结合域-免疫球蛋白融合蛋白的制作方法

专利名称：结合域-免疫球蛋白融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及具有免疫学活性的重组结合蛋白，具体涉及分子工 程化的结合域—免疫球蛋白融合蛋白，包括单链Fv-免疫球蛋白融合蛋 白，本发明也涉及用于治疗恶性状况和B细胞疾病，包括特征在于自 身抗体产生的疾病的组合物和方法.
背景技术：
免疫球蛋白分子由两条相同的轻链和两条相同的重链组成，它们通 过链间二疏键连接成大分子复合物.链内二疏鍵连接相同多肽链的不 同区域，这导致形成环，该环与邻近的氛基酸构成免疫球蛋白结构域. 每条轻链和每条重链具有单个可变区，该区表现出抗体之间氨基酸组 成的很大变异.轻链可变区VL与重链可变区Vh締合，形成免疫球蛋 白的抗原结合位点Fv.轻链具有单个恒定区结构域，重链有几个恒定 区结构域.IgG IgA和IgD具有三个恒定区结构域，称为CH1， CH2 和CH3， IgM和lgE具有四个恒定区结构域.
免疫球蛋白重链可以分为三个功能区Fd、铰链区和Fc, Fd区包 含VH和CH1结构域，与轻链一起形成Fab. Fc片段一般认为负责免 疫球蛋白的效应物功能，例如，补体固定和结合与Fc受体.在IgGj IgA 和IgD中发现的铰链区作为柔性的间隔基，允许Fab部分在空间中自 由移动.与恒定区相反，铰链区结构域结构多样，各类和亚类的免疫 球蛋白之间序列和长度都有变化.例如，人类IgG的三种亚类，IgGl， IgG2和IgG4具有12 — 15个氛基酸的铰链区，而IgG3含有约62个氨 基酸，包括21个脯氨酸残基和11个半胱氨酸残基.根据结晶学研究， 铰链区可进一步根据功能细分为三个区上铰链区、核心和下铰链区 (Shin et al.， Immunological Reviews 130: 87 (1992)).上铰链区包含CH1的羧基端的氨基酸至限制运动的铰链区的笫一个残基， 一般是第 一个半胱氨酸残基，它在两条重链之间形成链间二破鍵.上铰链区的 长度与抗体的片段柔性相关.核心铰链区含有重链间二疏键，下铰链
区连接CH2结构域的氨基末端并且包含CH2中的残基.(Id.)人IgG 的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，当形成而二硫鍵时，该序列 形成一个环状八肽，人们认为该八肽作为一个轴，由此赋予柔性.铰 链区也可以含有碳水化合物附着位点.例如，IgAl在铰链区的一个17 氨基酸的片段中含有S个碳水化合物位点，它们赋予了铰链区对肠蛋 白酵的例外抗性，这被认为是分泌性免疫球蛋白的有利特征.
铰链区的结构和柔性所允许的构象改变可以影响抗体的Fc部分的 效应物功能.与Fc区相关的效应物功能的三个大类包括(1)激活经 典的补体级联，(2)与效应分子相互作用和(3)免疫球蛋白的区室化. 不同的人IgG亚类在其激活和扩增补体刑量的步驟的相对效力方面有 所不同. 一般说来，IgGl和IgG3最有效固定补体，IgG2效力较低， 而IgG4不激活补体，补体激活是由Clq与抗原抗体复合物的结合起 始的，Clq是级联中的笫一个成分Cl的一个亚基.尽管Clq的结合 位点位于抗体的CH2结构域，铰链区影响抗体激活級联的能力.例如， 缺乏铰链区的重组免疫球蛋白不能激活补体,(W.)如果没有铰链区所赋 予的柔性，与抗原结合的抗体的Fab部分可能不能采用允许Clq与 CH2结合所需的构象.(见id.)研究表明，铰链区长度和片段柔性与补 体激活相关；然而，该相关不是绝对的.具有与IgG4相同的刚性的改 变的铰链区的人IgG3分子仍然有效激活该级联.
铰链区的缺乏也影响人IgG免疫球蛋白结合免疫效应细胞上的Fc 受体的能力.免疫球蛋白与Fc受体的结合促进抗体依赖性细胞毒性 (ADCC),它被推定为消除肿瘤细胞的重要方式，人IgG Fc受体家族 被分为三组，即，能够结合具有高亲和性的IgG的FcyRI(CD64)、都 是低亲和性受体的FcyRII (CD32)和FcyRHI (CD16).三种受体的每一 种和免疫球蛋白之间的分子相互作用还没有精确确定，但实验表明， CH2结构域的铰链近端区中的残基对抗体和Fc受体之间的相互作用 的特异性是重要的.此外，IgGl骨拔瘤蛋白和缺乏铰链区的重組IgG3 嵌合抗体不能结合FcyRI,很可能是因为对CH2的可接近性减少(Shin et al.， Intern. Rev. Immunol. 10: 177,178-79 (1993)).
7单克隆抗体技术和基因工程方法导致了用于诊断和治疗人疾病的 免疫球蛋白分子的迅速开发.已经应用了蛋白工程改进抗体与其关联 抗原的亲和性，以减少与免疫原性相关的问趙，并且改变抗体的效应 物功能.免疫球蛋白的域结构容易顺应工程化，这是由于抗原结合域 和赋予效应物功能的结构域可以在免疫球蛋白种类和亚类之间交换.
此外，构建了较小的免疫球蛋白分子，以克服与完整的免疫球蛋白
的治疗相关的问题.单链Fv(scFv)包含通过短的接头肽与轻链可变区 连接的重链可变区(Huston et al. Proc. Natl, Acad. Sci. USA， 85: 5879-83,1988),由于scFv分子较小，它们表现出4艮快从血浆和组织清 除，并且比完整免疫球蛋白更有效穿透到組织中.抗肺瘤scFv表现出 与相应嵌合抗体更迅速的肿瘤穿透和在肿瘤团块中更平均的分布 (Yokota et al.， Cancer Res. 52,3402-08 (1992)). ScFv与另 一种分子，如 毒素的融合利用了特异性的抗原结合活性和scFv的小尺寸而将毒素递 送到把組织(Chaudary et al" Nature 339 : 394 (1989); Batra et al" Mol. Cell. Biol. 11: 2200 (1991)),
尽管scFv分子的优点实现了血清疗法，该治疗方法仍存在一些缺 陷.尽管scFv的迅速清除可以减少在正常细胞中的毒性作用，这种迅 速清除可能阻碍向靶组织递送最小的有效刑量.由于不利影响产量的 表达和分离的困难，制备足重的用于给予患者的scFv是具有挑战性的， 在表达过程中，scFv分子缺乏稳定性并且由于不同分子的可变区的配 对而经常聚集，此外，哺乳动物表达系统中的scFv分子的产量水平低， 因此限制了有效制备用于治疗的scFv分子的可能性(Davis et al， J Biol. Chem. 265: 10410-18 (1990); Traunecker et al" EMBO J 10: 3655-59 (1991)).已经探索了改进产量水平的策略，包括向可变区添加糖基化 位点(Jost， C. R. US Patent # 5,888,773， Jost et al， J, Biol. Chem. 269: 26267-73 (1994)).
毒素与scFV的偶联或融合提供了非常强效的分子，但由于毒素分 子的毒性，给药是有限的.毒性作用包括升高肝醉和血管渗漏综合征. 此外，免疫毒素是高度免疫原性的，并且抗毒素的宿主抗体限制了其 用于重复治疗的可能性.
使用scFv进行治疗的其它缺点是缺乏效应物功能.与免疫球蛋白 恒定区缔合的，没有细胞毒性功能、ADCC和补体依赖性细胞毒性(CDC)的scFv可能对于治疗疾病是无效的.尽管scFv的开发技术 已经开始了12年多，目前还没有scFv被批准用于治疗.
对疾病治疗的抗体恒定区相关效应物功能促进了融合蛋白的开发， 其中用非免疫球蛋白序列取代了抗体可变区.例如，由HIV识別的T 细胞表面蛋白CD4被重组融合于免疫球蛋白Fc效应物结构域(见 Sensel et al" Chem, Immunol. 65: 129158 (1997) ) 这种分子的生物学 活性将部分依赖于所选择的恒定区的类或亚类.IL-2-IgGl融合蛋白实 现了补体介导的具有IL-2受体的细胞的裂解(见id.).用免疫球蛋白 恒定区构建这些和其它融合蛋白也可以賦予改进的药代动力学特征.
认为容易顺应于一些类型的免疫球蛋白治疗的疾病和紊乱包括癌 症和免疫系统紊乱.癌症包括宽范闺的疾病，影响全世界大约四分之 一的个体，恶性细胞的迅速和得到上调的增殖是许多癌症，包括血液 系统恶性肺瘤的特点.在过去的20年中，具有血液系统恶性状况的患 者从癌症治疗的进展得到了最多的益处(Multani et al.， J. Clin. Oncology 16: 3691-3710,1998).尽管緩解率增加，大多数患者仍然复发 并且难以治愈其疾病.用细胞毒性药物治疗的陣碍包括肿瘤细胞抗性 和化疗的高毒性，这阻碍了许多患者的最佳给药.基于导向于特异性 结合恶性细胞的分子，包括单克隆抗体(mAbs)的新治疗可以改进有效 性而不增加毒性.
由于首先在1975年记栽了单克隆抗体(Kohler et al.， Nature 256: 49597 (1975)),已经用胂瘤细胞上表达的单克隆抗体治疗了许多患者.
这些研究产生了关于选择适于治疗的靶抗原的重要经验.首先，也是 最重要的，关鍵的正常组织不应该表达靶抗原.幸运的是，血液系统 恶性细胞表达许多在干细胞或其它关鍵细胞上不表达的抗原.减少了 正常和血液系统来源的恶性细胞的血液系统恶性状况的治疗已经被接 受，因为在治疗结束后发生了从祖细胞再生正常细胞.其次，靶抗原 应该在所有克隆发生的肿瘤细胞群上都表达，并且尽管存在来自于免 疫球蛋白治疗的选择压力，该表达应该持续.因此，尽管抗原表现出 高度的肿瘤选择性，具有改变的独特型表达的肿瘤细胞变体的生长限 制了用于治疗B细胞恶性肿瘤的表面独特型的选择(Meeker et al" N. Engl. J Med. 312: 1658-65 (1985)).笫三，所选择的抗原在与免疫球蛋 白结合后必须适当运输.免疫球蛋白结合抗原后靶抗原的脱落或内化
9可以允许肿瘤细胞逃脱破坏，从而限制血清疗法的有效性.笫四，免 疫球蛋白与传送激活信号的靶抗原的结合可以导致肿瘤细胞中的功能 性应答，从而导致生长停滞和凋亡.尽管所有的这些特征都是重要的， 免疫球蛋白结合抗原后凋亡的引发可能是达到成功的血清疗法的关鍵 因素.
已经验证作为B和T细胞恶性胂瘤的血清疗法的靶点的抗原包括 Ig独特型(Brown et al" Blood 73: 651-61 (1989))， CD19 (Hekman et al" Cancer Immunol. Immunother, 32: 364-72 (1991); Vlasveld et al" Cancer Immunol. Immunother. 40: 37-47 (1995))， CD20 (Press et al" Blood 69: 584-91 (1987) ; Maloney et al" J ; Clin, Oncol, 15: 3266-74， (1997))， CD21 (Scheinberg et. al" J Clin. Oncol. 8: 792-803， (1990))， CD5 (Dillmaii et. al" J Biol. Respn. Mod. 5: 394-410 (1986))，和CD52 (CAMPATH) (Pawson et al.， J Clin. Oncol. 15: 2667-72， (1997)).其中， 用CD20作为B细胞淋巴瘤的治疗把获得了最大的成功.其它把的每 一种受到了抗原的生物学特征的限制.例如，通过体细胞突变可以改 变表面独特型，允许肿瘤细胞逃脱.在单克隆抗体结合后，CD5，CD21 和CD19被迅速内化，允许肿瘤细胞逃脱破坏，除非单克隆抗体与毒 素分子偶联.CD22仅在B细胞淋巴瘤的一个亚型上表达，而CD52在 T细胞和B细胞上都表达，并且由T细胞减少产生免疫抑制.
CD20实现了上述为治疗B细胞恶性状况而选择适当的靶抗原的基 本标准.用嵌合CD20单克隆抗体在许多患者中诱导了部分或完全的 反应(McLaughlin et al， Blood 88: 90a (abstract, suppl. 1) (1996); Maloney et al， Blood 90: 2188-95 (1997)).然而，在6个月到1年内通 常发生胂瘤复发.因此，需要进一步改进血清疗法以诱导低分級B细 胞淋巴瘤的更持续反应，并且允许有效治疗高分级淋巴瘤和其它B细 胞疾病.
改进CD20血清疗法的一种方法是用CD20的特异性单克隆抗体将 放射性同位素导向于B细胞淋巴瘤.尽管治疗的有效性增加，与放射 性抗体的长体内半衰期相关的毒性也增加，有时要求患者进行干细胞 拯救(Press et al" N. Eng. J Med. 329: 1219-1224， 1993 ; Kaminski et al.， N. Eng. J Med. 329: 459-65 (1993)).用蛋白酶切割了 CD20的单克 隆抗体以便在连接于放射性同位素之前产生F(ab，)2或Fab片段.这改进了放射性同位素偶联物穿透进入肿瘤，并且缩短了体内半表期，从
而减少了对正常组织的毒性.然而，CD20单克隆抗体的Fc区提供的 效应物功能，包括补体固定和ADCC的优点却丧失.因此，为改进放 射性同位素的递送，需要一种策略来制备保留了 Fc依赖性效应物功能， 但尺寸更小的CD20单克隆抗体衍生物，从而增加肿瘤穿透并缩短单 克隆抗体半衰期.
CD20是第一个由单克隆抗体鉴定的人B细胞系特异性表面分子， 但CD20在B细胞生物学中的功能仍然没有完全了解.CD20是非糖基 化的，疏水的35Kda的磷酸蛋白，具有在细胞质中的氨基和羧基端 (Einfeld et al， EMBO J. 7: 711-17 (1988)).还没有鉴定CD20的天然配 体.CD20由所有正常的成熟B细胞，但前体B细胞不表达.
CD20单克隆抗体向正常B细胞递送影响存活力和生长的信号 (Clark et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494-98 (1986)).最近的数 据表明，CD20的广泛交联可以诱导B淋巴瘤细胞系的凋亡(Shan et al.， Blood 91: 1644-52 (1998)).细胞表面的CD20的交联增加信号传导的 强度和动力学，这是通过测量酪氨酸残基上的细胞底物的磷酸化而检 测的(Deansetal" J. Immunol. 146: 846-53 (1993)).重要的是，通过加 入Fc受体阳性细胞而交联CD20单克隆抗体也诱导Ramos淋巴瘤细 胞的凋亡(Shanetal.， Blood 91: 1644-52 (1998)).因此，除了通过补体 和ADCC机制减少细胞，Fc受体与CD20单克隆抗体的体内结合可以 通过CD20交联而促进恶性B细胞的凋亡.这一理论与表明SCID小 鼠模型中人淋巴瘤的CD20治疗有效性依赖于CD20单克隆抗体对Fc 受体的结合的实验相一致(Funakoshi et al" J. Immunotherapy 19: 93-101 (1996)).
CD20多肽含有4个跨膜结构域(Einfeld et al.， EMBO J 7: 711-17， (1988); Stamenkovic et al" J. Exp. Med. 167: 1975-80 (1988); Tedder et. al.， J Immunol. 141: 4388-4394(1988)).多个跨膜结构域防止了抗体结 合后的CD20内化.CD20的该特性被识別为当给B细胞淋巴瘤患者注 射鼠CD20单克隆抗体1F5时B细胞恶性肿瘤的有效治疗的重要特征， 这导致恶性细胞的显著减少和部分临床反应(Press et al.， Blood 69 : 584-91 (1987)).
由于正常成熟B细胞也表达CD20， CD20抗体治疗时正常B细胞
ii减少(Reff， M. E. et al， Blood 83: 435-445,1994).然而，治疗完成后， 从CD20阴性B细胞前体再生正常B细胞；因此，用抗CD20疗法治 疗的患者不经历严重的免疫抑制.在涉及自身抗体的不适当产生的疾 病或B细胞可能起作用的其它疾病中，正常B细胞的减少可能是有益
的.由与人IgGl重链和人K轻链恒定区融合的小鼠来源的重链和轻链 可变区组成的CD20的特异性嵌合单克隆抗体保留了与CD20的结合和 介导ADCC以及固定补体的能力(Liu et al.， J. Immunol. 139: 3521-26 (1987); Robinson et al.， U. S. Patent No. 5,500,362).该研究导致了嵌合 CD20单克隆抗体RituximabTM的开发，目前已经被美国食品和药品监 督管理局批准用于B细胞淋巴瘤的治疗.尽管RituxiniabTM治疗后经 常观察到临床反应，患者通常在约6-12个月后复发.
静脉注射需要高刑量的RituximabTM,因为该分子是大约150kDa 的大分子，并且扩散限制于进入许多肿瘤细胞存留的淋巴組织.人们 认为Rituximal)TM的抗肿瘤活性机制是几种活性的结合，包括ADCC、 补体固定和在恶性B细胞中激发促进凋亡的恶性B细胞.RituximabTM 的大尺寸防止了该分子进入含有恶性B细胞的淋巴组织的最优扩散， 从而限制了这些抗肿瘤活性.如前面所讨论，用蛋白酶切割为Fab或 F(ab')2片段使它们更小，并且更容易穿透到淋巴组织中，但失去了对 于抗肿瘸活性来说很重要的效应物功能.尽管CD20 mAb片段可能比 完整抗体在递送放射性同位素方面更有效，但仍然需要构建保留Fc部 分的效应物功能，但更小的CD20 mAb衍生物，以促进更好的肿瘤穿 透并导致更短的半衰期.
CD20由B细胞来源的恶性细胞，包括B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细 胞白血病(CLL)表达.CD20不被悉性的前B细胞，例如急性成淋巴 细胞白血病表达.因此CD20是治疗B细胞淋巴瘸、CLL和B细胞参 与疾病活性的其它疾病的良好靶点.其它B细胞疾病包括在B细胞分 化为血浆细胞期间产生自身抗体的自身免疫病.B细胞疾病的例子包 括自身免疫性甲状腺疾病，包括格雷夫斯病和桥本氏甲状腺炎、类风 湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征、免疫性血小板减少 性紫癜(ITP)、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、牛皮癣、硬皮病和 炎性肠病，包括克隆氏病和潰疡性结肠炎.
从上文中看出，确实需要用于治疗恶性状况和B细胞疾病的改进的
12组合物和方法.本发明的组合物和方法通过提供结合域-免疫球蛋白 融合蛋白而克服了先有技术的限制，该融合蛋白包含与免疫球蛋白铰
链区多肽融合的结合域多肽，该铰链区多肽与免疫球蛋白重链CH2恒 定区多肽融合，CH2恒定区多肽与免疫球蛋白肿瘤CH3恒定区多肽融 合，其中结合域—免疫球蛋白融合蛋白能够介导ADCC或补体固定. 此外，该組合物和方法提供了其它相关的益处.

发明内容
本发明的一方面提供了结合域 一 免疫球蛋白融合蛋白，包含(a)与免 疫球蛋白铰链区多肽融合的结合域多肽，其中所述铰链区多肽选自(i) 不含半胱氨酸残基并且来源于具有一个或更多半胱氨酸残基的野生型 免疫球蛋白铰链区多肽的突变的铰链区多肽，(H)含有一个半胱氨酸残 基并且来源于具有两个或更多半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链 区多肽的突变的铰链区多肽，(iii)野生型人IgA铰链区多肽，(iv)不含 半胱氨酸残基并且来源于野生型人IgA区多肽的突变的人IgA铰链区 多肽和(v)含有一个半胱氨酸残基并且来源于野生型人1gA区多肽的突 变的人IgA铰链区多肽；(b)与铰链区多肽融合的免疫球蛋白重链CH2 恒定区；和(c)与CH2恒定区多肽融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区 多肽，其中(l)结合域 一 免疫球蛋白融合蛋白具有至少一种选自抗体依 赖性细胞介导的细胞毒性和补体固定的免疫活性，并且(2)结合域多肽 能够特异性结合于抗原.在一种实施方案中，免疫球蛋白铰链区多肽 是一种突变的铰链区多肽，并且相对于野生型人免疫球蛋白G铰链区 多肽，表现出二聚化的能力降低.在另一种实施方案中，结合域多肽 包括至少一种是免疫球蛋白轻链可变区多肽或免疫球蛋白重链可变区 多肽的免疫球蛋白可变区多肽.在进一步的实施方案中，免疫球蛋白 可变区多肽来源于人免疫球蛋白.
在另一种实施方案中，结合域Fv-免疫球蛋白融合蛋白的结合城多 肽包含(a)至少一种免疫球蛋白轻链可变区多肽；(b)至少一种免疫球蛋 白重链可变区多肽；和(c)至少一种与(a)的多肽和与(b)的多肽融合的接 头肽.在进一步的实施方案中，免疫球蛋白轻链可变区和重链可变区 多肽来源于人免疫球蛋白.
在另一种实施方案中，至少一种免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽和免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽来源于人免疫球蛋白重链.在另一 种实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区CH2和CH3多肽属于选自人 IgG和人IgA的同种型.在另一种实施方案中，抗原选自CD19，CD20， CD37, CD40和L6.在上述融合蛋白的某些进一步的实施方案中，接 头肽包括至少一种具有氦基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的多肽，在某 些其它实施方案中，接头肽包括具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 的多肽的至少三次重复.在某些实施方案中，免疫球蛋白铰链区多肽 包括人IgA铰链区多肽.在某些实施方案中，结合域多肽包括CD154 胞外域.在某些实施方案中，结合域多肽包括CD154胞外域和至少一 种免疫球蛋白可变区多肽.
在另一种实施方案中，本发明提供了一种编码上述任意一种结合域 —免疫球蛋白融合蛋白的分离的多核苷酸，并且在相关的实施方案中， 本发明提供了一种包含这种多核苷酸的重组表达构建体，并且在某些 进一步的实施方案中，本发明提供了用这种重组表达构建体转化或转 染的宿主细胞.在另一种实施方案中，本发明提供了生产结合域-免 疫球蛋白融合蛋白的方法，包括以下步骤(a)在允许结合域-免疫球 蛋白融合蛋白表达的条件下培养上迷宿主细胞；和(b)从宿主细胞培养 物中分离结合域-免疫球蛋白融合蛋白
本发明也在某些实施方案中提供了含有与生理可接受栽体組合的 上述结合域-免疫球蛋白融合蛋白的药物组合物.在另一种实施方案 中，提供了一种治疗具有或怀疑具有恶性状况或B细胞疾病的受试者 的方法，包括给予患者治疗有效量的上述结合域-免疫球蛋白融合蛋 白，在某些进一步的实施方案中，恶性状况或B细胞疾病是B细胞淋 巴瘤或以自身抗体产生为特征的疾病，并且在某些其它的实施方案中， 恶性状况或B细胞疾病是类风湿性关节炎、重症肌无力、格雷夫斯病、 I型糖尿病、多发性硬化或自身免疫病.
参考以下发明详述和附图将更明确本发明的这些和其它方面.在此 引入此处公开的所有参考文献的完整内容作为参考，如同单独引入每
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图1表示一种能够特异性结合CD20的结合域-免疫球蛋白融合蛋白2H7scFv-Ig的DNA和推測的氨基酸序列[SEQ ID NO : 15.
图2表示通过转染的、穗定的CHO细胞系产生的2H7 scFv-Ig的 水平和通过纯化的2H7 scFv-Ig与表达CD20的CHO细胞的结合产生 标准曲线.
田3表示分离的2H7scFv-Ig蛋白的多个制备物的SDS-PAGE分析.
闺4表示由2H7scFv-Ig进行的补体回定(闺4A)和抗体依赖性细 胞毒性(ADCC，困4B).
困5表示CD20和CD40的同时连接对正常B细胞生长的作用.
图6表示CD20和CD40的同时连接对B类淋巴母细胞系中CD95 表达和凋亡诱导的作用.
图7表示能够特异性结合CD20和CD40的2H7scFv-CD154 L2(困 7A， SEQ ID NO:33)和2H7scFv-CD154 S4(困7B， SEQ ID NO :34) 结合域—免疫球蛋白融合蛋白的DNA和推测氨基酸序列.
困8表示通过流式细胞术测定的2H7scFv-CD154结合域-免疫球 蛋白融合蛋白与CD20+CHO细胞的结合.
困9表示2H7scFv-CD154结合域-免疫球蛋白融合蛋白与细胞结 合后膜联蛋白V与B细胞系Ramos, BJAB和TS1的结合.
图10表示2H7scFv-CD154结合域—免疫球蛋白融合蛋白结合后对 B细胞系T51的作用.
图11分别图示了称作CytoxB或CytoxB衍生物的2H7ScFv-Ig融 合蛋白SEQ ID NOS : 17、 16和18CytoxB-MHWTGIC (2H7 ScFv， 突变的铰链区，野生型人IgGl Fc结构域)，CytoxB-MHMGIC (2H7 ScFv，突变的铰链区，突变的人IgGl Fc结构域)和 CytoxB-IgAHWTHGlC(2H7 SeFv,人IgA来源的铰链区，野生型人 IgGl Fc结构域)的结构，箭头表示认为对FcR结合和ADCC活性(粗 箭头)、以及补体固定(细箭头)起作用的氨基酸残基的位置编号.注 意没有链间二硫键.
闺12表示分离的CytoxB和2H7scFv-CD154结合域-免疫球蛋白 融合蛋白的SDS-PAGE分析.
闺13表示CytoxB衍生物的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)活性.
闺14表示CytoxB衍生物的补体依赖性细胞毒性(CDC).
15困15表示猕猴血样中CytoxB-MHWTGlC的血清半衰期确定. 困16表示CytoxB-MHWTGlC对猕猴血样中循环的CD40+ B细胞 水平的作用.
图17表示转染的哺乳动物细胞系的HD37(CD19特异性的)ScFv-Ig 产量水平，以及通过纯化的HD37ScFv-Ig与表达CD19的细胞的结合 产生标准曲线.
困18表示转染的稳定CHO细胞系的L6 (癌抗原)ScFv-Ig产量 水平，以及通过纯化的L6 ScFv-Ig与表达L6抗原的细胞的结合产生 标准曲线.
困19表示结合域-免疫球蛋白融合蛋白2H7 ScFv-Ig, HD37 ScFv-Ig和G28-l (CD37特异性)ScFv-Ig的ADCC活性.
图20表示L6 ScFv-Ig融合蛋白的ADCC活性.
图21表示L6 ScFv-lg和2H7 ScFv-Ig融合蛋白的SDS-PAGE分析.
图22表示G28-l ScFv-Ig和HD37 ScFv-Ig融合蛋白的SDS-PAGE 分析.
具体实施例方式
本发明涉及用于免疫治疗和免疫诊断应用，并且提供比现有技术的 抗原特异性多肽更有某些优势的结合域_免疫球蛋白融合蛋白 本发 明的融合蛋白优选是在相关部分包含以下融合结构域的单多肽链结 合域多肽、免疫球蛋白铰链区多肽、免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽 和免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽，在特别优选的实施方案中，结合 域-免疫球蛋白融合蛋白是或来源于人基因序列的产物，但本发明不 需要限制于此，并且实际上可以涉及此处提供的来源于任何天然或人 工来源的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，包括基因工程化和/或突变的 多肽.
本发明部分涉及出人意料的观察结果，即，此处描述的结合域-免 疫球蛋白融合蛋白具有免疫学活性.更具体地，尽管具有预计不能促
进效应物活性的结构，这些蛋白保留了参与公知的免疫学效应物活性 的能力，所述活性包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC，例如 细胞表面的抗原结合后，在适当条件下募集和诱导具有适当Fc受体的 细胞毒性效应细胞，如具有FcRyIII的天然杀伤(NK)细胞)和/或补体依赖性细胞毒性中的补体固定(CDC，例如细胞表面的抗原结合后， 募集和激活作为血液补体级联成分的细胞裂解蛋白).如下文的更详细 描述，ADCC和CDC是包含免疫球蛋白重链区的单体蛋白的预料不到
的功能，选用于该融合蛋白的结构，特別是对不利于它们形成链间同 二聚体二疏鍵的能力的铰链区多肽的选择有利于该功能，
本发明提供的另一优点是能以大黃产生的结合域-免疫球蛋白融 合多肽，其产量一般大于用现有技术的单链抗体构建体常规获得的量. 在一种优选的实施方案中，本发明的结合域-免疫球蛋白融合多肽在 哺乳动物表达系统中重组表达，这提供了以下优点，即提供了体内(例 如在生理条件下)稳定的多肽.根据非限制性的理论，这种稳定性可 能部分来源于融合蛋白的翻译后修饰和特异性糖基化.已经在静态细 胞培养物中通过重组哺乳动物表达而以每升培养物上清液大于50mg 蛋白的水平产生了本发明的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，在这种培 养物中 一般观察到的产量是10-50 mg/1,因此在静态培养条件下优选可 以产生至少10-50 mg/1;也考虑了用本领域接受的大规模方法如"补料 分批"(即非静态)生产方法增加融合蛋白的产重，获得了至少5-500 mg/l的产量，在一些情况下为至少0.5-1 g/l，取决于特定的蛋白产物.
本发明的结合域多肽可以是具有特异性识别和结合相关生物分子 或一种以上分子的复合物或这种分于的穗定或瞬时组装物或聚集物的 能力的任何多肽，所述分子包括蛋白、多肽、氨基酸或其衍生物；脂 质、脂肪酸等或其衍生物；碳水化合物、糖等或其衍生物等；或其任 意组合，例如，糖蛋白、糖肽、糖脂、脂蛋白、蛋白脂等；或可能存 在于生物学样品中的任意其它生物分子.可以通过从受试者或生物来 源获得血样、活检标本、组织外植体、器官培养物、生物流体或任意 其它组织或细胞制备物而提供生物学样品.受试者或生物来源可以是 人或非人动物、原代细胞培养物或适合培养的细胞系，包括但不限于 可能含有染色体整合或附加型重组核酸序列的基因工程化的细胞系、 永生化的可永生化的细胞系、体细胞杂交细胞系、分化的或可分化的 细胞系、转化的细胞系等.在本发明的某些优选实施方案中，受试者 或生物来源可以被怀疑或患有此处所述的恶性状况或B细胞疾病，或
者具有患此处所述的恶性状况或B细胞疾病的风险，在某些进一步优
选的实施方案中可以是自身免疫病，在本发明的某些其它优选实施方
17案中，受试者或生物来源可以已知没有患所述疾病的风险，或没有该 疾病.
因此，结合域多肽可以是任何天然存在或重组产生的此处提供的相 关生物分子的结合配偶体，该相关生物分子是感兴趣的把结构，此处 称作"抗原"，但根据本发明的公开，意欲包括任何需要使本发明的融 合蛋白特异性与其结合的靶生物分子.如果结合域-免疫球蛋白融合
蛋白以大于或等于约1043\1"，优选大于或等于约105M",更优选大于 或等于约106M"，更优选大于或等于约1(^M"的Ka结合需要的把分 子，则该结合域-免疫球蛋白融合蛋白定义为"免疫特异性"或能够 特异性结合.本发明的结合域-免疫球蛋白融合蛋白的亲和力可以使 用常规技术，例如描述于Scatchard et al" Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660 (1949)中的技术容易测定.也可以使用任何已知用于鉴定和获得特异性 与其它蛋白或多肽相互作用的蛋白的方法，例如美国专利5,283,173和 美国专利5，468，614，或其同族专利等描述的酵母双杂交筛选系统进行 融合蛋白与感兴趣的耙抗原结合的这种测定.
本发明的结合域-免疫球蛋白融合蛋白的优选实施方案包括舍有 至少一个免疫球蛋白可变区多肽的结合域，所述可变区多肽例如重链 或轻链可变区的所有或部分或片段，前提是它能够特异性结合于抗原 或此处描述的感兴趣的其它需要的靶结构.在其它优选的实施方案中， 结合域包含一个单链免疫球蛋白来源的Fv产物，它可以包含至少一种 免疫球蛋白轻链V区的所有或一部分和至少一种免疫球蛋白重链V区 的所有或一部分；并且进一步包含与V区融合的接头；此处更详细描 述了所迷构建体的制备和检验，并且这也是本领域公知的.其它结合 域多肽可以包括保留了特异性结合于此处提供的抗原的能力的任何蛋 白或其部分，包括非免疫球蛋白.因此本发明考虑了包含来源于以下 成分的结合域多肽的融合蛋白多肽配体如激素、细胞因子、趋化因 子等；这种多肽配体的细胞表面或可溶受体；凝集素；细胞间粘附受 体如特异性白细胞整联蛋白、选择蛋白、免疫球蛋白基因超家族成员、 细胞间粘附分子(ICAM-1 ，-2,-3)等；组织相容性抗原等，
可以提供结合域多肽并且也可以选择为本发明的结合城-Ig融合蛋 白需要结合的靶分子或抗原的细胞表面受体的例子包括以下成分等 HER1 (如GenBank编号U48722， SEG.HEGFREXS， K03193)， HER2
18(Yoshino et al" 1994 J. Immunol. 152: 2393; Disis et al" 1994 Cane. Res. 54: 16;也见，例如GenBank编号X03363, M17730, SEG HUMHER20)， HER3 (例如GenBank编号U29339, M34309), HER4 (Plowman et al.， 1993 Nature 366: 473;也见，例如GenBank编号 L07868, T64105),表皮生长因子(EGFR)(例如GenBank编号U48722, SEG.HEGFREXS， K03193),血管内皮细胞生长因子(例如GenBank 编号M32977)，血管内皮生长因子受体(例如GenBank编号AF022375, 1680143， U48801, X62568),胰島素样生长因子-I(例如GenBank编号 X00173, X56774, X56773, X06043，也见欧洲专利GB 2241703)，狭烏素 样生长因子-II(例如GenBank编号X03562, X00910, SEG.HUMGFIA， SEGJHUMGFK， Ml 7863, Ml 7862)，转铁蛋白受体(Trowbridge and Omary， 1981 Proc. Nat. Acad. USA 78 : 3039;也参见，例如GenBank 编号X01060, M11507)，雌激素受体(如GenBank编号M38651，X03635， X99101, U47678, M12674),孕激素受体(如GenBank编号X51730, X69068, M15716)，滤泡刺激素受体(FSH-R)(如GenBank编号Z34260， M65085),视黄酸受体(如GenBank编号L12060, M60909, X77664, X57280, X07282, X06538 )， MUC-1 (Barnes et al" 1989 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 7159;也见，例如GenBank编号SEG一MUSMUCIO， M65132, M64928), NY-ESO-l(如GenBank编号AJ003149, U87459 )， NA 17-A (如欧洲专利WO 96/40039)， Melan-A/MART-1 (Kawakami et al" 1994 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3515;也见，例如GenBank编 号U06654, U06452),酪氨酸酶(Topalian et al" 1994 Proc. Nat.Acad. Sci. USA 91: 9461;也见，例如GenBank编号M26729, SEG HUMTYRO，也见，例如Weber et al" J ; Clin. Invest (1998) 102 : 1258), Gp-100 (Kawakami et al" 1994 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3515;也见，例如GenBank编号S73003,也见欧洲专利EP 668350; Adema et al.， 1994 J. Biol. Chem. 269: 20126), MAGE (van den Bruggen et al" 1991 Science 254: 1643;例如GenBank编号U93163， AF064589, U66083, D32077, D32076, D32075, U10694, U10693, U10691, U10690, U10689, U10688, U10687, U10686, U10685, L18877, U10340, U10339，L18920， U03735, M77481), BAGE (例如GenBank编 号U19180，也见美国专利5，683，886和5,571,711), GAGE (例如GenBank编号AF055475, AF055474, AF055473, U19147, U19146, U19145, U19144, U19143, U19142),任意CTA类的受体，具体包括由 SSX2基因编码的HOM-MEL-40抗原(例如GenBank编号X86175, U90842， U90841, X86174),癌胚抗原(CEA, Gold and Freedman， 1985 J Exp. Med 121: 439;也见，例如GenBank编号SEG一HUMCEA， M59710, M59255, M29540),以及PyLT (例如GenBank编号J02289, J02038 )
其它可以作为结合域多肽的来源或可以作为相关抗原的细胞表面 受体包括以下受体等CD2 (例如GenBank编号Y00023, SEG HUMCD2， Ml 6336， Ml 6445， SEG一MUSCD2， Ml 4362 ), 4曙lBB(CDw137， Kwon et al" 1989 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86 : 1963), 4-1BB配体(Goodwin et al.， 1993 Eur, J. Immunol. 23: 2361; Melero et al.， 1998 Eur. J. Immunol' 3: 116》CD5 (例如GenBank编 号X78985, X89405), CD10 (例如GenBank编号M81591, X76732 )， CD27(例如GenBank编号M63928, L24495, L08096),CD28 (June et al" 19卯Immunol. Today 11: 211;也见，例如GenBank编号SEG HUMCD28， M34563), CTLA-4 (例如GenBank编号L15006, X05719, SEG一HUMIGCTL ), CD40 (例如GenBank编号M83312, SEG MUSC040A0, Y10507, X67878, X96710, U15637, L07414), y干扰素 (IFN-y,见例如Farrar et al, 1993 Ann. Rev, Immunol. 11: 571及其中 引用的参考文献，Gray et al. 1982 Nature 295: 503， Rinderknecht et al. 1984 J Biol. Chem, 259: 6790， DeGrado et al. 1982 Nature 300: 379), 白介素-4 (IL-4，见例如53rd Forum in Immunology, 1993 Research in Immunol. 144: 553-643; Banchereau et al" 1994 in The Cytokine Handbook, 2nd ed" A. Thomson, ed" Academic Press, NY， p, 99; Keegan et al.， 1994 J Leukocyt. Biol.. 55: 272，及其中引用的参考文献)， 白介素-17 (IL-n)(例如，GenBank编号U32659, U43088)和白介素-17 受体(IL-17R)(例如，GenBank编号U31993，U58917)，尽管包括前述 内容，本发明特意不包括U.S. 5,807,734， U.S.5,795,572或U.S. 5,807,734 所公开的任何免疫球蛋白融合蛋白.
其它可以作为结合域多肽的来源或可以作为相关抗原的 胞表面 受体包括以下受体等CD59(例如，GenBank编号SEG一HUMCD590，M95708, M34671) ， CD48(例如，GenBank编号M59904), CD58/LFA-3(例如，GenBank编号A25933, Y00636, E12817,也见JP 19970750卯-A) ， CD72(例如，GenBank编号AA311036, S40777, L35772) , CD70(例如，GenBank编号 Y13636, S69339)， C麵/B7.1(Freeman et al" 1989 J. Immunol. 43:2714; Freeman et al" 1991 J, Exp. Med.l74:625,也见，例如GenBank编号U33208,1683379)， CD86/B7.2(Freeman et al.， 1993 J. Exp, Med. 178: 2185， Boriello et al" 1995 J Immunol.155 : 5490;也见，例如GenBank编号AF099105, SEG MMB72G U39466，U04343， SEGHSB725, L25606, L252S9), CD40配体 (例如，GenBank编号SEG一HUMCD40L， X67878, X65453, L07414), IL-17(例如，GenBank编号U32659, U43088), CD43(例如，GenBank 编号X52075, J04536)和VLA-4(a4p7)(例如，GenBank编号LI 2002， X16983, L20788, U97031, L24913, M68892，M95632).以下细胞表面受 体一般与B细胞相关CD19(例如，GenBank编号SEG一HUMCD19W0， M84371, SEG MUSCD19W， M62542), CD20(例如，GenBank编号SEG HUMCD20, M62541), CD22(例如，GenBank编号1680629， Y10210, X59350, U62631, XS2782, L16928), CD30配体(例如，GenBank编号 L09753, M83554), CD37(例如，GenBank编号SEGJV1MCD37X， X14046, X53517), CD106 (VCAM-1)(例如，GenBank编号X53051, X67783, SEG-MMVCAM1C,也见美闺专利5,596,090), CD54 (ICAM-1) (例如，GenBank编号X84737, S82847, X06990, J03132, SEG MUSICAMO)，白介素12 (见，例如Reiter et al， 1993 Crit. Rev. Immunol, 13:1,及其中引入的参考文献).辅助的细胞试刑也可以包括 以下一般与树突细胞相关的细胞表面受体CD83(例如，GenBank编 号AF001036, AL021918), DEC-205(例如，GenBank编号AF011333, 1119271).
上述免疫球蛋白铰链区多肽包括任何天然存在的、作为人工肽或作 为基因工程结果和位于负责在CHI和CH2区中形成链内免疫球蛋白 —结构域二疏鍵的氨基酸残基之间的免疫球蛋白重链多肽内的铰链区 肽或多肽；用于本发明的铰链区多肽也可以包括突变的铰链区多肽. 因此，免疫球蛋白铰链区多肽可以来源于上迷经典地认为具有铰链区 功能的免疫球蛋白链区域，或是其部分或片段(即以肽鍵连接的一个或多个氨基酸， 一般5-65个氨基酸，优选10-50个，更优选15-35个， 更优选18-32个，更优选20-30个，更优选21,22,23， 24，25，26，27，28或 29个氨基酸).但用于本发明的铰链区多肽并不限于此，并且可以包括 位于邻接的免疫球蛋白结构域，如CH1结构域或CH2结构域中的氨 基酸(根据用于分配特定残基至特定结构域的结构标准可能不同，如 本领域公知)，或者在某些人工工程化的免疫球蛋白构建体的情况下， 可以包括免疫球蛋白可变区结构域.
野生型免疫球蛋白铰链区多肽包括任何位于免疫球蛋白的恒定区 结构域CH1和CH2之间的天然存在的铰链区.野生型免疫球蛋白铰 链区多肽优选是人免疫球蛋白铰链区多肽，优选包含来自人IgG免疫 球蛋白的铰链区，更优选包含来自人IgGl同种型的铰链区多肽.如本 领域所公知，尽管免疫球蛋白氨基酸序列具有极大的总体多样性，免 疫球蛋白 一級结构在免疫球蛋白多肽链的特定部分表现出高度序列保 守性，特別是存在半胱氨酸残基，它们通过其玟基提供了与其它存在 的巯基形成二疏鍵的潜能.因此，在本发明的内容中，野生型免疫球 蛋白铰链区多肽可以被认为特征在于一个或多个高度保守的(如以统 计学显著的方式普遍存在于人群中)半胱氨酸残基，在某些优选实施 方案中，突变的铰链区多肽可以选自含有0或1个半胱氨酸残基的铰 链区并且来源于这样的野生型铰链区.
突变的免疫球蛋白铰链区多肽可以包含来源于不同于CH2和CH3 结构域的物种、免疫球蛋白同种型或类、或免疫球蛋白亚类的铰链区. 例如，在某些实施方案中，结合域-免疫球蛋白融合蛋白可以包含融 合于含有野生型人1gA铰链区多肽或此处描述的含有0或仅仅1个半 胱氨酸残基的突变的人IgA铰链区多肽的免疫球蛋白铰链区多肽的结 合域多肽.这种铰链区多肽可以融合于来自于不同的Ig同种型或类， 如IgG亚类的免疫球蛋白重链CH2区多肽，该IgG亚类在某些实施方 案中优选为IgGl亚类.
例如，如下面更详细的描述，在本发明的某些实施方案中，免疫球 蛋白铰链区多肽选自来源于天然包括三个半胱氡酸的的野生型人IgA 铰链区，其中所选择的铰链区多肽相对于完整的铰链区被截短，使得 只剩下一个半胱氨酸残基(如SEQIDNO:36).同样，在本发明的某 些其它实施方案中，结合域-免疫球蛋白融合蛋白包含融合于含有突
22变的铰链区多肽的免疫球蛋白铰链区多肽，突变的铰链区多肽中的半
胱氨酸残基数通过氨基酸取代或缺失而减少.因此突变的铰链区多肽 可以来源于含有一个或多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链
区.在茱些实施方案中，突变的铰链区多肽可以含有0个或仅仅1个
半胱氨酸残基，其中突变的铰链区多肽来源于分别含有一个或多个或 两个或多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区.在突变的铰链 区多肽中，野生型免疫球蛋白铰链区的半胱氨酸残基优选被不能形成 二疏键的氨基酸取代.在本发明的一个实施方案中，突变的铰链区多
肽来源于人IgG野生型铰链区多肽，该野生型铰链区多肽可以包括四 种人IgG同种型亚类IgGl， IgG2， IgG3或IgG4的任意一种.在某些优 选的实施方案中，突变的铰链区多肽来源于人IgGl野生型铰链区多 肽，作为举例，来源于人IgG野生型铰链区多肽的突变的铰链区多肽 可以含有在野生型免疫球蛋白铰链区的三个半胱氨酸中的两个或三个 上发生的突变.
存在于野生型免疫球蛋白铰链区并且根据本发明的特別优选的实 施方案而进行的诱变所缺失的半胱氨酸残基包括形成、或能够形成链 间二疏键的半胱氨酸残基.不希望受到理论的限制，本发明考虑了这 些铰链区半胱氨酸残基的突变，这些半胱氨酸残基被认为参与链间二 疏桥形成，减少本发明的结合域-免疚球蛋白融合蛋白通过二碟鍵形 成而二聚化(或形成更高級的寡聚物)的能力，同时出乎意料地不减 少融合蛋白促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或固定补体 的能力 具体地，介导ADCC的Fc受体(FcR)(如FcRIII， CD16)具有 对免疫球蛋白Fc结构域的低亲和性，表示Fc与FcR的功能性结合需 要Fc-FcR复合物的亲和穗定，这是由于常规抗体中重链的二聚结构， 和/或通过常规抗体Fc结构的FcR聚集和交联而导致的.(Sonderman et al" 2000 Nature 406: 267; Radaev et al" 2001 J BioL Chem. 276: 16469; Radaev et al" 2001 J : Biol. Chem, 276: 16478 ; Koolwijk et al" 1989 J ， Immunol. 143: 1656; Kato et al" 2000 Immunol. Today 21: 310.).因此，本发明的结合城-免疫球蛋白融合蛋白提供了与单链免 疫球蛋白融合蛋白相关的优点，同时也出乎意料地保留了免疫学活性， 同样，固定补体的能力一般与包含Fc的重链恒定区为二聚化的免疫球 蛋白相关，而本发明的结合域-免疫球蛋白融合蛋白表现出出乎意料
23的固定补体的能力.
如上文所指出的，根据非限定性的理论，确信结合域-免疫球蛋白 融合蛋白损害了它们二聚化的能力，并且进一步根据理论，该性质是 减少存在于所选的包舍于融合蛋白的构建中的免疫球蛋白铰链区多肽 中的半胱氨酸残基数的结果.确定多肽二聚化的相对能力的方法是本 领域公知的，其中可以用许多确立的方法检测蛋白的二聚化(见，例
如 Scopes, Protein Purification : Principles and Practice, 1987 Springer-Verlag， New York).例如，用于根据分子大小分辨蛋白的生 化分离技术(例如凝胶电泳、凝胶过滤层析、分析性超速离心法等) 和/或在引入巯基活性(例如硤乙酰胺、N-乙基马来耽亚胺)或二疏鍵 还原性(如2-巯基乙醇、二疏苏糖醇)试剂之前和之后比较蛋白的生 理化学特征的方法，或其它相当的方法都可以用于检测多肽二聚化或 寡聚化的程度，并且确定二疏鍵对这种潜在四级结构的可能作用.在 某些实施方案中，本发明涉及此处提供的相对于野生型人免疫球蛋白 G铰链区多肽表现出二聚化能力降低(即相对于适当的IgG来源的对 照以统计学显著的方式降低)的结合域免疫球蛋白融合蛋白.闳此， 本领域的熟练技术人员能够容易确定特定融合蛋白是否表现出这种二 聚化能力降低.
用于制备免疫球蛋白融合蛋白的組合物和方法是本领域公知的，例 如美国专利5,892,019的描迷，该专利公开了作为单个编码性多核苷酸 的产物但不是本发明的结合域 一免疫球蛋白融合蛋白的重组抗体.
对于用于人的本发明的免疫球蛋白融合蛋白，恒定区一般来源于人 序列，以减少潜在的抗人免疫应答并且提供适当的效应物功能，操作 编码抗体恒定区的序列描迷于Morrison和Oi的PCT公开WO 89/07142.在特别优选的实施方案中，CHI结构域缺失，并且结合域 的羧基端，或当结合域包含两个免疫球蛋白可变区多肽时，第二个(即 更接近于C末端)可变区通过铰链区连接于CH2的氨基末端.描述两 个示例性结合域-免疫球蛋白融合蛋白的结构的概要困见图11，应该 注意，在特别优选的实施方案中，不存在链间二硫键，在其它实施方 案中，相对于野生型铰链区多肽中的该鍵的数目，可以存在有限的链 间二疏鍵数目，在其它实施方案中，融合蛋白包含相对于野生型人IgG 铰链区多肽表现出二聚化能力降低的突变铰链区多肽.因此，分离的
24多核苷酸分子编码单链免疫球蛋白融合蛋白，该融合蛋白具有提供对 所选择抗原的特异性结合亲和性的结合域.
如上文所指出的，在某些实施方案中，结合域免疫球蛋白融合蛋白 包含至少一个免疫球蛋白可变区多肽，该多肽可以是轻链或重链可变
区多肽，并且在某些实施方案中，融合蛋白包含至少一个该轻链V区
和一个该重链v区以及至少一个融合于每一个v区的接头舦.构建这
种结合域，例如单链Fv结构域的方法是公知的，并且在下文的实施例 中由详细描述，并且在例如美国专利5,892,019及其引用的参考文献中 有详细描述；单链可变区和融合于每一个重链来源和轻链来源的V区 的接头多肽的选择和组装(例如产生包含单链Fv多肽的结合域)也是 本领域公知的，并且在本文和例如美国专利5,869,620, 4,704,692和 4,946,778中有描述.在某些实施方案中，来源于非人来源的免疫球蛋 白序列的全部或一部分可以根据公知程序进行"人源化"，以制备人源 化抗体，即，引入了人Ig序列以减少人免疫系统将该蛋白识别为外源 蛋白的程度的免疫球蛋白序列(见，例如美国专利5,693,762 ; 5,585,089; 4,816,567; 5，225，S39; 5,530,101及其中引用的参考文献).
一旦设计了此处提供的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，可以通过描 述于例如Sinha et al.， Nucleic Acids Res.， 12,4539-4557 (1984)中的寡核 苷酸合成方法合成编码该多肽的DNA，通过描述于例如Innis， Ed.， PCR Protocols, Academic Press (1990)和Better et al. J. Biol. Chem. 267,16712 - 16118 (1992)的PCR方法组装；通过描述于例如Ausubd et al" Eds" Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989)以及Robinson et al" Hum. Antibod Hybridomas， 2， 84-93 (1991)的标准程序进行克隆和表达；并且通过描迷于例如Harlow et al" Eds.， Antibodies : A Laboratory Manual, Chapter 14， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988)和Munson et al.， AnaL Biochem.， 107， 220-239 (1980)的方法检测特异性抗原结合 活性.
Fv区的羊多肽链结合分子即羊链Fv分子的制备描迷于美国专利 4,946,778,在此引入作为参考.在本发明中，通过编码笫一个重链或 轻链可变区，然后分别编码相应轻链或重链可变区的一个或多个接头 而合成单链Fv样分子.两个可变区之间的适当接头的选择描述于美国专利4,946,778.此处描述的示例性的接头是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3. 接头用于将天然聚集但化学上分离的重链和轻链转化为单个多肽链的 氨基末端抗原结合部分，其中该抗原结合部分将折叠成类似于由两条 多肽链形成的原始结构，从而保持结合目的抗原的能力.通过编码接 头的序列连接的编码重链和轻链可变区的核苷酸序列连接于编码抗体 恒定区的核苷酸序列.恒定区是允许得到的多肽形成链间二硫鍵以形 成具有所需效应物功能，例如介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的二聚 体的区域.对于意欲用于人类的本发明的免疫球蛋白样分子来说，恒 定区 一般基本来自于人，从而使潜在的抗人免疫应答减少到最小并且 提供适当的效应物功能.对编码抗体恒定区的序列的搮作描述于 Morrison和Oi的PCT公开89/07142,在此引入作为参考.在优选实 施方案中，缺失CH1结构域并且通过铰链区将笫二个可变区的羧基末 端连接于CH2的氨基末端.与轻链的相应Cys形成二硫鍵以保持天然 抗体的重链和轻链的铰链区Cys残基可以缺失或被例如Pro残基等取 代.
如上文所述，本发明提供了能够指导此处提供的结合域免疫球蛋白 融合蛋白的表达的重组表达构建体.存在于此处提到的各种氨基酸序 列中的氨基酸是根据它们的公知三字母或单字母简称而鉴别的 存在 于此处的各种DNA序列或其片段中的核苷酸是根据本领域中常用的 标准单字母命名法进行命名的.特定的氨基酸序列也可以包括具有微
小改变的相似氨基酸序列，例如说明性而非限定性的共价化学修饰、 插入、缺失和取代，可以进一步包括保守取代.彼此相似的氨基酸序 列可以具有很大的序列同源区.以相似的方式，核苷酸序列可以包括 仅具有微小改变的基本相似的核苷酸序列，例如说明性而非限定性的 共价化学修饰、插入、缺失和取代，可以进一步包括由于遣传密码子 的简并性而导致的沉默突变.彼此相似的核苷酸序列可以具有很大的 序列同源区.
受试者中存在恶性状况是指存在受试者中存在发育异常的、癌性和 /或被转化细胞，包括，例如赘生性、肿瘤、非接触抑制的或致癌性被 转化细胞等.在优选实施方案中，本发明考虑了例如这些癌细胞是恶 性造血细胞，例如淋巴系的被转化细胞，具体如B细胞淋巴瘤等；在 某些优选实施方案中，癌细胞也可以是上皮细胞如上皮癌细胞.本发明也考虑了 B细胞疾病，可以包括影响B细胞的某些恶性状况(如B 细胞淋巴瘤)，但不限于此，也可以包括自身免疫病，具体说是以自身 抗体产生为特征的疾病、紊乱和状况.
自身抗体是与自身抗原反应的抗体.在一些自身免疫病(即宿主免 疫系统产生不适当的抗"自身"免疫反应的疾病、紊乱或状况)中检 测到了自身抗体，它们参与疾病活动.目前这些自身免疫病的治疗是 需要连续给药、缺乏特异性并导致严重副作用的免疫抑制药物.能够 消除自身抗体的产生并具有最小的毒性的新方法将解决影响许多人的 各种疾病的未满足的医学需要.本发明的结合域-免疫球蛋白融合蛋 白是设计用于改进穿透到淋巴组织中.B淋巴细胞的消除中断了自身 抗体产生循环，并且允许免疫系统重新设置，同时从骨拔中的前体产 生新的B淋巴细胞.
根据非限制性理论已经鉴定，对于许多疾病B细胞消除理论导致了 有益的效果，这些疾病的一些例子的简要描迷如下，
自身免疫性甲状腺疾病包括格雷夫斯病和桥本氏甲状腺炎.在美 国，有约2千万人患有某种形式的自身免疫性甲状腺疾病.自身免疫 性甲状腺疾病是由刺激甲状腺而导致甲状腺机能亢进(格雷夫斯病) 或破坏甲状腺而导致甲状腺机能减退(桥本氏甲状腺炎)的自身抗体 的产生而导致的.甲状腺的刺激是由结合并激活甲状腺刺激激素 (TSH)受体的自身抗体所导致的.甲状腺的破坏是由与其它甲状腺 抗原反应的自身抗体所导致的.
当前格雷夫斯病的治疗包括手术、放射性碘或抗甲状腺药物治疗. 放射性碘被广泛使用，因为抗甲状腺药物具有显著副作用，并且疾病 复发率高.手术用于具有大的甲状腺肿的患者，或需要使甲状腺功能 非常迅速地正常化的患者.目前还没有靶向于刺激TSH受体的自身抗 体的产生的疗法.目前用于桥本氏甲状腺炎的治疗是左旋甲状腺素钠， 并且该治疗是终身的，因为该疾病消退几乎是不可能的.已经发现抑 制性治疗在桥本氏甲状腺炎肿使甲状腺肿萎缩，但还没有已知一种疗
法能够减少抗体产生从而靶向于疾病机制.
类风湿性关节炎(RA)是一种以导致肿胀、疼痛和功能丧失的关 节的炎症为特征的慢性疾病.RA在美国影响了大约250万人.RNA 是由包括起始的感染或损伤的事件、异常免疫应答和遣传因素的结合
27所导致的.尽管RA中存在自身反应性T细胞和B细胞，RA的诊断 中使用了在关节中采集的高水平抗体，即称作类风湿因子的抗体的检 测.目前用于RA的治疗包括许多用于控制疼痛和延緩疾病进展的药 物.还没有发现能够治愈该疾病的治疗.药物包括非甾体类抗炎药 (NSAIDS)和疾病修饰性抗类风湿药物(DMARDS). NSAIDS在良性疾 病中有效，但在严重RA中不能阻止进展为关节破坏和残疾.NSAIDS 和DMARDS都与严重的副作用相关.只在十多年中，只批准了一种新 的DMARD,即来氟米特.来氟米特阻断自身抗体的产生，减少炎症， 并且延緩RA的进展.然而，该药物也导致严重的副作用，包括恶心、 腹泻、脱发、皮渗和肝损伤.
系统性红斑狼疮(SLE)是一种由于多个器官，包括肾、皮肤和关节 中的血管的反复损伤导致的自身免疫病.SLE在美国影响了超过 500,000人.在SLE患者中，T细胞和B细胞之间的异常相互作用导 致了攻击细胞核的自身抗体的产生.这些抗体包括抗双链DNA和抗 Sm抗体.在约半数的SLE患者中也发现了结合于磷脂的自身抗体， 并且负责血管损伤和低血细胞计数.免疫复合物在SLE患者的肾、血 管和关节中聚集，它们在此导致炎症和组织破坏.还没有发现治愈该 疾病的疗法.根据疾病的严重程度，将NSAIDS和DMARDS用于治 疗.用于去除自身抗体的带有血浆交换的血浆除去法可以导致SLE患 者的暂时改进.普遍同意自身抗体与SLE有关，所以消除B细胞系， 允许免疫系统重新设置，同时从前体产生新的B细胞的新疗法为SLE 患者的长期持续益处带来了希望.
干燥综合征是以身体中产生湿润环境的腺体的破坏为特征的一种 自身免疫病.干燥综合征是最普遍的自身免疫病之一，影响了多至400 万美国人，约半数千燥综合征患者也患有结締组织病，如类风湿性关 节炎，而另一半患有原发性干燥综合征，没有其它并发的自身免疫病. 干燥综合征患者中通常存在自身抗体，包括抗核抗体、类风湿因子、 抗胞村蛋白和抗毒萆碱受体抗体.常规治疗包括皮质类固醇.
免疫性血小板减少性紫癜(1TP)是由结合于血小板并导致其破坏 的自身抗体所导致的. 一些ITP病例是由药物导致的，其它与感染、 妊娠或自身免疫病如SLE相关.约半数病例分类为"特发性"，表示原 因未知，ITP的治疗是由症状的严重性所决定的.在一些病例中，不需要治疗.在大多数病例中，用免疫抑制药物，包括皮质类固酵或静
脉输注免疫球蛋白来消除T细胞.另一种通常导致血小板数目增加的 治疗方法是切除脾，该器官破坏抗体包被的血小板.更强效的免疫抑 制药物，包括环孢審素、环辨酰胺或碟唑嚷呤用于治疗严重病例.通 过使患者的血浆通过蛋白A株而去除自身抗体被用作严重疾病患者的 二线疗法.
多发性硬化(MS)是以中枢神经系统的炎症和拔鞘破坏为特征的自 身免疫病，它刺激脑、脊號和身体中的神经细胞纤维.尽管MS的原 因未知，普遍认为自身免疫性T细胞是该疾病发病的主要原因，然而， 高水平的抗体存在于MS患者的脑脊液中， 一些理论预测，导致抗体 产生的B细胞应答在介导该疾病中是重要的.在MS患者中还没有研 究B细胞消除理论.MS不能治愈.目前的治疗是皮质类固醇，它可 以减少攻击的持续时间和严重性，但不影响MS随时间的进程.最近 批准了 MS的新的生物技术干扰素(IFN)治疗.
重症肌无力(MG)是一种慢性免疫性神经肌肉疾病，特征在于随 意肌群的袭弱.MG影响了大约40，000美国人.MG是由结合于在神 经肌肉接头表达的乙酰胆碱受体的自身抗体导致的.该抗体减少或阻 断乙酰胆碱受体，阻止信号从神经传递到肌肉，MG还不能治愈.常 见的疗法包括用皮质类固醇、环孢審素、环磷耽胺或疏唑嘌呤进行免 疫抑制.手术切除胸腺通常用于钝化自身免疫应答.用于降低自身抗 体水平的血浆除去法在MG中有效，但作用时间短，因为持续产生自 身抗体.血浆除去法通常在手术前用于严重的肌肉衰弱.
牛皮裤影响了大约500万人.它是皮肤的自身免疫性炎症.30%的 牛皮癬与关节炎相关(硬皮病关节炎).有许多治疗方法，包括甾体类、 紫外线维生素A类、维生素D衍生物、环孢審素、氨甲喋呤.
硬皮病是结缔組织的一种慢性自身免疫病，也称作系统性硬化，硬 皮病的特征在于胶原的过量产生，导致皮肤增厚.大约300,000美国人 患有硬皮病.
包括克隆氏病和溃疡性结肠炎的炎性肠病是消化系统的自身免疫
病
本发明进一步涉及编码结合域-免疫球蛋白融合蛋白的构建体，具 体涉及用于给予编码可以表达为例如所述多舦的片段、类似物和衍生物的所述蛋白的重组构建体的方法.当提到结合域—免疫球蛋白融合 多肽或融合蛋白时，"片段"、"衍生物"和"类似物"是指任何保持与 所述多肽基本相同的生物功能或活性的任何结合城 一 免疫球蛋白融合 多肽或融合蛋白.因此，类似物包括可以被前蛋白部分的切割所激活 而产生活性结合域 一 免疫球蛋白融合多肽的前蛋白.
此处提到的由cDNA编码的结合域-免疫球蛋白融合多肽或融合 蛋白的片段、衍生物或类似物，包括结合域-免疫球蛋白融合多肽或 融合蛋白可以是(i)其中的一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的 氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)所取代，并且所述被取代的氨 基酸残基可以或不可以由遗传密码编码，或(ii)其中的一个或多个氨基 酸残基包含取代基，或(iii)其中的其它氨基酸融合于结合域免疫球蛋白 融合多肽，包括用于检测结合域免疫球蛋白融合多肽或前蛋白序列， 或对其进行特异性功能改变.根据此处的教导，所述片段、衍生物和 类似物被认为在本领域技术人员公知的范闺内.
本发明的多肽包括具有与本领域公知的序列或其片段或部分相同 或相似的结合域多肽氨基酸序列的结合域免疫球蛋白融合多舦和融合 蛋白.例如用于说明而不是限定性的，人CD154分子胞外域可考虑用 于本发明，作为与报道的多肽和所述多肽的部分具有至少70%相似性 (优选70%同一性)，更优选90%相似性(优选^)%同一性)，更优选 95%相似性(优选95%同一性)的多肽，其中所述结合域免疫球蛋白 融合多肽的部分一般含有至少30个氨基酸，更优选50个氨基酸.
如本领域所公知，两个多肽间的"相似性"通过比较多肽的氨基酸 序列和多肽的保守氨基酸取代与第二个多肽的序列而确定.编码本发 明的多肽的核酸的片段或部分可以用于合成本发明的全长核酸.如此 处所用到的，"百分比同一性"表示当使用有空位的BLAST算法如 Altschul et al.， 1997 Nucl. Ac. Res. 25: 3389)对两个或更多多肽进行比 对并分析其序列时，相应氦基酸残基位置处的相同氨基酸百分比，该 算法根据国家卫生部/ NCBI数据库提供的缺省加权，对序列空位和序 列错配进行加权(Bethesda， MD; 见 www. ncbi. nlm. nih. gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast).
"分离的"表示该物质被从其来源环境(例如，如果天然存在，则 为天然环境)中取出.例如，存在于活动物体内的天然存在的核酸或多肽不是分离的，但与天然系统中一些或全部共存物质分开的相同核 酸或多肽则是分离的.所迷核酸可以是栽体的部分和/或所述核酸或多 肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为所述栽体或組合 物不是其天然环境的一部分.
"基因"表示参与产生多肽链的DNA的片段，它包括在编码区之 前和之后的区域"前导区和非转录尾区"以及各个编码片段(外显子) 之间的间插序列(内含子).
如此处所描述，本发明提供了由具有框内融合于類外的免疫球蛋白 结构域编码序列的结合域编码序列的核酸编码的结合城免疫球蛋白融 合蛋白，所迷框内融合提供了与額外的功能性多肽序列融合的结合域 多肽序列的表达，从而，例如但不限于允许了融合蛋白的检测、功能 性改变、分离和/或纯化.所述融合蛋白可以通过含有影响融合产物行 为的频外的免疫球蛋白来源的多肽序列而允许结合域的功能性改变， 例如(以及上文所述)减少参与二硤鍵形成的就基和赋予加强ADCC 和/或CDC的能力.
可以通过本领域技术人员公知的任何方法实现多肽的修饰.此处的 优选方法依赖于编码融合蛋白的DNA的修饰和所述修饰DNA的表达. 编码上文所讨论的结合域-免疫球蛋白融合蛋白之一的DNA可以采 用标准方法进行诱变，包括下文所迷方法.例如，可以从多肽中去除 或取代促进多聚体形成或促进特定分子构象的半胱氨酸残基，例如负 责聚集物形成的半胱氨酸残基.如果必要，可以通过缺失和/或取代半 胱氨酸残基而从经验上确定有利于聚集的半胱氨酸残基，并且确定得 到的蛋白在含有生理可接受的緩冲液和盐中是否聚集.此外，可以构 建和使用结合域-免疫球蛋白融合蛋白的片段.如上文所指出，已经 描述了许多候选结合域—免疫球蛋白融合蛋白的反受体/配体结合域， 因此本领域技术人员可以容易选择用于引入本发明的瞬时表达构建体 的编码产物中的适当多肽结构域.
氨基酸的保守取代是本领域公知的，可以在不改变得到的结合域免 疫球蛋白融合蛋白分子的生物活性的条件下进行.例如，所述取代一 般是通过在极性残基、带电残基.疏水残基、小残基等之间进行的. 如果必要，所述取代可以仅仅用体外生物测定法检测得到的修饰蛋白 结合适当的细胞表面受体、或结合适当抗原或所需靶分子的能力而进
31行经验确定.
本发明进一步涉及与此处提供的结合域-免疫球蛋白融合蛋白的 编码多核苷酸序列杂交的核酸分子，或其互补序列，这对本领域技术
人员是容易理解的，条件是在序列之间存在至少70%,优选至少90%, 更优选至少95%同一性.本发明特别涉及在严格条件下与此处提到的 结合域免疫球蛋白融合蛋白的编码核酸杂交的核酸.此处用到的《严 格条件"表示只有当序列之间有至少95%，优选97%同一性时才能杂 交的条件.与结合域-免疫球蛋白融合蛋白的编码核酸杂交的核酸在 此处的优选实施方案中是指，编码保持与此处引用的参考的cDNA编 码的结合域-免疫球蛋白融合多肽基本相同的生物功能或活性的多 肽.
此处用到的在特定的严格性条件下"杂交"是描述在两个单链核酸 分子之间形成的杂交体的稳定性.杂交的严格性一般是以杂交体退火 和洗涤的离子强度和溫度条件表达的."高"、"中"和"低"严格性包 括以下条件或与其相当的条件高严格性0.1 x SSPE或SSC， 0.1% SDS， 65"C;中严格性0.2 x SSPE或SSC, 0.1% SDS， 50TC;低严格性 1.0xSSPE或SSC，0.1。/oSDS，50X:.如本领域技术人员所公知，可以 通过改变用于预杂交、杂交和洗涤步壤的溶液的时间、温度和/或浓度 而达到杂交条件的严格性的改变，适当的条件也部分依赖于所使用探 针，以及印迹的先证者核酸样品的特定核苷酸序列.因此，可以理解， 不用过多的实验就可以容易选择适当的严格条件，其中基于与一种或 多种先证者序列杂交而不与某些其它先证者序列杂交的能力而鉴定探 针的所需选择性.
本发明的核酸分子，此处也称作多核苷酸，可以是RNA或DNA形 式，所述DNA包括cDNA,基因组DNA和合成DNA. DNA可以是双 链或单链，如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链.用于
本发明的编码结合域免疫球蛋白融合多肽的编码序列可以与本领域公 知的编码任何结合域 一免疫球蛋白融合蛋白的序列同一，或者可以是 不同的编码序列，其由于遗传密码的冗余或简并而编码相同的结合域 -免疫球蛋白融合多肽，
编码用于本发明的结合域—免疫球蛋白融合多肽的核酸可以包括，
但不限于只有结合域-免疫球蛋白融合多肽的编码序列；结合域-
32免疫球蛋白融合多肽的编码序列和賴外的编码序列；结合域—免疫球 蛋白融合多肽的编码序列(任选類外的变序列)和非编码序列，例如 内含子或结合域—免疫球蛋白融合多肽的编码序列的5，和/或3，非编码 序列，例如可以进一步包括，但不限于，可以是被调节的或可调节的 启动子、增强子、其它转录调节序列、阻遏物结合序列、翻译调节序 列或其它调节核酸序列的一种或多种调节性核酸序列.因此，编码结 合域-免疫球蛋白融合蛋白的"核酸"或"多核苷酸"包括仅含有结
合域-免疫球蛋白融合多舦的编码序列的核酸和含有频外的编码和/或 非编码序列的核酸.
用于此处的核酸和寡核苷酸可以通过本领域公知的任何方法合成 (见，例如WO 93/01286，美国申请系列号07/723,454;美国专利 5,218,088;美国专利5，175，269;美国专利5,109,124).用于本发明的寡 核苷酸和核酸序列的鉴定包括本领域公知的方法.例如，有用的寡核 苷酸的所需特性、长度和其它特征是公知的.在某些实施方案中，可 以将合成寡核苷酸和核酸序列设计为抗内源性宿主细胞核酸裂解醉的 降解，这是通过含有疏代疏酸酯、甲基膦酸酯、砜、碟酸酶、羰游基、 二疏代硫酸醋、氨基疏酸酯、砩酸酶等鍵和其它证明可用于反义应用 的键而实现的(见，例如Agrwal et al,， Tetrehedron Lett 28: 3539-3542 (1987); Miller et al.， J Am. Chem. Soc. 93 : 6657-6665 (1971); Stec et al" Tetrehedron Lett. 26 s 21912194 (1985》Moody et al" Nucl, Acids Res. 12: 4769-4782 (1989); Uznanski et al" Nucl. Acids Res. (1989); Letsinger et al" Tetrahedron 40: 137-143 (1984); Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54: 367-402 (1985); Eckstein, Trends Biol. Scie 14: 97-100 (1989); Stein In: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed， Macmillan Press, London, P97-117 (1989); Jager et al" Biochemistry 27: 7237-7246 (1988) )
在一种实施方案中，本发明提供了用于结合城-免疫球蛋白融合蛋 白的截短成分(如结合域多肽、铰链区多肽、接头等)，在另一种实施 方案中，本发明提供了编鸡具有所述截短成分的结合城-免疫球蛋白 融合蛋白的核酸.截短的分子可以是任何包含少于分子的全长形式的 分子.本发明提供的截短分子可以包括截短的生物聚合物，在优选实 施方案中，截短的分子可以是截短的核酸分子或截短的多肽.截短的分子具有已知或已描述过的核酸分子的少于全长的核苷酸序列，所述 已知或已描述过的核酸分子可以是天然存在的、合成的或重组的核酸 分子，只有本领域技术人员认为它是全长分子.这样，例如，相当于
基因序列的截短的核酸分子含有少于全长的基因，其中该基因包含编 码和非编码序列、启动子、增强子和其它调节序列、側翼序列等，以 及认为是基因的一部分的其它功能性和非功能性序列.在另一实施例
中，相当于mRNA序列的截短的核酸分子舍有少于全长的mRNA转 录物，该mRNA转录物可以包含各种翻译和非翻译区以及其它功能性 和非功能性序列.
在其它优选实施方案中，截短的分子是包含少于特定蛋白或多肽成 分的全长氨基酸序列的多肽.此处用到的"缺失"具有本领域技术人 员所理解的其常用的含义，并可以在任意末端或非末端区相对于相应 的全长分子缺乏序列的一个或多个部分，例如，此处提供的截短分子， 作为线性生物聚合物的截短分子如核酸分子或多肽可以在分子的任意 末端具有一个或多个缺失，或者在分子的非末端区具有缺失，其中所
述缺失可以是1-1500个连续核苷酸或氨基酸残基的缺失，优选1-500 个连续核苷酸或氨基酸残基的缺失，更优选1-300个连续核苷酸或氡基 酸残基的缺失.在某些特别优选的实施方案中，截短的核酸分子可以 具有270-330个连续核苷酸的缺失.在某些其它特别优选的实施方案 中，截短的多肽分子可以具有80-140个连续氨基酸的缺失.
本发明进一步涉及此处提到的编码结合域 一免疫球蛋白融合多肽 的片段、类似物和/或衍生物的核酸的变体.编码结合域-免疫球蛋白 融合多肽的核酸的变体可以是核酸的天然存在的等位变体或天然存在 的变体.如本领域所公知，等位变体是可能具有一个或多个核苷酸的 取代、缺失或添加中的至少一种的核酸序列，其中任意一种都基本不 改变被编码的结合域—免疫球蛋白融合多肽的功能.
可以通过编码结合域 一免疫球蛋白融合多肽的核苷酸序列的突变 而获得结合域-免疫球蛋白融合多肽的变体和衍生物.可以通过任意 常规方法完成天然氨基酸序列的改变.可以通过合成含有突变序列的 寡核苷酸将突变引入特定位点，其側翼为能够与天然序列的片段连接 的限制位点.连接后，得到的重构序列编码具有所需氨基酸插入、取 代或缺失的类似物.或者，可以使用定位于寡核苷酸的位点特异性诱变程序来提供改变 的基因，其中预定的密码子可以通过取代、缺失或插入来改变.进行
所述改变的示例性的方法公开于Walder et al. (Gene 42 : 133,1986); Bauer et al. (Gene 37: 73,1985》Craik (BioTechniques, January 1985，12陽19); Smith et al. (Genetic Engineering : Principles and Methods BioTechniques, January 1985,12-19); Smith et al. (Genetic Engineering. Principles and Methods, Plenum Press, 1981) ; Kunkel (Proc. Natl. Acad Sci. USA 82 : 488,1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154 : 367， 1987);以及美国专利4，S18，584和4,737,462.
例如，可以通过对编码蛋白的DNA进行定点诱变并联合使用DNA 扩增方法而修饰DNA,在扩增方法中使用引物在DNA模板中引入并 扩增改变，例如通过重叠延伸(SOE)进行PCR剪接.定点诱变一般 是采用具有单链和双链形式的噬菌体栽体而实现的，所述栽体如公知 并可以购得的M13噬菌体栽体.可以使用其它适当的含有单链噬菌体 复制起点的栽体(见，例如Veira et al" Meth. Enzymol, IS : 3,1987 ) 概言之，通过制备编码目的蛋白(如特定结合域-免疫球蛋白融合蛋 白的全部或组成部分)的单链栽体进行定点诱变.在与单链栽体中的 DNA同源的区域内含有所需突变的寡核苷酸引物与栽体退火，然后加 入DNA聚合酶，例如大肠杆菌DNA聚合酶I(克列诺片段)，该聚合 酶使用双链区作为引物，以产生异双链体，其中一条链编码改变的序 列，另一条为最初的序列.将异双链体引入适当的细菌细胞并选择包 含所需突变的克隆.得到的改变的DNA分子可以在适当宿主细胞中重 组表达以产生修饰的蛋白.
本发明也包括编码各种氨基酸残基或序列的添加或取代，或末端缺 失或生物活性所不需要的内部残基或序列缺失的等同的DNA构建体. 例如，如上文所讨论，编码不需要的或对生物活性不是关鍵的Cys残 基的序列可以进行改变，导致Cys残基缺失或被其它氨基酸取代，从 而防止在复性时形成异常分子内二疏桥.
宿主生物包括那些可以重组产生本发明的重组构建体编码的结合 域-免疫球蛋白融合产物的生物，例如细菌(如大肠杆菌)、酵母(例 如哞酒糖酵母和巴斯德毕赤氏酵母)、昆虫细胞和哺乳动物，包括体内
和体外表达.因此宿主生物可以包括用于此处提供的疫苗的构建、繁殖、表达或其它步驟的生物；宿主也包括其中发生免疫应答的受试者， 如上文所迷.此处优选的宿主生物是大肠杆菌林，近交鼠系和鼠细胞 系，以及人细胞、受试者和细胞系.
将编码所需结合域-免疫球蛋白融合蛋白的DNA构建体引入用于 在适当宿主中表达的质粒.在优选实施方案中，宿主是细菌宿主.编 码配体或核酸结合域的序列优选进行了密码子优化，用于在特定宿主 中表达.因此，例如，如果人结合域-免疫球蛋白融合蛋白在细菌中 表达，将对密码子进行优化用于细菌使用.对于小的编码区，可以将 基因合成为单个寡核苷酸.对于较大的蛋白，可以使用多个核苷酸的 剪接、诱变或其它本领域公知的技术.质粒中的作为调节区的核苷酸 序列，例如启动子和採纵子，进行了彼此的搮作性结合，用于转录. 编码结合域-免疫球蛋白融合蛋白的核苷酸序列也可以包括编码分泌 信号的DNA,由此得到的肽是前体蛋白.得到的加工后的蛋白可以从 周质间隙或发酵培养基中回收.
在优选实施方案中，DNA质粒也包含转录终止子序列.此处用到 的"转录终止子区"是传递转录终止信号的序列.完整的转录终止子 可以从蛋白编码基因获得，该基因可以与插入的结合域-免疫球蛋白 融合蛋白编码基因或启动子来源相同或不同.转录终止子任选是此处 的表达系统的成分，但在优选实施方案中使用.
此处使用的质粒包含与编码目的蛋白或多肽的DNA採作性连接的 启动子，并且设计用于在上文所迷宿主(例如细菌、鼠或人)中表达 蛋白，这取决于质粒的所需用途(例如，给予含有结合域-免疫球蛋 白融合蛋白编码序列的疫苗).用于表达此处的蛋白和多肽的适当启动 子可以从多种途径获得，并且是本领域公知的.优选连接于调节区的 诱导型或组成型启动子.这些启动子包括，但不限于T7噬菌体启动子 或其它T7样噬菌体启动子，例如T3， T5和SP6启动子，trp， lpp和lac 启动子，如大肠杆菌的lacUV5启动子；杆状病毒/昆虫细胞表达系统 的PIO或多角体蛋白基因启动子(见，例如美国专利5,243,041， 5，242，687, 5,266,317， 4,745,051和5,169,784)以及来自于其它真核表 达系统的诱导型启动子.对于表达蛋白，将这些启动子插入质粒，与 控制区如lac搮纵子处于搮作性连接.
优选的启动子区是在大肠杆菌中可诱导并且具有功能的.适当的诱导型启动子和启动子区的例子包括，但不限于，反应于异丙基-D-硫代吡喃半乳糖糖普(IPTG;见Nakamura et al.， Cell 18 : 1109-1117,1979)的大肠杆菌lac操纵子；反应于重金属(如锌)诱导的金属疏蛋白启动子金属调节元件(见例如Evans等的美国专利4,870,009 );反应于IPTG的噬菌体T71ac启动子(见例如美国专利4，9S2，496;和Studier et al.，Meth. Enzymol. 185 : 60-89,1990)以及TAC启动子.
质粒可以任选包含在宿主中具有功能的一个或多个可选择标记基因.可选择标记基因包括任何赋予细菌能够使被转化细菌细胞从大量未转化细胞中鉴定出来并选摔性生长的表型的基因.用于细菌宿主的适当可选择标记，例如包括氛千青審素抗性基因(Amp1)、四环素抗性基因(T《0和卡那審素抗性基因(Kan1).在此优选卡那審素抗性基因.
质粒也可以包含编码用于可操作性连接的蛋白的分泌信号的DNA.使用的分泌信号可以从多种途径获得并且是本领域公知的.此处优选的分泌信号包括，但不限于，由以下大肠杆菌基因编码的信号ompA，ompT， ompF， ompC， J5-内酰胺醉和械性辨酸酶等(von Hei〗ne， J MoLBioL 184 : 99-105， 1985).此外，可以使用细菌pelB基因分泌信号(Leiet al.， J. Bacteriol. 169 : 4379,1987), phoA分泌细胞和在昆虫细胞中有功能的cek2.最优选的分泌信号是大肠杆菌ompA分泌信号，也可以使用本领域公知的其它原核和真核分泌信号(见，例如von Heijne， JMoL Biol. 184 : 99-105， 1985).采用此处描述的方法，本领域技术人员可以替换在酵母、昆虫或哺乳动物细胞中有功能的分泌信号以从这些细胞分泌蛋白.
用于转化大肠杆菌细胞的优选质粒包括pET表达栽体(如pET-1 la,pET-12a-c， pET-15b;见美国专利4,952,496 ;可以从Novagen，Madison, WI.获得).其它优选的质粒包括pKK质粒，特别是pKK223-3，它含有tac启动子(Brosius et al" Proc. Natl. Acad, Sci. 81 :6929,1984; Ausubel et al" Current Protocols in Molecular Biology ;美国专利5,122,463，5,173,403，5,187,153,5,204,254，5，212，058,5,212,286，5，215，卯7， 5,220,013, 5，223，483和5,229,279).已经通过用卡那莓素基因替代氨苄青霉素抗性基因而修饰质粒pKK (可以从Pharmacia;得自pUC4K,见例如Vieiraetal (Gene 19 :259 268,1982;和美国专利4，719，179.).杆状病毒栽体，例如pBlueBac(也称作pJVETL及其衍生物)，特别是pBlueBac III (见例如美国专利5，278，050, 5，244，805， 5,243,041, 5,242,687， 5,266,317， 4,745,051和5,169,784;可以从 Invitrogen， San Diego得到)也可以用于在昆虫细胞中表达多肽.其它 质粒包括pIN-IIIompA质粒(见美国专利4,575,013;也见Duffaud et alv Meth,Enz,153:492- 507, 1987)，例如pIN-IIIompA2,
优选地，DNA分子在细菌细胞中复制，优选在大肠杆菌中复制. 优选的DNA分子也包括细菌的复制起点，以保证DNA分子在细菌的 各代中保留.以此方式，可以通过在细菌中的复制产生大量DNA分子. 优选的细菌复制起点包括，但不限于fl-ori和col El复制起点，优选的 宿主细胞含有可操作性连接于诱导型启动子，如lacUV启动子的编码 T7 RNA聚合酶的DNA (见美国专利4,952,496).所述宿主包括，但 不限于溶原体大肠杆菌林HMS174 (DE3) pLysS， BL21 (DE3) pLysS， HMS174 (DE3)和BL21 (DE3).菌林BL21 (DE3)是优选的.pLys提 供了低水平的T7溶菌酶，即T7 RNA聚合酶的一种天然抑制刑.
提供了 DNA分子也可以含有编码阻遏蛋白的基因.阻遏蛋白能够 抑制含有结合于阻遏蛋白的核苷酸序列的启动子的转录.可以通过改 变细胞的生理条件而解除启动子的阻遏.例如，该改变可以通过在生 长培养基中加入抑制与採纵子或调节蛋白或DNA的其它区域相互作 用的能力的分子或通过改变生长培养基的温度而完成，优选的阻通蛋 白包括，但不限于反应于IPTG诱导的大肠杆菌lacl阻遏物，温度敏 感性kcl857阻遏物等.
概言之，本发明的重组构建体也将含有转录和翻译的必要元件.具 体地，这些元件是优选的，其中含有编码结合域-免疫球蛋白融合蛋 白的核酸的重組表达构建体将用于在宿主细胞或生物中报道.在本发 明的某些实施方案中，可以通过放置启动子调节下的基因而完成细胞 结合域免疫球蛋白 一融合蛋白编码基因的细胞类型优选性或细胞类型 特异性表达，启动子的选择将取决于待转化细胞类型和所需控制的程 度或类型.启动子可以是组成型的或有活性的，并且可以进一步是细 胞类型特异性的，组织特异性的、各个细胞特异性的、事件特异性的、 时间特异性的或诱导型的.细胞类型特异性启动子和亊件类型特异性 的启动子是优选的.组成型或非特异性启动子的例子包括SV40早期启 动子(美国专利5,118,627)、 SV40晚期启动子(美国专利5,118,627)、CMV早期基因启动子(美国专利5，168，062)，以及腺病毒启动子.除 病毒启动子外，细胞启动子也用于本发明的内容.具体地，可以使用 用于所谓的管家基因的细胞启动子.病毒启动子是优选的，因为它们 一般是比细胞启动子更强的启动子.已经在许多真核生物，包括高等 真核生物中鉴定了启动子区，这样本领城技术人员可以容易选择用于 特定宿主的适当启动子.
也可以使用诱导型启动子.这些启动子包括由地塞米松诱导的 MMTV LTR (PCT WO 91/13160)、由重金属诱导的金属疏蛋白启动子； 和由cAMP诱导的具有cAMP反应元件的启动子.通过使用诱导型启 动子，编码结合城-免疫球蛋白融合蛋白的核酸序列可以由本发明的 表达构建体递送至细胞，并且保持静止，直到加入诱导刑.达允许了 对基因产物的产生时间的进一步控制.
亊件类型特异性启动子仅仅在发生某种事件，如致肿瘸性或病毒感 染时才有活性或被上调.HIV LTR是亊件类型特异性启动子的公知例 子.该启动子是无活性的，除非存在tat基因产物，这是在病毒感染时 发生的. 一些亊件类型特异性启动子也是组织特异性的.
此外，可以使用由特定细胞基因协同调节的启动子.例如，当需要 特定结合域融合蛋白编码基因的表达与一个或多个額外内源性或外源 性引入的基因协同时，可以使用协同表达的基因的启动子.当已知与 在免疫系统的特定組织中引入免疫应答相关的基因表达模式时，这种 类型的启动子特别有用，这样该組织内的特异性免疫感受态细胞可以 被激活或募集参与免疫应答.
除了启动子外，可以插入阻遏序列、负调节子、或组织特异性沉默 子，以减少某些情况下结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码基因的非特 异性表达，所迷情况例如，作为治疗策略的一部分而瞬时无免疫应答 的宿主.可以在启动子区插入多种阻遏元件.转录的阻遏是不依赖于 阻遏元件的方向或与启动子的距离的. 一种类型的阻遏序列是绝緣序 列 这种序列抑制转录(Dunaway et al" Mol Cell Biol 17182-9,1997; Gdula et al" Proc Natl Acad Sci USA 93 : 9378-83,1996， Chan et al" J Virol 70 : 5312-28,1996; Scott and Geyer， EMBO J 14 : 6258-67,1995; Kalos and Fournier, Mol Cell Biol 15 : 198-207,1995; Chung et al" Cell 74 : 505-14，1993)并将沉默本底转录.
39也在II型(軟骨)胶原、碱性醜基转移酶、白蛋白(Hu et al.， J. Cell Growth Differ. 3 (9): 577-588， 1992)、磷酸甘油激酶(PGK-2) (Misuno et al.， Gene 119 (2): 293-297，1992)的启动子区和6 -裤酸果糖-2 -激醉/ 果糖-2， 6-二磷酸酶基因中鉴定了阻遏元件(Lemaigre et al.， Mol. Cell Biol, 11 (2): 1099-1106).此外，在许多肝脏特异性基因中鉴定了阴 性负调节元件Tse-l，发现其阻断cAMP反应元件-(CRE)介导的肝细 胞中基因激活的诱导(Boshart et al.， Cell 61 (5): 905-916,1990).
在优选实施方案中，将增加所需产物的表达的元件掺入构建体中. 所述元件包括内部核糖体结合位点(IRES; Wang and Siddiqui， Curr. Top. Microbiol. Immunol 203 :外，1995; Ehrenfeld and Semler， Curr, Top. Microbiol. Immunol. 203 : 65,1995; Rees et al., Biotechniques 20: 102,1996; Sugimoto et al,， Biotechnology 12 : 694,1994). IRES增加翻 译效率.同样，其它序列也增加表达.对于一些基因，特別是在5，端 的序列抑制转录和/或翻译.这些序列通常是可以形成发夹结构的回文 序列. 一般去除待递送核酸中的这种序列.对转录或翻译产物的表达 水平进行了测定，以证实或确定哪些序列影响表达.可以用任何公知 的方法测定转录水平，包括RNA印迹杂交，RNA酶探针保护等.可 以通过任意公知的方法测定蛋白水平，包括ELISA,蛋白印迹，免疫 细胞化学或其它公知方法.
可以将其它元件掺入本发明的结合域免疫球蛋白融合蛋白中.在优 选实施方案中，该构建体包含转录终止子序列，包括聚腺苷酸化位点， 剪接供体和受体位点，以及增强子.也可以掺入其它用于表达构建体
和将其维持在哺乳动物细胞或其它真核细胞中的元件(如复制起点). 由于这些构建体可以方便地在细菌细胞中产生，掺入了对于在细菌中 增殖是必要的，或者增强在细菌中增殖的元件.所示元件包括复制起 点、可选择标记等.
此处通过同时递送两种或更多的不同调节的核酸构建体而使用本 发明的构建体将对结合域_免疫球蛋白融合蛋白编码核酸的表达的附 加控制递送给细胞.使用这样的多核酸构建体方法可以允许免疫应答 的协同调节，例如，依赖于细胞类型和/或另一所表达的被编码成分的
空间时间协同.本领域技术人员可以理解，通过选择适当的调节序列 可以用相似的方式完成多个水平的被调节基因表达，所述调节序列包括但不限于启动子、増强子和其它公知的基因调节元件.
本发明也涉及栽体，以及通过包含本发明的核酸的4S知栽体制备的 构建体，特別涉及包含结合域-免疫球蛋白融合蛋白的任何编码核酸
的"重組表达构建体"和上文提供的本发明的多肽；涉及通过用本发 明的栽体和/或构建体而基因工程化的宿主细胞，以及通过重組技术施 用包舍本发明的所述结合域-免疫球蛋白融合多肽和融合蛋白，或其 片段或变体的编码核酸的方法.结合域-免疫球蛋白融合蛋白基本可 以在适当启动子的控制下在任何宿主细胞中表达，这取决于构建体的 性质(如上文所述启动子的类型)，以及所需宿主细胞的性质(如是有 丝分裂后最终分化或活跃分裂；如表达构建体在宿主细胞中是作为附 加体存在还是整合到宿主基因组中).用于原核和真核宿主的适当克隆 和表达栽体描述于Sambrook， et al" Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY， (1989),如上文所指 出，在本发明的特别优选的实施方案中，在用本发明的重组表达构建 体转染或转化的哺乳动物细胞中进行重組表达.
一般地，用质粒栽体递送构建体.优选的构建体是改进的pNASS 栽体(Clontech， Palo Alto， CA)，其具有编码氨苄青審素抗性基因的核 酸、聚腺苷酸化信号和T7启动子位点.其它适当的哺乳动物表达栽体 是公知的(见，例如，Ausubel et al" 1995; Sambrook et al" supra ;也 见,例如catalogues from Invitrogen， San Diego， CA; Novagen， Madison， WI; Pharmacia, Piscataway， NJ,及其它) 目前可以制备的 优选构建体包含适当调控下的二氩喋呤还原醉(DHFR)编码序列，用于 增加结合域-免疫球蛋白融合蛋白的产生水平，该水平是通过在施用 适当选择试刑(如methetrexate)后进行基因扩增而达到的.
一般地，重组表达栽体包括允许宿主细胞转化的复制起点和可选择 标记，以及来自于高表达的基因、用于指导下游结构序列转录的上文 所述的启动子.异源结构序列与翻译起始和终止序列组装在适当噬菌 体中.因此，例如，此处提供的结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码核 酸可以包含在各种表达栽体中，所述栽体构建为重组表达构建体，用 于在宿主细胞中表达结合域-免疫球蛋白融合多肽.在某些优选实施 方案中，构建体包含在体内给药的制刑中.所述栽体和构建体包括染 色体的、非染色体的和合成DNA序列，如，SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA;酵母质粒，来源于质粒和噬菌体DNA的联合的栽体、 病毒DNA如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒，以及假狂犬病病毒或复制 缺陷逆转录病毒的DNA,如下文所述.然而，任何其它栽体可以用于 制备重组表达构建体，在优选实施方案中，所迷栽体是可复制的，并 且可在宿主中存活.
可以通过各种程序将适当的DNA序列插入栽体中.概言之，通过 本领域公知的程序将DNA序列插入适当的限制性内切酶位点.用于克 隆、DNA分离、扩增和純化的标准技术，用于酶促反应的标准技术， 包括DNA连接酶，DNA聚合酶、限制性内切醉等，以及各种分离技 术是本领域技术人员公知和通常使用的.许多标准技术描述于，例如 Ausubel et al. (1993 Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA); Sambrook et al. (1989 Molecular CUming， Second Ed.， Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview， NY); Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Glover (Ed.) (1985 DNA Cloning Vol. I and II， IRL Press, Oxford, UK); Hames and Higgins (Eds,)， (1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK);及其它.
表达栽体中的DNA序列与至少一种适当的表达控制序列(如组成 型启动子或受调节的启动子)搮作性连接，以指导mRNA合成.这种 表达控制序列的代表性例子包括真核细胞启动子或上迷真核细胞病 毒.可以使用CAT (氯審素转移醉)栽体或其它具有可选择标记的栽 体从任何需要的基因选择启动子区.真核启动子包括CMV立即早期启 动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒 LTR启动子和小鼠金属硫蛋白-I启动子.适当启动子的选择处于本领 域普通技术人员的水平之内，此处描述了某些特别优选的重组表达构 建体的制备，其中包含与编码结合域-免疫球蛋白融合多肽的核酸可
搮作性连接的至少一种启动子或受调节启动子.
由高等真核动物进行的编码本发明的多肽的转录可以通过将增强 子序列插入栽体而增强.增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10 -300bp,作用于启动子以増加其转录.增强子的例子包括位于复制起 点晚期侧100-270bp的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、
42复制起点晚期側的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子.
此处在某些实施方案中提供的栽体可以是病毒栽体如逆转录病毒
栽体(MHler et al" 1989 BioTechniques 7: 980; Coffin and Var咖s， 1996 Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.).例如， 可以得到逆转录病毒质粒栽体的逆转录病毒包括，但不限于莫洛尼鼠 类白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤 病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、 骨號增殖性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒.
逆转录病毒是一种通过DNA中间体能复制并整合到宿主细胞基因 组中的RNA病毒.该DNA中间体，或前病毒，可以穗定整合到宿主 细胞DNA.根据本发明的某些实施方案，疫苗可以包含掺入了编码外 源蛋白的外源基因而替代正常逆转录病毒RNA的逆转录病毒.当逆转 录病毒伴随感染进入宿主细胞时，外源基因也引入细胞中，然后可以 作为逆转录病毒基因组的一部分而整合到宿主细胞DNA中.该外源基 因的在宿主中的表达导致外源蛋白的表达.
开发用于基因治疗的大多数逆转录病毒系统都是基于鼠逆转录病 毒.所述逆转录病毒以两种形式存在，即作为称作毒粒的游离病毒颗 粒，或作为整合到宿主细胞DNA中的前病毒.毒粒形式的病毒舍有逆 转录病毒的结构蛋白和酶蛋白(包括逆转录睐)、病毒基因組的两个 RNA拷贝、以及含有病毒被膜糖蛋白的来源细胞质膜的部分.逆转录 病毒基因组組织为四个主要区城含有转录起始和终止所必须的顺式 作用元件并且位于编码基因的5，和3，的长末端重复(LTR)，以及三个编 码基因gag， pol和env.这三个基因gag， pol和env分別编码内部病毒 结构、酶蛋白(如整合醉)以及赋予病毒感染性和宿主范围特异性的 被膜糖蛋白(称为gp70和pl5e),以及未确定功能的"R"肽.
巳经开发了单独的包装细胞系和栽体产生细胞系，这是出于逆转录 病毒使用的安全性考虑，包括它们在本发明的疫苗中使用的安全性 简言之，该方法使用了两种成分，逆转录病毒栽体和包装细胞系(PCL). 逆转录病毒栽体含有长末端重复(LTRs)、待转移的外源DNA和包装序 列(y).该逆转录栽体自身不会复制，因为编码结构蛋白和被腹蛋白的 基因没有包含在栽体基因组中.PCL含有编码gag， pol和env蛋白的 基因，但不含包装信号"y".这样，PCL自身只能形成空的毒粒.在此普通方法中，将逆转录病毒栽体引入PCL中，从而建立栽体产生细胞 系(VCL).该VCL制造仅含有逆转录病毒(外源)基因組的毒粒，因 此被认为是用于质粒用途的安全的逆转录病毒栽体.
"逆转录病毒栽体"是指在本发明优选实施方案中能够指导目的序 列或基因，如结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码核酸序列的表达的组 装体.简言之，逆转录病毒构建体可以包含5'LTR、 tRNA结合位点、 包装信号、笫二条链DNA合成的起点和3'LTR.可以将多种异源序列 包含在栽体构建体中，例如，编码蛋白(如细胞毒性蛋白、疾病相关 抗原、免疫辅助分子或替代基因)的序列，或自身作为分子的序列(如 作为核酶或反义序列).
可以容易从多种逆转录病毒构建本发明的逆转录病毒构建体，包括 例如B、 C和D型逆转录病毒以及泡沫病毒和慢病毒(见，例如RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985).所述逆转录病毒可以容易从存放处或保藏中心获得，例如从美 国典型培养物保藏中心("ATCC" ; RockviUe， Maryland),或者使用 常用技术从公知来源分离.根据此处提供的公开内容和标准重组技术， 可以使用上述任意逆转录病毒以组装或构建本发明的逆转录病毒栽体 构建体、包装细胞或生产细胞(如Sambrook et al， Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2d ed争，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ; Kunkle， PNAS 82 : 488,1985).
用于病毒栽体中的适当启动子可以包括，但不限于描述于Miller, et al.， Biotechniques 7: 980-9卯(1989)中的逆转录病毒LTR; SV40启动 子和人巨细胞病毒(CMV)启动子，和任意其它启动子(如细胞启动 子，如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、polIII和p肌动蛋白 启动子).其它可以使用的病毒启动子包括，但不限于腺病毒启动子、 胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子.根据此处包含的教导 和上文描述的受调节启动子或启动子，本领域技术人员可以明白适当 启动子的选择.
如此处所描述，使用逆转录病毒质粒栽体转导包装细胞系以形成生 产细胞系，可以转染的包装细胞系包括，但不限于Miller， Human Gene Therapy, 1: 5-14 (1990)中描述的PE501, PA317, ，2， ，AM， PA12, T19-14X， VT-19國17-H2， \|/CRE，甲CRIP， GP+E-86， GP+envAmI2和DAN细胞系.栽体可以通过本领域的任何方法转导包装细胞系.这些 方法包括，但不限于，电穿孔，脂质体的使用和CaP04沉淀.在另一 选择中，逆转录病毒质粒栽体可以包被在脂质体中，或偶联于脂，然 后给予宿主.
生产细胞系产生包含编码结合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋 白的核酸序列的感染性逆转录病毒栽体顆粒.然后用这些逆转录病毒 栽体颗粒体外或体内转导真核细胞.被转导的真核细胞将表达编码结
合域—免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白的核酸序列.可以转导的真核
细胞包括，但不限于，胚胎干细胞，以及造血干细胞、肝细胞、成纤
维细胞、循环外周血单核细胞和多形核细胞，包括骨拔单核细胞、淋
巴细胞、成肌细胞、组织巨噬细胞、树突细胞、肝巨虔细胞、淋巴结
和脾的淋巴和网状内皮细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞.
作为本发明的用病毒栽体制备重组结合域-免疫球蛋白融合表达 构建体的实施方案的另一个例子，在一个优选实施方案中，用指导结
合域免疫球蛋白融合多舦或融合蛋白表达的重组病毒构建体转导的宿 主细胞可以产生病毒颗粒，该病毒顆粒含有被表达的来源于病毒出芽 时由病毒颗粒掺入的宿主细胞膜的部分的结合域-免疫球蛋白融合蛋 白融合多肽或融合蛋白.
另一方面，本发明涉及含有上迷重组结合域-免疫球蛋白融合表达 构建体的宿主细胞.用本发明的栽体和/或表达构建体基因工程化(转 导、转化或转染)的宿主细胞可以是，例如，克隆栽体、穿梭栽体或 表达构建体.该栽体或构建体可以是，例如，质粒、病毒顆粒、噬菌 体等形式.工程化的宿主细胞可以在经改进的常规营养培养基中培养， 该培养基适于激活启动子、选择转化体或扩增特定基因如编码结合域 -免疫球蛋白融合多肽或结合域-免疫球蛋白融合蛋白的基因.选择 用于表达的特定宿主细胞的培养条件，如温度、pH等对于本领域技术 人员是容易理解的.
宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞， 如酵母细胞，或宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞.适当宿主细 胞的代表性例子包括，但不需要限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、 鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇S2和夜 蛾Sf9;动物细胞，如CHO， COS或293细胞；腺病毒；植物细胞，或适于体外繁殖或从头建立的适当细胞.本领域技术人员根据此处的 教导应该能够选择适当宿主细胞.
也可以使用多种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白.哺乳动物
表达系统的例子包括由Gluzmaii， Cell 23 : 175 (1981)描述的猴肾成纤 维细胞的COS-7系，以及其它能够表达相容栽体的细胞系，如C127， 3T3， CHO， HeLa和BHK细胞系.哺乳动物表达栽体将包含复制起点、 适当的启动子和增强子，以及必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位 点、剪接供体和受体位点、转录终止序列、和5，側翼非转录序列，例 如此处所提供的关于结合域-免疫球蛋白融合表达构建体的制备.来 源于SV40剪接的DNA序列，以及聚腺苷酸化位点可以用于提供需要 的非转录遗传元件.将构建体引入宿主细胞可以通过本领域技术人员 熟悉的各种方法而实现，包括但不限于，例如，磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染或电穿孔(Davis et al.， 1986 Basic Methods in Molecular Biology),
可以将本发明的结合域-免疫球蛋白融合蛋白制刑化为药物组合 物，用于根据常规方法给药.药物组合物一般包含一种或多种重組表
达构建体，和/或所述构建体的表达产物，并组合了可药用栽体、赋形 刑或稀释刑.所述栽体在使用的刑量和浓度下对接受者是无毒的.对 于基于核酸的制刑，或包含本发明的重組构建体的表达产物的制刑， 将给予约0.01jig/kg-约100mg/kg体重， 一般通过真皮内、皮下、肌 内或静脉途径或其它途径.优选的刑量为约ljig/kg-约1 mg/kg,约 5|ig/kg -约200|ig/kg是特别优选的 本领域技术人员将明白，给药的 次数和频率将取决于宿主的反应.用于治疗用途的"可药用栽体"是 制药领域公知的,描述于,例如Remingtons Pharmaceutical Sciences, MackPublishingCo. (A. R. Gennaroedit. 1985).例如，可以使用生理 pH的无菌盐水和磷酸緩冲盐水，可以通过药物组合物形式提供防腐 刑、稳定刑、染料和调味刑.例如，可以添加苯甲酸钠、山梨酸和P-鞋基苯甲酸的醋作为防腐刑.Id. 1449.此外，可以使用抗氧化刑和悬 浮刑.Id.
"可药用盐"是指本发明的化合物的盐，它来自于所述化合物和有 机或无机酸(酸加成盐)或有机或无机碱(碱加成盐)的组合.本发 明的化合物可以以游离碱或盐形式使用，两种形式都考虑处于本发明
46的范围内.
含有一种或多种结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码构建体(或它们 的表达产物)的药物组合物可以是允许将该组合物给予患者的任何形 式.例如，该组合物可以是固体、液体或气体(气溶胶).典型的给药 途径包括，但不限于口服、局部、肠胃外(如舌下或颊)、舌下、直肠、 阴道和弄内给药.此处使用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌 内、胸骨内、鞘内、腔道内、尿道内注射和输注技术.对药物组合物 进行制刑化，从而允许其中含有的活性成分在将组合物给予患者时是 生物可利用的.将给予患者的组合物是一种或多种刑量单位的形式， 例如，片刑可以是单剂量单位，本发明的气溶胶形式的一种或多种化 合物的容器可以具有多个刑量单位，
对于口服给药，可以存在赋形刑和/或粘合刑.其例子包括蔗糖、 高岭土、甘油、淀粉糊精、藻酸钠、羧甲基纤维素和乙基纤维素.可 以存在着色刑和/或调味刑.可以使用包衣.
組合物可以是液体，如脉剂、糖浆、溶液、乳状液或悬浮液形式. 该液体可以用于作为两个例子的口服给药或通过注射递送.当用于口
服给药时，除一种或多种结合域-免疫球蛋白融合构建体或表达产物 外，优选的组合物还含有一种或多种增甜刑、防腐剂、染料/着色刑和 调味刑.在用于注射给药的組合物中，可以含有一种或多种表面活性 刑、防腐剂、润湿刑、分散刑、悬浮刑、緩冲刑、穗定刑和等渗刑.
不论是溶液、悬浮液或其它形式，此处用到的液体药物组合物可以
包含一种或多种一些佐刑无菌稀释刑如用于注射的水、盐溶液，优 选生理盐水、林格氏液、等渗氣化钠，固定的油，如可以作为溶刑或 悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其 它溶刑；抗菌刑如苯甲醇或甲基对幾基苯甲酸醋；抗氣化刑如抗坏血 酸或亚碟酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；緩冲刑如乙酸盐、柠檬酸 盐或磷酸盐；以及用于调节渗透压的试刑如氦化钠或右旋糖，肠胃外 制刑可以包含于玻璃或塑料制备的安瓿、 一次性注射器或多刑重管形 瓶中.生理盐水是优选的佐刑.可注射的药物组合物优选是无菌的.
制刑中也可能需要包含其它成分，如递送栽体，包括但不限于铝盐、 油包水乳状液、生物可降解油栽体、水包油乳状液、生物可降解微胶 囊和脂质体.用于所述栽体中的免疫刺激物质(佐刑)包括N-乙耽胞壁耽-L-丙氨酸-D-异谷氨耽胺(MDP)、脂多糖(LPS)、葡聚糖、IL-12、 GM-CSF、 y干扰素和IL-15.
尽管在本发明的药物组合物中可以使用任何适当的本领域技术人员公知的栽体，栽体的类型将根据给葯方式和是否需要持续释放而不同.对于肠胃外给药，如皮下注射，栽体优选包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或緩冲液.对于口服给药，可以使用任何上迷栽体或固体栽体如甘露醇、乳糖、淀粉硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁.也可以将生物可降解微球体(如polylactic galactide)也可以用作本发明的药物组合物的栽体.适当的生物可降解微球体公开于，例如美国专利4,897,268和5,075,109.在这一点上，微球体优选大于约25微米.
药物组合物也可以包含稀释刑如緩冲液、抗氧化刑如抗坏血酸、低分子量( 小于约IO个残基)多肽、蛋白、氨基酸、糖，包括葡萄糖、蔗糖或糊精、螯合剂如EDTA、谷胱甘肽及其它穗定刑和赋形刑.中性緩冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是极为适合的稀释剂.优选地，用作为稀释刑的适当赋性溶液(如蔗糖)将该产物制刑化为冻干物.
如上文所述，本发明包括能够递送编码结合域—免疫球蛋白融合蛋白的核酸分子的组合物.所述组合物包括重组病毒栽体(如逆转录病毒(见WO 90/07936， WO 91/02805， WO 93/25234， WO 93/25698和WO 94/03622 )，腺病毒(见Berkner, Biotechniques 6 : 616-627,1988; Liet al" H亂Gene Ther. 4 : 403-409， 1993; Vincent et al" Nat. Genet. 5:130-134,1993;和Kolls et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :215-219,1994)，以及疽病毒(见美闺专利4，769，330;美闺专利5,017,487和WO 89/01973))，复合于聚阳离子分子的重组表达构建体核酸分子(见WO 93/03709 ),和脂质体相关的核酸(见Wang et al" Proc, Natl.Acad. Sci. USA 84: 7851， 1987).在某些实施方案中，DNA可以连接于杀死的或灭活的腺病毒(见Curiel et al.， Hum. Gene Ther. 3:147-154,1992; Cotton et al" Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89 : 6094，1992 ).其它适当的组合物包括DNA -配体(见Wu et al.， J. Biol. Chem.264 : 16985-16987， 1989)和脂质-DNA組合(见Feigner et al" Proc.Natl, Acad Sci. USA 84 : 7413-7417， 1989 ) 除了定位于体内程序，也可以使用体外程序，其中从宿主取出细胞，进行修饰，然后置于相同或另一宿主动物.明显的是，可以使用上述任意一种组合物，将结合域-免疫球蛋白融合蛋白或结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码核酸分子引入体外的组织细胞.病毒、物理和化学摄取方法的程序是本领域公知的.
因此，本发明用于治疗B细胞疾病或恶性状况的患者，或用于治疗来源于所述患者的细胞培养物.此处用到的"患者"是指任何温血动物，优选人.患者可以患有癌症，如B细胞淋巴痛或可以是正常的(即没有可检测的疾病和感染)."细胞培养物"是任何可以进行离体处理的制备物，例如，舍有免疫系统的免疫感受态细胞或分离细胞(包括但不限于T细胞、巨嗟细胞、单核细胞、B细胞和树突细胞)的制备物.所述细胞可以通过本领域公知的多种技术进行分离(如Ficoll-hypaque密度离心)，细胞可以(但不是必须)从B细胞疾病或恶性状况的患者中分离，并且可以在治疗后重新引入患者，
用于肠胃外或口服给药的液体组合物可以含有一定量的结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码构建体或表达产物，从而获得适当的剂量.一般地，该量为组合物中含有至少0.01 wt。/o结合域-免疫球蛋白融合构建体或表达产物.当用于口服给药时，该量可以是組合物的0.1-70 wt%.优选口服組合物含有约4 - 50 wt %的结合域—免疫球蛋白融合构建体或表达产物.优选组合物和制刑制备物一个肠胃外刑量单位含有0.01-1 wt %活性化合物.
药物组合物可以用于局部给药，在此情况下栽体可以适当包括溶液、乳状液、油骨或凝胶基质.该基质，例如可以包含一种或多种一些成分矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂坩、矿物油、稀释刑如水和醇，以及乳化剂和稳定刑.用于局部给药的药物组合物中可以存在增稠刑.如果用于经皮给药，该組合物可以包含经皮贴刑或离子电渗设备.局部制刑可以含有浓度为约0,1-10% w/v (每羊位体积的重量)的结合域 一免疫球蛋白融合构建体或表达产物.
组合物可以用于以在直肠中溶解并幹放药物的栓刑形式进行直肠给药.用于直肠给药的组合物可以含有油性基质，如适当的非刺激性赋形刑.所迷基质包括，但不限于羊毛脂、可可油和聚乙二醉.
在本发明的方法中，可以通过插入物、珠、时间控制释放制刑、贴剂或快速释放制剂的形式给予结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码构建体或表达产物.
以下实施例是作为举例而不是限制性的.
实施例实施例1
2H7可变区的克隆和2H7SCFV-IG的测序
该实施例说明了编码单克隆抗体2H7的重链和轻链可变区的cDNA分子的克隆，该实施例也证明了 2H7scFv-Ig的构建、测序和表达.
特异性结合于CD20的表达2H7单克隆抗体的杂交瘤细胞是由华盛顿州西雅图的华盛頓大学的Ed Clark提供的.在收获之前，将杂交瘤细胞在补加了谷氨酰胺、丙酮酸、DMEM非必须氨基酸和青審素-链審素的RPMI 1640培养基(Life Technologies, Gaithersburg， MD)中维持于对数生长期.通过离心从培养基重沉淀细胞，用2^107个细胞制备RNA.使用Pharmingen (San Diego， CA)总RNA分离试刑盒(目录号45520K)根据试刑盒所附制造商的说明从产生2H7的杂交瘤细胞分离RNA.用1微克(jig)总RNA作为模板通过逆转录制备cDNA.结合RNA和300 ng随机引物并且在加入酶之前在721C下变性10分钟.在5X笫二条链緩冲液存在下以总体积25 U向RNA加引物混合物中加入Superscript II逆转录酶，并且随酶提供0.1 M DTT.在42C下使逆转录反应进行l小时.
用随机引发的逆转录醉反应产生的2H7 DNA和V区特异性引物通过PCR扩增2H7抗体轻链和重链的可变区.以公幵序列(Vl的Genbank编号M17954, VH为M17953)为指导，设计V区特异性引物，两个可变链设计为具有相容末端序列，使得可以通过在扩增和限制酶消化后连接两个V区而组装scFv.
通过向2H7的VL的反义引物加入额外的核苷酸而掺入将在两个V区之间插入的(gly4ser)3肽接头.也在两个V区的接合处引入Sac I限制位点.用于扩增包含限制位点HindIII的2H7 VL和轻链前导肽的有义引物为5'-gtc 8犯c" gcc gcc gat ttt caa gtg cag att ttt cag c-3'(SEQ ID NO : 23),反义引物为5'-gtc gtc 2犯etc cca cct cct cca gat ccacca ccg ccc gag cca ccg cca cct ttc age tec age ttg gt￡ ￡￡-3' (SEQ ID NO:
24) . V区的阅读框架表示为粗体，加下划线的密码子.HindH和SacI 位点表示为加下划线的斜体序列，
对VH结构域进行扩增，而没有前导肽，但包含用于融合于VL的 S' Sacl限制位点和用于融合于各种尾，包括人IgGl Fc结构域和截短 形式的CD40配体CD154的位于3，末端的Bell限制位点.有义引物 为5'-gct get g犯etc ggc tta tct aca gca agt ctg g-3' (SEQ ID NO:
25) . Sacl位点表示为斜体和加下划线的字体.VH结构城的笫一个氨基 酸的密码子的阅读框架表示为粗体和加下划线的字体.反义引物为
5'-gtt gtc tga tea四g acg gtg acc gtg gtc cc曙3' (SEQ ID NO: 26). Bell
位点表示为斜体和加下划线的字体.VH结构域序列的最后一个丝氨酸 表示为粗体和加下划线的字体.
通过将2H7 scFv HindIH-BclI片段插入含人IgGl铰链区、CH2 和CH3区、用限制性酶迅ndIH和BclI消化的pUC19中而组装scFv-Ig. 连接后，将连接产物转化到DH5a细菌中.用位于作为诊断位点的2H7 的VL-VH结合处的Sacl位点筛选阳性克隆的适当插入的片段.使 2H7scFv-lg cDNA在热循环仪上进行循环测序，采用25个循环的程序， 在961C变性10秒，在50TC退火30秒，在72TC延伸4分钟.测序引物 是pUC正向和反向引物和退火于1gG恒定区部分中的人CH2结构域 的内部引物.用Big Dye Terminator Ready测序混合物(PE Applied Biosystems， Foster City, CA),根据制造商的说明进行测序反应 随后 用Centrisep柱(目录号CS-901, Princeton Separations, Adelphia， N. J.)纯化样品，并且在Savant真空干燥器中干燥，在模板抑制试刑 (PE-ABI)中变性，并且在ABI 310基因分析仪(PE-AppHed Biosystems) 上分析.用Vector Nti 6.0版(Informax， North Bethesda，MD)编辑、翻 译和分析序列.图1表示2H7scFv-Ig构建体的cDNA和推测氨基酸序 列.
实施例2
2H7 SCFV-1G在稳定CHO细胞系中的表达
该实施例说明在真核细胞中表达2H7scFv-Ig,以及通过SDS-PAGE 和功能测定，包括ADCC和补体固定鉴定被表达的2H7scFv-Ig,将具有正确序列的2H7scFv-Ig HindIII-XbaI(约1. 6 kb)插入哺乳 动物表达栽体pD18，用Q1AGEN治疗制备试刑盒(QIAGEN， Valencia, CA)扩增阳性克隆的DNA.然后在非必要区通过用Ascl消化将重组质 粒DNA(100吗)线性化，通过酚提取而纯化，在组织培养基Excell 302 (目录号14312-79P, JRH Biosciences, Lenexa， KS)中重悬.使用于转染 的细胞CHO DG44细胞处于对数生长，每个转染反应收获107个细胞. 将线性化的DNA以0.8ml的总体积加入CHO用于电穿孔.
通过可选摔、可扩增质粒pD18的电穿孔至中国仓鼠即巢(CHO)细 胞中完成2H7scFv-Ig融合蛋白(SEQ.IDNO: 15)的稳定产生，该质粒 含有CMV启动子控制下的2H7 scFv-Ig cDNA.将2H7表达盒作为约 1.6 kb的HindIII-XbaI片段亚克隆至CMV启动子下游栽体多克隆位 点中.pD18栽体是编码DHFR可选择标记的pcDNA3的修饰形式， 用减弱的启动子增加质粒的选择压力，用Qiagen maxiprep试刑盒制 备质粒DNA，然后在酚提取和乙醇沉淀之间在独特的Ascl位点线性化 纯化的质粒.将鲑鱼精子DNA (Sigma-Aldrich， St. Louis， MO)作为栽 体DNA加入，用IOO叫每种质粒和栽体DNA通过电穿孔转染107个 CHO DG44细胞.在含有谷氨酰胺(4mM)、丙稱酸、重组胰岛素、青 審素-链審素和2X DMEM非必须氨基酸(均来自于Technologies, Gaithersburg， Maryland)的Excell 302培养基(JRH Biosciences,此 后称作"Excell 302完全"培养基)中使细胞生长至对数期.用于被转 染细胞的培养基也含有HT (从次黄嚷呤和胸苷的IOOX溶液稀释)(Life Technologies).用于在选择下转染的培养基含有各种水平的作为选择试 刑的氨甲喋呤(Sigma-Aldrich)，浓度为50 nM-5jiM.在275伏特， 950jiF下进行电穿孔.允许转染细胞在非选择性培养基中回收过夜， 然后在96孔平底板(Costar)中，以125细胞/孔- 2000细胞/孔的各种 系列稀释进行选择性铺板.用于细胞克隆的培养基是Excell 302完全培 养基，含有lOOnM氨甲喋呤. 一旦克隆生长足够，筛选孔中的培养上 清液的系列稀释液中与CD20-CHO转染细胞的结合.将具有最高融合 蛋白产量的克隆扩増至T25烧瓶，然后扩增至T75烧瓶中，以提供足 够数量的细胞，用于冷冻和2H7scFvIg的扩大产生.通过在含氨甲喋
呤的培养基中逐步扩增而在三个克隆的培养物中进一步增加产生水 平.在细胞的每个连续传代中，Excell 302完全培养基含有增加浓度的
52氨甲喋呤，这样只有扩增了 DHFR质粒的细胞可以存活.
从表达2H7scFv-Ig的CHO细胞收集上清液，通过0.2|*m PES加 压滤膜(Nalgene， Rochester, NY)进行过滤，然后通过蛋白A-琼脂糖 (IPA 300交联琼脂糖)柱(Repligen, Needham， MA).用PBS洗涤柱， 然后用pH 3.0的O.IM柠樣酸緩冲液洗脱结合蛋白.收集级分并且用 1M Tris， pH 8.0中和洗脱的蛋白，然后在PBS中透析过夜.通过280 nm 处的吸光度测定纯化的2H7scFv-Ig (SEQ ID NO: IS)的浓度.用Vector Nti软件包(Informax， North Bethesda， MD)中的蛋白分析工具测定出 1.77的消光系数.该程序使用氨基酸组合物数据计算消光系数.
通过流式细胞术分析转染的稳定CHO细胞的2H7scFv-Ig产生水 平.使CHO细胞的纯化2H7scFv-Ig与表达CD20的CHO细胞(CD20 CHO)结合，并且使用荧光素偶联的抗人IgG笫二步骤试剂(目录号 H10101和H10501, CalTag， Burlingame， CA )进行流式细胞术分析. 图2 (上)表示通过滴定2H7seFv-Ig与CD20 CHO的结合产生的标准 曲线.在2H7scFv-Ig的每一个浓度下，表示出了以线性单位表示的荧 光信号平均亮度.从含有表达2H7scFv-Ig的稳定CHO细胞克隆的T 烧瓶中收集上清液，然后使其与CDMCHO结合，然后通过流式细胞 术分析结合.测量由上清液中含有的2H7scFv-Ig产生的荧光信号，从 标准曲线计算上清液中的2H7scFv-Ig浓度(困2，下)
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化的2H7scFv-Ig (SEQ ID NO : 15).通过独立的蛋白A琼脂糖柱纯化的2H7scFv-Ig样品在没有 二疏鍵还原的SDS样品緩冲液中煮沸，并应用于SDS 10% Tris-BIS凝 胶(目录号NP0301, Novex， Carlsbad, CA).将20微克每种纯化的批 量样品加栽到凝胶上.电泳后通过考马斯亮兰(Pierce Gel Code Blue Stain Reagent,目录号24590， Pierce, Rockford， IL)显色，然后在蒸馏 水中脱色.在相同的凝胶上包含分子量标记(Kaleidoscope Prestained Standards，目录号161-0324， Bio-Rad， Hercules, CA).结果表示于困3. 泳道上的数字表示独立的纯化批，以千道尔顿表示的大小标记的分子 量表示于困左側.用替代样品制备条件进行的进一步实验表示通过在 含有DTT或2 -巯基乙酵的SDS样品緩冲液中煮沸蛋白而进行的二疏 键还原导致2H7scFv-Ig聚集.
用本领域公知的常规测定可以监测任何其它的免疫参数 这些测定可以包括，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定，笫二体 外抗体应答，采用确立的标记抗原系统进行的多种外周血或淋巴单核 细胞亚群流式免疫细胞荧光测定分析，免疫组化或其它相关测定.这 些和其它测定可以参加，例如Rose et al. (Eds.)， Manual of Clinical Laboratory Immunology, 5th Ed.， 1997 American Society of Microbiology, Washington, DC,
用B细胞系Ramos和Bjab在补体存在下检测2H7scFv-Ig杀灭 CD20阳性细胞的能力.在测定中使用最终稀释度为1/10的兔补体(Pel Freez， Rogers, AK).用B细胞和补体在371C下将纯化的2H7scFv-Ig 孵育45分钟，然后通过台盼蓝排除计数活细胞和死细胞.图4A的结 果表明，在兔补体存在下，2H7scFv-Ig裂解表达CD20的细胞.
通过在4小时测定中使用100:1的PBMC与Bjab细胞比例测量 51Cr从标记的Bjab细胞的释放而检验2H7scFv-Ig在外周血单核细胞 (PBMC)存在下杀灭CD20阳性细胞的能力.困4B所示结果表明， 2H7scFv-lg可以介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC),因为PBMC和 2H7scFv-Ig存在下的slCr释放高于PBMC或2H7scFv-Ig单独存在下 的"Cr释放.
实施例3
CD20和CD40的同时连接对正常B细胞生长，以及对CD95表逸和凋 亡诱导的作用
该实施例说明了细胞表面表达的CD20和CD40的交联对细胞增殖 的作用.
通过Percoll分步梯度从人扁桃体分离密集的静息B细胞，通过 E-rosetting去除T细胞.通过4天实验的最后12个小时的3[印-胸苷 摄取测量密集的扁桃体B细胞.在四份培养物中测量增殖，平均值和 标准差如图所示.使用单独的或与抗鼠KmAb 187.1 (抗CD20XL)交联 的鼠抗人CD20 mAb 1F5 (抗CD20),使用与鼠CD8 (CD154) (Hollenbaugh et al" EMBO J 11: 4212-21 (1992))融合的可溶性人 CD154完成CD40激活，使用抗鼠CD8 mAb 53-6 (CD154XL)完成 CD40交联.该程序允许细胞表面CD20和CD40的同时交联.结果见 困5,检验了 CD20和CD40在一种B淋巴瘤细胞系Ramos细胞上的交联，使用特异性结合于CD20 (1F5)和CD40 (G28-5)的鼠单克隆抗体分析处理(无山羊抗小鼠IgG(GAM))后18小时Ramos细胞的CD95(Fas)表达和凋亡百分比和/或交联(+GAM).用特异于CD3的非结合性同种型对照(64.1)处理对照细胞.
收获处理后的Ramos细胞，用FITC-抗-CD95孵育，并且通过流式细胞术分析测定CD20或CD40交联后细胞表面上的Fas相对表达水平.将数据作图为用指出的刺激处理后细胞的平均荧光(困6A).
收获相同实验的处理后的Ramos细胞，测定膜联蛋白V的结合，用于表示经处理的培养物中的凋亡百分比.使用1F5和G28-5以及随后的与GAM的交联，通过CD20和CD40交联18小时后的膜联蛋白V的结合而测量凋亡.使用FITC-膜联蛋白V试刑盒(目录号PN-IM2376, Immunotech， Marseille, France，)测量膜联蛋白V的结合.已知膜联蛋白V结合是细胞发展为凋亡中的早期亊件.凋亡，或程序性细胞死亡，是以通过自杀导致细胞死亡的分解代谢反应级联为特征的过程.在凋亡的早期阶段中，在细胞改变外形和水解DNA之前，保持了细胞膜的完整性，但细胞失去了它们的膜磷脂的不对称性，暴露了带负电的磷脂，如细胞表面的磷脂耽丝氨酸.膜联蛋白V，即一种钾和磷脂结合蛋白，优先结合磷脂醜丝氨酸，并且对其有高亲和力.
证明CD20和CD40的交联对FAS受体(CD95)表达的作用的结果表示于图6B.CD20和CD40的交联对膜联蛋白结合于细胞的作用见困6B.
实施例4
2H7 ScFv-CD 154融合蛋白的构建和表征
为了构建能够结合CD20和CD40这两者的分子，将编码2H7 scFv的cDNA与编码CD154,即CD40配体融合的cDNA.从2H7 scFvIg构建体去除在HindIH-BclI片段上编码的2H7 scFv cDNA，与编码人CD154的胞外域的BamHI-XbaI cDNA片段一起插入pD18栽体.胞外域在CD154的羧基末端编码，与其它II型膜蛋白相似.
用随机引物和来自于用PHA (植物凝集素)激活的人T淋巴细胞的RNA对人CD154的胞外城进行PCR扩增.引物组包括两个不同的5，或有义引物，它们在CD154的胞外域中的两个不同位置产生融合接
55合处.两个不同融合接合处设计为产生一种包含胞外域的氨基酸108(Glu)-2"(Leu) + (Ghi)的短或截短形式(S4形)，以及包舍胞外域的氨基酸48 (Arg)-261 (Leu) + (Ghi)的长或完全形式(L2形)，它们都构建为BamHI-XbaI片段.将两个不同的截短胞外域融合于2H7scFv的有义引物包括用于克隆的BamHI位点.CD154 cDNA的S4形的有义引物命名为SEQUENCE ID NO: 27或CD154BAM108,并且编码具有以下序列的34聚体5'-gtt gtc gga tec aga aaa cag ctt tga aat gca a-3，，而反义引物命名为SEQUENCE ID NO: 28或CD154XBA，并且编码具有以下序列的44聚体5,-gtt gtt tct aga "a tea etc gag ttt gag taa gecaaa gga cg-3、
用于扩增CD154胞外城的长形式(L2 )的编码氨基酸48 (Arg)-261(Leu) + (Glu)的寡核普酸引物如下命名为CD154 BAM48(SEQUENCE ID NO : 29)的有义引物编码具有以下序列的35聚体5'-gtt gtc gga tec aag aag gtt gga caa gat aga ag-3'*命名为CD154XBA(SEQUENCE ID NO: 28)的反义引物编码具有以下序列的44聚体5'-gtt gtt tct aga "a tea etc gag "t gag taa gec aaa gga cg-3',其它PCR反应条件与用于扩增2H7 scFv的条件相同(见实施例l).用PCR快速试刑盒(QIAGEN， San Diego， CA)纯化PCR片段，在30jil ddH20中洗脱，然后用BamHI和Xbal (Roche)限制性内切睐在37C下以40jil的反应体积消化3小时.凝胶纯化片段，根据制造商的说明(QIAGEN)用QIAEX试刑盒纯化，并且与2H7 HindIII-BclI片段一起连接到用HindUI+Xbal消化的pD18表达栽体中.将连接反应转移到DH5-a化学感受态细菌中，并且铺于含100jig/ml氨苄青審素的LB板上.使转染物在371C生长过夜，用分离的菌落接种含lOOjig/ml氛苄青霉素的Luria培养液中的3ml液体培养物.微量质粒制备(QIAGEN)后筛选用于插入2H7 scFv和CD1S4胞外域片段的克隆.
在PE 9700热循环仪上使用25个循环的程序对2H7scFv-CD154构建体cDNA进行循环测序，包括在96"C变性IO秒，在50TC退火5秒，在60t:延伸4分钟.使用的测序引物为pD18正向(SEQ ID NO: 30:5'-gtctatataagcagagctetggc-3')和pD18反向(SEQ ID NO: 31: 5'-cgaggctgatcagcgagctctagca-3')引物，此外，使用了与人CD154序列(SEQ ID NO: 32: 5'-ccgcaatttgaggattctgatcacc-3')具有特异性的内部引物.测序反应包含3.2 pmol的引物，约200 ng DNA模板，以及8pl测序混合物.使用Big Dye Terminator Ready测序混合物(PE-AppliedBiosystems， Foster City, CA)，根据制造商的说明进行测序反应，随后用Centrisep柱(Princeton Separations, Adelphia, NJ)纯化样品.在Savant加速真空干燥器中干燥洗脱物，95"下在20 il模板抑制试刑(AB1)中变性2分钟，并且在ABI 310基因分析仪(PE-AppliedBiosystems)上分析.使用Vector Nti 6.0版(Informax， North Bethesda，MD)编辑、翻译和分析序列，2H7scFv-CD 154 L2 cDNA序列和预测的氨基酸序列见图7A， 2H7scFv-CD154 S4 cDNA cDNA序列和预测的氨基酸序列见困7B.
通过流式细胞术测定了 2H7 scFv-CD154融合蛋白(SEQ. ID NO:33和34)与CD20和CD40的同时结合活性.该测定使用表达CD20的CHO细胞乾，用2H7 scFv-CD154表达质粒转染的细胞的上清液孵育CD20 CHO细胞45分钟后，洗涂CD20 CHO细胞两次，用PBS/2% FBS中的生物素偶联的CD40-Ig融合蛋白孵育.45分钟后，洗涤细胞两次，用1: 100溶于PBS/2% FBS的藻红蛋白(PE )标记的链霉素(MolecularProbes, Eugene OR)进行孵育.孵育顧外的30分钟后，洗涤细胞两次，通过流式细胞术进行分析.结果表明2H7 scFv-CD154分子能够结合细胞表面上的CD20并且从溶液中捕获生物素偶联的CD40.
为确定2H7scFv-CD154对B淋巴瘤和成、淋巴细胞系的生长和存活的作用，用2H7scFv CD154 L2 (SEQ. ID NO: 33)孵育细胞12小时，然后检验膜联蛋白V的结合.使用FITC-膜联蛋白V试刑盒(Immunotech， Marseille, France,目录号PN-IM2376)测量膜联蛋白V的结合.用来自于表达分泌形式的2H7scFv-CD 154融合蛋白的细胞的浓缩、经渗透上清液的稀释液在lml培养物中孵育B细胞系.
通过24小时培养的最后6小时的3H-胸苷摄取检验2H7scFv-CD154存在下Ramos B淋巴瘤细胞的生长速度.2H7scFv-CD154对细胞增殖的作用见图10.
实施例5
CYTOXB抗体衍生物的构建和表征
CytoxB抗体衍生自2H7scFv-IgG多肽.通过改变的铰链区(见图
5711)将2H7 scFv (见实施例1)连接于人IgGl Fc结构域.通过定点诱变和其它本领域公知的方法用丝氨酸残基取代铰链区的半胱氨酸残基.将突变铰链区融合于野生型Fc结构域以产生一种命名为CytoB-MHWTGlC的构建体，或融合于在CH2结构域中引入了额外突变的突变Fc结构域(CytoxBMHMGlC).与效应物功能有关的CH2中的氨基酸序列见困11.这些残基中的一个或多个的突变可以减少FcR结合和效应物功能的介导.在此实施例中，在2H7scFv融合蛋白CytoxBMGlH/MGlCl中，本领域公知对Fc受体结合具有重要性的亮氨酸残基234进行了突变.在另一构建体中，用人IgA铰链区的一部分取代了人IgGl铰链区，该部分与野生型人Fc结构域融合(CytoxB-IgAHWTHGIC)(见困11).该突变的铰链区允许保持了人IgGl CH2和CH3结构域的功能特性的单体和二聚体分子混合物的表达.根据实施例2中描述的方法构建了用于这些分子的重组cDNA表达盒并且在CHODG44细胞中表达了多肽.
根据实施例2中描述的方法通过SDS-PAGE分析了 CytoxB-scFvIg分子的纯化融合蛋白衍生物.在非还原和还原条件下进行了聚丙烯耽氨凝胶电泳，在每个凝胶上加栽两个不同的分子量标记系列BioRad预染色标记(BioRad， Hercules, CA)和Novex Multimark分子量标i己.不同构建体和RiUiximabTM的迁移模式见田12.
用Bjab B淋巴瘤细胞作为靶和新制备的人PBMCs作为效应细胞测量CytoxB-scFvIg分子的不同衍生物介导ADCC的能力(见实施例2).效应物与靶的比例改变如下70: 1， 35: l，和18: 1，每孔的Bjab细胞数保持恒定，但PBMCs的数目不同 用slCr标记Bjab细胞2小时，以5xl0^细胞/孔的细胞密度等分至平底96孔板的每个孔中.以10 mg/ml的浓度将纯化的融合蛋白或rituximab加入PBMCs的各种稀释液.在不添加PBMC或融合蛋白的情况下测量自发释放，通过向适当的控制加入洗涤剂(1。/。 NP-40)而测量最大释放.将反应孵育4小时，将100|il培养上清液收获至Lumaplate (Packard Instruments)*且干燥过夜，然后计数释放的cpm.结果见困13.
也测量了 CytoxB衍生物的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性.基本按实施例2中的描述进行反应.结果见困14,表示为每个融合蛋白浓度下死亡细胞占总细胞数的百分比.实施例6
在猕猴中进行的体内研究
在非人灵长类动物中进行了 CytoxB衍生物的初步体内研究.困15 表示了鉴定CytoxB在猴中的血清半表期的数据.在箭头所示日，给予 每只猴6 mg/kg的刑量后，对从两只不同的猕猴(J99231和K99334) 获得的血清样品进行测量.对于每种样品，通过与标准曲线比较评估 存在的211780 ￥18水平，标准曲线是通过純化€^( 8- (MHWTG1C)-Ig 融合蛋白与CD20 CHO细胞的结合产生的(见实施例2).数据见图 15下部.
研究了 CytoxB- (MHWTG1C) Ig融合蛋白对所研究的猕猴中循环 CD40+细胞水平的作用.在困16所示的每一天进行全血计数.此外， 使用CD40特异性荧光素偶联的抗体对外周血淋巴细胞进行FACS(荧 光激活细胞分类)测定，以检测细胞群中的B细胞.然后用阳性细胞 百分比计算原始样品中的B细胞数，数据作困为注射后的体定日测量 的千B细胞数/升血液(困16).
实施例7
抗-CD19 scFv-IG融合蛋白的构建和表达
根据实施例1、2和5描述的方法以及本领域的标准构建了抗-CD19 scFv-Ig融合蛋白，将其转染到真核细胞，并进行表达.从分离自产生 抗体HD37的杂交瘤细胞的RNA克隆重链可变区和轻链可变区，HD37 特异性结合于CD19 . 测量了 HD37scFv-IgAHWTGlC和 HD37scFv-IgMHWTGlC的表达水平，并且与用純化HD37 scFvIg产 生的标准曲线相比较，结果见困17.
实施例8
抗-L6 scFv-IG融合蛋白的构建和表达
用来源于抗癌mAb即L6的可变区构建scFv-Ig融合蛋白.根据实 施例l、 2和5描述的方法以及本领域的标准构建融合蛋白，转染至真 核细胞中，并且进行表达.测量了 L6scFv-IgAHWTGlC和 L6scFv- 的表达水平，并且与用纯化HD37 scFvIg产生的标准曲线相比较，结果见围18. 实施例9
多种scFv-IG融合蛋白的表征
除已经描述的scFv-Ig融合蛋白，基本按实施例1和5的描迷制备 G28-l (抗CD37) scFv-Ig融合蛋白.根据本领域公知的方法克隆重链 和轻链可变区.根据上述方法(见实施例2)确定2H7-MHWTG1C, 2H7-IgAHWTGlC , G28-1-MHWTG1C , G28-l 1gAHWTGlC , HD37-MHWTG1C和HD37-IgAHWTGlC的ADCC活性.结果见图 19 .用 2981人肺癌细胞系测量L6scFv-IgAHWTGlC和 L6scFv-IgMHWTGlC的ADCC活性.结果见图20.已知鼠L6单克 隆抗体没有ADCC活性.
通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下分析纯化蛋白.基本按实 施例2和5的描述制备样品和进行凝胶电泳，L6和2H7 scFv-Ig融合 蛋白的结果见图21, G28-l和HD37scFv-Ig融合蛋白的结果见困22.
从上文中可以理解，尽管处于说明的目的描述了本发明的许多特定 实施方案，可以在不偏离本发明的精神和范围的前提下进行多种修饰. 因此，本发明并不受其限制，而是由所附权利要求进行限定.序列表
<110>基因工艺公司 J. A.勒贝尔特 M.海登-.勒贝尔特
<120>结合域-免疫球蛋白融合蛋白
<130> 30906/41458UTL
<150〉 US 09/765, 208 <151> 200卜01-17
<歸 38
<170> Patentln version 3. 3
<210>
<211> 812
<212> 腿 <213〉人工序列
<220>
<223>合成的小鼠SCFV融合基因
<220〉
<221〉 sig一肽
<222> (13).. (78)
<220>
<221> V—区
<222〉(亍9).. (396)
<223〉 抗CD20 scFv的轻链可变区
<220>
<221〉 misc—特征
<222> (397亍..(444)
<223> asp-gly3ser(gly4ser) 2-ser肽接头 <220>
〈221〉 V—区
<222〉 (;45). . (808)
<223〉 抗CD20 scFv的重链可变区
<400〉 1
aagcttgccgccatggattttcaagtgcag attttcagcttcctgctaatcagtgcttca60
gtcat肌ttgccagaggacaaattgttctc tcccagtctccagcaatcctgtctgcatct120
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tctggagtccctgctcgcttcagtggcagt gggtctgggacctcttactctctcacaatc300
agcagagtggaggctg幼gatgctgccact tattactgccagcagtggagttttaaccca360cccacgttcggtgctgggacc胆gctggagctgaaaggtggcggtggctcgggcggtggt420
ggatctggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtg480
柳cctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacatttaccagttac540
aatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttat600
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ggcacagggaccacggtcaccgtctctgatca812
<210> 2
<211> 1518 <212>鹏 <213〉人工序列
<220>
<223〉合成的小鼠人嵌合融合基团
<220〉
<221> misc—特征
<222〉 (13).. (807)
<223> 叙抗人CD20 scFv
<220>
<221> C一区
<222〉 (508).. (1513)
<223>人工IgGl Fc尾，野生型铰链区，CH2和CH3
<400> 2
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttca60
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tgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct1500
ccgggtaaatgettctaga1518
<210> 3
<211> 1518
<212> 隨
<213> 人工序列
<220>
<223>合成的小鼠人嵌合融合基团
<220>
<221> misc一特征
<222> (13).. (807)
<223> 小鼠抗人CD20 scFv
<220>
<221> C—区
〈222〉 (508).. (1513)
<223〉突变为丝氨酸的铰链区半胱氨酸(826-829: 844-4847: 853-856) CH2中脯氨酸至丝氨酸的突变破坏效应物功能
<400〉 3
aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60
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63taccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggct240
tctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatc300
agcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttttaaccca360
cccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggt420
ggatctggaggaggtgggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtg480
aggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacatttaccagttac540
aatatgcactgggt犯叫cagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttat600
ccagga肌tggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgta660
gacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaagactctgcg720
gtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctgg780
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ccgggtaaatgatctaga1518
<210〉 4
<211〉 1518
<212> 隐 <213〉人工序列
<220>
<223>合成的小鼠人嵌合融合基团
<220><221> misc-特征
<222> (13).. (807)
<223> 小鼠抗人CD20 scFv
〈220>
<221〉 C一区
<222> (S08).. (1513)
<223>突变为丝氨酸的铰链区半胱贫酸(826-829: 844-847; 853-856) 野生型CH2和CH3结构域介导效应物功能
<400> 4
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttca60
gtcataattgccagaggacaaattgttctctcccagtctccagcaatcctgtctgcatct120
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gtctatttctgtgc卿agtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctgg780
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〈210〉 5
<211〉 1524
<212> DNA <213〉人工序列
<220〉
<223>合成的小鼠人嵌合融合基团
<220〉
<221> misc一特征
<222〉 (1)..(796)
<223> 小鼠抗人CD20 scFv
<220>
<221〉 N一区
<222> (子97).. (864)
<223> 人IGA铰链区
<220〉
<221〉 C—区
<222〉(细..(1518)
<223>人IGGl CH2和CH3野生型FC结构域
<400> 5
atggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatca gtgcttcagt cataattgcc60
ttgttctctcccagtctccagcaatcctgtctgcatctco aggggagaag120
gtxacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttaca tgcactggta ccagcagaag180
ccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatcca acctggcttc tggagtccct240
gctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcag cagagtggag300
gctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttttaacccacc cacgttcggt360
gctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtgg atctggagga420
ggtgggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgag gcctggggcc480
tcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacaca>tttaccagttacaa tatgcactgg540
gta幼gcagacacctagacagggcctgg肪tggattggagctatttatcc aggaaatggt600
gatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggcceicactgactgtaga caaatcctcc660
agceicagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaagactctgcggt ctatttctgt720
gcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctgggg cacagggacc780
acggtcaccgtctctgatcagccagttccctc幼ctccacctaccccatc tccctcaact840
66ccmcctaccccatctccctcatgcgcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc900
ttccccccaaaaccc幼ggacaccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg960
gtggtggeicgtgagccmcgaagaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg譲
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gtc叫cgtcctcaccgtcctgcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag1140
gtctccaacaaagccctcccagcccccatc gagaaaacaa totccaaagc caaagggcag1200
ccccgagaaccacaggtgtacaccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag1260
gtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag1320
agcaatgggccaactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc1380
tccttcttcctctacagcaagctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc1440
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ctgtctccgggtaaatgatctaga1524
<210> 6
<211> 711
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<223〉合成的人部分融合基因
<220>
<221> misc一特征
<222> (1)..(705)
<223>突变为丝氨酸的铰链区半胱氨酸(19-21; 37-39; 46-48).
<柳> 6
gatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccc caccgtccccagcacctgaa60
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tcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtga gccacgaagaccctgaggtc180
aagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatg ccaagacaaagccgcgggag240
gagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctca ccgtcctgcaccaggactgg300
ctgaatggcagtgcaaggtctccaacaaag ccctcccagcccccatcgag360
aaaacaatctcca祖gccaaagggcagccccgagaaccac aggtgtacaccctgccccca420
tcccgggatgagctgacc肌gaaccaggtcagcctgacct gcctggtcaaaggcttctat480
cccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagc cggagaacaactac幼gacc540acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 600 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 660 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatgatctag a 711
<210> 7
<211> 729
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223〉合成的人部分融合基因
<220>
<221> hL区
<222> (T)..(69)
<223> 人IGA铰链区
〈220>
<221> C—区
<222> (TO).. (723)
<223〉 人野生型IGGl CH2和CH3, Fc
<400〉 7
gatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccct caactccacc taccccatct60
ccctcatgcgcacctgaactcctggggggaccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc120
aaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc180
cacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc240
aagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc300
gtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc360
ctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaag ggcagccccg agaaccacag420
gtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc480
ctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg540
gagaacaacta_caag3ccacgcctcccgtgctggactccg acggctcctt cttcctctac600
agcaagctcaccgtggacaagagc柳tggcagcagggga acgtcttctc atgctccgtg660
atgcatgaggctctgcacaa ccactacacgcagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa720
tgatctaga729
<210> 8 <211〉 825 <212> ■
68<213>人工序列 <220>
<223>合成的小鼠SCFV融合基因
<220>
<221>迈isc—特征
<222〉 (13)., (72) <223〉 轻链前导肽
<220>
<221> V一区
<222> (亍3),,(405)
<223> 小鼠抗人CD19: HD37的轻链可变区 <220>
〈221> niisc—特征
<222> (406^".. (450〉
<223>合成的(gly4ser) 3接头肽
<220〉
<221> V一区
<222> (;54)..(825)
<223> 小鼠抗人CD19:HD37的重链可变区
<400〉 8
aagcttgccgccatggagacagacacactcctgctatgggtgctgctgct ctgggttcca60
ggctccactggtgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgt gtctctaggg120
cagagggccaccatctcctgcaaggccagccaaagtgttgattatgatgg tgatagttat180
ttgaactggtaccaacagattccaggacagccacccaaactcctcatcta tgatgcatcc240
aatctagtttctgggatcccacccaggtttagtggcagtgggtctgggac agacttcacc300
ctcaacatccatcctgtggagaaggtggatgctgc幼cctatcactgtca gcaaagtact360
gaggatccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaaggtgg cggtggctcg420
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cagatttggcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaaggg taaagccact660
ctgactgcagacgaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcct agcatctgag720
gactctgcggtctatttctgtgcaagacgggagactacgacggtaggccg ttattactat780
gctatggactaggaacctcagtcaccgtctcctca825
<210〉 9 <211> 795
69<212> ■ <213>人工序列
〈220〉
<223>合成的小鼠SCFV融合基因
<220〉
<221> fflisc一特征
<222〉 (13).. (72)
<223〉 轻链前导肽
<220>
<221> V一区
<222> (73).. (393)
<223>小鼠^]人CD37:G28-1的轻链可变区 <220〉
<221> misc—特征
<222〉 (394J".. (441)
<223>编码的合成接头肽gly4ser3
<220>
<221〉 V—区
<222> (:42)..(795)
<223>小鼠抗人CD37:G28-1的轻链可变区
<400> 9
肌gcttgccgccatggtatccacagctcagttccttgggt
ggtggcagatgtgacatccagatgactcagtctccagcct
gagactgtcaccatcacatgtcgaacaagtgaaaatgttt
cagcagaaacagggaaaatctcctcagctcctggtctctt
ggtgtgccatcaaggttcagtggcagtggatcaggcacac
agcctgcagcctgaagattctggaagttatttctgtcaac
acgttcggtggaggcaccgaactggagatcsaaggtggcg
tcgggtggcggcggatcgtcagcggtccagctgeagcagt
cctggcgcttcagtgaagatttcctgcaaggcttctggtt
atg肌ctgggtgaagcagaataatggaaagagccttgagt
tattatggtggtactacctacaaccggaagttcaagggca
aaettcctccagcacagcctacatgcagctcaagagtctga
tattactgtgcaagatcggtcggccctatggactactggg
gtctcttctgatcag
<210> 10
tgctgctgctgtggcttaca60
ccctatctgcatctgtggga120
acagttatttggcttggtat180
ttgcaaaaaccttagcagaa240
agttttctctgaagatcagc300
atcattccgataatccgtgg360
gtggctcgggcggtggtggg420
ctggacctgagctggaaaag480
actcattcactggctacaat540
ggattggaaatattgatcct600
aggccacattgactgtagEic660
catctgaggactctgcagtc720
gtcaaggaacctcagtcacc780
795<211> 824
<212> DM <213>人工序列
<220>
<223>合成的小鼠SCFV融合基因
<220>
<221> sigj太
<222> (1).,(61) <223>天然轻链前导肽
<220>
<221〉 V一区
<222> 细..(397)
<223>小鼠抗人CD22: G28-7的轻链可变区 <220>
<221> misc—特征
<222> (398[ . (445)
<223> (gly4ser)3接头肽
<220>
<221> V一区
<222> (;45)..(818)
<223>小鼠抗人CD22-G28-7的重链可变区 <220>
<221> miso一特征
<222> (819亍..(824)
<223> Bcll限制位点
<400> 10
atggagtcacattcccaggtctttctctccctgctgctct gggtatctggtacctgtggg60
aacattatgatgacacagtcgccatcatctctggctgtgt cagcaggagaaaaggtcact120
atgaactgtaagtccagtcaaagtgttttctacagttcaa atcagaggaattatttggcc180
tggtatcagcaga肌ccagggcagtctcccaaattgctga tctactgggcatctactagg240
g肌tctggtgtccctgatcgcttcacaggcagtggatccg ggacagactttactcttacc300
atcagcagtgtacatactgaagacctggcagtttattact gtcatcaattcctctcttcg360
tggacgttcggtggaggcaccaagctgg幼atcaaaggcg gtggtggttcgggtggtggt420
ggttcgggtggcggcggatcttctcaggtccaactgcagc agcctggggctgaactggtg480
aagcctgggacttcagtgaagctgtcctgcaaggcctctg gctacaccttcaccaactac540
tggatggtctgggtg肌gcagacgcctggagaaggccttg agtggattggagaaattatt600
cctagcaacggtcgtactaaatacaatgagaagttcaaga gcaaggccacactgactgca660
gacaaatcctcccgcacagcctacatgcaactcagcagcc tggcatctgaggactctgcg720
71gtctattatt gtgcaagaga gatgtccatt attactacgg tactgactcc cggtttgctt 780 actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgcagcctg atca 824
<210> 11
<211> 266
<212> PRT
<213〉 小鼠(迈us musculus)
<220〉
<221> INIT—MET
<222〉 (l)..(l)
<220>
<221〉信号
<222> (l)..咖
<220> <221〉 <222〉 <223>
<220> <221> <222〉 <223>
<220> <221> <222> <223>
结构域 (23)., (128)
小鼠抗人CD20的轻链可变区
位点
(129). . (144)
Asp-(Gly3ser)-(Gly4ser) 2-ser接头肽
结构域 (145). . (266)
小鼠抗人CD20的重链可变区
<400〉 11
Met Asp Phe Gin 1
Val Gin lie Phe Ser Phe Uu Uu lie Ser Ala Ser 5 10 15
Val lie lie Ala Arg Gly Gin lie Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala lie
20
25 30
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser
35
40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser
50
55 60
Pro Lys Pro Trp lie Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Uu Thr lie 85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 100 05 110
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125
Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
130
135 140
Gin Ala Tyr Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
145
150 155
160
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
165 170
175
Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Arg Gin Gly Leu Glu Trp lie 80 185 190
Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 195 200 205
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
210
215 220
Met Gin Uu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
225
230 235
240
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
245 250
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp 260 265
<210> 12
<211> 271
<212> PRT
<213> 小鼠
255
(Mus musculus)
<220〉
<221>位点
<222> (1)..(271)
<223〉 小鼠抗人CD19 scFv
<400> 12
73Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Uu Trp Val Leu Uu Uu Trp Val Pro 15 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30
Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser 35 40 45
Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin lie Pro 50 55 60
Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser 65 70 75 80
Gly lie Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95
Leu Asn lie His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys 100 105 110
Gin Gin Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125
Glu lie Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140
Gly Ser Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 145 150 155 160
Pro Gly Ser Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 165 170 175
Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Uu 180 185 190
Glu Trp lie Gly Gin lie Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn 195 200 205
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Uu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser 210 215 220
Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Uu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val225 230 235 240
Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr 245 250 255
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 260 265 270
<220>
<221〉位点
<222> (1)..(259)
<223〉 小鼠抗人CD37 scFv
<400> 13
Met Val SeT Thr Ala Gin Phe Uu Gly Uu Uu Uu Uu Trp Uu Thr 15 10 15
Gly Gly Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn 35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro 50 55 60
Gin Leu Leu Val Ser Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Gin His His Ser 100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu lie Lys Gly 115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ala 130 135 140
<20> <211> <212> <213>
9 T
5 R
、Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser
145
150 155 160
Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn 165 170 175
Met Asn Trp Val Lys Gin Asn Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie Gly
180
185 190
Asn lie Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys
195
200 205
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
210
215 220
Gin Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
225
230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr 245 250 255
Val Ser Ser
<210> 14
<211> 272
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221>位点
<222> (1)..(272)
<223> 小鼠抗人CD22 scFv
<400> 14
Met Glu Ser His Ser Gin Val Phe Leu Ser Uu Leu Uu Trp Val Ser 15 10 15
Gly Thr Cys Gly Asn lie Met Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30
Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser 35 40 45Val Phe Tyr Ser Ser Asn Gin Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 50 55 60
Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Uu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90
95
Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Val His Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr
100 105
110
Tyr Cys His Gin Phe Leu Ser Ser Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120
125
Leu Glu lie Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140
Gly Gly Ser Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val
145 150 155
160
Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170
175
Phe Thr Asn Tyr Trp Met Val Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly Glu Gly
180 185
190
Leu Glu Trp lie Gly Glu lie lie Pro Ser Asn Gly Arg Thr Lys Tyr
195 200
205
Asn Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser
210
215 220
Arg Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala 225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Met Ser lie lie Thr Thr Val Leu Thr 245 250 255
Pro Gly Leu Uu Thr Gly Ala Lys Gly Uu Trp Ser Leu Ser Leu Gin
260
265 270
<210> 15
77<211> 499
<212> PRT <213>人工序列
<220〉
<223>小鼠-人杂交融合蛋白
<220〉
<221> 位点
<222> (1)..(265)
<223> 小鼠抗人CD20 scFv:2H7
<220〉
<221〉结构域
<222> (266)..(499)
<223>人IGG1野生型铰链区，CH2, CH3 Fc
<400> 15
Met Asp Phe Gin Val Gin lie Phe Ser Phe Leu Leu lie Ser Ala Ser
1
5
10
15
Val lie lie Ala Arg Gly Gin lie Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala lie 20 25 30
Uu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60
Pro Lys Pro Trp lie Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65
70
75
80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Uu Thr lie 85 90 95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 100 105 110
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125
Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140
Gin Ala Tyr Leu Gin'Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
145
150
155
160Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175
Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Arg Gin Gly Leu Glu Trp lie 180 185 190
Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 195 200 205
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 225 230 235 240
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 245 250 255
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Cys 260 265 270
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 275 280 285
Gly Pro Ser Val Phe Uu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Uu Met 290 295 300
lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 305 310 315 320
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 325 330 335
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyi 340 345 350
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Uu Asn Gly 355 360 365
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie 370 375 380Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 385 390 395 400
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 405 410 415
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 420 425 430
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 435 440 445
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 450 455 460
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 465 470 475 480
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
485
490 495
Pro Gly Lys
<210〉 <211> <212> <213>
16
499
PRT
人工序列
<220>
<223>小鼠-人杂交融合蛋白
<220〉 <221〉 <222> <223>
<220> <221> <222> <223〉
位点
(l).. (265)
靶向于人CD20的2H7 scFv
结构域
突变^丝氨酸的铰链区半胱氨酸(氮基酸272, 278， 281) CH2中突变为丝氨酸的脯氨酸(氨基酸290)
<400〉 16
Met Asp Phe Gin Val Gin lie Phe Ser Phe Leu Leu lie Ser Ala Ser 15 10 15
80Val lie lie Ala Arg Gly Gin lie Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala lie 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60
Pro Lys Pro Trp lie Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie 85 90 95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 簡 105 110
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Uu Glu Uu Lys 115 120 125
Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140
Gin Ala Tyr Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Uu Val Arg Pro Gly Ala 145 150 155 160
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175
Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Arg Gin Gly Uu Glu Trp lie 180 185 190
Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 195 200 205
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220
Met Gin Leu Ser Ser Uu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 225 230 235 240
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 245 250 255Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser 260 265 270
Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Uu Leu Gly 275 280 285
Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 290 295 300
lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 305 310 315 320
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
325 330 335.
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 340 345 350
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 355 360 365
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie 370 375 380
Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 385 390 395 400
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 405 410 415
Uu Thr Cys Uu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 420 425 430
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 435 440 445
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Uu Tyr Ser Lys Uu Thr Val 450 455 460
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 465 470 475 480
82His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Uu Ser
485
490 舰
Pro Gly Lys
<210> <211> <212> <213>
17
499 PRT
人工序列
<220>
<223>小鼠-人杂交融合蛋白
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
位点
(l).. (265)
小鼠抗人CD20 scFv:2H7
结构域 (266)..(柳)
突变为丝氨酸的铰链区半胱氨酸(氨基酸272, 278, 281) CH2和CH3结构域的序列是野生型
<400> 17
Met Asp Phe Gin Val Gin lie Phe Ser Phe Leu Leu lie Ser Ala Ser
1 5
10 15
Val lie lie Ala Arg Gly Gin lie Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala lie 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60
Pro Lys Pro Trp lie Tyr Ala Pro Ser Asn Uu Ala Ser Gly Val Pro
65
70
75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie
85
恥 95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 100 105 110Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125
Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140
Gin Ala Tyr Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 145 150 155 160
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175
Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Arg Gin Gly Uu Glu Trp lie 180 185 190
Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 195 200 205
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 225 230 235 240
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 245 250 255
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser 260 265 270
Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Uu Uu Gly 275 280 285
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 290 295 300
lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 305 310 315 320
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 325 330 335
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 340 345 350
84Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 355 360 365
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie
370
375 380
Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
385
390 395 400
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 405 410 415
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 420 425 430
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 435 440 445
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
450
455 460
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
465
470 475 480
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
485
490 495
Pro Gly Lys
〈210〉 18
<211〉 505
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>小鼠-人杂交融合蛋白
<220>
<221〉位点
<222〉 (1)..(265)
〈223〉 小鼠抗人CD20 scFv彌
<220>
<221〉结构域<222> <223〉
<220〉 <221> <222〉 <223>
(266).. (288) 野生型IGA铰链区
结构域 (289). . (505)
人IGGl CH2和CH3结构域，野生型序列
<400> 18
Met Asp Phe Gin Val 1 5
Gin lie Phe Ser
Phe Leu Leu lie Ser Ala Ser 10 15
Val lie lie Ala Arg Gly Gin lie Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala lie 20 25 30
Uu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60
Pro Lys Pro Trp lie Tyr Ala Pro Ser Asn Uu Ala Ser Gly Val Pro
65
70
75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie
85
90 95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 100 105 110
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125
Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140
Gin Ala Tyr Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Uu Val Arg Pro Gly Ala 145 150 155 160
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175
Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Arg Gin Gly Leu Glu Trp lie 180 185 190
86Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 195 200 205
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 225 230 235 240
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 245 250 255
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gin Pro Val Pro Ser Thr 260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys 275 280 285
Ala Pro Glu Leu Uu Gly Gly Pro Ser Val Phe Uu Phe Pro Pro Lys 290 295 300
Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 305 310 315 320
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 325 330 335
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 340 345 350
Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 355 360 365
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 370 375 380
Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin 385 390 395 400
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Uu 405 410 415
Thr Lys Asn Gin Val Ser Uu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 420 425 430
87Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 435 440 445
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
450 455
460
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val
465 470
475
480
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin
485 490
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 505
495
<210〉 19
<211〉 234
<212> PRT
<213〉 人
<220〉
<22D结构域 <222〉 (1).. (234)
<223>突i'的IGG1铰链区(氨基酸7, 13, 16) 野生型CH2和CH3结构域 SCFVIG融合蛋白的替代羧基末端
<400〉 19
Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser 15 10 15
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 20 25 30
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 35 40 45
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 50 55 60
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 65 70 75 80
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Uu Thr Val Uu85
90 95
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn100 105 110
Lys Ala Uu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly115 120 125
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu130 135 140
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Uu Val Lys Gly Phe Tyr
145
150
155
160
Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn165 170 175
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe180 185 190
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn195 200 205
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr210 215 220
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 230
<210> 20
<211〉 241
<212> PRT
<213〉 人(Homo sapiens)
<220>
<221>位点
<222> (1) . (23)
<223> SC"IG融合蛋白的替代羧基末端<220>
<221〉 结构域
<222〉 (24).. (240)
<223> 人IGG1野生型CH2和CH3 Fc
<400> 20
Ala Asp Gin Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr10
15
Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro20 25 30
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser35 40 45
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp50 55 60
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn65 70 75 80
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val85 90 95
Val Ser Val Leu Thr Val Uu His Gin Asp Trp Uu Asn Gly Lys Glu100 105 110
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys115 120 125
Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr130 135 140
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr145 150 155 160
Cys Uu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu165 170 175
Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu180 185 190
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Uu Thr Val Asp Lys195 200 205
Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu210 215 220
Ala Uu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Uu Ser Uu Ser Pro Gly225 230 235 240
90<210> 21
<211> 1470
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>小鼠-人杂交体 <220>
<221> misc—特征
<222〉 (1)..(808〉
<223〉 小鼠抗人CD20 SCFV
<220〉
<221〉 niisc—特征
<222> (814[ . (1455) <223>人胞外域长型，CD154
<400> 21
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttca60
gtcataattgccagaggacaaattgttctctcccagtctccagcaatcctgtctgcatct120
ccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcactgg180
taccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggct240
tctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatc300
agcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttttaaccca360
cccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggt420
ggatctggaggaggtgggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtg480
aggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacatttaccagttac540
aatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttat600
ccaggaaatggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgta660
gacaaeitcctccagcacagcctaoatgcagctcagcagcctgacatctgaagactctgcg720
gtctatttctgtgca柳gtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctgg780
ggcacagggaccacggtcaccgtctctgatccaagaaggttggacaagatagetagatgaa840
aggaatcttcatgaagattttgtattcatgaaaacgatacagagatgc幼cacaggag幼900
agatccttatccttactgaactgtgaggagattaaaagccagtttgaaggctttgtgaag960
gatataatgtt幼aca肌gaggagacgaagaaagaaaacagctttgaaatgcaaaaaggt1020
91gatcagaatoctcaaattgcggcacatgtcataagtgaggccagcagtaaaac幼catct1080
gtgttacagtgggctgaaaaatggatactacaccatgagcaacaacttggtaaccctggaa1140
aatgggaaacagctgaccgttaaaagacaaggactctattatatctatgcccaagtcacc1200
ttctgttccaatcgggaagcttcgagtcaagctccatttatagccagcctctgcctaaag1260
tcccccggtagattcgagagaatcttactcagagctgcaaatacccacagttccgccaaa1320
ccttgcgggcaacaatccattcacttgggaggagtatttgaattgcaaccaggtgcttcg1380
gtgtttgtcaatgtgactgatccaagccaagtgagccatggcactggcttcacgtccttt1440
ggcttactcaaactcgagtgataatctaga1470
<210〉 <2U〉 <212〉 <213>22 1290 腿 人工序列
<220> <223>小鼠-人杂交体
<220> <221〉 <222〉 <223>迈isc特征 (13),. (808) 小鼠抗人CD20 scFv
<220> <221> <222〉 <223>misc特征 (814丁.. (1275) 人胞外域，短型,CD154
<400〉 22 aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttca60
gtcataattgccagaggacaaattgttctctcccagtctcceigcaatcctgtctgcatct120
ccaggggagaaggtcacaatgacttgc柳gccagctcaagtgtaagttacatgcactgg180
taccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggct240
tctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatc300
agcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgcc agcagtggagttttaaccca360
cccacgttcggtgctgggacc幼gctggag ctgaaagatg gcggtggctcgggcggtggt420
ggatctggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtg480
aggcctggggcctcagtgaagatgtcctgc aaggcttctg gctacacatttaccagttac540
aatatgcactgggtaaagcagacacctaga cagggcctggaatggattggagctatttat600
92ccaggaaatggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccac actgactgta660
gacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctga agactctgcg720
gtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagt幼ctcttactggtactt cgatgtctgg780
ggcacagggaccacggtcaccgtctctgatccagaaaacagctttgaaat gcaaaaaggt840
gatcagaatcctcaaattgcggcacatgtcataagtgaggccagcagtaa aacaacatct900
gtgttacagtgggctgaaaaaggatactacaccatgagcaacaacttggt aaccctggaa960
aatggg肌acagctgaccgtggactctattatatctatgc ccaagtcacc1020
ttctgttccaatcgggaagcttcgagtcaagctccatttatagccagcct ctgcctaaag麵
tcccccggtagattcgagagaatcttactcagagctgcaaatacccacag ttccgccaaa1140
ccttgcgggcaacaatccattcacttgggaggagtatttgaattgcaacc aggtgcttcg1200
gtgtttgtcaatgtgactgatcc幼gcc幼gtgagccatggcactggctt cacgtccttt1260
ggcttactcaaactcgagtgataatctaga1290
<210〉 23
<211〉 43
<212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
<223>寡核苷酸
<400〉 23
gtcaagcttg ccgccatgga ttttcaagtg cagatttttc age 43
<210> 24
<211〉 74
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<220〉
<223>寡核苷酸
<400> 24
gtcgtcgagc tcccacctcc tccagatcca ccaccgcccg agccaccgcc acctttcagc 60 tccagcttgg tccc 74
<210> 25
<211> 37
<212〉 腿 <213>人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
93<400〉 25
gctgctgagc tctcaggctt atctacagca agtctgg 37
<210〉 26
<211〉 32
<212〉 腿 <213〉人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400〉 26
gttgtctgat cagagacggt gaccgtggtc cc 32
<210> 27
<211〉 34
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400〉 27
gttgtcggat ccagaaaaca gctttgaaat gcaa 34
<210〉 28
<211〉 44
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400〉 28
gttgtttcta gattatcact cgagtttgag taagccaaag gacg 44
<210> 29
<211> 35
<212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400> 29
gttgtcggat ccaagaaggt tggacaagat agaag 35
<210> 30
<211〉 23
<212> DNA
<213〉 人工序列<220>
<223>寡核苷酸 <400> 30
gtctatataa gcagagctct ggc 23
<210> 31
<211〉 25
<212> ■ <213〉人工序列
<220>
<223〉寡核苷酸
<400> 31
cgaggctgat cagcgagctc tagca 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400〉 32
ccgcaatttg aggattctga tcacc 25
<210> <211> <212〉 <213>
33
482
PRT
人工序列
<220〉
<223>小鼠-人杂交融合蛋白
<220> <221> <222> <223>
<220〉 <221> <222> <223〉
位点
(1〉.. (266〉 小鼠抗人CD20 scFv
结构域 (268〉.. (481)
细胞外域，长型，人CD154
<400> 33
Met Asp Phe Gin Val Gin lie Phe Ser Phe Leu Uu lie Ser Ala Ser 15 10 15
Val lie lie Ala Arg Gly Gin lie Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala lie 20 25 30
95Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60
Pro Lys Pro Trp lie Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie 85 90 95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 100 105 110
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125
Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140
Gin Ala Tyr Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Uu Val Arg Pro Gly Ala 145 150 155 160
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175
Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Arg Gin Gly Leu Glu Trp lie 180 185 190
Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 195 200 205
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 225 230 235 240
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 245 250 255Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Pro Arg Arg Leu Asp Lys 260 265 270
lie Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr 275 280 285
lie Gin Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys 290 295 300
Glu Glu lie Lys Ser Gin Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp lie Met Leu 305 310 315 320
Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gin Lys Gly 325 330 335
Asp Gin Asn Pro Gin lie Ala Ala His Val lie Ser Glu Ala Ser Ser 340 345 350
Lys Thr Thr Ser Val Leu Gin Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met 355 360 365
Ser Asn Asn Leu Val Thr L>eu Glu Asn Gly Lys Gin Leu Thr Val Lys 370 375 380
Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr lie Tyr Ala Gin Val Thr Phe Cys Ser Asn 385 390 395 400
Arg Glu Ala Ser Ser Gin Ala Pro Phe lie Ala Ser Leu Cys Uu Lys 405 410 415
Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg lie Uu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His 420 425 430
Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gin Gin Ser lie His Leu Gly Gly Val 435 440 445
Phe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro 450 455 柳
Ser Gin Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys 465 470 475 480
L>eu Glu
97422
PRT
人工序列
<220>
<223>小鼠-人杂交融合蛋白
<220> <221> <222> <223〉
<220> <221> <222> <223〉
位点
(l).. (266) 小鼠抗人scFv
结构域 (268).. (421)
细胞外域，短型，人CD154
<400> 34
Met Asp Phe Gin Val Gin IU Phe Ser Phe Leu Leu lie Ser Ala Ser
1 5
10
15
Val lie lie Ala Arg Gly Gin lie Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala lie 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser
50
55 60
Pro Lys Pro Trp lie Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65
70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie
85
90 95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 100 105 110
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Uu Glu Leu Lys 115 120 125
Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140
98Gin Ala Tyr Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 145 150 155 160
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175
Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Arg Gin Gly Leu Glu Trp lie 180 185 190
Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 195 200 205
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220
Met Gin Leu Ser Ser Uu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 225 230 235 240
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 245 250 255
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Pro Glu Asn Ser Phe Glu 260 265 270
Met Gin Lys Gly Asp Gin Asn Pro Gin lie Ala Ala His Val lie Ser 275 280 285
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gin Trp Ala Glu Lys Gly 290 295 300
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Uu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin 305 310 315 320
Leu Thr Val Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr lie Tyr Ala Gin Val Thr 325 330 335
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gin Ala Pro Phe lie Ala Ser 340 345 350
Leu Cys Uu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg lie Leu Leu Arg Ala 355 360 365
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gin Gin Ser lie His370
375
380
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 385 390 395 400
Val Thr Asp Pro Ser Gin Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 405 410 415
Gly Leu Leu Lys Leu Glu 420
<210> <211> <212〉 <213>
35 63 DNA 人
<220> <221> <222> <223〉
N一区
(l).. (63)
只含1个半胱氛酸的人IGA铰链区的部分
<400> 35
ccagttccct caactccacc taccccatct ccctc站ctc cacctacccc atctccctca 60 tgc 63
<210> <211> <212> <213>
36 21 PRT 人
<400〉 36
Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Sef Pro Ser Thr Pro Pro Thr 15 10 15
Pro Ser Pro Ser Cys 20
<210> <211〉 <212> <213〉
37 763 飄 人
<220〉 <221> <222> <223>
misc一特征
融合于氨基末端scFvs的BCLI位点
100<220>
<221〉 N一区 <222> (L (752)
<223>野生型IGA铰链区，CH2, CH3结构域 截短以去除分泌成分连接
〈400〉 37 tgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccacctaccccatc60
tccctcatgctgccacccccgactgtcactgcaccgaccggccctcgaggacctgctctt120
aggttcagaagcgatcctcacgtgcacactgaccggcctgagagatgcctcaggtgtcac180
cttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgctgttcaaggaccacctgaccgtgacct240
ctgtggctgctacagcgtgtccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatgg300
gaagaccttcacttgcactgctgcctaccccgagtccaagaccccgctaaccgccaccct360
ctcaaaatccggaaacacattccggcccgaggtccacctgctgccgccgccgtcggagga420
gctggccctgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggcttcagccccaagga480
tgtgctggttcgctggctgc柳ggtcacaggagctgccccgcgagaagtacctgacttg540
ggcatcccggcaggagcccsgccagggcaccaccaccttcgctgtgaccagcatactgcg600
cgtggcagccgaggactggaag卿ggggacaccttctcctgcatggtgggccacgaggc660
cctgccgctggccttcacacagaagaccatcgaccgcttggcgggtaaacccacccatgt720
c肌tgtgtctgttgtcatggcggaggtggactgataatctaga763
<210> 38
<211> 250
<212〉 PRT
<213> 人
<220>
<221> 结构域 <222〉 (3^ (250)
<223〉截金^)形式，去除介导与分泌成分连接的最后三个氨基酸 <400> 38
Asp Gin Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro 15 10 15
Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Uu His Arg 20 25 30
Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala lie Leu Thr Cys 35 40 45Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gin Gly Pro Pro Asp Arg Asp Leu65 70 75 80
Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro85 90 95
Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser100 105 110
Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg115 120 125
Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn130 135 140
Glu Uu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp145 150 155 160
Val Leu Val Arg Trp Leu Gin Gly Ser Gin Glu Leu Pro Arg Glu Lys165 170 175
Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gin Glu Pro Ser Gin Gly Thr Thr Thr180 185 190
Phe Ala Val Thr Ser lie Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys195 200 205
Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Uu Pro Uu Ala210 215 220
Phe Thr Gin Lys Thr lie Asp Arg Uu Ala Gly Lys Pro Thr His Val225 230 235 240
Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp245 250
10权利要求
1.一种结合域-免疫球蛋白融合蛋白，包含(a)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合域多肽，其中所述铰链区多肽选自(i)含有一个或两个半胱氨酸残基并且来源于具有两个或更多半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽的突变的铰链区多肽，前提是当铰链肽含有两个半胱氨酸时，负责与野生型免疫球蛋白铰链区多肽中的轻链恒定区形成二硫键的铰链的第一半胱氨酸不被缺失或取代，(ii)野生型人IgA铰链区多肽，和(iii)不含半胱氨酸残基并且来源于野生型人IgA区多肽的突变的人IgA铰链区多肽；(b)与铰链区多肽融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽；和(c)与CH2恒定区多肽融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽，其中(1)结合域-免疫球蛋白融合蛋白具有至少一种选自抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体固定的免疫活性，并且(2)结合域多肽能够特异性结合于CD20。
2. 权利要求1的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽是突变的铰链区多肽，并且相对于野生型人免疫球蛋白G 铰链区多肽，表现出二聚化的能力降低.
3. 权利要求1的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中结合域多肽 包括至少一种免疫球蛋白可变区多肽，其选自免疫球蛋白轻链可变区 多肽和免疫球蛋白重链可变区多肽.
4. 权利要求3的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 可变区多肽来源于人免疫球蛋白.
5. 权利要求1的结合域免疫球蛋白融合蛋白，其中结合域多肽包 含(a)至少一种免疫球蛋白轻链可变区多肽；(b)至少一种免疫球蛋白 重链可变区多肽；和(c)至少一种与(a)的多肽和与(b)的多肽融合的接头 肽.
6. 权利要求5的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 轻链可变区和重链可变区多肽来源于人免疫球蛋白.
7. 权利要求1的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中至少一种免 疫球蛋白重链CH2恒定区多肽和免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽来 源于人免疫球蛋白重链.
8. 权利要求1的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 重链恒定区CH2和CH3多肽属于选自人IgG和人IgA的同种型.
9. 权利要求1的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中结合域多肽 是来源于单克隆抗体G28-12H7的羊链Fv.
10. 权利要求S的结合域—免疫球蛋白融合蛋白，其中接头多肽包 括至少一种具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-SerSEQ ID NO : 21的 多肽.
11. 权利要求S的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中接头多肽包 括具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser [SEQ ID NO : 21]的多肽的至 少三次重复.
12. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽包括人IgA铰链区多肽.
13. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽含有一个半胱氨酸残基并且来源于具有两个或更多半胱氨 酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽.
14. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽含有一个半胱氨酸残基并且来源于人IgGl铰链区多肽.
15. 权利要求1的结合域—免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽含有一个半胱氨酸残基并且来源于人IgG2铰链区多肽、人 IgG3铰链区多肽，或人IgG4铰链区多肽.
16. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽是突变的铰链区多肽，其含有两个半胱氨酸残基.
17. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽是突变的铰链区多肽，其含有两个半胱氨酸残基，并且来 源于野生型IgG铰链区多肽.
18. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽是突变的铰链区多肽，其含有两个半胱氨酸残基，并且来 源于野生型人IgG铰链区多肽.
19. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽是突变的铰链区多肽，其含有两个半胱氛酸残基，并且来 源于野生型人IgGl铰链区多肽.
20. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白铰链区多肽是突变的铰链区多肽，其含有两个半胱氨酸残基，并且来源于野生型人IgGl铰链区多肽，并且含有一个丝氨酸残基取代一个半 胱氨酸残基.
21. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽是突变的铰链区多肽，其含有两个半胱氨酸残基，并且来 源于野生型IgG2铰链区多肽、野生型IgG3铰链区多肽，或者野生型 IgG4铰链区多肽.
22. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽含有不含半胱氨酸残基并且来源于野生型人IgA区多肽的 突变的人IgA铰链区多肽.
23. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区为大约5 -大约65个氨基酸.
24. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区为大约15-大约35个氨基酸.
25. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 重链CH2恒定区多肽是人IgG重链CH2恒定区多肽.
26. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 重链CH3恒定区多肽是人IgG重链CH3恒定区多肽.
27. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 重链CH2恒定区多肽是人IgGl重链CH2恒定区多肽，并且免疫球蛋 白重链CH3恒定区多肽是人IgGl重链CH3恒定区多肽.
28. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 重链CH2恒定区多肽是人IgA重链CH2恒定区多肽.
29. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 重链CH3恒定区多肽是人IgA重链CH3恒定区多肽.
30. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 重链CH2恒定区多肽是人IgA重链CH2恒定区多肽，并且免疫球蛋 白重链CH3恒定区多肽是人IgA重链CH3恒定区多肽.
31. 权利要求1的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中结合域包含 SEQIDNO: 15的氨基酸23 - 265,
32. 权利要求9的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中单链Fv是 人源化的.
33. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中结合域多肽 能够以至少大约107M"的Ka结合CD20.
34. 编码权利要求1-33任一项的结合域-免疫球蛋白融合蛋白 的分离的多核苷酸.
35. —种包含与启动子可搮作性连接的权利要求34的多核苷酸的 重组表达构建体.
36. 用权利要求35的重組表达构建体转化或转染的宿主细胞.
37. 生产结合域-免疫球蛋白融合蛋白的方法，包括以下步樣(a) 在允许结合域-免疫球蛋白融合蛋白表达的条件下培养权利要 求36的宿主细胞；和(b) 从宿主细胞培养物中分离结合城 一 免疫球蛋白融合蛋白.
38. 含有与生理可接受栽体组合的权利要求1-33任一项的结合 域—免疫球蛋白融合蛋白的药物组合物.
39，权利要求38的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用 于治疗具有或怀疑具有恶性状况或B细胞疾病的受试者.
40. 权利要求39的用途，其中恶性状况或B细胞疾病选自B细胞 淋巴瘤和以自身抗体产生为特征的疾病.
41. 权利要求39的用途，其中恶性状况或B细胞疾病选自类风湿 性关节炎、重症肌无力、格雷夫斯病、I型糖尿病、多发性硬化和自身免疫病
全文摘要
本发明涉及结合域-免疫球蛋白融合蛋白。其特征在于对相关结构，如抗原、反受体等的结合域、具有0或1个半胱氨酸残基的铰链区多肽、以及免疫球蛋白CH2和CH3结构域。尽管主要作为单体多肽存在，该融合蛋白能够ADCC和/或CDC。该融合蛋白可以高表达水平重组产生。也提供了相关的组合物和方法，包括免疫治疗应用。
文档编号C07K16/46GK101684158SQ200910165059
公开日2010年3月31日 申请日期2002年1月17日 优先权日2001年1月17日
发明者J·A·勒贝特尔, M·海登-勒贝特尔 申请人:特鲁比昂药品公司