由使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白和能够形成亚单元结构的蛋白融合而得到的单体蛋 ...的制作方法
【专利摘要】一种由使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白和能够形成亚单元结构的蛋白融合而得到的单体蛋白组成的多聚体蛋白的制备方法，该制备方法包括下述步骤：步骤(A)，准备在微生物的菌体内呈不溶性颗粒形态的蛋白，该蛋白为上述单体蛋白；步骤(B)，利用含有月桂酰-L-Glu的水溶液增溶步骤(A)中准备的单体蛋白；步骤(C)，在含有精氨酸盐酸盐的缓冲液中稀释步骤(B)中得到的溶液，降低月桂酰-L-Glu的浓度；以及步骤(D)，利用凝胶过滤层析等将步骤(C)中得到的溶液的溶剂置换成缓冲液。
【专利说明】由使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白和能够形成亚单元结构的蛋白融合而得到的单体蛋白组成的多聚体蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及由使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白和能够形成亚单元结构的蛋白融合而得到的单体蛋白组成的多聚体蛋白的制备方法。
【背景技术】 [0002]治疗用抗体由于其疗效高和副作用风险小而取得了巨大成功，但因其制造成本高而引起的高药价则成为课题。该抗体的疗效局限于白血病或自身免疫疾病等较窄的疾病范围，在药物的组织转移性受到限制的固体癌症等中不太有效，这也成为课题。
[0003]自从1988年可以在大肠杆菌内制备抗体片段(非专利文献I~3)以来，组织转移性高、低分子化的修饰抗体(抗体片段)的开发持续进行。为了获得更高的抗癌效果，有多种使抗体片段与抗癌药、毒素、放射性同位素或前体药物活化酶等融合而得到的抗体融合蛋白也被提案。
[0004]但是，当天然抗体所具有的二价结合性是发挥其与靶抗原的高亲和性和优异的体内动力学的基础时，人工制作的一价抗体融合蛋白与靶抗原的结合性不及天然抗体的结合性。
[0005]因此，最近将低分子化修饰抗体或抗体融合蛋白形成多价的试验逐渐盛行(非专利文献4)。如果能够使用微生物廉价地生产抗体这样的多价分子，那么当然可以满足高功能和低药价这两个方面。
[0006]如双抗体、三链抗体或模仿免疫球蛋白M的抗体那样，已知利用抗体结构自身的缔合性来制备多价分子的方法。作为其他方法，还有通过使缔合性蛋白与抗体的片段结构融合而得到多价分子的方法。其例子有:经由与单链抗体可变区(scFv)结合的亮氨酸拉链结构等进行二聚化的方法(非专利文献5)或经由来自人p53的四聚体化a螺旋结构的方法(非专利文献6)、利用来自微生物的链霉亲和素的四聚体化的方法等。特别是，关于使链霉亲和素融合的方法，已经通过链霉亲和素的结构修饰实现了高功能化(提高稳定性和溶解性、降低免疫原性等)(非专利文献7)。融合了链霉亲和素的蛋白可以经由以高亲和性与链霉亲和素结合的生物素分子实现药物预靶向作用，因此是最受期待的多价融合蛋白之一(非专利文献7)。
[0007]其中，问题在于:使用大肠杆菌等微生物生产多价融合蛋白时，往往会在微生物的菌体内形成不溶性蛋白。在微生物的菌体内不溶性的蛋白丧失了活性或稳定性，所以为了将该蛋白作为药品等来使用，必需重新进行用于重建活性结构的重折叠操作。
[0008]Schultz等人通过想办法研究与链霉亲和素结合的scFv内的肽接头或H链与L链的配置顺序，报道了在大肠杆菌的菌体内以可溶性且活性型的方式生产的例子(非专利文献8)。但是，可知若将链霉亲和素改变成修饰型，则其在大肠杆菌的菌体内不溶(非专利文献9)。因此，在链霉亲和素融合蛋白的实用化上，认为必需进行重折叠操作。[0009]由于这样的情况，Choe等人研究了修饰型链霉亲和素融合蛋白的重折叠例子(非专利文献10)，但目标物的回收率远远低于1%，在实用化上还存在很多课题。
[0010]本发明人之前提出了使由于不溶化或丧失了高级结构而失去了活性或稳定性的蛋白(改性蛋白)恢复天然状态的高级结构的方法(重折叠方法)(专利文献I)。根据该方法，使用I~3%的预定的酰基谷氨酸表面活性剂水溶液在pH6.5~9.0下增溶已改性沉淀的蛋白，之后，使用精氨酸缓冲液将该增溶后的溶液的表面活性剂浓度降低至0.02~0.5%，从而可以有效地重建蛋白结构。
[0011]现有技术文献 专利文献
专利文献1:国际公开第2009/136568号；
非专利文献
非专利文献 1:Science, 240, 1038-1041 (1988)；
非专利文献 2:Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 85,5879-5883 (1988)；
非专利文献 3:Science, 242，423-426 (1988)；
非专利文献 4:Nature Reviews Immunology, 10 345-352 (2010)；
非专利文献 5:Biochemisry (Mosc)，31，1579-1584 (1992)；
非专利文献 6 Journal of Immunogy, 157，2989-2997 (1996)；
非专利文献 7 Journal of Controlled Release 65，203-220 (2000)；
非专利文献 8 =Cancer Research, 60，6663-6669 (2000)；
非专利文献 9:Protein Science 10，491-503 (2001)；
非专利文献 10:Bulletin of Korean Chemical Society, 30, 1101-1106 (2009)。
【发明内容】
[0012]发明所要解决的课题
如上所述，使用大肠杆菌等微生物生产多价融合蛋白时，往往会在微生物的菌体内形成不溶性蛋白， 但为了将其作为药品等来使用，必需进行用于重建活性结构的重折叠操作。
[0013]本发明的课题在于提供:即使在多价融合蛋白中，在亚单元结构中也包含免疫球蛋白折叠结构的多聚体蛋白的新的制备方法。
[0014]解决课题的方法
这次，本发明人发现:通过月桂酰-L-Glu增溶的具有免疫球蛋白折叠结构的融合蛋白，即使将月桂酰-L-Glu浓度降低至0.02~0.5%，也不会形成多聚体结构，而是稳定地继续溶解。而且，在该融合蛋白溶解于月桂酰-L-Glu溶液期间，只形成亚单元结构，接着，通过置换该溶液和特定的缓冲液，能够形成上述融合蛋白的多聚体结构。
[0015]即，通过本发明，提供由使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白与能够形成亚单元结构的蛋白融合而得到的单体蛋白组成的多聚体蛋白的制备方法，该制备方法包括下述步骤:
步骤(A)，准备在微生物的菌体内呈不溶性颗粒形态的蛋白，该蛋白为使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白与能够形成亚单元结构的其他蛋白融合而得到的单体蛋白；步骤(B)，利用含有月桂酰谷氨酸或其盐的水溶液增溶步骤(A)中准备的单体蛋白；步骤(C)，在含有精氨酸或精氨酸衍生物的缓冲液中稀释步骤(B)中得到的溶液，降低月桂酰谷氨酸或其盐的浓度；以及
步骤(D)，利用选自下述(dl)~(d4)的方法，将步骤(C)中得到的溶液的溶剂置换成缓冲液，
(dl)选自凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水性相互作用层析和它们的组合的柱层
析；
(d2)超滤法；
(d3)透析法；以及
(d4) (dl)~(d3)中的两种以上的组合。
[0016]发明效果
通过本发明，使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白与能够形成亚单元结构的其他蛋白融合，并根据该融合蛋白的性质形成多聚体结构，由此可以制备对靶抗原具有多个亲和性部位的多聚体结构的多价融合蛋白。 [0017]根据本发明，即使是使性质大为不同的两种以上的蛋白融合而得到的蛋白，也可以有效地形成多聚体结构。
[0018]根据本发明的方法，能够形成亚单元结构的蛋白不会形成多聚体蛋白，可以抑制其聚集和沉淀。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1显示实验10中纯化的HyHEL-1O scFv SA全长的还原SDS凝胶电泳的结果。
[0020]图2是显示实验10中纯化的HyHEL-1O scFv SA全长的凝胶过滤HPLC图形(225nm下的紫外部吸收)的图。
[0021]图3显示实验11中纯化的Dl.3 scFv SA全长的还原SDS凝胶电泳的结果。
[0022]图4是显示实验11中纯化的Dl.3 scFv SA全长的凝胶过滤HPLC图形(225nm下的紫外吸收)的图。
[0023]图5是显示实验12中纯化的HyHEL-1O scFv SAcore多聚体蛋白的凝胶过滤HPLC图形(柱=Superdex 10/300 GL ;展开溶剂:0.1M磷酸钠、0.2M精氨酸盐酸盐、pH6.8 ;流速为0.8ml/分钟；检测:280nm下的紫外吸收)的图。在峰的后方看到的次要成分推测是HyHEL-1O scFv SAcore多聚体蛋白的分解物。
[0024]图6是显示实验12中纯化的HyHEL-1O scFv SAcore多聚体蛋白的场流分级法图形(交叉流:2.7ml/分钟；槽流:1.5ml/分钟；展开溶剂:0.1M磷酸钠、pH6.8 ;225nm下的紫外吸收)的图。分子量利用多角度光散射装置和Zi_ plot法算出。在峰的前方看到的次要成分推测是HyHEL-1O scFv SAcore多聚体蛋白的分解物。
[0025]图7是显示实验12中纯化的HyHEL-1O scFv SAcore多聚体蛋白的阴离子交换HPLC 图形(柱 RESOURCE QUml ;流速:0.5ml/分钟;展开溶剂:20mM Tris-盐酸盐、pH8.0 ；洗脱方法:0~0.5M NaCl线性浓度梯度洗脱法、20分钟；检测:280nm下的紫外吸收)的图。在峰的前方、后方看到的次要成分推测是HyHEL-1O scFv SAcore多聚体蛋白的分解物。
[0026]图8是显示实验12中纯化的HyHEL-1O scFv SAcore多聚体蛋白的鸡卵清溶菌酶活性抑制率的图。将溶菌酶和HyHEL-1O scFv SAcore多聚体蛋白以图中所示的比率进行混合，加入到作为溶菌酶底物的微生物悬浮液中，由其吸光度的变化率评价残留的溶菌酶活性，求出相对于未添加HyHEL-1O scFv SAcore多聚体蛋白时的溶菌酶活性的抑制率(%)。
[0027]图9是通过SDS-PAGE (非还原)分析实验13中实施的HyHEL-10 scFv SAcore多聚体蛋白的重折叠步骤的图。泳道1:提取步骤；泳道2:利用稀释缓冲液进行的50倍稀释阶段；泳道3:置换成含有精氨酸盐酸盐的缓冲液的阶段；泳道4:利用阴离子交换柱进行的纯化阶段；泳道5:实验12中得到的纯化HyHEL-10 scFv SAcore多聚体蛋白，粗箭头(—)显示四聚体的谱带，细箭头(一)显示单体的谱带。
【具体实施方式】
[0028]〔定义〕 在本说明书中，“免疫球蛋白折叠结构”是指，通过以二硫键结合的两个P结构平面构成的稳定的结构域结构，通过在其表面提示的环结构，能够形成与特定的分子强力结合的亲和性分子。还称作免疫球蛋白折叠(immunoglobulin fold)。分子细胞生物学,第3版，1227页，东京化学同人，1997年。
[0029]在本说明书中，“亚单元结构”是指，通过非共价键集合而形成稳定的多聚体结构的蛋白的、其中的一个结构单元。分子细胞生物学，第3版，51页，东京化学同人，1997年。
[0030]在本说明书中，“多聚体结构(多聚体蛋白)”是指，作为其构成成分的亚单元结构经由非共价键集合而形成的高级的层次结构，通常亚单元结构的配置是规则的、对称的。分子细胞生物学，第3版，51页，东京化学同人，1997年。有时将具有多聚体结构的蛋白称作多聚体蛋白。另外，有时将形成多聚体结构的构成成分称作单体蛋白。
[0031]〔步骤(A):蛋白的准备〕
本发明中的构成多聚体蛋白的单体蛋白是使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白与能够形成亚单元结构的其他蛋白融合而得到的单体蛋白。根据该其他的蛋白所具有的自身集合性?自身结合性的性质，可以形成多聚体结构，可以制备与靶抗原具有多个亲和性部位的多聚体结构的多价融合蛋白。
[0032]作为具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白，可以列举:抗鸡溶菌酶抗体(例如HyHEL_10、Dl.3)、抗 TNF a 抗体(英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、戈利木单抗(goIimumab))、抗HER2抗体(曲妥珠单抗(trastuzumab))、抗CD20抗体(利妥昔单抗(rituximab))、抗VEGF抗体(贝伐珠单抗(bevacizumab))、抗EGFR抗体(西妥昔单抗(cetuximab)、中白尼单抗(panitumumab))等。
[0033]作为能够形成亚单元结构的其他蛋白，可以列举:链霉亲和素、来自人P53的四聚体化a螺旋结构、亮氨酸拉链结构、或它们的功能性片段等。需要说明的是，在本说明书中，功能性片段是指能够形成亚单元结构的蛋白片段，例如可以列举核心序列型链霉亲和素。
[0034]作为本发明中使用的单体蛋白，具体而言，可以列举scFv与链霉亲和素的融合蛋白等。更具体而言，可以列举:HyHEL-10 scFv与链霉亲和素的融合蛋白、Dl.3 scFv与链霉亲和素的融合蛋白或HyHEL-10 scFv与核心序列型链霉亲和素的融合蛋白等。
[0035]本发明中使用的单体蛋白在微生物的菌体内呈不溶性颗粒的形态。以后，只称呼“单体多聚体蛋白”时，还包括在微生物的菌体内意图不溶性颗粒的形态的单体蛋白的情形，该单体蛋白是指使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白与能够形成亚单元结构的其他蛋白融合而得到的蛋白。
[0036]本发明中使用的单体蛋白，可以利用本领域公知的方法、例如Ueda等人，Gene.1993, 129, 129-34.Lin, Y.等人，Cancer Res.2006, 66, 3884-3892.或Fischmann,T.0.等人，J.Biol.Chem.1991，266，12915-12920.Lin, Y.等人，Cancer Res.2006，66，3884-3892.中记载的方法，构建目标单体蛋白的生产系统，接着利用常规方法进行培养、集菌，由此即可制得。
[0037]〔步骤⑶:单体蛋白的增溶〕
*表面活性剂的种类
在本发明中，用于增溶单体蛋白的表面活性剂为月桂酰谷氨酸(月桂酰-Glu)或其盐。月桂酸_Glu可以是D体、L体、DL体中的任一种。优选月桂酸-L_Glu。
[0038]*表面活性剂的浓度
月桂酰-Glu或其盐优选制成I~10%的水溶液，更优选制成I~8%的水溶液。当为上述浓度范围时，可以充分提高单体蛋白的增溶效率，同时可以适度限制作为之后的操作的稀释的倍率。
[0039]* pH
关于该水溶液在25°C下的pH，根据单体蛋白的性质，可以选择优选pH6.5~9.0、更优选？117.0~8.8的温和条件。需要说明的是，在本发明中，pH可以利用安装有pH电极的pH计来测定。PH的调节可以使用氢氧化钠等碱来进行。可以使用缓冲液作为该水溶液。
[0040]*温度和时间
利用如此操作制备的月桂酰-Glu水溶液，得到增溶单体蛋白的溶液。可以向月桂酰-Glu水溶液中添加单体蛋白，也可以向单体蛋白中添加月桂酰-Glu水溶液。
[0041]之后，通常可以在5~40°C下、优选15~40°C下放置。当为上述范围时，由化学反应引起的单体蛋白的切断或氧化等修饰被抑制在最小限度，因此优选。
[0042]放置时间通常为10分钟~3小时,优选为10分钟~I小时。当为上述范围时，由化学反应引起的单体蛋白的切断或氧化等修饰被抑制在最小限度，因此优选。可以在接触过程中进行搅拌。
[0043]蛋白是否被增溶，这可以通过例如目视的浊度判定、或者280nm等的紫外吸收光谱法等来确认。
[0044]〔步骤(C):利用精氨酸缓冲液进行的稀释〕
*稀释倍率
接着，将步骤(B)中得到的增溶了单体蛋白的溶液，以数10倍~150倍左右的稀释倍率稀释在包含精氨酸或精氨酸衍生物作为添加剂的缓冲液中，直至单体蛋白恢复天然状态的高级结构，并维持不变。稀释后的月桂酰-Glu的浓度优选达到0.01~0.5%，进一步优选达到0.02~0.3%。稀释可以按照I段、多段(分级梯度)或线性梯度来适当选择进行。
[0045]当为上述范围时，天然状态的高级结构恢复得到促进，还可确保单体蛋白的稳定性，因此优选。单体蛋白是否恢复了天然状态的高级结构，这可以通过CD光谱或荧光光谱等分光测定、或观察HPLC等蛋白的理化特性的方法、或者酶活性等的高级结构指标来确认。
[0046]添加剂的种类
用作添加剂的精氨酸可以是L型也可以是D型。可以是盐酸盐等与无机酸形成的盐、或者是乙酸盐等与有机酸形成的盐。
[0047]作为精氨酸衍生物，可以列举:乙酰精氨酸、N- 丁酰精氨酸等具有碳原子数I~6的酰基的精氨酸；除去了羧基的精胺；导入了羟基以代替a氨基的精氨酸等。作为精氨酸衍生物，优选酰基化精氨酸，更优选N- 丁酰精氨酸。
[0048]作为添加剂，最优选精氨酸盐酸盐。
[0049] pH
作为缓冲液，可以使用磷酸钠、枸橼酸钠、Tris-盐酸盐等。pH只要是与恢复天然状态的蛋白的性质相符的pH即可，稳定在大约pH6.5~9.0的中性pH。因此，步骤(C)中的pH只要处于该范围即可，可以不同于步骤(B)中的pH。pH的调节例如可以使用盐酸或氢氧化钠等来进行。
[0050]添加剂浓度
添加剂浓度根据恢复天然状态的蛋白的性质分别选择，但稀释后的添加剂浓度优选调整成0.1~1.5M，进一步优选调节成0.2~1.2M。当为上述范围时，天然状态的高级结构恢复得到促进，因此优选。
[0051]稀释温度?保持时间
稀释可以在室温下实施，当目标蛋白恢复天然状态时的热稳定性不够高时，可以在5~10°C下实施。温度调节可以按照I段、多段(分级梯度)或线性梯度适当选择进行。
[0052]稀释后，可以保持数小时~数天。优选保持I小时~5天，更优选保持1.5小时~3天，进一步优选保持2小时~24小时。可以逐步稀释。
[0053]分成几个阶段来进行稀释时，在最终阶段的稀释后，只取抵消稀释倍率的份量，例如利用超滤膜进行浓缩，从而将最终阶段的稀释后的蛋白浓度保持在0.01~1.0mg/ml、优选0.01~0.5mg/ml,当目标蛋白包含Fab时,促进构成Fab的重链与轻链的二硫键形成。
[0054]〔步骤⑶:与缓冲液进行置换〕
将步骤(C)中得到的溶液的溶剂与缓冲液进行置换。由此，从系统中除去月桂酰-Glu。
[0055]利用缓冲液进行的置换采用选自下述(dl)~(d4)的方法来进行，其中，优选(dl)的柱层析，更优选凝胶过滤层析:
(dl)选自凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水性相互作用层析和它们的组合的柱层
析；
(d2)超滤法；
(d3)透析法；以及
(d4) (dl)~(d3)中的两种以上的组合。
[0056]上述操作方法是本领域中使用的惯用方法，本领域技术人员可以适当选择?确定操作条件。
[0057]本发明中使用的缓冲液是pH缓冲液，例如可以使用:在三(羟甲基)氨基甲烷等弱碱性溶液中加入有计算量的强酸(例如盐酸、硫酸、甲酸等)的缓冲液、或者在磷酸等弱酸性溶液中加入有计算量的强碱(例如氢氧化钠或氢氧化锂等)稀溶液的缓冲液。[0058]缓冲液中可以含有精氨酸或精氨酸衍生物，也可以含有NaCl等无机盐或EDTA等螯合剂。此时的浓度例如为0.001~1.2M。
[0059]缓冲液的pH优选为6~9。
[0060]利用本发明的方法，单体蛋白是否形成了多聚体蛋白，这可以通过紫外吸收、静态光散射法等来确认。
[0061]〔任意步骤⑴:用添加剂溶液进行稀释前的放置〕
根据蛋白，在用精氨酸或精氨酸衍生物缓冲液进行稀释前，可以添加磷酸缓冲溶液等，并进行放置。具体而言，在上述步骤⑶与步骤(C)之间添加磷酸缓冲液，使表面活性剂浓度达到2~5%，之后，优选在5~40°C下优选放置10分钟~I小时，由此可以提高单体蛋白的提取率，可以进一步提闻溶解度。其结果，可以进一步提闻蛋白的闻级结构的恢复率。此时得到的溶液在25°C下的pH只要处于pH6.5~9.0的范围即可。
[0062]〔任意步骤(ii):二硫键的形成〕
根据蛋白，在单一的分子内有时具有二硫键。使蛋白进行氧化还原反应以促进这些二硫键的形成时，重折置率进一步提闻，因此优选。
[0063]氧化还原反应可以通过共存用于促进硫醇? 二硫化物交换反应以形成分子内或分子间的二硫键的氧化还原物质(例如氧化型谷胱甘肽(GSSG)与还原型谷胱甘肽(GSH)的混合物、或胱氨酸与半胱氨酸的混合物、或胱胺与半胱胺的混合物、或氧化型谷胱甘肽或胱氨酸与巯基乙醇的混合物等))、或用于促进空气氧化的铜离子来进行，也可以通过改变蛋白的氧化还原电位来进行。优选使用氧化还原物质。
[0064]氧化还原反应只要`在上述步骤(B)以后进行即可，例如可以通过在上述步骤(C)中将氧化还原物质和添加剂一同添加到步骤(A)中得到的溶液中来进行，也可以通过在上述步骤(C)中在得到稀释液后向该稀释液中添加氧化还原物质来进行。
[0065]对于每一种恢复天然状态的蛋白，氧化还原物质或铜离子的浓度都调整至适当的浓度。
[0066]此时的25°C下的pH只要处于pH6.5~9.0的范围即可。pH的调节例如可以使用
盐酸或氢氧化钠等来进行。
[0067]液温可以和步骤⑶中得到的溶液的温度为相同程度，也可以和步骤(C)中得到的溶液的温度为相同程度。为了促进氧化还原反应，优选5~48°C左右。
[0068]氧化还原反应后，可以在5~48°C下放置I小时~5天(120小时)左右。
[0069]根据本发明的方法，重折叠率至少为10%，往往会达到30%。
[0070]〔任意步骤(iii):纯化〕
恢复了高级结构的蛋白，可以通过常规方法、例如超滤、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水性相互作用层析、反向层析、亲和层析等进行纯化。
[0071]在本发明人的之前的申请(国际公开第2009-136568号)中报道了:使用I~3%的预定的酰基谷氨酸表面活性剂在PH6.5~9.0下增溶改性蛋白，之后，使用精氨酸缓冲液进行稀释，使表面活性剂浓度降低至0.02~0.5%，由此可以有效地重建蛋白结构。
[0072]虽然多聚体蛋白具有通过非共价键缔合的若干个亚单元，但即使使用预定的酰基谷氨酸表面活性剂(月桂酰-L-Glu)在预定pH下增溶多聚体蛋白，之后仅凭用精氨酸缓冲液进行稀释，也无法结束重折叠。虽然不拘泥于任何的理论，但推测是亚单元间的缔合被月桂酸_L-Glu抑制。
[0073]本发明有悖于此，虽然不拘泥于任何的理论，但本发明推测如下:通过用月桂酰-L-Glu抑制亚单元间的缔合，起初只是促进亚单元的结构形成，之后用缓冲液置换认为是抑制缔合的因子的月桂酰-L-Glu而将其除去，其结果，引起亚单元之间的缔合，结束重折叠。
[0074]使用如此操作而制备的多聚体蛋白，可以得到癌症、免疫疾病、生活习惯病等各种疾病的治疗药、临床检查用试剂、研究用试剂等。这些药物组合物除了含有通过本发明的方法得到的多聚体蛋白外，还可以含有赋形剂或载体等。
实施例
[0075]〔参考例I〕
包含HyHEL-10 scFv SA全长的不溶性颗粒的沉淀物的制备
构建以大肠杆菌BL21株(DE3)为生产宿主的、单链抗体可变区(HyHEL-10 scFv)与全长型链霉亲和素(SA全长)的融合蛋白(HyHEL-10 scFv SA全长)的生产系统(Ueda等人，Gene.1993，129，129-34.Lin, Y.等人，Cancer Res.2006，66，3884-3892.)。
[0076]按照常规方法，使用带有挡板的三角烧瓶，将所构建的生产菌在2XYT培养基中、在28°C下振荡培养18小时(4L)，使HyHEL-10 scFv SA全长在大肠杆菌的菌体内以不溶性颗粒的形式蓄积。收集其菌体，悬浮于20mM Tris-盐酸盐、0.5M NaCl、pH8.1中，进行超声波破碎。将得到的悬浮液在6000g、30分钟的条件下进行离心分离，回收包含HyHEL-10 scFvSA全长不溶性颗粒的沉淀物。
[0077]回收的沉淀物依次用2%的Triton X-100水溶液、丙酮进行清洗。之后，用纯净水(^ ') Q水)清洗，完全除去Triton X-100。再次在上述条件下进行离心分离操作，得到包含不溶性颗粒的沉淀物。
[0078]将得到的每IOOmg的沉淀物分到4支Eppendorf离心管中。将各管称作管I~4。
[0079]需要说明的是，在本说明书中，只要没有特别说明，则单位“％”是指“质量％”。
[0080]〔参考例2〕
包含Dl.3 scFv SA全长的不溶性颗粒的沉淀物的制备
在参考例I中，除了使用Dl.3 scFv作为单链抗体可变区来代替HyHEL-10 scFv,构建其与全长型链霉亲和素(SA全长)的融合蛋白(D1.3 scFv SA全长)的生产系统(Fischmann, T.0.等人，J.Biol.Chem.1991，266，12915-12920.Lin, Y.等人，Cancer Res.2006, 66，3884-3892.)以外，进行与参考例I相同的操作，得到包含Dl.3scFv SA全长的不溶性颗粒的沉淀物。
[0081]〔实验1〕
(I)制备5%的月桂酰-L-Glu溶液(20mM磷酸钠、pH8.5)。
[0082](2)将该溶液中的0.2ml加入到管I中、0.25ml加入到管2中、0.3ml加入到管3中、0.35ml加入到管4中,增溶管中的沉淀物。将管I~4在室温下涡旋后,轻轻地进行离心分离(10000rpm、l分钟)，消去所产生的泡。
[0083](3)向各管中加入20mM的磷酸钠(pH7)，定容至0.5ml，将管I~4的最终的月桂酰-L-Glu浓度分别调整至2.0%、2.5%、3.0%、3.5%。使用微小pH电极将管内的pH调节至7.3左右，之后在37°C下加热30分钟，从沉淀物中提取不溶性颗粒，使其溶解。需要说明的是，在本说明书中，只要没有特别说明，则在25°C下测定pH。
[0084](4)将得到的各溶液转移到另外的Eppendorf离心管中，在14000rpm(18700 Xg)下离心分离10分钟，回收上清I~4。
[0085](5)作为稀释用溶液，制备0.404M的精氨酸盐酸盐溶液(ImM EDTA、80mM Tris-盐酸盐、pH7.2)。
[0086](6)使用7.425ml的该稀释用溶液，在5 °C下稀释之前回收的各0.075ml的上清I~4，最终分别调整成0.1%的月桂酰-L-Glu、0.4M的精氨酸盐酸盐(ImM EDTA、80mMTris-盐酸盐、pH7.2、7.5ml)。蛋白浓度调整至0.05mg/ml。
[0087](7)已稀释的上清I~4在5°C下保持18小时，之后用离心分离型超滤膜(AmiconUltra 15、分子量截留IOkDa ;MiIIipore制)浓缩3倍，调整至2.5ml。
[0088](8)将各2.5ml的3倍浓缩液负载到用缓冲液(50mM Tris-盐酸盐、0.2M NaCl,ImM EDTA、pH7.2)事先平衡好的凝胶过滤用柱(PD-10柱、GE Healthcare制)上，接着，用
3.0ml相同的缓冲液展开，回收全量的浓缩液。由此，用缓冲液置换柱内的浓缩液。
[0089](9)将这些浓缩液在5°C下保持18小时后，在14000rpm(18700Xg)下离心分离10分钟。将 30//L 该上清供给凝胶过滤 HPLC (柱:Superdex 200 10/300 GL, GE Healthcare制；展开液:0.1M磷酸钠、0.8M精氨酸盐酸盐、pH6.8 ;检测方法:225nm的紫外吸收；定量用标准品:纯化抗血管性血友病因子单克隆抗体(W096/17078))，定量已形成四聚体结构的HyHEL-10 scFv SA全长。结果见表1。
[0090][表 I]
【权利要求】
1.多聚体蛋白的制备方法，所述多聚体蛋白是由使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白和能够形成亚单元结构的蛋白或其功能性片段融合而得到的单体蛋白组成的，该制备方法包括下述步骤: 步骤(A)，准备在微生物的菌体内呈不溶性颗粒形态的蛋白，该蛋白为使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白与能够形成亚单元结构的其他蛋白融合而得到的单体蛋白； 步骤(B)，利用含有月桂酰谷氨酸或其盐的水溶液增溶步骤(A)中准备的单体蛋白；步骤(C)，在含有精氨酸或精氨酸衍生物的缓冲液中稀释步骤(B)中得到的溶液，降低月桂酰谷氨酸或其盐的浓度；以及 步骤(D)，利用选自下述(dl)~(d4)的方法，将步骤(C)中得到的溶液的溶剂置换成缓冲液， (dl)选自凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水性相互作用层析和它们的组合的柱层析； (d2)超滤法； (d3)透析法；以及 (d4) (dl)~(d3)中的两种以上的组合。
2.权利要求1所述的方法，其中，单体蛋白为scFv与链霉亲和素的融合蛋白。
3.权利要求2所述的方法，其中，上述scFv选自HyHEL-1OscFv和Dl.3 ScFv0
4.权利要求2或3所述的`方法，其中，链霉亲和素为全长链霉亲和素或其功能性片段。
5.权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，精氨酸或精氨酸衍生物选自具有碳原子数I~6的酰基的精氨酸、精氨酸丁酯、精胺和精氨酸。
6.权利要求1~5中任一项所述的方法，其中，精氨酸或精氨酸衍生物为精氨酸盐酸盐。
【文档编号】C07K19/00GK103608463SQ201280030917
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2012年6月25日 优先权日:2011年6月23日
【发明者】江岛大辅, 佐藤春奈, 津本浩平, 伊达雅代 申请人:味之素株式会社