感光嵌合gpcr蛋白的制作方法【专利摘要】提供一种包含来自G蛋白偶联受体(GPCR)蛋白超家族的至少两个成员的结构域的感光嵌合蛋白用于医学疗法和用于制备用于改善视力、特别用于治疗由视网膜光感受器变性引起的视力丧失的药物，所述结构域融合在一起以产生能够使光信号与代谢型谷氨酸受体6(mGluR6)的信号转导级联偶联的感光GPCR嵌合体。至少两个GPCR家族成员的第一个促成介导对嵌合感光GPCR蛋白的感光性的结构域。该第一成员属于感光GPCR蛋白家族亦称感光色素，并且在一些实施方案中，这种感光GPCR蛋白是黑视蛋白，特别是人黑视蛋白。至少两个GPCR家族成员的第二个是mGluR6，其促成使光信号与mGluR6的胞内信号转导级联偶联的结构域，所述mGluR6是内视网膜中ON-双极细胞的细胞膜的天然组分。【专利说明】感光嵌合GPCR蛋白发明领域[0001]本发明在于用于治疗患有视力丧失的人或动物患者的医学治疗学和医学疗法领域，并且涉及用于用感光嵌合GPCR蛋白改善视力、特别用于治疗由视网膜光感受器变性引起的视力丧失的治疗法以及用于所述改善的药物的制备。[0002]发明背景视网膜光感受器变性的主要原因包括色素性视网膜炎(RP)、年龄相关性黄斑变性(ARMD)、糖尿病性视网膜病和其它疾病。大约3000人中有一人，即全球有300万人患有色素性视网膜炎(RP)，一种导致光感受器变性和最终失明的遗传病况。光感受器变性的速率(rate)和严重程度是可变的，高度取决于突变本身。超过50个基因可受到影响(Hartong等，Lancet368:1795-1809;2006)。迄今，对于RP患者几乎没有可用的治疗。正在进行中的专注于神经保护剂(例如睫状神经营养因子)或基因添加疗法(geneadditiontherapy)(引入“非突变的”基因)的试验，迄今为止仅显示有限的成功，这些试验的目的在于将获得性或遗传性基因缺陷纠正成为天然的功能基因。考虑到成体视网膜在光感受器丧失后没有产生新光感受器的能力，因此基因添加疗法只有光感受器丧失少时才是有用的，并且主要减缓或稳定早期病况。[0003]应用于最近实验性研究的备选方法是通过感光蛋白质的转基因表达赋予其余光感受器感光性或使内视网膜神经元感光性继续保持。[0004]在US2009/0088399和US2010/0015095中，提出了将光门控海藻离子通道通道视紫红质_2(light-gatedalgalion-channelchannelrhodopsin-2,ChR2)引入患有光感受器细胞变性的患者的内视网膜。这就赋予了天然光不敏感的内视网膜细胞(例如双极细胞或无长突细胞)感光性并且能够检测视觉信息，所述视觉信息随后传送到大脑而无需接收来自光感受器的输入。`[0005]类似地，在US2005/0208022和US2009/0208462中，提出了将一种感光蛋白(photoreceptiveprotein)例如视蛋白(包括黑视蛋白(melanopsin))或细胞色素引入内视网膜神经元中，包括患有光感受器变性的患者的无长突细胞、水平细胞和双极细胞。[0006]在内视网膜神经元中表达ChR2的方法具有可观的前景，目前在非人灵长类动物(FradotM等，HumanGeneTherapy22(5),587-593;2011)和分离的人视网膜(IvanovaE等，OpthalmolVisSci51(10)，5288-5296，2010)中进行试验，这为不久的将来的临床试验增加了希望。[0007]近年来，使用重组腺伴随病毒(rAAV)的视网膜基因置换疗法已获成功，并且已达到最后的临床试验。具体地讲，Bainbridge及同事使用rAAV置换缺陷型视网膜色素上皮特异性65-kDa蛋白质基因(RPE65)。RPE65蛋白的缺乏使得光感受器不能够对光起反应，因为需要其进行生色团再循环，即全反式视黄醛向11-顺式视黄醛转化(BainbridgeJWB等，NEnglJMed358(21)，2231-2239;2008)。因此，基因疗法是一种通过将合适的基因引入视网膜神经元来纠正视觉缺陷的有前景的治疗方法。[0008]然而，目前可利用的可用于基因疗法以补偿光感受器细胞丧失的光可激活蛋白(light-activatable)仍有许多实质性缺点:1)外来的无脊椎动物或藻类蛋白质(例如ChR2)的人工表达可引发患者中的不可预测的免疫反应。2)ChR2对于钙具有相对高的通透性，这在长时间内将会是有毒的。3)ChR2反应在自然光强度下本来就弱，因为每个俘获的光子只能激活单个蛋白质。4)虽然黑视蛋白能够通过门控高通量酶促反应的活性来放大光信号，但是在内视网膜神经元中无法充分获得这些酶的配偶体。因此，神经节细胞和ON-双极细胞中黑视蛋白的表达不引起足以恢复自然光强度下的功能视觉的光信号放大。5)此外，在表达外源蛋白质时，缺乏通过更新(turnover)和调节的改变而自然控制蛋白质活性的调节机制。[0009]本发明的目的是提供感光嵌合蛋白，所述感光嵌合蛋白当在内视网膜神经元中表达时，将克服这些缺点。也就是说，本发明的目的是提供用于改善和恢复视力(特别是视网膜光感受器变性患者的视力)的优良感光蛋白。与通过现有技术水平所给出的蛋白质可获得的感光性相比，这种嵌合蛋白将改善或恢复感光性至较高程度。本发明的其它目的包括编码嵌合感光蛋白的遗传信息和在活的细胞和生物体中表达这种嵌合蛋白的方法。本发明的更多目的包括在体内的内视网膜细胞中表达编码嵌合感光蛋白的遗传信息用于治疗性治疗及包含感光蛋白或编码所述嵌合蛋白的遗传信息的生物医学制品。[0010]发明概述该技术问题通过包含来自G蛋白偶联受体(GPCR)蛋白超家族的至少两个成员的结构域的感光嵌合蛋白得到解决，所述结构域融合在一起产生感光GPCR嵌合体，其能够将光信号与代谢型谷氨酸受体6(mGluR6)的信号转导级联偶联。[0011]G蛋白偶联受体(GPCR)蛋白超家族成员是将信号从细胞表面传送至胞内效应物的跨膜蛋白受体。它们具有一定结构，其通常包含7个跨膜结构域(TM1-TM7)、3个胞外环(EL1-EL3)、3个胞内环(IL1-1L3)、1个胞外N端结构域(NT)和I个胞内C端(CT)结构域。GPCR蛋白超家族包括称为感光色素的感光受:体蛋白，例如视蛋白，例如视紫红质和黑视蛋白。GPCR超家族还包括配体门控性代谢型受体，例如mGluR6。代谢型G蛋白偶联受体通过由特异性G蛋白介导的信号转导级联与膜中的离子通道间接连接以实现信号放大。也就是说，活化G蛋白调节酶(例如腺苷`酸环化酶)的活性，所述酶快速产生大量产物(例如cAMP)，产物继而可激活细胞膜中的大量离子通道。与这种代谢型GPCR形成对比，离子型受体与膜中的离子通道直接连接。因此，离子型受体如通道视紫红质不能够像代谢型受体一样放大信号。[0012]本发明的一个方面涉及嵌合GPCR蛋白，其包含来源于至少两个GPCR家族成员的结构域:至少两个GPCR家族成员的第一个促成介导嵌合感光GPCR蛋白的感光性的结构域。所述第一成员属于感光GPCR蛋白家族,亦称感光色素,并且在一些实施方案中，这种感光GPCR蛋白是黑视蛋白(melanopsin),特别是人黑视蛋白。[0013]至少两个GPCR家族成员的第二个，即mGluR6，促成使光信号与mGluR6的胞内信号转导级联偶联的结构域。[0014]mGluR6是内视网膜中ON-双极细胞的细胞膜的天然组分。对于本发明的治疗方面，这些ON-双极细胞是感光嵌合GPCR蛋白可在其中表达的靶细胞。在生理学上，天然ON-双极细胞mGluR6在胞外结合谷氨酸时激活其胞内信号级联。因此，ON双极细胞天然含有介导mGluR6信号转导级联的特异性胞内组分。[0015]在生理光信号转导途径中，光激活的健康视杆和视锥光感受器细胞响应光强度的降低，其中从其突触末端释放的谷氨酸水平增加，谷氨酸然后与ON-双极细胞上的mGluR6结合，这继而通过mGluR6的特异性G蛋白偶联的胞内信号转导级联引起光信号放大。与这种天然途径类似，在光激活时，失明视网膜的ON-双极细胞中表达的嵌合感光GPCR蛋白将光信号传送至依旧存在(KriajD等，VisionRes.50:2460-65，2010)的mGluR6受体的胞内号级联。[0016]引人注目的是，ON-双极细胞当补充嵌合感光GPCR蛋白时，通过嵌合感光GPCR蛋白直接感知光信号，绕过因光感受器的光刺激而随之发生的间接谷氨酸信号。因此，嵌合感光GPCR蛋白能够将光激活与mGluR6信号级联直接偶联。换句话说，光激活不依赖于任何功能性视杆或视锥光感受器细胞。此外，由一个光子引起的信号的生理放大通过mGluR6的信号转导级联而被保持。[0017]在本专利申请的情况下，术语“结构域”是指GPCR蛋白家族成员的胞内环和胞外环、N端和C端和跨膜区。术语“来源于……结构域”，例如来源于mGluR6的结构域或来源于视蛋白的结构域包括任何结构域，其中生理学相关对应部分具有与GPCR家族成员的生理学对应物中的这样的结构域的序列相同的氨基酸序列或类似的氨基酸序列。一般来说，类似的氨基酸序列或类似的结构域显示至少60%同源性，优选至少80%同源性，最优选至少90%同源性。类似的结构域还特别包括包含相关保守氨基酸的结构域、不依赖于剩余序列的部分是偏离天然对应物还是从天然对应物中缺失或者在天然GPCR家族成员中不存在的嵌合蛋白中是否存在其它序列。[0018]在一些实施方案中，嵌合蛋白包含来源于双稳态感光色素(例如黑视蛋白而不是例如视紫红质)的光可激活的胞外结构域。双稳态感光色素的优势在于它们在通过光的恢复而非通过外部细胞酶进行漂白(bleaching)后循环。恢复率极快，并且甚至在高光强度下都将保持高感光性。用双稳态感光色素，光漂白和漂白恢复在高光强度下同等增加，而用非双稳态的视紫红质，在照明期间失去其感光性，因为越来越多的视紫红质被漂白。在非双稳态感光色素(例如视紫红质)中，光漂白可导致在最坏的情况下短期失明。当非双稳态感光色素(例如视紫红质)在外源细胞类型中表达时，恢复率甚至会更慢，因为附近不一定可获得恢复酶。在健康视网膜中，这些酶位于视网膜色素上皮中。[0019]因此，来源于双稳态感光色素的嵌合GPCR的第一成员的结构域的选择使得光漂白后的嵌合GPCR恢复不依赖于漂白恢复酶的可用性。在一些实施方案中，双稳态光感受器蛋白的光可激活结构域选自视蛋白家族，最优选为黑视蛋白，并且如果用于人患者，则为人黑视蛋白以避免免疫反应。[0020]在嵌合GPCR蛋白的一些实施方案中，第一GPCR成员至少促成含有形成席夫碱(使生色团与GPCR共价连接)的氨基酸残基的结构域，所述残基在TM3中为黑视蛋白酪氨酸149(Y149)，在TM7中为赖氨酸321(K321)，或者促成所有结构域，其来源于在生理学对应物中形成生色团结合袋(bindingpocket)的结构域。生色团结合袋是指光色素的结合部位，其吸收光子例如黑视蛋白中的11-顺式视黄醒(Hermann等,Neuroscienceletters,第376卷，第76-80页，2004)。[0021]在一些其它的实施方案中，嵌合GPCR蛋白包含第一GPCR成员的全部胞外结构域，其为N端和3个胞外环(EL1、EL2、EL3)及另外来自第一GPCR成员的所有7个跨膜结构域(TM1-TM7)。[0022]在这些实施方案的任一个中，嵌合GPCR蛋白的胞内结构域中的至少一个，即胞内环IL1、IL2、IL3和/或C端的至少一个来源于第二GPCR，第二GPCR是mGluR6。在一些实施方案中，来源于mGluR6的至少一个胞内结构域为IL3，或者为IL3和另外至少一个其它胞内结构域，例如IL3和IL2或IL3和IL2和C端或其它组合。[0023]本发明的功能性嵌合GPCR蛋白是感光的，并且能够使光激活与mGluR6信号转导级联偶联。取决于选择哪个感光色素作为嵌合蛋白的第一GPCR成员，使用该感光色素的一些或全部跨膜结构域和胞外结构域。形成生色团袋所需要的结构域是赋予嵌合蛋白光可激活性所必需的，根据现有知识，所述结构域是例如黑视蛋白中的TM3-TM7和通道视紫红质中的TM2-TM7。使光激活与mGluR6信号转导级联偶联所必需的结构域必须能够与mGluR6途径特异性的G蛋白Ga(ο)结合。IL3似乎对与GPCR信号级联的G蛋白的特异性结合特别相关。一般而言，在其中ILl和IL2和C端结构域的一些或全部不是来源于mGluR6的实施方案中，其它胞内环和C端提高G蛋白结合的特异性。[0024]在一些实施方案中，嵌合GPCR蛋白包含这样的结构域，其来源于不是第一成员并且也不是第二成员的另一种双稳态GPCR蛋白(或者基于双稳态GPCR的视蛋白嵌合体)。[0025]在一些实施方案中，为了使潜在的免疫原性反应最小化并使与待用于人的医学疗法的mGluR6生理偶联最优化，感光结构域来源于人GPCR，例如人黑视蛋白、人视紫红质、人视锥视蛋白以及嵌合人视蛋白。[0026]按照本领域已知技术，通过使编码GPCR成员的结构域的遗传信息与所需的感光性官能团融合，并且使光激活与mGluR6的信号转导级联偶联，来构建感光嵌合GPCR蛋白。所需结构域的鉴定和任何特定结构域的N末端和C末端的合适切割和连接部位的确定主要根据:1)基因序列/保守残基的比对，和2)应用本领域可获得的标准软件进行感光GPCR家族成员和mGluR6的二级结构和三级结构的计算机建模。这种方法在各个结构域长度的确切定义中具有固有变化性，并且当提及结构域时，这种变化性包括在本发明的范围内。此外，在结构域之间的各个融合位点上，一般存在将结构域剪接在一起产生功能性蛋白质的多种可能性。而且显然，非功能所需的氨基酸序列的部分的缺失、保守氨基酸取代(例如疏水氨基酸与疏水氨基酸或亲水氨基酸与亲水氨基酸交换)和核苷酸取代也在本发明的范围内。因此，大量的序列变体(特别是在嵌合GPCR蛋白相邻结构域之间融合位点的区域中)落入本发明的范围内，只要它们产生功能性嵌合GPCR蛋白。在其中所有跨膜和胞外结构域来源于第一GPCR成员且至少一个或全部胞内结构域被来源于mGluR6的相应结构域置换的实施方案中，用于交换IL1、IL2、IL3和C端的所有可行的切割和连接位点均在本发明的范围内。[0027]本发明的其它方面涉及能够使光激活与mGluR6的信号转导级联偶联的光可激活的嵌合GPCR蛋白的遗传信息、包含所述遗传信息的载体(包括病毒载体，例如rAAV)、包含所述遗传信息的转基因动物(例如小鼠和斑马鱼)和包含所述遗传信息或表达能够使光激活与mGluR6的信号转导级联偶联的光可激活的嵌合GPCR蛋白的细胞培养物细胞，特别包括神经元细胞系、内视网膜神经元细胞系和双极细胞系，特别是ON-双极细胞。[0028]本发明的又一个方面涉及将用于表达能够使光激活与mGluR6的信号转导级联偶联的光可激活的嵌合GPCR蛋白的遗传信息引入眼、优选引入ON-双极细胞的方法。本发明的再一个方面涉及将用于表达能够使光激活与mGluR6的信号转导级联偶联的光可激活的嵌合GPCR蛋白的遗传信息引入细胞培养物细胞、特别引入神经细胞系(包括视网膜细胞系，内视网膜细胞系和双极细胞系)的方法。[0029]本发明的又一个方面涉及将能够使光激活与mGluR6的信号转导级联偶联的感光嵌合GPCR蛋白引入眼、特别引入玻璃体或视网膜下间隙以靶向视网膜细胞(包括视杆和视锥光感受器细胞两者的ON-双极细胞)以用于在医学疗法中改善视力的基因治疗方法。所述基因治疗方法包括但不限于电穿孔、病毒转导和基于化学法的转染。所述医学疗法特别包括部分或完全失明的治疗，例如色素性视网膜炎(RP)和黄斑变性(ARMD)以及其它形式的光感受器变性的治疗。[0030]本发明的再一个方面涉及能够使光激活与mGluR6的信号转导级联偶联的感光嵌合GPCR蛋白或编码所述嵌合蛋白的遗传信息和包含所述蛋白质或所述遗传信息本身或者载体或细胞内的所述蛋白质或所述遗传信息的组合物用于医学疗法的目的、特别用于改善视力、用于部分或完全失明的治疗、用于色素性视网膜炎(RP)和黄斑变性(ARMD)以及其它形式的光感受器变性的治疗。[0031]在生理学上，视网膜内核层上的ON-双极细胞的代谢型谷氨酸受体在响应视网膜光感受器细胞活性时被神经递质谷氨酸激活。当光感受器被光刺激时，释放到ON-双极细胞的谷氨酸的浓度改变。感光嵌合GPCR蛋白是天然mGluR6蛋白质的变体，其被光直接激活，而天然mGluR6蛋白质在光感受器细胞被光改变刺激后通过谷氨酸被间接激活。因此，可通过在其ON-双极细胞中表达嵌合光可激活蛋白，来治疗患有光感受器变性的患者，所述嵌合光可激活蛋白包含能够使光激活与mGluR6的信号转导级联偶联的mGluR6的胞内结构域。[0032]在感光嵌合GPCR蛋白的一些实施方案中，黑视蛋白的至少一个或全部胞内组分或另一种双稳态感光色素`被mGluR6的胞内组分取代，产生包含黑视蛋白的光感受器结构域的嵌合蛋白，其能够驱动内视网膜神经元中、特别是ON-双极细胞中已有的胞内mGluR6信号转导级联。[0033]由于嵌合光可激活性mGluR6-黑视蛋白蛋白质在ON-双极细胞中的人工表达，因此弱的光信号通过操纵被天然mGluR6调节的生理上预先存在的快速酶促反应而被放大。此外，当使用天然光感受器蛋白(例如人黑视蛋白)的胞外结构域时，这类嵌合蛋白将逃逸免疫反应，因为免疫系统可及的唯一部分将与天然人黑视蛋白的胞外结构域相同。[0034]使用mGluR6作为第一GPCR成员的优势是mGluR6仅在视网膜中的ON-双极细胞中表达。因此，转基因表达的嵌合mGluR6-黑视蛋白将仅与ON双极细胞中的mGluR6信号转导级联有效偶联。而且，嵌合蛋白的降解和调节(例如抑制蛋白结合)可通过预先存在的mGluR6途径而发生，允许蛋白质活性的充分自我控制。[0035]嵌合感光mGluR6_黑视蛋白蛋白质在ON双极细胞中的表达还有另一个特殊作用以恢复视力，其不同于其它视力恢复方法:视觉对比实际上将被反转；暗将表现为明，明将表现为暗。也就是说，被光强度增强而天然激活的神经回路将被光强度的减弱激活，反之亦然。实际上相对于下文概述的现有技术，这可具有关键优势:在暗中，光感受器释放其相对高水平的神经递质(谷氨酸)，并且亮度增强时释放较少的递质。ON-双极细胞通过mGluR6受体接受递质输入，当被激活(在暗中)时，使双极细胞超极化，反之亦然。如果没有光感受器，就没有谷氨酸，ON-双极细胞被去极化，而且存活的内视网膜实际上呈“极强光”适应方式。实际上，ON双极细胞极慢的变性可能由这种持续的去极化所致。色素性视网膜炎患者意识不到其视网膜的光适应，因为视网膜输出仅表示光强度的空间和时间改变信。也就是说，如果未察觉强度的改变，则视网膜将不会有效地将信号送往大脑，尽管视网膜仍处于充分光适应状态。[0036]对于改善光感受器细胞部分或完全丧失的患者的视力，重要的是考虑视网膜处于充分光适应状态。这意味着ON-双极细胞被永久地相对去极化。在ON-双极细胞中表达的通道视紫红质-2只能将进一步使这些细胞去极化，因此有光(Iight-ON)状态和无光(Iight-OFF)状态之间的信号差异相对小。相比之下，表达本发明的嵌合感光mGluR6-GPCR蛋白的ON-双极细胞被光超极化。显然，这增加了信号差异，因此提高输出，并因而提高了感光性。[0037]附图简述图1:显示跨越感光嵌合GPRC蛋白的实施方案的细胞膜的结构域和方向的示意图，所述感光嵌合GPRC蛋白具有黑视蛋白的N端(NT)、跨膜结构域(TM1-TM7)和胞外环1_3(EL1-EL3)及mGluR6的胞内环1-3(IL1-1L3)和C端(CT)。[0038]图2:实施例1:用小鼠mGluR6-黑视蛋白(MGluR6的IL2(DRIY)、IL3(I)和CT，具有Seq.N0.7/8的示例性实施方案D)(具有在HEK293(GIRK)细胞中测量的最大电流的本发明的优选序列)转染的HEK293(GIRK)细胞的完整细胞电流响应图3:实施例1:向外K.电流图4:实施例2:使用rAAV2衣壳突变体载体进行的小鼠ON-双极细胞的成功和特异的mGluR6-黑视蛋白转导图5:在使用rAAV2载体将mGluR6_黑视蛋白导入视网膜ON双极细胞后I个月，自8周龄rdl小鼠视网膜(无光感受器细胞的视网膜)的视网膜神经节细胞中记录的光反应图6:用兔抗RablA抗体的免疫标记显示失明rdl小鼠的暗适应视网膜呈光适应去极化状态。[0039]一些实施方案的详述所需结构域的鉴定和任何特定结构域的N末端和C末端处的合适切割和连接部位的确定主要根据:1)基因序列/保守残基的比对，和2)应用例如CLCProteinWorkbench、1-TASSER、MODELLER、QUARK或SWISS-Model(KieferF等，NucleicAcidsRes37，D387-D392，2009)，进行感光GPCR家族成员和mGluR6的二级结构和三级结构的计算机建模。[0040]在感光嵌合GPCR蛋白的一些实施方案中，第一GPCR成员是黑视蛋白，特别是人或小鼠黑视蛋白，第二GPCR成员是人或小鼠mGluR6。嵌合感光GPCR蛋白的这些实施方案简称为mGluR6-黑视蛋白。[0041]下文中更详细地描述了构建感光mGluR6_黑视蛋白的数个实施方案。本发明的范围不限于这些具体的实施方案。在一些实施方案中，IL2、IL3和CT来源于mGluR6，而嵌合体的其余部分来源于黑视蛋白。在一些其它的实施方案中，所有3个胞内环IL1-1L3和CT来源于mGluR6，所有跨膜和胞外结构域来源于黑视蛋白。[0042]图1图解地显示了跨越一个实施方案的细胞膜的结构域和方向，该实施方案具有黑视蛋白的N端(NT)、跨膜结构域(TM1-TM7)和胞外环1_3(EL1-EL3)和mGluR6的胞内环1-3(IL1-1L3)和C端(CT)。7个剪接位点用字母a_g标示。基本上，黑视蛋白的胞内环被mGluR6的胞内环交换的所有可行的切割和连接位点均在本发明的范围内。[0043]表1公开了构建mGluR6-黑视蛋白实施方案的特别成功的多个剪接位点，其根据序列比对和3D-建模来选择，并发现是功能上有活性的。对于功能性mGluR6-黑视蛋白嵌合体的构建，存在可变剪接选择的各种组合，并且所述组合在本发明的范围内。[0044]人mGluR6-黑视蛋白的经测定的功能性剪接_连接位点:【权利要求】1.适于使光信号与内视网膜ON双极细胞中的mGluR6的信号转导级联偶联的嵌合GPCR蛋白，其包含来源于G蛋白偶联受体(GPCR)蛋白家族的至少两个成员的结构域，其特征在于至少两个成员的第一个是促成其介导光激活的结构域中至少一些的感光GPCR，以及至少两个GPCR家族成员的第二个促成其能够使光激活与mGluR6的信号转导级联偶联的结构域中的至少一些。2.权利要求1的嵌合GPCR蛋白，其中所述第一GPCR成员来源于双稳态感光色素。3.权利要求1或2的嵌合GPCR蛋白，其中所述第一GPCR成员至少促成含有形成席夫碱以使生色团与GPCR共价结合的氨基酸残基的结构域或促成在生理学对应物中形成生色团结合袋的所有结构域。4.权利要求1-3中任一项的嵌合GPCR蛋白，其中所述第一GPCR成员是黑视蛋白，优选人黑视蛋白。5.权利要求4的嵌合GPCR蛋白，其中所述黑视蛋白、特别是人黑视蛋白促成生色团结合袋，特别包含至少包括氨基酸序列Y149-K321的跨膜结构域TM3-TM7。6.权利要求4的嵌合GPCR蛋白，其中所述黑视蛋白、特别是人黑视蛋白促成TM3-TM7和胞外环1-3(EL1、EL2、EL3)及胞外N端，且其中mGluR6促成胞内环I(IL1)、胞内环2(IL2)、胞内环3(IL3)和C端的至少一个。7.权利要求1或5的嵌合GPCR蛋白，其中所述第一GPCR成员促成跨膜结构域TM1-TM7和胞外环1-3(EL1、EL2、EL3)及胞外N端，并任选另外促成胞内结构域胞内环I(ILl)、胞内环2(IL2)、胞内环3(IL3)和C端的至少一个而不是所有。8.权利要求1-7中任一项的嵌合GPCR，其中所述第二GPCR成员促成来源于人mGluR6的胞内结构域的至少一个。9.权利要求8的嵌合GPCR，其中所述来自mGluR6的至少一个胞内结构域包含mGluR6的第三胞内环和优选另外的第二胞内环，最优选第三胞内环、第二胞内环和C端。10.具有氨基酸序列编号1.2,2.2,3.2、4.2和5.2的嵌合GPCR蛋白，其包括具有保守氨基酸和核苷酸取代的序列。11.携带编码权利要求1-10中任一项的嵌合蛋白的遗传信息的核酸。12.序列编号1、3、5、7和9的核酸，其包括编码相同氨基酸序列和具有保守取代的氨基酸序列的序列。13.携带编码权利要求1-10中任一项的嵌合蛋白的遗传信息或权利要求11或12的核酸的载体。14.权利要求13的载体,其中所述载体是病毒载体,优选rAAV。15.权利要求13或14的载体，其包含控制编码权利要求1-10中任一项的嵌合蛋白的遗传信息的表达、只在ON-双极细胞中表达的视网膜蛋白质的启动子/增强子序列。16.权利要求15的载体，其中所述启动子/增强子序列来源于GY13或TRPMl或mGluR6或夜盲蛋白的启动子/增强子序列。17.在ON-双极细胞中含有嵌合体的转基因敲入小鼠。18.在ON-双极细胞中含有嵌合体的转基因斑马鱼。19.药物、载体或转基因细胞系，特别是转基因神经细胞系，所述细胞系包括包含权利要求11-16中任一项的遗传信息或表达权利要求1-10中任一项的嵌合GPCR蛋白的视网膜细胞系、内视网膜细胞系和双极细胞系以改善视力。20.将权利要求11-16中任一项的遗传信息体内引入眼中、特别是引入包括双极细胞、特别是ON-双极细胞在内的视网膜细胞中或者体外引入权利要求19的细胞培养物细胞系中的方法。21.将权利要求11-16中任一项的遗传信息引入眼中、特别是引入眼的玻璃体中或视网膜下间隙以靶向ON-双极细胞用于电穿孔或病毒转导的引入方法。22.权利要求1-10中任一项的嵌合GPCR蛋白或权利要求11-16中任一项的编码所述嵌合GPCR蛋白的遗传信息和包含所述蛋白质或遗传信息本身或者载体或细胞内的所述蛋白质或遗传信息的组合物，其用于医学疗法以改善视力、特别用于部分或完全失明的治疗、用于色素性视网膜炎(RP)、黄斑变性和其它形式的光感受器变性的治疗。【文档编号】C07K14/72GK103814045SQ201280030926【公开日】2014年5月21日申请日期:2012年6月22日优先权日:2011年6月24日【发明者】M.范维克,S.克莱恩洛格申请人:哈格－斯特莱特医疗科技股份公司