucidation of CXCR7mediated signalling eventsand inhibition of CXCR4 mediated tumor cell transendothelial migration byCXCR71igands.J Immunol.; 183 (5): 3204-11)。但是，尽管有大量的研究，但是目前还不清楚这些或类似的抗体是否适合于医学应用。
[0010]Zheng等报道了肝细胞癌组织中CXCR7的表达增加。CXCR7表达的下调导致HCC异种移植模型中肿瘤生长的减少。但是，作者使用了 SMMC-7721细胞，其预先在体外用 CXCR7shRNA 转染(Zheng 等 2010〃Chemokine receptor CXCR7regulates theinvasion, angiogenesis and tumour growth of human hepatocellular carcinomacells〃J.Exp.Clin.Cancer Res.29:31)。
[0011]已知小分子具有副作用和不良效果。小分子CCX771阻断CXCL12的结合(参考 Carbajal 等;20IO^Migration of engrafted neural stem cells is mediated byCXCL12signaling through CXCR4in a viral model of multiple sclerosis Proc NatlAcad Sci USA.107:11068 - 11073)，另一方面，它被描述为合成的 CXCR7 配体 CCX771，其也有力地刺激针对CXCR7的β-抑制蛋白2募集，比内源的趋化因子配体具有更高的效力和功效(Zabel 等，SOOfElucidation of CXCR7_Mediated Signaling Events andInhibition of CXCR4_Mediated Tumor Cell Transendothelial Migration by CXCR7Ligands〃J.Tmmun.183:0000 - 0000)。类似地，小化合物 VUFl 1403 (VUAmsterdam)在 β -抑制蛋白检测中表现为激动剂。
[0012]目前在市场上或临床上没有抗-CXCR7药物。
[0013]因此需要有效的抗-CXCR7试剂，其能够研究并建立该靶标的医疗潜力。进一步，需要在诊断、预防、和/或治疗上适合的抗-CXCR7试剂，例如本文所提供的那些。
[0014]CXCR7在许多人肿瘤细胞上表达，但是在大多数健康细胞上不表达。在我们的肿瘤模型系统中，我们发现通过免疫球蛋白的单可变结构域减少或抑制CXCR7可以在体内减少或消除肿瘤的形成。
[0015]免疫球蛋白序列，例如由此衍生的抗体和抗原结合片段(例如免疫球蛋白单可变结构域)在研究和治疗应用中特别用于靶向它们各自的抗原。免疫球蛋白单可变结构域例如VHHs的产生可以包括实验动物如美洲驼的免疫接种，从免疫组织建立噬菌体文库，噬菌体展示的结合抗原的免疫球蛋白单可变结构域的选择和具有所期望的特异性的所述结构域及其改造构建体的筛选(W094/04678)。或者，可以通过直接从天然或合成文库选择噬菌体展示的结合抗原的免疫球蛋白单可变结构域，并随后筛选具有所期望的特异性的所述结构域及其改造构建体来产生免疫球蛋白单可变结构域例如dAbs (Ward等,Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variabledomains secreted from Escherichia coli, Nature, 1989, 0ctl2;341(6242):544-6) ；Holt等，Trends Biotechnol.，2003，21 (11):484-490 ；以及例如 W006/030220, W006/003388 及其它Domantis Ltd.的公开专利申请)。
[0016]在例如W02008/028977中已经描述了靶向血清白蛋白以延长生物分子例如免疫球蛋白单可变结构域的半衰期。
[0017]在一方面，本发明涉及包含以下或基本由以下组成的多肽:i)第一结构单元，其基本上由一个或多个免疫球蛋白单可变结构域组成，其中所述免疫球蛋白单可变结构域是针对CXCR7，特别是针对人CXCR7 ;ii)第二结构单元，其基本上由一个或多个(优选一个)免疫球蛋白单可变结构域组成，其中所述免疫球蛋白单可变结构域是针对血清白蛋白，特别是针对人血清白蛋白(更加优选其中所述免疫球蛋白单可变结构域是AlbS (如本文所定义的))。而且，本发明还涉及编码这种多肽的核酸；制备这种多肽的方法；表达或能够表达这种多肽的宿主细胞；包含这种多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物，特别是药物组合物；以及这种多肽， 核酸，宿主细胞和/或组合物用于预防、治疗或诊断目的的用途。本发明的其它方面，实施方案，优点和应用通过本文的进一步描述将会变得清楚。
[0018]附图简述
[0019]图1显示了使用FACS进行的SDF-1竞争实验。
[0020]图2显示了使用FACS进行的MabllG8竞争实验。
[0021]图3显示了原发性肿瘤切片中CXCR7表达的免疫组化分析。
[0022]图4显示了用qPCR进行的头颈癌细胞系11B、22A、22B、FaDu、OE和93_VU_147中的CXCR7mRNA图谱分析。
[0023]图5显示了在头颈癌细胞系11B、22A、22B、FaDu、OE和93-VU-147中用配体CXCL11、CXCL12、纳米抗体09A04和阴性对照:无竞争剂(表示为表示总结合(TB))；和CXCL10 (表示非-特异性(a-specific)竞争)进行的[125I]-CXCL12竞争实验。
[0024]图6显示了在裸鼠中用22A移植物进行体内CXCR7纳米抗体治疗阴性对照(PBS);多肽构建体克隆060，克隆083，克隆085和克隆093。
[0025]图7显示了 多肽构建体克隆085和克隆093。
[0026]图8显示了在存在2mg/ml HSA的条件下对SDF-1与HEK293ThCXCR7的结合的抑制。
[0027]发明详述
[0028]定义:
[0029]a)除非另有说明或定义，使用的所有术语具有其在本领域中通常的含义，其对于本领域技术人员来说是清楚的。例如参考W008/020079第46页段a)中提及的标准手册。
[0030]b)除非另有说明，术语“免疫球蛋白单可变结构域”(ISVD)用作一般术语包括但不限于分别地抗原结合结构域或片段，例如Vffl结构域或Vh或\结构域。术语抗原结合分子或抗原结合蛋白可以交换使用，并且还包括术语纳米抗体。免疫球蛋白单可变结构域进一步是轻链可变结构域序列(例如序列)，或重链可变结构域序列(例如Vh-序列)；更特别地，它们可以是常规四链抗体的重链可变结构域序列或衍生自重链抗体的重链可变结构域序列。相应地，免疫球蛋白单可变结构域可以是结构域抗体，或者适合用作结构域抗体的免疫球蛋白序列，单结构域抗体，或者适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列，“dAbs”或者适合用作dAbs的免疫球蛋白序列，或者纳米抗体，包括但不限于Vhh序列。本发明包括不同来源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驴、人和骆驼科动物的免疫球蛋白序列。免疫球蛋白单可变结构域包括完全是人的、人源化的，其它序列优化的或嵌合的免疫球蛋白序列。免疫球蛋白单可变结构域和免疫球蛋白单可变结构域的结构可视为-但不限于-由四个构架区或“FR’ s”组成，其在本领域中以及在本文中分别称为“构架区I”或“ FR I” ； “构架区2 ”或“ FR2 ”；“构架区3 ”或“ FR3 ”；“构架区4 ”或“ FR4 ” ；构架区被三个互补决定区或“⑶R’ s”间隔开，所述三个互补决定区或“⑶R’ s”在本领域中分别称为“互补决定区I”或“⑶R1”；“互补决定区2”或“⑶R2”；“互补决定区3”或“⑶R3”。应当注意术语纳米抗体(Nanobody或Nanobodies)是Ablynx N.V.的注册商标，因此也被称为纳米抗体⑩(Nanobocly恥和 / 或Wanobociies? )。
[0031]c)除非另有说明，术语“免疫球蛋白序列”、“序列”、“核苷酸序列”和“核酸”如W008/020079第46页段b)中所述。术语纳米抗体也如W008/020079中所定义，且如其所述通常指具有Vhh结构域的功能和结构特性的免疫球蛋白重链可变结构域(例如骆驼科动物中出现的“仅有重链的”抗体的Vh结构域)，其特别可以是(天然的)Vhh,人源化Vhh或骆驼源化VH， 例如骆驼源化的人VH。
[0032]d)除非另有说明，所有没有特别详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行或已经这样进行，这对于本领域技术人员来说是清楚的。例如再次参考本文提及的标准手册和一般【背景技术】以及其中所引用的其它参考文献；以及例如下述综述 Presta, Adv.Drug Deliv.Rev.2006，58 (5-6): 640-56 ;Levin 和 Weiss, Mol.Biosyst.2006，2(1):49-57 ；Irving 等，J.1mmunol.Methods, 2001，248 (1-2)，31-45 ；Schmitz 等，Placenta, 2000，21 增干 Ij A, S106-12, Gonzales 等，TumourBiol.，2005, 26(1)，31-43，其中描述了蛋白质工程技术，例如亲和力成熟及其它提高蛋白质如免疫球蛋白的特异性及其它所需性质的技术。
[0033]e)氨基酸残基用标准的三字母或单字母氨基酸代码表示。参考发明名称为“Immunoglobulin single variable domains directed against IL-6R and polypeptidescomprising the same for the treatment of diseases and disorders associated withIl_6mediated signalling” 的 Ablynx N.V.的国际申请 W008/020079 第 48 页表 A_2。
[0034]f)为比较两个以上核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分比可以如W008/020079(通过引用的方式将其合并入本文中)第49页段e)所述进行计算或确定，例如用[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸的数目]除以[第一核苷酸序列中核苷酸的总数目]并乘以[100%]，其中第二核苷酸序列中每个核苷酸的缺失、插入、取代或添加-与第一核苷酸序列相比-视为是单核苷酸(位置)的差异；或者使用适合的计算机算法或技术，也如W008/020079 (通过引用的方式合并入本文中)第49页段e)所述。
[0035]g)为了比较两个以上免疫球蛋白单可变结构域或其它氨基酸序列例如本发明的多肽等的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”(本文中也称为“氨基酸同一性”)的百分比可以如W008/020079(通过引用的方式合并入本文中)第49和50页的段f)所述进行计算或确定，例如用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数目]除以[第一氨基酸序列中氨基酸残基的总数目]并乘以[100%]，其中第二氨基酸序列中每个氨基酸残基的缺失、插入、取代或添加-与第一氨基酸序列相比-视为是单个氨基酸残基(位置)的差异，即本文所定义的“氨基酸差异”；或者使用适合的计算机算法或技术，也如W008/020079(通过引用的方式将其合并入本文中)第49和50页段f)所述。
[0036]而且，在确定两个免疫球蛋白单可变结构域之间的序列同一性程度时，本领域技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，如W008/020079第50页所述。
[0037]还可以基于由Schulz 等，Principles of ProteinStructure, Springer-Verlag, 1978提出的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频度分析，由 Chou 和 Fasman, Biochemistryl3:211, 1974 和 Adv.Enzymol., 47:45-149, 1978 提出的结构形成潜能分析，由 Eisenberg 等,Proc.Natl.Acad Sc1.USA81:140-144，1984;Kyte&Doolittle;J Molec.Biol.157:105-132，1981，和 Goldman 等,Ann.Rev.Biophys.Chem.15:321-353, 1986提出的蛋白质疏水模式分析对本文所述的多肽应用任何氨基酸取代，通过引用的方式将它们的全文合并入本文。本文说明书和上述引用的一般【背景技术】中给出纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息。而且，为此目的，例如在Desmyter等，Nature Structural Biology, Vol.3，9，803(1996);Spinelli 等，Natural StructuralBiology (1996) ; 3，752-757;和 Decanniere 等，Structure, Vol.7，4，361 (1999)中给出了美洲驼(llama)的Vhh结构域的晶体结构。可以在上述引用的现有技术中找到关于在常规Vh结构域中在这些位置上形成VH/VL界面和可能的骆驼源化取代的一些氨基酸残基的进一步的信息。
[0038]h)如果免疫球蛋白单可变结构域和核酸序列在其全长上具有100%的序列同一性(如文本所定义的)，那么将它们称为“完全相同”。
[0039]i)当比较两个免疫球蛋白单可变结构域时，术语“氨基酸差异”指与第二序列相t匕，第一序列的某个位置上单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应当理解两个免疫球蛋白单可变结构域可以包含一个、两个或更多个这种氨基酸差异。
[0040]j)当核苷酸序列或氨基酸序列被称为分别“包含”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或者被称为“基本上由”另一个核苷酸或氨基酸序列“组成”时，其具有W008/020079第51-52页段i)所给出的含义。
[0041]k)术语“以基本上分离的形式”具有W008/020079第52和53页段j)所给出的含义。
[0042]I)术语“域”和“结合结构域”具有W008/020079第53页段k)所给出的含义。
[0043]m)术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中可互换使用，具有W008/020079第53页段I)所给出的含义。
[0044]η)如W008/020079第53页段m)中进一步描述的，能与特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或者它的至少一部分、片段或表位)(特异性)结合，与其具有亲和力和/或对其具有特异性的氨基酸序列(例如本发明的抗体、多肽，或通常的抗原结合蛋白或多肽或其片段)被称为“拮抗剂”或“针对”所述的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。
[0045]ο)术语“特异性”具有W008/020079第53_56页段η)所给出的含义；如其中所提到的，指特定的抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的多肽)分子能结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。可以基于亲和力和/或抗体亲抗原性确定抗原结合蛋白的特异性，如W008/020079第53-56页所述(通过引用合并入本文)，其还描述了一些测定抗原结合分子(例如本发明的多肽)与相关抗原的结合的优选技术。典型地，抗原结合蛋白(例如本发明的免疫球蛋白单可变结构域，和/或多肽)以
[0046]KT5-1O-12摩尔/升以下，优选ΚΤ-ΙΟ—12摩尔/升以下，更优选KT8-1O-12摩尔/升的解离常数(Kd)(即以IO5-1O12升/摩尔或更大，优选地IO7-1O12升/摩尔或更大和更优选地IO8-1O12升/摩尔的缔合常数(Ka))与它们的抗原结合。通常认为大于IO4摩尔/升的任何Kd值(或小于IO4M-1的任何Ka值)表示非特异性结合。优选本发明的单价免疫球蛋白单可变结构域以小于500ηΜ，优选小于200ηΜ，更优选小于ΙΟηΜ，例如小于500pM的亲和力与所希望的抗原结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适合的方式确定，包括，例如，斯卡查德(Scatchard)分析和/或竞争结合检测，如放射免疫检测(RIA)，酶联免疫检测(EIA)和夹心竞争检测，以及本领域中本身已知的其不同的变形方式；以及本文提到的其它技术。如本领域技术人员所清楚的，以及如W008/020079第53-56页所述的，解离常数可以是实际或表观解离常数。用于确定解离常数的方法对于本领域技术人员来说是清楚的，例如包括W008/020079第53-56页提及的技术。
[0047]P)本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期通常可以如W008/020079第57页段O)所描述的以及本文所提及的那样定义，指例如由于氨基酸序列或化合物的降解和/或天然机制造成的序列或化合物的清除或隔离，所述序列、化合物或多肽在体内的血清浓度减少50%所花费的时间。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以用其本身已知的任何方式确定，例如通过药代动力学分析确定。适合的技术对本领域技术人员来说是清楚的，通常可以是如W008/020079第57页段ο)所描述的。如W008/020079第57页段O)中还提及的，半衰期可以用参数例如tl/2-a，tl/2_i3和曲线下面积(AUC)表示。例如可以参考下面的实验部分，以及标准手册，例如Kenneth, A等:Chemical Stabilityof Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists 和 Peters 等,Pharmacokineticanalysis: A Practical Approach (1996)。还可以参考〃Pharmacokinetics", M Gibaldi&DPerron, Marcel Dekker出版，第2版修改版(1982)。术语“半衰期的增加”或“增加的半衰期”也如W008/020079第57页段ο)所定义的，特别指tl/2-β的增加，伴随或不伴随着tl/2-α和/或AUC或二者的增加。
[0048]q)关于靶标或抗原，术语靶标或抗原上的“相互作用位点”指靶标或抗原上的位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列段(stretch)，其是靶标或抗原的与配体、受体或其它结合配偶体的结合位点、催化位点、切割位点、变构相互作用位点、多聚化(例如同聚化或异二聚化)中涉及的位点；或者靶标或抗原的生物学作用或机制中涉及的靶标或抗原上的任何其它位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列段(stretch)。更通常地，“相互作用位点”可以是本发明的氨基酸序列或多肽能够结合并使得靶标或抗原(和/或涉及所述靶标或抗原的任何途径、相互作用、信号传导、生物学机制或生物学效应)被调节(如本文所定义的)的所述靶标或抗原上的任何位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列段(stretch)。
[0049]r)当免疫球蛋白单可变结构域或多肽与第一抗原以与所述氨基酸序列或多肽与第二靶标或多肽结合亲和力的至少10倍，例如至少100倍，优选至少1000倍，至多可达10，000倍或更高的亲和力/抗体亲抗原性(如上所述的，适合地表达为Kd值，Ka值，Kiw速率和/或Kg^速率)结合，则将其称为相对于第二靶标或抗原而言对第一靶标或抗原是“特异的”。例如，第一抗原可以与靶标或抗原以比所述氨基酸序列或多肽与第二靶标或抗原结合的KD小至少10倍，例如小至少100倍，优选小至少1000倍，例如10，000倍以下的Kd值结合。优选地，当与第二靶标或抗原相比，免疫球蛋白单可变结构域或多肽对第一靶标或抗原是“特异的”时，它针对(如本文所定义的)所述的第一靶标或抗原，而不针对所述第二革巴标或抗原。
[0050]s)术语“交叉阻断(cross-block) ”、“被交叉阻断(cross-blocked) ”和“交叉阻断的(cross-blocking) ”在本文中可互换使用,指免疫球蛋白单可变结构域或多肽通过变构调节直接或间接干扰本发明的其它免疫球蛋白单可变结构域或多肽与给定的靶标结合的能力。本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽能够干扰另一种与靶标的结合的程度，无论其是否可被称为根据本发明的交叉阻断，可以使用竞争性结合检测测定。一种特别适合的定量交叉阻断检测使用基于FACS-或基于ELISA的方法，根据标记的(例如带His标记的或放射性标记的)本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽及其它结合试剂与靶标的结合测量它们之间的竞争。实验部分一般性地描述了用于测定结合分子是否交叉阻断或者能交叉阻断本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽的适合的基于FACS-、基于ELISA-或基于放射性配体置换的检测。应当认识到所述检测可用于本文所描述的任何免疫球蛋白单可变结构域或其它结合试剂。因此，通常，根据本发明的交叉阻断氨基酸序列或其它结合剂是例如与上述交叉阻断检测中的靶标结合的，以使得在检测过程中以及在存在本发明的第二氨基酸序列或其 它结合剂的条件下，所记录的根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽被0.01mM或更少量的待测的可能的交叉阻断试剂(交叉阻断试剂可以是另一种常规单克隆抗体例如IgG,经典单价抗体片段(Fab, scFv))和改造的变体(双抗体、三抗体、微抗体、VHHS、dAbs、VHS、VLS)的置换为最大理论置换(例如被需要被交叉阻断的非标记的(例如未标记的)免疫球蛋白单可变结构域或多肽置换)的60%-100%之间(例如在基于ELISA/放射性配体的竞争检测中)或者80%-100%之间(例如在基于FACS的竞争检测中)。
[0051]t)如果氨基酸序列例如根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽对两个不同抗原或抗原决定簇(例如来自两个不同哺乳动物物种的血清白蛋白，例如人血清白蛋白和猕猴血清白蛋白)是特异的，那么将其称为对这些不同的抗原或抗原决定簇是“交叉反应的”。
[0052]u)如W008/020079(通过引用合并入本文)第58和59页段q)所进一步描述的，根据Kabat等给出的Vh结构域的通用编号对免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸残基进行编号 ° (“Sequence of proteins of immunological interest”，US Public HealthServices, NIH Bethesda, MD,公布号 91),如 Riechmann 和 Muyldermans, J.Tmmunol.Methods2000Jun23; 240 (1-2):185-195的文章(参见例如该出版物的图2)中应用于骆驼科动物的Vhh结构域的那样，相应地，免疫球蛋白单可变结构域的FRl包含1-30位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的CDRl包含31-35位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR2包含36-49位的氨基酸，免疫球蛋白单可变结构域的⑶R2包含50-65位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR3包含66-94位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的⑶R3包含95-102位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR4包含103-113位的氨基
酸残基。
[0053]V)所给出的附图、序列表和实验部分/实施例仅仅是进一步举例说明本发明，不应理解或解释为以任何方式限制本发明和/或所附权利要求的范围，除非本文另外明确指出。
[0054]1.本发明的多肽及其用途
[0055]1.1.杭-CXCR7 结构单元
[0056]本发明的多肽通常可用于调节，特别是抑制和/或防止CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQ ID NO:1)与 CXCL12 (和 / 或 CXCLlI)、特别是人 CXCL12 (NM_000609)和 / 或特别是人0乂(^11卬66096)的结合，从而调节，特别是抑制或防止由CXCR7且特别是人CXCR7 (SEQID NO:1)和/或CXCL12 (和/或CXCLlI)特别是人CXCL12 (NM_000609)和/或特别是人CXCLll (U66096)介导的信号传导，调节涉及CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQ ID NO:1)和/或CXCL12 (和 / 或 CXCLl I)特别是 CXCL12 (NM_000609)和 / 或特别是人 CXCLll (U66096)的生物学途径，和/或调节与这种信号传导或这些途径相关的生物学机制、反应和效应。
[0057]同样，本发明的多肽和组合物可以用诊断、预防和治疗本发明的疾病和失调(本文中也称为“本发明的疾病和失调”)，包括但不限于癌症，例如癌、神经胶质瘤、间皮瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性胶质瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、和伯基特淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆癌、胆囊癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、宫颈癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、胰腺内分泌癌、类癌、骨癌、皮肤癌、视网膜母细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、卡波氏肉瘤、多中心性Castleman病或AIDS相关的原发性渗出性淋巴瘤、神经外胚瘤、横纹肌肉瘤(关于更多癌症，参见，Cancer, Principles and practice (DeVita, V.T.等 edsl997));优选头颈癌，以及脑和神经元功能障碍，例如阿尔茨海默病和多发性硬化；肾功能障碍，肾移植排斥反应；鼻息肉病；类风湿性关节炎；心脏移植排斥反应；心脏功能障碍；动脉硬化；哮喘；肾小球肾炎；接触性皮炎；炎性肠病；结肠炎；银屑病；再灌注损伤；以及本文所述的其它失调和疾病。特别地，本发明的多肽和组合物可用于诊断、预防和治疗涉及CXCR7介导的转移、趋化作用、细胞粘附、跨内皮迁移、细胞增殖和/或存活。
[0058]通常，所述的“本发明的疾病和失调”可以定义为能够通过给有需要的受试者(即具有疾病或失调或其至少一种症状和/或具有引起或发展疾病或失调的危险)适当地施用本发明的多肽或组合物(特别是以其药学活性量)和/或有效针对CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQ ID NO:1)或者涉及CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQ ID NO:1)的生物学途径或机制的已知有效成分(特别是以其药学活性量)分别诊断、预防和/或治疗的疾病和失调。
[0059]特别地，本发明的多肽可用于诊断、预防和治疗本发明的疾病和失调，其特征在于过量的和/或不需要的由CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ IDNO:1)介导或涉及CXCR7、特别是A CXCR7 (SEQ ID NO:1)的 途径(例如 CXCL11/1-TAC - CXCR7 轴)介导的 CXCL12 特别是人CXCL12信号传导。本发明的这种疾病和失调的实例在本文的公开的基础上对本领域技术人员来说也是清楚的。
[0060]因此，不受其限制，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以例如用于诊断、预防和/或治疗目前用能调节CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQID NO:1)介导的信号传导的有效成分诊断、预防或治疗的所有疾病和失调，例如本文所引用的现有技术中提及的那些。还预期本发明的多肽可用于诊断、预防和/或治疗目前正在开发、已经提出、或将来要提出或开发用这种有效成分治疗的所有疾病和失调。此外，预期由于本文进一步描述的它们的有利特性，本发明的多肽可用于诊断、预防和治疗与正在使用或将要提出或开发使用这些已知的有效成分所治疗疾病和失调不同的其它疾病和失调；和/或本发明的多肽可以提供用于治疗本发明所述的疾病和失调的新的方法和方案。
[0061]本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽的其它应用和用途通过本文的进一步公开，对技术人员来说将会变得清楚。
[0062]通常，本发明的一个目的是提供药学活性剂以及包含它的组合物，其可用于诊断、预防和/或治疗本发明的疾病和/或失调；以及提供用于诊断、预防和/或治疗这种疾病和失调的方法，包括施用和/或使用这种药剂和组合物。
[0063]特别地，本发明的一个目的是提供与本领域中目前使用和/或已知的药剂、组合物和/或方法相比具有特定优势的药学活性剂、组合物和/或方法。这些优势通过下面进一步的描述将会变得清楚。
[0064]更特别地，本发明的一个目的是提供可用作药学活性剂的治疗剂蛋白，以及包含它的组合物，其可用于诊断、预防和/或治疗本发明的疾病和/或失调和本文所提及的其它疾病和失调；以及提供用于诊断、预防和/或治疗这种疾病和失调的方法，包括施用和/或使用这种治疗剂蛋白和组合物。
[0065]相应地，本发明的特定目的是提供针对CXCR7，特别针对来自温血动物的CXCR7，更特别针对来自哺乳动物如小鼠的CXCR7以及特别针对人CXCR7(SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白单可变结构域；以及提供包含至少一个这种免疫球蛋白单可变结构域或者基本由其组成的蛋白和多肽。
[0066]特别地，本发明的特定目的是提供适合于在温血动物中，特别是在哺乳动物中，更特别是在人中预防、治疗和/或诊断用途的这种免疫球蛋白单可变结构域和这种蛋白和/或多肽。
[0067]更特别地，本发明的特定目的是提供可用于在温血动物中，特别是在哺乳动物中，更特别是在人中预防、治疗、减轻和/或诊断与CXCR7相关的和/或由CXCR7介导的一种或多种疾病、失调或病症(例如本文提及的疾病、失调或病症)的这种免疫球蛋白单可变结构域和这种蛋白和/或多肽。
[0068]本发明的另一个特定目的是提供可用于制备用于在温血动物中，特别是在哺乳动物中，更特别是在人中预防和/或治疗与CXCR7相关的和/或由CXCR7介导的一种或多种疾病、失调或病症(例如本文提及的疾病、失调和病症)的药物组合物或兽药组合物的这种免疫球蛋白单可变结构域和这种蛋白和/或多肽。
[0069]在本发明中，通常，这 些目的通过使用本文所描述的免疫球蛋白单可变结构域、蛋白、多肽和组合物得以实现。
[0070]通常，本发明提供针对(如本文所定义的)和/或能特异性结合(如本文所定义的)CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白单可变结构域；以及包含至少一个这种氨基酸序列的化合物和构建体，特别是蛋白和多肽。
[0071]更特别地，本发明提供了能够以本文所定义的亲和力(适当地测定为和/或表达为Kd值(实际的或表观的)，Ka值(实际的或表观的)，kg速率和/或Kiw速率，或者IC5tl值，如本文所进一步描述的)结合CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白单可变结构域和多肽，以及包含至少一个这种氨基酸序列的化合物和构建体，特别是蛋白和多肽。
[0072]在特定的方面，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽是这样的，它们:
[0073]-在例如实验部分(例如实施例8)所描述的结合FACS检测中以IOOnM以下，更优选50nM以下，更加优选20nM以下，最优选IOnM以下的EC50与人CXCR7(SEQ ID N0:1)结合，其中所述多肽仅包含一个人CXCR7结合免疫球蛋白单可变结构域单元；
[0074]和/或这样的，它们:
[0075]-在例如实验部分(例如实施例9和10)所描述的检测中以IOOnM以下的平均Ki值，更优选以20nM以下的平均Ki值，更加优选以IOnM以下的平均Ki值，从人CXCR7 (SEQID NO:1)完全置换CXCL12 (SDF-1)，其中所述多肽仅包含一个人CXCR7结合免疫球蛋白单可变结构域单元，其中完全置换指大约60%至80%以上的平均CXCL12置换(例如当根据实施例9的配体置换检测测定时)或者其中完全置换指大约80%至100%以上的平均CXCL12置换(当根据实施例10的基于FACS的竞争检测测定时)；
[0076]和/或这样的，它们:
[0077]-在例如实验部分(例如实施例9和10)所描述的检测中以1000nM以下的平均Ki值，更优选以500nM以下的平均Ki值，更加优选以IOOnM以下的平均Ki值，更加优选以20nM以下的平均Ki值，更加优选以IOnM以下的平均Ki值，从人CXCR7 (SEQ ID NO:1)完全置换CXCLll (1-TAC)，其中所述多肽仅包含一个人CXCR7结合免疫球蛋白单可变结构域单元，其中完全置换指大约60%-80%以上的平均CXCLll置换(例如当根据实施例9的配体置换检测测定时)或者其中完全置换指大约80%-100%以上的平均CXCL12置换(当根据实施例10的基于FACS的竞争检测测定时)；
[0078]和/或这样的，它们:
[0079]-在例如实验部分(例如实施例9和10)所描述的检测中以IOOnM以下的平均Ki值，更优选以20nM以下的平均Ki值，更加优选以IOnM以下的平均Ki值，从人CXCR7 (SEQID NO:1)部分置换CXCL12 (SDF-1)，其中所述多肽仅包含一个人CXCR7结合免疫球蛋白单可变结构域单元，其中部分置换指大约40%-60%的平均CXCL12置换(例如当根据实施例9的配体置换检测测定时)或者其中部分置换指大约50%-80%的平均CXCL12置换(当根据实施例10的基于FACS的竞争检测测定时)；
[0080]和/或这样的，它们:
[0081]-在例如实验部分(例如实施例9和10)所描述的检测中以1000nM以下的平均Ki值，更优选以500nM以下的平均Ki值，更加优选以IOOnM以下的平均Ki值，更加优选以20nM以下的平均Ki值，更加优选以IOnM以下的平均Ki值，从人CXCR7 (SEQ ID NO:1)部分置换CXCLll (1-TAC)，其中所述多肽仅包含一个人CXCR7结合免疫球蛋白单可变结构域单元，其中部分置换指大约40%-60%的平均CXCLll置换(例如当根据实施例9的配体置换检测测定时)或者其中部分置换指大约50%-80%以上的平均CXCL12置换(当根据实施例10的基于FACS的竞争检测测定时)；
[0082]和/或这样的，它们:
[0083]-以IOOnM以下的平均Kd值，更优选以50nM以下的平均Kd值，更加优选以40nM以下，例如小于30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，3nM以下，例如小于InM，或者最优选小于0.1nM的平均Kd值与人CXCR7 (SEQ ID NO:1)结合。
[0084]应当认识到本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽与(人)CXCR7的结合可以导致从(人)CXCR7置换(人)CXCLll和/或CXCL12，如本文所述。还应当认识到本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽与(人)CXCR7的结合可以导致抑制(人)CXCLll和/或CXCL12与其关联受体，例如(人)CXCR7的结合，如本文所述。
[0085]正如已经提到的，在一些特定的但非限制性的方面(本文更详细描述的)，本发明提供了:
[0086]针对(如本文所定义的)CXCR7并能抑制或阻断(完全地或部分地，如本文进一步描述的)配体结合，特别是抑制或阻断(完全地或部分地，如本文进一步描述的)SDF-1与CXCR7结合(如本文进一步描述的)的氨基酸序列。这些氨基酸序列在本文中也称为“结合CXCR-7的氨基酸序列”或“CXCR7结合单元”。优选地，这些结合CXCR7的氨基酸序列是ISVDj s (如本文所描述的) ，在这种情况下，它们也被称为“结合CXCR7的ISVD’ S”。优选地，任何结合CXCR7的氨基酸序列、结合CXCR7的结构单元或结合CXCR7的ISVD’ s是这样的，它们具有阻断活性，即部分或完全阻断SDF-1与CXCR7结合，其可以通过本领域技术人员已知的任何适合的检测法，例如通过Alpha筛选检测或通过FACS竞争检测(例如本文所描述的)测定。优选地，通过实施例9所述的FACS竞争检测测定阻断活性。优选地，ISVD在NIH3T3-hCXCR7细胞中具有阻断或竞争SDF-1与CXCR7的结合的阻断活性或竞争能力，其平均 Ki 为小于 600nM，但优选 500nM, 400nM, 300nM, 200nM, IOOnM 或更小。
[0087]-例如，OlClO-样ISVD在该检测中具有阻断活性或竞争能力，其平均Ki为小于IOOnM,更优选小于75nM, 50nM以下，例如小于40nM或30nM, 25nM或24nM或更加优选小于22nM。
[0088]-例如，14G03-样ISVD在该检测中具有阻断活性或竞争能力，其平均Ki为小于150nM，更优选小于IOOnM, 90nM, 80nM以下，例如小于70nM或60nM, 50nM或40nM, 30nM, 20nM, 15nM 或 IOnM, 5nM 或更加优选小于 4nM。
[0089]在一个特定的但非限制性的方面，(一些)“结合CXCR-7的氨基酸序列”或“CXCR7结合单元”可以(且还优选)是这样的，它们能够抑制或阻断β_抑制蛋白的募集(参见实施例15)。优选地，任何结合CXCR7的氨基酸序列、结合CXCR7的结构单元或结合CXCR7的ISVD’ s是这样的，它们具有阻断活性，即部分或完全阻断或抑制SDF-1介导的CXCR7信号传导，其可以通过本领域技术人员已知的任何适合的检测法，例如通过任何适合的抑制蛋白募集检测测定，如本文所述的。
[0090]优选地，通过实施例15所述的抑制蛋白检测测定阻断活性或抑制能力。优选地，ISVD在PathHunter eXpress β -抑制蛋白检测(DiscoverX)中对配体(例如SDF-1)诱导的β_抑制蛋白具有阻断活性或竞争能力，其对β_抑制蛋白募集的抑制％为大于25%，大于30%，但优选40%, 50%, 60%, 70%, 80%或更大。[0091]-例如，14G03-样ISVD在该检测中具有阻断活性或竞争能力，其％抑制为大于50%，更优选大于60%，70%或更大，例如大于75%或80%，85%，或更加优选大于90%。
[0092]本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽对CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ IDNO:1)的结合、置换、迁移或其它体内和/或体外的效力的一些优选的技术值通过本文进一步的说明和实施例将会变得清楚。
[0093]而且，在本说明书和权利要求中，下述术语如下定义:
[0094]A) 01C10-样序列:“01C10-样序列”，“01C10-样 ISVD”，“01C10-样结构单元”或“第I组ISVDs”定义为包含以下的ISVD (如本文所描述的):
[0095]a)CDRl，其包含⑴氨基酸序列NYAMG(SEQ ID NO:93)或(ii)与氨基酸序列NYAMG(SEQ ID NO:93)仅有3、2或I个氨基酸差异(如本文所定义的)的氨基酸序列，或基本上由其组成；和/或
[0096]b)CDR2，其包含(i)氨基酸序列 AITPRAFTTYYADSVKG(SEQ ID NO:95)或(ii)与氨基酸序列AITPRAFTTYYADSVKG(SEQ ID NO:95)具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列AITPRAFTTYYADSVKG (SEQ IDNO:95)仅有7、6、5、4、3、2或I个氨基酸差异(如本文所定义的)的氨基酸序列，或基本上由其组成；和/或
[0097]c)CDR3，其包含(i)氨基酸序列 QLVGSGSNLGRQESYAY(SEQ ID NO:97)或(ii)与氨基酸序列QLVGSGSNLGRQESYAY(SEQ ID NO:97)具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列QLVGSGSNLGRQESYAY (SEQ IDNO:97)仅有7、6、5、4、3、2或I个氨基酸差异(如本文所定义的)的氨基酸序列，或基本上由其组成；
[0098]其中在这样的ISVD中存在的构架序列如本文所进一步描述的那样，其中⑶R1、⑶R2和⑶R3优选使得01C10-样ISVD具有阻断活性，例如如上所述的部分或完全阻断CXCLll和/或CXCL12与CXCR7结合，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或结合和/或识别CXCR7 (SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基W19以及任选地氨基酸残基S23和/或氨基酸残基D25，其均如本文所描述的。
[0099]还如本文所提到的，(一些)01C10-样序列可以(而且也优选)是这样的，它们例如在实施例10中使用的置换检测中能够抑制、阻断或置换SDF-1的结合(参见实施例9和10)。优选地，在这样的01C10-样序列中，CDRl和CDR2分别如a)和b)所定义；或者CDRl和CDR3分别如a)和c)所定义；或者CDR2和CDR3分别如b)和c)所定义。更优选地，在这样的01C10-样序列中，CDRU CDR2和CDR3均分别如a)、b)和c)所定义。而且，在这样的01C10-样序列中，⑶R1XDR2和⑶R3优选使得01C10-样ISVD具有阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7的结合，如本文所述的，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或结合和/或识别CXCR7 (SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基W19以及任选地氨基酸残基S23和/或氨基酸残基D25，其均如本文所描述的。
[0100]例如，在这样的01C10-样序列中:⑶Rl可以包含氨基酸序列NYAMG(SEQ IDNO:93)或基本上由其组成(⑶R2和⑶R3分别如b)和c)所定义)；和/或⑶R2可以包含氨基酸序列AITPRAFTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 95)或基本上由其组成(CDR1和CDR3分别如
a)和c)所定义)；和/或CDR3可以包含氨基酸序列QLVGSGSNLGRQESYAY (SEQ ID NO: 97)或基本上由其组成(⑶Rl和⑶R2分别如a)和b)所定义)。特别地，当OlClO-样序列是根据该方面时:⑶Rl可以包含氨基酸序列NYAMG(SEQ ID NO:93)或基本上由其组成，并且⑶R2可以包含氨基酸序列AITPRAFTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 95)或基本上由其组成(⑶R3如上述
c)所定义)；和/或CDRl可以包含氨基酸序列NYAMG (SEQ ID NO: 93)或基本上由其组成并且CDR3可以包含氨基酸序列QLVGSGSNLGRQESYAY (SEQ ID NO: 97)或基本上由其组成(CDR2如上述b)所定义)；和/或CDR2可以包含氨基酸序列AITPRAFTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 95)或基本上由其组成并且⑶R3可以包含氨基酸序列QLVGSGSNLGRQESYAY (SEQ ID NO:97)或基本上由其组成(⑶Rl如上述a)所定义)。而且，在这样的01C10-样序列中，⑶R1、⑶R2和⑶R3优选使得01C10-样ISVD具有阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7的结合，如本文所述的，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或结合和/或识别CXCR7 (SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基W19以及任选地氨基酸残基S23和/或氨基酸残基D25，其均如本文所描述的。在特别优选的方面，“01C10-样序列”，“01C10-样ISVD”，“01C10-样结构单元”或“第I组ISVDs”是包含以下的ISVD:
[0101]d)CDRl，其是⑴氨基酸序列NYAMG(SEQ ID NO:93)或(ii)与氨基酸序列NYAMG(SEQ ID NO:93)仅有3、2或I个氨基酸差异(如本文所定义的)的氨基酸序列；和/或
[0102]e)CDR2，其是(i)氨基酸序列 AITPRAFTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 95)或(ii)与氨基酸序列AITPRAFTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 95)具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列AITPRAFTTYYADSVKG (SEQ IDN0:95)仅有7、6、5、4、3、2或I个氨基酸差异(如本文所定义的)的氨基酸序列；和/或
[0103]f)CDR3，其是⑴氨基酸序列 QLVGSGSNLGRQESYAY (SEQ ID NO: 97)或(ii)与氨基酸序列QLVGSGSNLGRQESYAY (SEQ ID NO: 97)具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列QLVGSGSNLGRQESYAY (SEQ IDN0:97)仅有7、6、5、4、3、2或I个氨基酸差异(如本文所定义的)的氨基酸序列；
[0104]其中在这样的ISVD中存在的构架序列如本文所进一步描述的那样，其中CDR1、⑶R2和⑶R3优选使得01C10-样ISVD具有阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7结合，如本文所述的，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或结合和/或识别CXCR7(SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基W19以及任选地氨基酸残基S23和/或氨基酸残基D25，其均如本文所描述的。优选地，在根据该特别优选的方面的01C10-样序列中，⑶Rl和⑶R2分别如d)和e)所定义；或者⑶Rl和⑶R3分别如d)和f)所定义；或者⑶R2和⑶R3分别如e)和f)所定义。更优选地，在这样的01C10-样序列中，⑶R1XDR2和⑶R3均分别如d)、e)和f)所定义。而且，在这样的01C10-样序列中，⑶R1XDR2和⑶R3优选使得01C10-样ISVD具有阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7的结合，如本文所述的，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或结合和/或识别CXCR7(SEQID NO:1)中的氨基酸残基W19以及任选地氨基酸残基S23和/或氨基酸残基D25，其均如本文所描述的。
[0105]例如，在根据该特别优选的方面的01C10-样序列中ADRl是氨基酸序列NYAMG(SEQ ID NO:93) (CDR2和CDR3分别如e)和f)所定义);和/或CDR2是氨基酸序列AITPRAFTTYYADSVKG (SEQ ID NO:95) (CDR1 和 CDR3 分别如 d)和 f)所定义);和 / 或 CDR3是氨基酸序列 QLVGSGSNLGRQESYAY (SEQ ID NO:97) (CDR1 和 CDR2 分别如 d)和 e)所定义)。特别地，当OlClO-样序列是根据该方面时:⑶Rl是氨基酸序列NYAMG (SEQ ID NO: 93)并且CDR2 是氨基酸序列 AITPRAFTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 95) (CDR3 如上述 f)所定义);和 / 或CDRl 是氨基酸序列 NYAMG (SEQ ID NO: 93)并且CDR3 是氨基酸序列 QLVGSGSNLGRQESYAY (SEQID NO:97) (CDR2 如上述 e)所定义);和 / 或 CDR2 是氨基酸序列 AITPRAFTTYYADSVKG(SEQID NO: 95)并且 CDR3 是氨基酸序列 QLVGSGSNLGRQESYAY (SEQ ID NO:97) (CDR1 如上述 d)所定义)。而且，在这样的01C10-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选使得01C10-样ISVD具有阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7的结合，如本文所述的，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或结合和/或识别CXCR7 (SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基W19以及任选地氨基酸残基S23和/或氨基酸残基D25，其均如本文所描述的。
[0106]在特别优选的01C10-样序列中:CDRl是氨基酸序列NYAMG(SEQ ID NO:93),CDR2是氨基酸序列AITPRAFTTYYADSVKG (SEQ ID NO:95);并且CDR3是氨基酸序列QLVGSGSNLGRQESYAY(SEQ ID NO:97)。
[0107]在该段A)描述的所有的OlClO-样序列中，构架序列可以如本文进一步描述的。优选地,构架序列是这样的，构架序列与01C10的构架序列具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%的序列同一性(其例如可以通过测定给定序列与01C10的序列的序列同一性的总体程度来测定，在计算时忽略CDR’ s)。而且，在给定序列中存在的CDR’ s与构架的组合优选使得获得的OlClO-样ISVD具有本文所述的阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7的结合，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或结合和/或识别CXCR7 (SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基W19以及任选地氨基酸残基S23和/或氨基酸残基D25，其均如本文所描述的。
[0108]在一个特定的方面，01C10-样序列与氨基酸序列01C10(SEQ ID N0:91)具有至少70%，例如至少80%，例如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性。例如，在根据该方面的OlClO-样序列中，CDR’ s可以是根据上述特别优选的方面，可以特别是(但不限于)NYAMG(SEQ ID NO:93) (CDRl) !AITPRAFTTYYADSVKG(SEQ ID NO:95) (CDR2)；和QLVGSGSNLGRQESYAY (SEQ ID NO: 97) (CDR3)。而且，优选地，在这样的 OlClO-样 ISVD 中存在的CDR’ s与构架的组合优选使得获得的01C10-样ISVD具有本文所述的阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7的结合，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或结合和/或识别CXCR7(SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基W19以及任选地氨基酸残基S23和/或氨基酸残基D25，其均如本文所描述的。在一个特定的方面，任何01C10-样序列可以是人源化的和/或序列优化的序列，如本文进一步描述的。
[0109]B) 14G03-样序列:“ 14G03-样序列 ”,“ 14G03-样 ISVD”，“ 14G03-样结构单元”或“第2组ISVDs”定义为包含以下的ISVD (如本文所描述的):
[0110]a)CDRl，其包含⑴氨基酸序列INYMG(SEQ ID NO: 13)或(ii)与氨基酸序列INYMG(SEQ ID NO: 13)仅有3、2或I个氨基酸差异(如本文所定义的)的氨基酸序列，或基本上由其组成；和/或
[0111]b)CDR2，其包含(i)氨基酸序列 TLTSGGSTNYAGSVKG(SEQ ID NO:23)或(ii)与氨基酸序列TLTSGGSTNYAGSV KG (SEQ ID NO: 23)具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列TLTSGGSTNYAGSVKG (SEQ IDNO:23)仅 有7、6、5、4、3、2或I个氨基酸差异(如本文所定义的)的氨基酸序列，或基本上由其组成；和/或
[0112]c)CDR3，其包含⑴氨基酸序列GGTLYDRRRFES(SEQ ID NO:33)或(ii)与氨基酸序列GGTLYDRRRFES (SEQ ID NO: 33)具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(出)与氨基酸序列GGTLYDRRRFES (SEQ ID N0:33)仅有7、6、5、4、3、2或I个氨基酸差异(如本文所定义的)的氨基酸序列，或基本上由其组成；
[0113]其中在这样的ISVD中存在的构架序列如本文所进一步描述的那样，其中CDR1、⑶R2和⑶R3优选使得14G03-样ISVD具有阻断活性，例如部分或完全阻断CXCLll和/或CXCL12与CXCR7结合，如上所述，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或抑制β-抑制蛋白的募集，和/或结合和/或识别CXCR7(SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基M33以及任选地氨基酸残基V32和/或氨基酸残基M37，其均如本文所描述的。
[0114]还如本文所提到的，(一些)14G03-样序列可以(而且也优选)是这样的，它们例如在实施例10中使用的置换检测中能够抑制、阻断或置换SDF-1的结合(参见实施例9和10)。优选地，在这样的14G03-样序列中，CDRl和CDR2分别如a)和b)所定义；或者CDRl和CDR3分别如a)和c)所定义；或者CDR2和CDR3分别如b)和c)所定义。更优选地，在这样的14G03-样序列中，CDRU CDR2和CDR3均分别如a)、b)和c)所定义。而且，在这样的14G03-样序列中，⑶R1XDR2和⑶R3优选使得14G03-样ISVD具有阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7结合，如本文所述的，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或抑制β -抑制蛋白的募集，和/或结合和/或识别CXCR7 (SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基Μ33以及任选地氨基酸残基V32和/或氨基酸残基Μ37，其均如本文所描述的。
[0115]例如，在这样的14G03-样序列中:⑶Rl可以包含氨基酸序列INYMG(SEQ IDNO: 13)或基本上由其组成(⑶R2和⑶R3分别如b)和c)所定义)；和/或⑶R2可以包含氨基酸序列TLTSGGSTNYAGSVKG (SEQ ID NO: 23)或基本上由其组成(CDR1和CDR3分别如
a)和c)所定义)；和/或⑶R3可以包含氨基酸序列GGTLYDRRRFES(SEQ ID NO: 33)或基本上由其组成(CDR1和CDR2分别如a)和b)所定义)。特别地，当14G03-样序列是根据该方面时ADRl可以包含氨基酸序列INYMG(SEQ ID NO: 13)或基本上由其组成并且⑶R2可以包含氨基酸序列TLTSGGSTNYAGSVKG (SEQ ID NO: 23)或基本上由其组成(CDR3如上述c)所定义)；和/或⑶Rl可以包含氨基酸序列INYMG(SEQ ID NO: 13)或基本上由其组成并且⑶R3可以包含氨基酸序列GGTLYDRRRFES (SEQ ID NO: 33)或基本上由其组成(⑶R2如上述
b)所定义)；和/或CDR2可以包含氨基酸序列TLTSGGSTNYAGSVKG(SEQ ID NO: 23)或基本上由其组成并且⑶R3可以包含氨基酸序列GGTLYDRRRFES (SEQ ID NO: 33)或基本上由其组成(⑶Rl如上述a)所定义)。而且，在这样的14G03-样序列中，⑶R1、⑶R2和⑶R3优选使得14G03-样ISVD具有阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7结合，如本文所述的，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或抑制β -抑制蛋白的募集，和/或结合和/或识别CXCR7 (SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基Μ33以及任选地氨基酸残基V32和/或氨基酸残基Μ37，其均如本文所描述的。
[0116]在特别优选的方面，“ 14G03-样序列”，“ 14G03-样ISVD”，“ 14G03-样结构单元”或“第2组ISVDs”是包含以下的ISVD:[0117]d)CDRl，其是(i)氨基酸序列INYMG(SEQ ID NO: 13)或(ii)与氨基酸序列INYMG(SEQ ID NO: 13)仅有3、2或I个氨基酸差异(如本文所定义的)的氨基酸序列；和/或
[0118]e)CDR2，其是(i)氨基酸序列 TLTSGGSTNYAGSVKG (SEQ ID NO: 23)或(ii)与氨基酸序列TLTSGGSTNYAGSVKG (SEQ ID NO: 23)具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列TLTSGGSTNYAGSVKG (SEQ IDN0:23)仅有7、6、5、4、3、2或I个氨基酸差异(如本文所定义的)的氨基酸序列；和/或
[0119]f)CDR3，其是⑴氨基酸序列GGTLYDRRRFES (SEQ ID NO: 33)或(ii)与氨基酸序列GGTLYDRRRFES (SEQ ID NO: 33)具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列GGTLYDRRRFES (SEQ ID NO: 33)仅有7、6、5、4、3、2或I个氨基酸差异(如本文所定义的)的氨基酸序列；
[0120]其中在这样的ISVD中存在的构架序列如本文所进一步描述的那样，其中CDR1、⑶R2和⑶R3优选使得14G03-样ISVD具有阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7结合，如本文所述的，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或抑制β -抑制蛋白的募集，和/或结合和/或识别CXCR7(SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基M33以及任选地氨基酸残基V32和/或氨基酸残基M37，其均如本文所描述的。优选地，在根据该特别优选的方面的14G03-样序列中，⑶Rl和⑶R2分别如d)和e)所定义；或者⑶Rl和⑶R3分别如d)和f)所定义；或者CDR2和CDR3分别如e)和f)所定义。更优选地，在这样的14G03-样序列中，CDRU CDR2和CDR3均分别如d)、e)和f)所定义。而且，在这样的14G03-样序列中，⑶R1XDR2和⑶R3优选使得14G03-样ISVD具有阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7结合，如本文所述的，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或抑制抑制蛋白的募集，和/或结合和/或识别CXCR7(SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基M33以及任选地氨基酸残基V32和/或氨基酸残基M37，其均如本文所描述的。
[0121]例如，在根据该特别优选的方面的14G03-样序列中:CDR1是氨基酸序列INYMG(SEQ ID NO: 13) (CDR2和CDR3分别如e)和f)所定义);和/或CDR2是氨基酸序列TLTSGGSTNYAGSVKG (SEQ ID NO: 23) (CDR1 和 CDR3 分别如 d)和 f)所定义);和 / 或 CDR3 是氨基酸序列GGTLYDRRRFES (SEQ ID NO: 33) (CDR1和CDR2分别如d)和e)所定义)。特别地，当14G03-样序列是根据该方面时ADRl是氨基酸序列INYMG(SEQ ID NO: 13)并且⑶R2是氨基酸序列TLTSGGSTNYAGSVKG (SEQ ID NO: 23) (CDR3如上述f)所定义)；和/或CDRl是氨基酸序列 INYMG (SEQ ID NO: 13)并且 CDR3 是氨基酸序列 GGTLYDRRRFES (SEQ ID NO: 33)(CDR2如上述e)所定义);和/或CDR2是氨基酸序列TLTSGGSTNYAGSVKG (SEQ ID NO: 23)并且CDR3是氨基酸序列GGTLYDRRRFES (SEQ ID NO: 33) (CDR1如上述d)所定义)。而且，在这样的14G03-样序列中，⑶R1XDR2和⑶R3优选使得14G03-样ISVD具有阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7结合，如本文所述的，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或抑制β -抑制蛋白的募集，和/或结合和/或识别CXCR7 (SEQ IDNO:1)中的氨基酸残基Μ33以及任选地氨基酸残基V32和/或氨基酸残基Μ37，其均如本文所描述的。
[0122]在特别优选的14G03-样序列中=CDRl是氨基酸序列INYMG(SEQ ID NO: 13)，CDR2是氨基酸序列TLTSGGSTNYAGSVKG (SEQ ID NO: 23);并且CDR3是氨基酸序列GGTLYDRRRFES(SEQ ID NO:33)。
[0123]在该段A)描述的所有的14G03-样序列中，构架序列可以如本文进一步描述的。优选地,构架序列是这样的，构架序列与14G03的构架序列具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%的序列同一性(其例如可以通过测定给定序列与14G03的序列的序列同一性的总体程度来测定，在计算时忽略CDR’s)。而且，在给定序列中存在的CDR’ s与构架的组合优选使得获得的14G03-样ISVD具有阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7结合，如本文所述的，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或抑制β-抑制蛋白的募集，和/或结合和/或识别CXCR7(SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基M33以及任选地氨基酸残基V32和/或氨基酸残基M37，其均如本文所描述的。
[0124]在一个特定的方面，14G03-样序列是与氨基酸序列14G03(SEQ ID NO:43)具有至少70%，例如至少80%，例如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的ISVD。例如，在根据该方面的14G03-样序列中，CDR’ s可以是根据上述特别优选的方面，可以特别是(但不限于)INYMG (SEQ ID NO: 13) (CDRl) ；TLTSGGSTNYAGSVKG (SEQ ID NO: 23) (CDR2)；和GGTLYDRRRFES (SEQ ID NO: 33) (CDR3)。而且，优选地，在这样的14G03-样ISVD中存在的⑶R’s与构架的组合优选使得14G03-样ISVD具有阻断活性，例如部分或完全阻断SDF-1与CXCR7结合，如本文所述的，和/或减少和/或抑制异种移植模型中的肿瘤发生，和/或抑制β-抑制蛋白的募集，和/或结合和/或识别CXCR7(SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基M33以及任选地氨基酸残基V32和/或氨基酸残基M37，其均如本文所描述的。在一个特定的方面，任何14G03-样序列可以是人源化的和/或序列优化的序列，如本文进一步描述的。
[0125]为了与CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)结合，本发明的氨基酸序列或多肽通常在其氨基酸序列内包含一个或多个氨基酸残基或者一个或多个氨基酸残基序列段(stretchs)(即，每个“序列(stretch)”包含两个或更多在所述氨基酸序列的一级或三级结构中彼此相邻的或彼此非常接近的氨基酸残基)，本发明的氨基酸序列通过它们能够与CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)结合，这些氨基酸残基或氨基酸残基序列段(stretchs)因此形成了与CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)结合的“位点”(本文中也称为“抗原结合位点”)。
[0126]本发明提供的免疫球蛋白单可变结构域优选是基本上分离的形式(如本文所定义的)，或者形成本发明的蛋白或多肽的一部分(如本文所定义的)，本发明的蛋白或多肽可以包含本发明的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域或基本由其组成，且任选地可以进一步包含一个或多个其它免疫球蛋白单可变结构域(所有都任选地通过一个或多个合适的接头连接起来)，和/或一个或多个其它结合结构域、结合单元、氨基酸序列或其它(官能)基团或分子，其优选还给构建体带来一种或多种所希望的特性(其一些非限制性的实例通过本文的进一步描述将会变得清楚)。
[0127]本发明提供的多肽或免疫球蛋白单可变结构域优选在体内减少肿瘤发生。
[0128] 在更优选的实施方案中，本发明提供了包含至少两个针对CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域的构建体。更优选地，所述针对CXCR7的免疫球蛋白可变结构域选自以下1.5节表B-2中定义的针对CXCR7的多肽和免疫球蛋白单可变结构域(例如第2组免疫球蛋白单可变结构域)的变体，其中所述针对CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域可以是相同的或不同的。优选地，所述两个针对CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域选自14G03-样ISVDs，例如14G03，08A05, 08A10, 07C03和07B11。在另一个更优选的实施方案中，本发明提供了包含至少两个针对CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域的构建体，所述针对CXCR7的免疫球蛋白可变结构域选自以下1.5节表B-2中定义的针对CXCR7的多肽和免疫球蛋白单可变结构域(例如第I组免疫球蛋白单可变结构域)的变体，其中所述针对CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域可以是相同的或不同的。优选地，所述两个针对CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域选自 OlClO (SEQ ID NO:91), 01B12(SEQ ID NO: 100)，OlFll (SEQ ID NO: 101)或 OlBlO (SEQID NO:102)。
[0129]已经出人意料地证明了包含至少一个第I组免疫球蛋白单可变结构域和至少一个第2组ISVD的双特异性构建体特别适合于在体内减少肿瘤生长。特别地，已表明这些构建体抑制SDF-1与CXCR7结合，在体内抑制肿瘤生长，并且抑制β-抑制蛋白的募集。而且，鉴于第2组ISVDs的结合功效，例如由SDF-1置换表征的，包含至少一个第I组ISVD和至少一个第2组ISVD的这些构建体更好地与靶标结合(参见例如实施例17)。这会导致用更低的剂量抑制肿瘤生长。此外，同时抑制β_抑制蛋白的募集将会导致长期的抗肿瘤发生的效果。
[0130]相应地，在更优选的实施方案中，本发明提供了包含至少两个针对CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域的构建体，其中至少一个针对CXCR7的所述免疫球蛋白单可变结构域(即针对CXCR7的“第一”免疫球蛋白单可变结构域)是01C10-样的，例如01C10(SEQ IDN0:91), 01B12(SEQ ID NO: 100), OlFll (SEQ ID NO: 101)或 OlBlO (SEQ ID NO: 102)，或其变体，如以下1.5节表B-2中定义的(例如第I组免疫球蛋白单可变结构域)，其中至少一个针对CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域(即针对CXCR7的“第二”免疫球蛋白单可变结构域)选自以下1.5节表B-2中定义的不同于针对CXCR7的“第一”免疫球蛋白单可变结构域或其变体的针对CXCR7的多肽和免疫球蛋白单可变结构域的变体。优选地，所述针对CXCR7的“第一”免疫球蛋白单可变结构域是01C10，以及所述针对CXCR7的“第二”免疫球蛋白单可变结构域选自由14G03-样，例如14G03, 08A05, 08A10, 07C03和07B11组成的组。
[0131]如实施例11所描述的，以01C10为代表的第I组免疫球蛋白单可变结构域与CXCR7的结合受到突变的W19的影响。相反，所有检测的免疫球蛋白单可变结构域的结合受到M33突变的影响，而第I组ISVDs不受其影响。还表明第I组ISVDs也优先识别和/或结合S23和D25 (数据未显示)。
[0132]第I组ISVDs或多肽可以表征为结合/或识别“第I组表位”。第I组ISVDs或多肽结合和/或识别CXCR7(SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基W19以及任选地氨基酸残基S23和/或氨基酸残基D25。第I组表位包含CXCR7 (SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基W19以及任选地氨基酸残基S23和/或氨基酸残基D25。第I组ISVDs尤其以01C10 (SEQ IDN0:91), 01B12(SEQ ID NO: 100), OlFll (SEQ ID NO: 101)或OlBlO(SEQ ID NO: 102)为代表，明显针对与第2组表位不同的表位；
[0133]第2组ISVDs或多肽可以表征为结合/或识别“第2组表位”。第2组ISVDs或多肽不结合和/或识别CXCR7(SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基W19，氨基酸残基S23和/或氨基酸残基D25。第2组ISVDs或多肽结合和/或识别CXCR7 (SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基M33以及任选地氨基酸残基V32和/或氨基酸残基M37。第2组表位包含CXCR7 (SEQID NO:1)中的氨基酸残基M33以及任选地氨基酸残基V32和/或氨基酸残基M37。第2组ISVDs 以 14G03-样 ISVDs 为代表，例如 14G03 (09A04), 08A05, 08A10 和 07C03,明显针对与第I组表位不同的表位。优选地，第2组ISVDs抑制β-抑制蛋白的募集，如本文所定义的；以及
[0134]第3组ISVDs或多肽可以表征为结合/识别(部分的)“第I组”表位以及(部分的)“第2组”表位。第3组ISVDs或多肽尤其以07Β11为代表，明显介于第I组和第2组中间。
[0135]本领域技术人员熟悉本领域中测定表位的常用方法，例如本发明实施例11中提供的“表位作图”。
[0136]相应地，本发明涉及多肽ISVDs，以及(常规的)抗体，或其部分，例如Fe、Fab、微抗体等，其识别和/或结合CXCR7中的W19以及任选地S23和/或D25。
[0137] 上述抗-CXCR7/CXCR7双特异性抗体可以适当地延长半衰期(例如通过聚乙二醇化，与血清白蛋白融合，或者与能够结合血清蛋白如血清白蛋白的多肽或结合单元融合，如本文进一步描述的)，因此例如可以另外包含血清白蛋白结合多肽或结合结构域(例如本文所描述的那些)，其任选地通过一个或多个适合的间隔子或接头连接。
[0138]而且，这种另外的结合结构域、结合单元、氨基酸序列或其它(官能)基团或分子包括一个或多个其它免疫球蛋白单可变结构域，例如一个或多个(单)结构域抗体，dAb’ s或纳米抗体(例如Vhh、人源化Vhh或骆驼源化Vh，例如骆驼源化的人Vh)，以提供本发明的“双特异性”蛋白或多肽(即包含至少一个-例如一个或两个-针对CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域和至少一个-例如一个或两个-针对另一个靶标的免疫球蛋白单可变结构域的本发明的多肽)。
[0139]例如，根据特定的但是非限制性的方面，本发明的构建体、蛋白或多肽可以具有增加的半衰期，例如通过官能化和/或通过在构建体中包含增加构建体半衰期的分子或结合单元。这种官能化、分子或结合单元的实例对本领域技术人员来说是清楚的，例如可以包括聚乙二醇化，与血清白蛋白融合，或者与能够结合血清蛋白如血清白蛋白的多肽或结合单元融合。
[0140]在后者的构建体(即包含至少一个-例如一个或两个-本发明的氨基酸序列以及至少一个-例如一个或两个-能结合血清蛋白如血清白蛋白的肽或结合单元的融合构建体)中，结合血清白蛋白的肽或结合血清白蛋白的结构域可以是任何适合的能增加构建体半衰期的(与没有结合血清白蛋白的肽或结合血清白蛋白的结构域的相同构建体相比)结合血清白蛋白的肽或结合血清白蛋白的结构域，特别可以是 申请人:的W02008/068280(以及特别是W02009/127691和W02011/095545，其均为 申请人:的)中所描述的结合血清白蛋白的肽，或者结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域(例如结合血清白蛋白的纳米抗体；例如Alb-1或人源化形式的Alb-1如Alb-8，其可以参考例如W006/122787)。
[0141]关于半衰期，应当注意在本发明中，通过使用本文所述的不同的半衰期延长技术(例如通过适当地选择根据W02008/068280、W02009/127691和/或W02011/095545的结合血清白蛋白的肽)，本发明的构建体或多肽的半衰期可以(且优选)适当地根据预期的(治疗和/或诊断)应用“调整”和/或在所期望的治疗和/或药理效果和可能的不希望的副作用之间取得最佳平衡。
[0142]因此，例如但不受其限制地，本发明的优选方面提供了“双特异性”多肽，其基本由一个针对人CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域(或者两个针对人CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域，其可以是相同的或不同的，以提供-当它们是相同或不同时-本发明的“二价”多肽，或者-当它们是不同的时-本发明的“双互补位”多肽)和一个针对人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域通过肽接头(如本文所定义的)连接组成，以分别提供本发明的双特异性多肽，其均如本文所描述的。这种蛋白或多肽也可以是基本上分离的形式(如本文所定义的)。
[0143]在另一个特定的，但是非限制性的方面，本发明的氨基酸序列(例如纳米抗体)或本发明的多肽(例如本发明的二价的、双互补位的或者双特异性的多肽)可以适当地与毒素或与(细胞)毒性残基、结构部分或有效载荷连接(也是以化学方式或通过一个或多个合适的接头或间隔子)。可以与本发明的氨基酸序列或多肽连接以提供-例如-细胞毒性化合物(即基于本发明的氨基酸序列或多肽的抗体药物缀合物或“ADC”)的合适的(细胞)毒性结构部分、化合物、有效载荷或残基的实例对本领域技术人员来说是清楚的。例如参考Ducry 和 Stump, Bioconjugate Chem., 2010, 21 (I), pp.5 - 13 的综述。本发明的这种细胞毒性氨基酸序列或多肽特别可以用于/适合于那些要杀死表达本发明的氨基酸序列或多肽针对的靶标的细胞(例如在癌症的治疗中)，或减少或减慢这种细胞的生长和/或增殖的应用。通常但不受其限制地，本发明的(细胞)毒性多肽或者不是半衰期延长的，或者仅仅具有限制的和/或严格控制的半衰期延长。
[0144]在另一个方面，本发明的至少一个氨基酸序列(即针对CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域)可以适当地与至少一个针对CXCR4的免疫球蛋白单可变结构域连接，以提供直接针对CXCR7和CXCR4 二者的双特异性多肽。
[0145]例如，在 该方面，本发明的至少一个-例如一个或两个-氨基酸序列可以适当地与至少一个-例如一个或两个-针对CXCR4的免疫球蛋白单可变结构域连接。
[0146]可以用于这种构建体中的针对CXCR4的免疫球蛋白单可变结构域的一些优选地但非限制性的实例是(或者可以适当地选自):
[0147]-来自AblynxN.V.的国际申请W009/138519的针对CXCR4的免疫球蛋白单可变结构域(特别是纳米抗体之一)(例如但不限于，W009/138519的表Β_1.I中的238D2/SEQID N0:238 和 238D4/SEQ ID NO:239);和 / 或
[0148]-在2010年6月25日提交的AblynxN.V.的未提前公开的美国专利申请61/358，495中描述的氨基酸序列238D2和238D4的序列优化/改进的变体；和/或
[0149]-在2010 年 10 月 4 日提交的 Ablynx N.V.的 PCT 申请 PCT/EP2010/064766 中描述的能与238D2和/或238D4的相同表位结合的免疫球蛋白单可变结构域；和/或
[0150]-在2011 年 I 月 7 日提交的 Ablynx N.V.的 PCT 申请 PCT/EP2011/050156 第 7-13页中描述的10E9-类型的序列，281E10-类型的序列，10E12-类型的序列，10A10-类型的序列，10G10-类型的序列，14A2-类型的序列，15A1-类型的序列，15H3-类型的序列和/或283B6-类型的序列；和/或
[0151]-在2011年 I 月 7 日提交的 Ablynx N.V.的 PCT 申请PCT/EP2011/050156 第 15-47页中描述的10E9-类型的序列，281E10-类型的序列，10E12-类型的序列，10A10-类型的序列，10G10-类型的序列，14A2-类型的序列，15A1-类型的序列，15H3-类型的序列和/或283B6-类型的序列。[0152]上述的抗CXCR7/CXCR4双特异性构建体(以及包含本发明的至少一个氨基酸序列的其它双特异性构建体)可以适当地延长半衰期(例如通过聚乙二醇化，与血清白蛋白融合，或者与能够结合血清蛋白如血清白蛋白的多肽或结合单元融合，如本文进一步描述的)，因此例如可以另外包含结合血清白蛋白的多肽或结合血清白蛋白的结构域(例如本文所描述的那些)，其任选地通过一个或多个适合的间隔子或接头连接。
[0153]因此，本发明的一个特定的但非限制性的方面是一种多肽，其包含一个或两个(优选一个)针对CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域(如本文所定义的，且优选一个或两个纳米抗体)，一个或两个(优选一个)针对CXCR4的免疫球蛋白单可变结构域(如文本所定义的，且优选一个或两个纳米抗体)，以及针对(人)血清白蛋白的肽或免疫球蛋白单可变结构域，其任选通过一个或多个适合的间隔子或接头连接。
[0154]上述的抗CXCR7/CXCR4双特异性构建体(以及包含本发明的至少一个氨基酸序列的其它双特异性构建体)还可以适当地与毒素或与(细胞)毒性残基、结构部分或有效载荷(如本文所进一步描述的)连接(也是以化学方式或通过一个或多个合适的接头或间隔子)。而且，本发明的这种(细胞)毒性双特异性多肽或者不是半衰期延长的，或者仅仅具有限制的和/或严格控制的半衰期延长。 [0155]本发明在其最广泛的意义上还包含本发明的氨基酸序列(例如纳米抗体)和本发明的多肽的衍生物。这种衍生物通常可以通过对本发明的氨基酸序列(例如纳米抗体)和本发明的多肽和/或形成本发明的纳米抗体的一个或多个氨基酸残基进行修饰，特别是通过化学和/或生物学(例如，酶学)修饰获得。
[0156]这种修饰的实例，以及可以以这种方式修饰(即或者在蛋白质骨架上但优选在侧链上)的本发明的氨基酸 序列(例如纳米抗体)和多肽中的氨基酸残基的实例，可用于引入这种修饰的方法和技术以及这种修饰的潜在用途和优点对本领域技术人员来说是清楚的。
[0157]例如，这种修饰可以包括向本发明的氨基酸序列(例如纳米抗体)和本发明的多肽引入(例如通过共价结合或以另一种适合的方式)一个或多个官能基团、残基或结构部分，特别是能赋予本发明的纳米抗体一种或多种所希望的特性或功能性的一个或多个官能基团、残基或结构部分。这种官能基团的实例对于本领域技术人员来说是清楚的。
[0158]例如，这种修饰可以包括引入(例如通过共价结合或以任何其它适合的方式)增加本发明的纳米抗体的半衰期、溶解性和/或吸收，减少本发明的纳米抗体的免疫原性和/或毒性，消除或减轻本发明的纳米抗体的不希望的副作用，和/或赋予本发明的纳米抗体和/或多肽其它有利的特性和/或减少不希望的特性的一个或多个官能基团；或者前述两个或更多个的任何组合。这种官能基团和引入它们的技术的实例对于本领域技术人员来说是清楚的，通常可以包括本文上述引用的一般【背景技术】中提及的所有官能基团和技术以及其用于修饰药用蛋白，特别是用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFv’ s和单结构域抗体)的本身已知的官能基团和技术，例如参考Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16thed., Mack Publishing C0.，Easton, PA(1980)。这种官能基团例如可以直接与本发明的纳米抗体连接(例如共价地)，或者任选地通过适合的接头或间隔子连接，这对于本领域技术人员来说也是清楚的。
[0159]用于增加药用蛋白的半衰期和/或减少其免疫原性的一种最广泛使用的技术包括与适当的药学可接受的聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)连接。通常，可以使用聚乙二醇化的任何适当的形式，例如用于抗体和抗体片段领域(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv’ s)的聚乙二醇化；例如参考 Chapman, Nat.Biotechnol.，54，531-545(2002) ；Veronese 和 Harris, Adv.DrugDeliv.Rev.54, 453-456 (2003) , Harris 和 Chess, Nat.Rev.Drug.Discov., 2, (2003)和TO04/060965。用于蛋白质的聚乙二醇化的不同试剂也是可商购的，例如从NektarTherapeutics, USA 获得。
[0160]优选地，使用定点聚乙二醇化，特别是通过半胱氨酸残基(参见例如Yang等，Protein Engineering, 16，10, 761-770 (2003)) ? 例如，为此目的，可以将 PEG 与本发明的纳米抗体中天然存在的半胱氨酸残基连接，可以修饰本发明的纳米抗体以适当地引入用于连接PEG的一个或多个半胱氨酸残基，或者可以将包含一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基的氨基酸序列与本发明的纳米抗体的N-和/或C-末端融合，所有使用的蛋白质工程技术对于本领域技术人员来说都是本身已知的。
[0161]优选地，对于本发明的纳米抗体和蛋白，使用分子量大于5000，例如大于10,000且小于200，000，例如小于100，000 ;例如20，000-80，000范围内的PEG。
[0162]另一个，通常次优选的修饰包括N-连接的或O-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，这取决于用于表达本发明的纳米抗体或多肽的宿主细胞。
[0163]另一种修饰可以包括引入一个或多个可检测的标记物或其它产生信号的基团或结构部分，这取决于所标记的纳米抗体的预期用途。适合的标记和连接、使用和检测它们的技术对于本领域技术人员来说是清楚的，例如包括但不限于荧光标记、磷光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性同位素、金属、金属螯合物、金属离子、发色团和酶，例如W008/020079第109页提及的那些。其它适合的标记对于本领域技术人员来说是清楚的，例如包括可用NMR或ESR光谱检测的结构部分。
[0164]本发明的这种标记的纳米抗体和多肽例如可以用于体外、体内或原位检测(包括本身已知的免疫检测例如ELISA，RIA, EIA及其它“夹心检测”等)以及体内诊断和成像目的，这取决于特定标记的选择。
[0165]如本领域技术人员所清楚的，另一种修饰可以包括引入螯合基团，例如螯合上面提到的一种金属或金属离子。适合的螯合基团例如包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
[0166]另一种修饰可以包括引入作为特异结合对，例如生物素_(链霉)亲和素结合对的一部分的官能基团。这种官能基团可用于将本发明的纳米抗体与另一种连接所述结合对的另一半的蛋白、多肽或化学化合物，即通过形成结合对连接起来。例如，本发明的纳米抗体可以与生物素缀合，并与另一种缀合亲和素或链霉亲和素的蛋白、多肽、化合物或载体连接。例如，这种缀合的纳米抗体可以用做报道子，例如在其中产生可检测信号的试剂与亲和素或链霉亲和素缀合的诊断系统中。这种结合对还可以例如用于将本发明的纳米抗体与载体，包括适合于制药目的的载体相结合。一种非限制性实例是Cao和Suresh, Journal ofDrug Targetting, 8, 4, 257(2000)描述的脂质体制剂。这种结合对还可以用于将治疗活性剂与本发明的纳米抗体连接。
[0167]其它可能的化学和酶学修饰对于本领域技术人员来说是清楚的。还可以为研究目的引入这种修饰(例如研究功能-活性关系)。例如参考Lundblad和Bradshaw, Biotechnol.Appl.Biochem., 26, 143-151(1997)。
[0168]本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽同样优选基本上由不通过二硫键与任何其它氨基酸序列或链连接的单氨基酸链组成(但是可以包含或不包含一个或多个分子内的二硫键。例如，已知本发明的试剂-如本文所述的-有时可以包含⑶R3和⑶Rl或FR2之间的二硫键)。但是，应当注意本发明的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域可以彼此连接和/或与其它的免疫球蛋白单可变结构域连接(例如通过二硫键)以提供也可用于本发明中的肽构建体(例如Fab’片段，F(ab’)2片段，ScFv构建体，“双抗体”及其它多特异性构建体。例如参见 Holliger 和 Hudson, Nat Biotechnol.2005Sep; 23 (9): 1126-36 的综述)。
[0169]通常，当本发明的氨基酸序列(或包含它的化合物、构建体或多肽)是要给受试者施用时(例如为了如本文所述的治疗和/或诊断目的)，优选所述受试者中天然不存在氨基酸序列；或者，当所述受试者天然存在其时，其是基本上分离的形式(如本文所定义的)。
[0170]本领域技术人员也清楚的是，对于制药用途，本发明的免疫球蛋白单可变结构域(以及包它的化合物、构建体和多肽)优选针对人CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQ ID NO:1)；然而为兽药的目的，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽优选针对来自所治疗物种的CXCR7，或者至少与来自所治疗物种的CXCR7交叉反应。
[0171]进一步，本发明的氨基酸序列可以任选地，除了至少一个针对CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQ ID NO:1)结合的结合位点之外，还包含一个或多个针对其它抗原、蛋白或靶标结合的其它结合位点。
[0172]本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽，以及包含它的组合物的功效可以用任何适合的本身已知的体外检测、基于细胞的检测、体内检测和/或动物模型，或其任意组合进行检测，这取决于所涉及的特定疾病或失调。适合的检测和动物模型对于本领域技术人员来说是清楚的，例如包括配体置换检测(Burns等，J.Exp.Med.20064; 203 (9):2201-13)，β 抑制蛋白募集检测(Zabel 等，J.1mmunol.20091; 183 (5):3204-11), 二聚化检测(Luker 等,Faseb J.200923(3):823-34),信号传导检测(Wang 等,J Tmmunol? 2009S印I;183(5):3204-11)，增殖检测(Wang 等，J Immunol.2009Sepl;183 (5):3204-11; Odemis 等，J Cell Sign.2010 年 4 月 I 日；123 (Pt7): 1081-8)，存活检测(Burns 等,J.Exp.Med.20064; 203 (9): 2201-13),细胞粘附检测(Burns 等,J.Exp.Med.20064;203(9):2201-13),和跨内皮迁移检测(Mazzinghi 等,J.Exp.Med.2008Febl8; 205 (2): 479-90)，内皮细胞萌芽检测(Wang 等，J Immunol.2009S印I;183 (5): 3204-11),成肌分化(Melchionna 等,Muscle Nerve, 2010Febll)和体内异种移植模型(Burns等，J.Exp.Med.20064; 203 (9): 2201-13)，胶原诱导的关节炎模型(Hegen等，Ann Rheum Dis.2008Nov; 67 (11): 1505-15)和实验性自身免疫脑脊髓炎模型(Wekerle, AnnRheum Dis.2008Dec; 67Suppl3:1ii56_60)以及以下的实验部分中和本文引用的现有技术中所使用的检测和动物模型。
[0173]而且，根据本发明，针对来自第一物种的温血动物的CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以表现出或不表现出与来自于一种或多种其它物种的温血动物的CXCR7的交叉反应性。例如，针对人CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以表现出或不表现出与来自于一种或多种其它灵长类物种(例如但不限于，称猴属(Macaca)的猴(例如以及特别是食蟹猴(Macaca fascicularis)和/或称猴(Macaca mulatta)和狒狒(Papio ursinus))的CXCR7和/或与来自于一种或多种经常用于疾病动物模型中的动物物种(例如小鼠、大鼠、兔、猪或狗)，特别是与CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQ ID NO:1)相关的疾病和失调的动物模型中动物物种(例如本文提及的物种和动物模型)的CXCR7的交叉反应性。在这一方面，本领域技术人员清楚这种交叉反应性，当存在时，从药物开发的角度来说是有利的，因为它使得可以在这种疾病模型中检测针对人CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白单可变结构域和多肽(参见例如实施例 12)。
[0174]更通常地，与来自多个哺乳动物物种的CXCR7交叉反应的本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽通常对于在兽药中的应用是有利的，因为它使得同样的氨基酸序列或多肽可以跨多个物种使用。因此，也包含在本发明范围内的是，直接针对来自一个动物物种的CXCR7的免疫球蛋白单可变结构域和多肽(例如针对人CXCR7(SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白单可变结构域和多肽)可以用于治疗另一个物种的动物，只要所述免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽的使用在要治疗的物种中提供了所希望的效果。
[0175]本发明在其最广泛的意义上也不特别受到本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽针对的CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)的特定抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象(confirmation)(在适用的情况下)的限制或由其限定。例如，免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以针对或可以不针对CXCL11/CXCL12相互作用位点和/或CXCR7/CXCR7同二聚体化位点和/或CXCR4/CXCR7异二聚化位点(或CXCR7与其它趋化因子受体如CXCR3的异二聚化)，如本文进一步定义的。 [0176]如本文进一步所述的，本发明的多肽可以包含两个或更多个针对CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQ ID NO:1)的本发明的免疫球蛋白单可变结构域。通常，这种多肽与本发明的单氨基酸序列相比以增加的抗体亲抗原性结合CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQ ID NO:1)。这种多肽可以例如包含两个针对CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)的相同抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象(在适用的情况下)(其可以是或不是相互作用位点)的本发明的免疫球蛋白单可变结构域；或者包含至少一个针对CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ IDNO:1)的第一相同抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象(在适用的情况下)(其可以是或不是相互作用位点)的本发明的“第一”氨基酸序列，例如第I组表位；以及至少一个针对与第一不同的第二抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象(在适用的情况下)(其也可以是或不是相互作用位点)的本发明的“第二”氨基酸序列，例如第2组表位。优选地，在本发明的这样的“双互补位”多肽中，本发明的至少一个氨基酸序列针对相互作用位点(如本文所定义的)，尽管本发明在其最广泛的意义上不限于此。例如，本发明的多肽可以是例如双互补位的形式，以组合实验部分所表征的针对不同表位的单价结构单元(参见实施例9-17)。虽然“二价”多肽的单个免疫球蛋白单可变结构域的结合常数，例如缔合常数和解离常数，完全优于“双互补位”多肽的单个免疫球蛋白单可变结构域的结合常数，但是本发明完全出人意料地证明本发明的“双互补位”多肽在生物检测例如β -抑制蛋白检测中比“二价”多肽更有效。
[0177]而且，当靶标是结合对(例如受体-配体结合对)的一部分时，免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以是这样的，它们与关联结合配偶体，例如CXCLlU也称为1-TAC)和/或CXCL12 (也称为SDF-1)竞争结合CXCR7，和/或它们(完全或部分地)中和结合配偶体与靶标的结合。
[0178]还预期本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽通常可以与CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQ ID NO:1)的所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段结合；或者至少与包含一个或多个与本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽与CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)结合的抗原决定簇或表位基本上相同的抗原决定簇或表位的CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)的那些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段结合。而且，在这种情况下，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以与这些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段以与本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽与(野生型)CXCR7结合的亲和力和特异性相同或不同(即高于或低于)的亲和力和/或特异性结合。
[0179]由于CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)以单体形式以及以一种或多种多聚体形式，例如同二聚形式以及与CXCR4如人CXCR4的异二聚形式存在(RM Maksym等，上文；KELuker等，上文)，所以包含在本发明范围内的是，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽i)仅与单体形式的CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)结合，ii)仅与多聚体/ 二聚体(同-和/或异二聚体)形式的CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)结合，或iii)与单体和多聚体形式均结合。在本发明的优选的方面，本发明的多肽防止同二聚人CXCR7复合物和/或异二聚人CXCR4/CXCR7复合物的形成。在本发明的另一个优选的方面，本发明的多肽不诱导(即使在高浓度，例如IOnM以下，50nM以下，IOOnM以下，或500nM以下的条件下)同二聚人CXCR7复合物和/或异二聚人CXCR4/CXCR7复合物的形成。而且，在这种情况下，本发明的多肽可以与单体形式以与本发明的免疫球蛋白单可变结构域与多聚体形式结合的亲和力和特异性相同或不同(即高于或低于)的亲和力和/或特异性结合。
[0180] 而且，当CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)可与其它蛋白或多肽缔合以形成蛋白复合物(例如与CXCL12/SDF-1或CXCL11/1-TAC)时，包含在本发明范围内的是，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽与CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)以其非缔合状态结合(例如防止配体结合)，与CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)以其缔合状态结合，或者与二者结合(优选与非缔合状态结合)。在所有这些情况下，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以与这样的缔合蛋白复合物以与本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽与非缔合状态的CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)结合的亲和力和/或特异性相同或不同(即高于或低于)的亲和力和/或特异性结合。
[0181]而且，如本领域技术人员清楚的，包含两个或更多个针对CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白单可变结构域的蛋白或多肽与相应的单体氨基酸序列相比可以以更高的抗体亲抗原性与CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)结合。例如但不受其限制地，包含两个或更多个针对CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)的不同表位的免疫球蛋白单可变结构域的蛋白或多肽与不同单体中的每一个相比可以(通常会)以更高的抗体亲抗原性结合，包含两个或更多个针对CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白单可变结构域的蛋白或多肽也可以(通常会)以更高的抗体亲抗原性与CXCR7的多聚体(例如同二聚体，与CXCR4的异二聚体)，特别是与人CXCR7(SEQ ID NO:1)的多聚体(例如同二聚体，与CXCR4的异二聚体)结合。
[0182]通常，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽至少与从生物的和/或治疗的角度考虑最相关的CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)的那些形式(包括单体，多聚体，缔合的和不同的构象形式)结合，其对于本领域技术人员来说是清楚的。
[0183]也在本发明范围内的是使用本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物，和/或使用包含一个或多个这些部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物或基本上由其组成的蛋白或多肽，只要它们适合于本文所预期的用途。这些部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物通常包含(至少部分)针对CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)结合的功能性抗原结合位点；更优选能够特异性结合CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQ ID NO:1),更加优选能够以与结合、迁移、置换和/或增殖阻断和/或其它功效的测量相关的本文定义的EC50值、平均Ki，IC50值，例如本文实验部分中进一步所描述的，结合CXCR7、特别是人CXCR7 (SEQID NO:1),而且这些部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物可以更有效，更稳定，更可溶以及可以具有相同的表位。这些部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因、衍生物、蛋白和/或多肽的一些非限制性实例通过本文的进一步描述将会变得清楚。还可以通过适当地将一个或多个本文所述的(较小的)部分或片段组合(即通过连接或基因融合)提供本发明的其它的片段或多肽。
[0184]对于免疫球蛋白单可变结构域的一般说明，参考以下的进一步描述，以及本文所引用的现有技术。然而在这方面，应当注意，本说明书和现有技术主要描述了所谓的“Vh3类”的免疫球蛋白单可变结构域(即与Vh3类的人生殖系序列，例如DP-47，DP-51或DP-29具有高度序列同源性的免疫球蛋白单可变结构域)，其形成了本发明的优选方面。然而应当注意，本发明在其最广泛 的意义上通常包括针对CXCR7、特别是人CXCR7(SEQ ID NO:1)的任何类型的免疫球蛋白单可变结构域，以及例如还包括属于所谓的“VH4类”的免疫球蛋白单可变结构域(即与Vh4类的人生殖系序列例如DP-78具有高度序列同源性的免疫球蛋白单可变结构域)，例如W007/118670中所描述的。
[0185]通常，免疫球蛋白单可变结构域(特别是Vhh序列和序列优化的免疫球蛋白单可变结构域)可以特别表征为在一个或多个构架序列(也如本文进一步描述的)中存在一个或多个“标志(Hallmark)残基”(如本文所述的)。
[0186]因此，通常，免疫球蛋白单可变结构域可以定义为具有(通用)结构的氨基酸序列
[0187]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0188]其中FR1-FR4分别指构架区1_4，其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1_3。
[0189]在优选的方面，本发明提供了包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其是具有(通用)结构的氨基酸序列
[0190]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0191]其中FR1-FR4分别指构架区1_4，其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1_3，且其中:
[0192]i)根据 Kabat 编号的位置 11，37，44，45，47，83，84，103，104 和 108 的氨基酸残基的至少一个选自下表A-1中提及的标志残基；和/或其中:
[0193]ii)所述氨基酸序列与W02009/138519中显示的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个(参见W02009/138519中的SEQ ID NOs: 1-125)具有至少80%，更优选90%，更加优选95%的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基(在序列中用X表不)；和/或其中:
[0194]iii)⑶R序列通常如本文进一步定义的(例如表B-2提供的组合中的⑶R1，⑶R2和CDR3，应注意CDR的定义是根据Kabat编号系统计算的);和/或其中:
[0195]iv)FR序列通常如本文进一步定义的，例如表B-2提供的组合中的FR1，FR2, FR3和FR4，和/或分别与表B-2中提供的FRs的FR1，FR2, FR3和FR4(其中FR的定义是根据Kabat编号系统计算的)的至少一个有至少80%，更优选90%，更加优选95%的氨基酸同一性的 FRl, FR2, FR3 和 FR4。
[0196]表A-1 =VHHs中的标志残基
[0197]
【权利要求】
1.构建体，其包含:至少一个结合和/或识别CXCR7(SEQID NO:1)中的氨基酸残基M33和任选地氨基酸残基V32和/或氨基酸残基M37的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)；和至少一个结合和/或识别CXCR7 (SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基WF19和任选地S23和/或 D25 的 ISVD0
2.根据权利要求1的构建体，其用作药物减少肿瘤生长和/或治疗癌症，优选头颈癌或GBM。
3.免疫球蛋白单可变结构域，其能够以小于IOOnM的平均Ki以及50%以上的平均SDF-1 和 1-TAC 置换特异性置换人 CXCR7 (SEQ ID NO:1)上的 SDF-1 和 1-TAC0
4.免疫球蛋白单可变结构域，其能够以小于IOOnM的平均Ki以及50%以上的平均SDF-1置换特异性置换人CXCR7 (SEQ ID NO:1)上的SDF-1。
5.免疫球蛋白单可变结构域，其能够以小于IOOnM的平均Ki以及50%以上的平均1-TAC置换特异性置换人CXCR7 (SEQ ID NO:1)上的1-TAC。
6.权利要求3-5任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述平均Ki为50nM以下。
7.权利要求3-5任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述平均Ki为IOnM以下。
8.权利要求3-7任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述平均SDF-1或1-TAC置换为80%以上。
9.免疫球蛋白单可变结构域，其能够以小于50nM的Kd结合人CXCR7(SEQ ID NO:1)。
10.免疫球蛋白单可变结构域，其结合和/或识别CXCR7(SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基M33和任选地氨基酸残基V32和/或氨基酸残基M37。
11.免疫球蛋白单可变结构域，其结合和/或识别CXCR7(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基WF19和任选地S23和/或D25。
12.根据权利要求10或11的免疫球蛋白单可变结构域，其用作药物减少肿瘤生长和/或治疗癌症，优选头颈癌或GBM。
13.根据权利要求3-12任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含式I的氨基酸序列:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I); 其中FRl至FR4指构架区I至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；并且 其中⑶Rl选自由以下组成的组: a)SEQ ID N0:9的免疫球蛋白单可变结构域， b)与SEQID N0:9的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域， c)与SEQID NO: 9的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域， 并且其中⑶R2选自由以下组成的组: d)SEQ ID NO: 19的免疫球蛋白单可变结构域； e)与SEQID NO: 19的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； f)与SEQID NO: 19的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域；并且其中⑶R3选自由以下组成的组: g)SEQ ID NO: 29的免疫球蛋白单可变结构域； h)与SEQID NO:29的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； i)与SEQID NO:29的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域。
14.根据权利要求3-12任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含式I的氨基酸序列:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I); 其中FRl至FR4指构架区I至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；并且 其中⑶Rl选自由以下组成的组: a) SEQ ID NO: 10的免疫球蛋白单可变结构域， b)与SEQID NO: 10的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域， c)与SEQID NO: 10的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域， 并且其中⑶R2选自由以下组成的组: d)SEQ ID NO: 20的免疫球蛋白单可变结构域； e)与SEQID NO:20的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； f)与SEQID NO:20的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域； 并且其中⑶R3选自由以下组成的组: g)SEQ ID N0:30的免疫球蛋白单可变结构域； h)与SEQID NO:30的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； i)与SEQID NO:30的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域。
15.根据权利要求3-12任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含式I的氨基酸序列:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I); 其中FRl至FR4指构架区I至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；并且 其中⑶Rl选自由以下组成的组: a)SEQ ID NO: 11的免疫球蛋白单可变结构域， b)与SEQID NO: 11的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域， c)与SEQID NO: 11的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域， 并且其中⑶R2选自由以下组成的组:d)SEQ ID N0:21的免疫球蛋白单可变结构域； e)与SEQID N0:21的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； f)与SEQID NO:21的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域； 并且其中⑶R3选自由以下组成的组: g)SEQ ID NO:31的免疫球蛋白单可变结构域； h)与SEQID NO:31的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； i)与SEQID NO:31的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域。
16.根据权利要求3-12任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免 疫球蛋白单可变结构域包含式I的氨基酸序列:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I); 其中FRl至FR4指构架区I至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；并且 其中⑶Rl选自由以 下组成的组: a)SEQ ID NO: 12的免疫球蛋白单可变结构域， b)与SEQID NO: 12的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域， c)与SEQID NO: 12的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域， 并且其中⑶R2选自由以下组成的组: d)SEQ ID NO:22的免疫球蛋白单可变结构域； e)与SEQID NO:22的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； f)与SEQID NO:22的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域； 并且其中⑶R3选自由以下组成的组: g)SEQ ID NO:32的免疫球蛋白单可变结构域； h)与SEQID NO:32的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； i)与SEQID NO:32的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域。
17.根据权利要求3-12任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含式I的氨基酸序列:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I); 其中FRl至FR4指构架区I至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；并且 其中⑶Rl选自由以下组成的组: a)SEQ ID NO: 13的免疫球蛋白单可变结构域，b)与SEQID NO: 13的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域， c)与SEQID NO: 13的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域， 并且其中⑶R2选自由以下组成的组: d)SEQ ID NO:23的免疫球蛋白单可变结构域； e)与SEQID NO:23的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； f)与SEQID NO:23的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域； 并且其中⑶R3选自由以下组成的组: g)SEQ ID NO:33的免疫球蛋白单可变结构域； h)与SEQID NO:33的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； i)与SEQI D NO:33的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域。
18.根据权利要求3-12任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免 疫球蛋白单可变结构域包含式I的氨基酸序列:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I); 其中FRl至FR4指构架区I至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；并且其中⑶Rl选自由以下组成的组: a)SEQ ID NO:93的免疫球蛋白单可变结构域， b)与SEQID NO:93的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域， c)与SEQID NO:93的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域； 并且其中⑶R2选自由以下组成的组: d)SEQ ID NO: 95的免疫球蛋白单可变结构域； e)与SEQID NO:95的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； f)与SEQID NO:95的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域； 并且其中⑶R3选自由以下组成的组: g)SEQ ID NO: 97的免疫球蛋白单可变结构域； h)与SEQID NO:97的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； i)与SEQID NO:97的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域。
19.根据权利要求3-12任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含式I的氨基酸序列:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I); 其中FRl至FR4指构架区I至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；并且 其中⑶Rl选自由以下组成的组: a)SEQ ID NO: 107的免疫球蛋白单可变结构域， b)与SEQID NO: 107的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域， c)与SEQID NO: 107的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域， 并且其中⑶R2选自由以下组成的组: d)SEQ ID NO: 115的免疫球蛋白单可变结构域； e)与SEQID NO: 115的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； f)与SEQ ID NO: 115的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域； 并且其中⑶R3选自由以下组成的组: g)SEQ ID NO: 123的免疫球蛋白单可变结构域； h)与SEQID NO: 123的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； i)与SEQID NO: 123的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域。
20.根据权利要求3-12任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含式I的氨基酸序列:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I); 其中FRl至FR4指构架区I至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；并且 其中⑶Rl选自由以下组成的组: a)SEQ ID NO: 108的免疫球蛋白单可变结构域， b)与SEQID NO: 108的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域， c)与SEQID NO: 108的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域， 并且其中⑶R2选自由以下组成的组: d)SEQ ID NO: 116的免疫球蛋白单可变结构域； e)与SEQID NO: 116的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； f)与SEQID NO: 116的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域； 并且其中⑶R3选自由以下组成的组: g)SEQ ID NO: 124的免疫球蛋白单可变结构域；h)与SEQID NO: 124的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； i)与SEQID NO: 124的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域。
21.根据权利要求3-12任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含式I的氨基酸序列:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I); 其中FRl至FR4指构架区I至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；并且 其中⑶Rl选自由以下组成的组: a)SEQ ID NO: 110的免疫球蛋白单可变结构域， b)与SEQID NO: 110的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域， c)与SEQID NO: 110的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域， 并且其中⑶R2选自由以下组成的组:
d)SEQ ID NO: 118的免疫球蛋白单可变结构域； e)与SEQID NO: 118的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； f)与SEQID NO: 118的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域； 并且其中⑶R3选自由以下组成的组: g)SEQ ID NO: 126的免疫球蛋白单可变结构域； h)与SEQID NO: 126的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域； i)与SEQID NO: 126的免疫球蛋白单可变结构域具有3、2或I个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域。
22.根据权利要求1-21任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述构架区(FRs)与 SEQ ID N0s:4-8, 92, 103, 104 或 106 (FRl)，14-18，94，111，112 或114 (FR2)，24-28，96，119，120 或 122 (FR3)，和 / 或 34-38，98，127，128 或 130 (FR4)的 FRs具有大于80%的序列同一'丨生。
23.多肽，其包含权利要求3-22任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
24.根据权利要求23的多肽，其中所述免疫球蛋白单可变结构域选自由以下组成的组:氨基酸序列与SEQ ID NOs:39-43，91或99-102的免疫球蛋白单可变结构域具有大于80%的序列同一性的免疫球蛋白单可变结构域。
25.根据权利要求23-24任一项的多肽，其另外包含至少一个结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域并且任选地包含选自接头SEQ ID NOs:49-58的接头。
26.根据权利要求23-25任一项的多肽，其另外包含ALB8(SEQ ID NO: 2)并且任选地包含选自接头SEQ ID NOs:49-58的接头。
27.根据权利要求23-26任一项的多肽，其中所述多肽选自由以下组成的组:氨基酸序列与SEQ ID NOs:44-48, 78-89和131-140的多肽具有大于80%的序列同一性的多肽。
28.构建体，其选自由以下组成的组: -构建体，其包含至少两个ISVDs，所述ISVDs结合和/或识别CXCR7 (SEQ ID NO:1)的氨基酸残基WF19和任选地S23和/或D25，其中所述至少两个ISVDs可以是相同的或不同的； -构建体，其包含至少两个ISVDs，所述ISVDs结合和/或识别CXCR7(SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基M33和任选地氨基酸残基V32和/或氨基酸残基M37，其中所述至少两个ISVDs可以是相同的或不同的； -构建体，其包含至少一个第1组ISVD和至少一个第2组ISVD ； -构建体，其包含至少一个第1组ISVD和至少一个第3组ISVD ； -构建体，其包含至少一个第2组ISVD和至少一个第3组ISVD ;和 -构建体，其包含至少一个01C10-样序列和至少一个14G03-样序列。
29.根据权利要求28的构建体，其用作药物减少肿瘤生长和/或治疗癌症，优选头颈癌或 GBM。
30.核酸序列，其编码 i)根据权利要求3-22中任一项的免疫球蛋白单可变结构域； ?)根据权利要求23-27中任一项的多肽，或 iii)根据权利要求1，2，28或29中任一项的构建体。
31.药物组合物，其包括 i)根据权利要求3-22中任一项的免疫球蛋白单可变结构域； ii)根据权利要求23-27中任一项的多肽；或 iii)根据权利要求1，2，28或29中任一项的构建体； 和任选地药学可接受的赋形剂。
32.根据权利要求3-22中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，根据权利要求23-27中任一项的多肽，或根据权利要求1、2、28或29中任一项的构建体,其用于癌症、优选头颈癌，GBM和/或炎性疾病。
33.根据权利要求3-22中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，根据权利要求23-27中任一项的多肽，或根据权利要求1、2、28或29中任一项的构建体，其用在类风湿性关节炎中。
34.根据权利要求3-22中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，根据权利要求23-27中任一项的多肽，或根据权利要求1、2、28或29中任一项的构建体，其用于多发性硬化。
35.生产根据权利要求3-22中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，根据权利要求23-27中任一项的多肽，或根据权利要求1、2、28或29中任一项的构建体的方法，所述方法至少包括以下步骤: a)在适当的宿主细胞或宿主生物体中或在另一种适当的表达系统中，表达根据权利要求30的核酸或核苷酸序列；任选地接着: b)分离和/或纯化根据权利要求3-22中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，根据权利要求23-27中任一项的多肽，或根据权利要求1、2、28或29中任一项的构建体。
【文档编号】C07K16/28GK103917560SQ201280026571
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年3月28日 优先权日:2011年3月28日
【发明者】弗朗西斯·德康, 达维德·安德列·巴蒂斯特·莫桑-德塔耶, 马腾·范罗伊, 雷格留斯·勒尔, 玛丽亚·冈萨雷斯帕胡埃洛, 帕斯卡尔·热拉尔·梅谢尔, 马蒂娜·斯密特, 卡特林恩·斯托特勒斯, 菲利普·范龙帕伊, 彼得·万兰德舒特 申请人:埃博灵克斯股份有限公司