Caspase-3抑制剂在制备促进脑中风后神经再生的制剂中的用途
【专利摘要】本发明属细胞生物学领域，涉及Caspase-3抑制剂在制备促进脑中风后神经功能重塑制剂中的用途。本发明经脑中风小鼠模型动物实验，结果显示，在脑中风的恢复期，caspase-3在脑室下区和海马齿状回的新生神经前体细胞中的表达明显增加，体外培养提取的神经前体细胞显示，caspase-3限制神经前体细胞的自我更新能力，但并不引起细胞的凋亡；所述caspase-3通过降低Akt的磷酸化对神经再生进行调控；实验结果证实，用caspase-3抑制剂抑制caspase-3活性能显著促进脑室下区的神经前体细胞的增殖和迁移，从而促进神经元的再生和脑中风后的神经功能恢复。
【专利说明】Caspase-3抑制剂在制备促进脑中风后神经再生的制剂中的用途
【技术领域】
[0001]本发明属细胞生物学领域，涉及Caspase-3抑制剂在促进脑中风后神经再生中的用途，具体涉及Caspase-3抑制剂在制备促进脑中风后神经功能重塑制剂中的用途。
【背景技术】
[0002]据报道，脑中风是全球性致死和致残的主要原因之一。有研究指出，tPA溶栓治疗对急性缺血性脑脑中风具有明显的疗效；但是，许多未能及时接受tPA溶栓治疗的脑中风患者，往往会留下严重的后遗症，包括偏瘫、感觉缺失、记忆损失等。尽管医学界一直在不断地努力，但是至今仍然没有有效的针对脑脑中风后神经功能受损的治疗方法。
[0003]近年的研究表明，神经再生一直存在于成年哺乳动物的脑室下区和海马齿状回。脑中风时，会刺激上述两个区域的神经再生反应，导致神经前体细胞迁移到梗死的边缘并进一步分化为成熟的神经元；新生的神经元有助于修复脑中风造成的神经功能缺失。
[0004]已知Caspases属于半胱氨酸蛋白酶家族，在凋亡中起着中枢性的调节作用。Caspase已经被证明在许多的中枢神经系统疾病中起着介导程序性神经元死亡的作用。研究显示，Caspase-3是一种主要的凋亡执行因子，是程序性细胞死亡的关键执行分子之一；Caspase-3能够裂解许多的细胞底物，并且诱导DNA断片化(凋亡的主要特征)；有文献报道，在脑缺血和脑外伤急性期抑制caspase-3活性可强力地保护神经元受损。近来的研究证明caspase激活,尤其是caspase-3激活，与许多不引起细胞死亡的生物过程有关，例如树突减少、突触抑制、细胞分化及代偿增殖等生物过程；还有研究发现，脑中风后在非凋亡的星形胶质细胞中检测到大量的caspase-3 ;但是,迄今尚未见有关Caspase-3在脑中风后神经再生中的作用的报道。
[0005]与本发明有关的现有技术有:
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【发明内容】
[0067]本发明的目的是提供Caspase-3抑制剂在促进脑中风后神经再生中的用途，具体涉及Caspase-3抑制剂在制备促进脑中风后神经功能重塑制剂中的用途。
[0068]本发明所述的Caspase-3抑制剂可通过市购渠道获得，本发明的实施例中优选caspase-3 抑制剂 Z-DEVD-fmk。
[0069]本发明的Caspase-3抑制剂进行了脑中风小鼠模型动物实验，结果显示，所述caspase-3为抑制脑中风后神经再生的关键内源性成分,抑制caspase-3的活性能增加脑中风后的神经再生反应；结果表明，抑制caspase-3能增强脑中风后大脑组织神经功能重塑。
[0070]本发明的动物实验中采用的材料包括:
[0071 ] ①试剂和抗体(均可通过市购渠道获得);
[0072]②脑中风模型
[0073]按现有技术的方法制备小鼠模型；取6片冠状动脉切片(20 μ m)进行H&E染色后测量脑梗死的大小；梗死采用NIHImageJ软件分析测定，并表示为对侧半脑的百分比；
[0074]采用的实验方法包括:
[0075]①BrdU标记，②注射Caspase-3抑制剂，③行为学测试，④免疫组织化学，⑤TUNEL染色，⑦FlUOT0-JadeB染色，⑧细胞计数，⑨神经球培养和免疫细胞化学及⑩流式细胞术坐寸ο
[0076]实验中进行如下分析:
[0077]①Westernblot 分析
[0078]分离脑中风后第12天的缺血侧大脑半球的脑室下区，使用含有蛋白酶抑制剂cocktails的RIPA裂解液提取脑室下区或神经球中的蛋白；离心后，通过BCA蛋白分析法测定蛋白浓度；等量的蛋白样本分别加到8%，10%和12%Tris-甘氨酸凝胶上电泳，转移到PVDF膜上；膜用5%的脱脂牛奶(脱脂奶粉溶于含0.1%吐温20的TBS)封闭，一抗孵育，力口入辣根过氧化物酶结合的二抗后，然后通过B1-1mageAnalysisSystem(B1-Rad)扫描光密度进行定量；
[0079]②数据分析
[0080]数值用平均值土标准差表示；在经过Bonfeironi’ s多重比较检测后，采用单因素方差分析进行数据处理；两组比较时，采用未配对双尾Studentt检验或MannWhitneyU检验，P〈0.05为有统计学差异；
[0081]实验结果显示了:
[0082](I)脑中风后神经干细胞和细胞死的时间、空间分布情况，
[0083]脑中风刺激脑室下区和海马齿状回区的神经再生反应，梗死周边的皮层区对脑中风后脑功能的恢复起关键作用；结果表明，缺血大脑中神经再生和细胞死亡展现着不同的时间和空间模式，并且在损伤侧大脑皮层区神经再生比细胞死亡持续的时间更长；
[0084](2)在脑中风恢复期caspase-3在神经再生区的表达明显上升，在脑中风的恢复期，caspase-3与其在急性期所起的作用不同；
[0085]确定caspase-3的细胞定位；Caspase_3与BrdU或DCX双染发现，caspase-3在脑室下区)和海马齿状回区的BrdU阳性新生细胞和DCX阳性的神经前体细胞中均有表达，表明上述caspase-3阳性细胞是增殖的神经前体细胞；此外，在上述区域未检测到caspase_7和 caspase-8 ；
[0086]采用抗caspase-3抗体和断裂DNA标记物(TUNEL)进行双染,结果显示,caspase-3阳性细胞并不呈现TUNEL阳性，caspase-3阳性细胞的核为非固缩；
[0087]采用DNA凝胶电泳检测或采用甲酚紫、FlUOT0-JadeB染色检测组织学特征，结果显示，脑室下区和海马齿状回区既无DNA损伤也无神经元损伤的组织学特征；表明，在脑中风恢复期，神经再生区域增殖的神经前体细胞激活caspase-3但与凋亡无关；
[0088](3)脑中风后抑制caspase-3活性促进神经前体细胞的增殖
[0089]结果表明，caspase-3抑制对神经再生的影响不是在减少脑梗死损伤之后产生；与对照组比较，Z-DEVD-fmk处理组的小鼠脑室下区的BrdU阳性细胞数和BrdU阳性的神经前体细胞分别增加45.8%和34.3% ；
[0090]检测脑中风后14天时Z-DEVD-fmk处理组和对照组脑室下区的细胞死亡情，Z-DEVD-fmk对14天的TUNEL阳性细胞数没有影响(Z-DEVD-fmk处理组，2.00±0.89 ;对照组，1.50 ± 1.22; P=0.34, n=6)；
[0091]上述结果表明，caspase-3在脑中风后对神经前体细胞的增殖起着重要的作用；
[0092](4) Caspase限制体外培养神经前体细胞的自我更新
[0093]选取脑中风后第七天小鼠缺血侧脑室下区的神经球进行体外培养，在神经球形成阶段，观察到caspase-3在神经球中的表达,免疫细胞化学染色进一步确认上述现象；实验结果还显不，87.3%的caspase-3阳性细胞为TUNEL阴性,表明神经球中表达的caspase-3可能不参与细胞的凋亡过程；
[0094]米用caspase-3抑制剂Z-DEVD-fmk处理培养的神经球，该处理明显抑制了caspase-3的表达，但未见Z-DEVD-fmk处理组和对照组神经球凋亡率有实质的差异；此外，对TUNEL阳性的神经前体细胞计数显示Z-DEVD-fmk处理未改变细胞的死亡率(Z-DEVD-fmk处理组和对照组TUNEL阳性细胞百分率:1.92±0.04比1.86±0.03;n=15)；
[0095]分离出原代神经球，检验caspase-3对二代神经球形成的影响，结果显示，Z-DEVD-fmk处理虽然对神经球的直径和BrdU阳性率均无明显影响，但Z-DEVD-fmk处理能够产生更多的二代神经球，结果表明，caspase-3不是神经前体细胞死亡的执行因子，caspase-3参与调节神经前体细胞的自我更新；
[0096](5) Akt憐酸化介导caspase-3的作用
[0097]监测脑中风后12天Z-DEVD-fmk处理小鼠的脑室下区caspase-3已知底物的表达水平，结果显示，Z-DEVD-fmk未改变磷酸化ERK、磷酸化JNK和磷酸化p38的水平，但显著增加了磷酸化Akt的水平；结果表明，在脑中风期,抑制caspase-3的活性能通过调节磷酸化Akt促进神经前体细胞的增殖；进一步的结果表明，神经球的培养基中预先加入Akt抑制剂LY294002后，Z-DEVD-fmk对神经前体细胞自我更新的调节能力明显降低；上述结果表明，脑中风后caspase-3对神经前体细胞增殖的调节作用是通过磷酸化Akt途径；
[0098](6)抑制caSpaSe3活性促进神经元再生和脑中风后神经功能的重塑
[0099]采用对照剂或Z-DEVD-fmk处理小鼠，并在脑中风后14天和42天检测其大脑，结果显示，在脑中风后42天而不是14天时对照剂和Z-DEVD-fmk处理的小鼠脑室下区BrdU阳性细胞数均减少，表明神经前体细胞已经从脑室下区迁移到缺血半球受损区；与对照组相比，Z-DEVD-fmk处理组42天时大脑皮层的BrdU阳性细胞数明显增加，表明抑制caspase-3促进脑中风后新生细胞的迁移；所述Z-DEVD-fmk没有改变BrdU和GFAP阳性的细胞数目(fcdU和GFAP双阳性细胞数，Z-DEVD-fmk处理组与对照剂组:104.61 ±38.71比85.56±15.28; P=0.29，n=6)，但其显著增加了损伤皮层区域BrdU和NeuN双阳性的细胞数目；结果表明，抑制caspase-3能够促进神经元细胞的再生；抑制caspase-3提高了脑中风后小鼠的运动活性；
[0100]采用beam-walking实验检测小鼠的运动缺失,结果显示,在脑中风后一天时所有小鼠呈现相似的功能缺失，且Z-DEVD-fmk处理组和对照组小鼠在功能缺失方面没有显著差异；与对照组比较，Z-DEVD-fmk处理组的小鼠在脑中风后14天时前肢错步数显著减少，在28天时后肢的错步数显著减少；
[0101]本发明实验的结果表明，所述caspase-3在脑中风恢复期起着非凋亡的作用；caspase-3限制体外培养的缺血脑室下区的神经前体细胞的自身更新，采用小鼠脑中风模型，发现在神经再生区caspase-3的局部上调对于神经前体细胞的增殖、迁移和成熟具有重要的影响；进一步，结果表明，抑制caspase-3的活性能改善脑中风后的功能恢复；该结果表明caspase-3是调控脑中风后神经再生的一种关键要素；
[0102]本实验的结果表明，caspase-3表达的增加与脑中风诱导的神经前体细胞的增加时间基本一致；在增殖的神经前体细胞中caspase-3的表达与脑中风后细胞的凋亡过程无关；抑制caspase-3的活性增加神经前体细胞的增殖，和促进再生的神经元的增殖；上述结果与caspase-3缺失增加皮层神经元密度的实验结论相符；本实验虽然未检测到caspase-3抑制剂对梗死大小的影响,但结果证实caspase-3抑制剂对神经功能恢复起重要的作用，抑制caspase-3引起的神经元再生是导致神经功能恢复的主要原因；
[0103]本实验的结果还表明，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt失活介导了 caspase-3对神经前体细胞增殖的作用；进一步证实caspase-3的作用与ERK, JNK或p38通路无关；然而，除Akt通路外，多种其它的caspase-3底物也参与caspase-3的作用；
[0104]上述实验结果显示，在脑中风的恢复期，caspase-3在脑室下区和海马齿状回的新生神经前体细胞中的表达明显增加，然而上述神经前体细胞却未表现出凋亡的迹象；经对提取的缺血小鼠的脑室下区和海马齿状回的神经前体细胞进行体外培养，结构显示caspase-3有限制神经前体细胞的自我更新能力，但并不引起细胞的凋亡；实验结果还显示,caspase-3对神经再生的调控机制是通过降低Akt的磷酸化,结果表明，使用caspase-3抑制剂抑制其活性能够显著促进脑室下区的神经前体细胞的增殖和迁移，从而促进神经元的再生和脑脑中风后的神经功能恢复；抑制caspase-3对急性脑脑中风具有保护作用，caspase-3可作为治疗脑中风的药物新靶点。
[0105]本发明所述的Caspase-3抑制剂可制备促进脑中风后神经再生的制剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0106]图1.脑中风后神经再生和细胞死的发生和发展过程，
[0107]其中(A):假手术组小鼠和脑中风后第1、3、7、14天小鼠脑室下区，海马齿状回及梗死周边大脑皮层代表性的BrdU免疫组化照片，标尺，100 μ m(最上和中间)，25 μ m(底部)，LV, Iateralventricle (脑室下区)；GCL, granulecell layer (颗粒细胞层);HIL, hiIus (海马齿状回门区)，S，sham(假手术组)；
[0108](B):脑中风后BrdU阳性细胞的时程定量，数值表示为平均值土标准差(每组n=3)，*与假手术组比，Ρ〈0.05 ；
[0109](C):假手术组小鼠和脑中风后第1、3、7、14天小鼠脑室下区，海马齿状回及梗死周边皮层代表性的TUNEL染色照片，箭头指示TUNEL阳性细胞，标尺，5ym(最上和中间)，20 μ m (底部)；
[0110](D):脑中风后TUNEL阳性细胞的时程定量，数值表示为平均值土标准差(每组n=3)，*与假手术组比，Ρ〈0.05。
[0111]图2.在脑中风恢复期，Caspase-3在脑室下区和海马齿状回的表达增加，
[0112]其中，A，B:假手术组小鼠和脑中风后第1、3、7、14天小鼠脑室下区，海马齿状回区代表性的 caspase-3 免疫染色照片，Cas-3, caspase-3; LV, lateral ventricle (脑室下区)；GCL, granulecelllayer (颗粒细胞层);HIL, hilus (海马齿状回门区)。标尺50 μ m (A), 25 μ m(B)；
[0113]C:脑中风后脑室下区和海马齿状回区caspase-3阳性细胞的时程定量，S，sham (假手术组)，数值表示为平均值土标准差(每组n=3)，*与假手术组比，P〈0.05。
[0114]图3.脑中风恢复期，caspase-3在神经再生区增殖的神经前体细胞中的表达增加，
[0115]其中A，B:脑中风后14天，caspase-3在脑室下区的BrdU阳性细胞和DCX阳性细胞中广泛表达，标尺，20 μ m ；
[0116]C，D:脑中风后14天，caspase-3在海马齿状回区BrdU阳性细胞和DCX阳性细胞中广泛表达，标尺，20 μ m ；
[0117]E，F:脑中风后14天，脑室下区和海马齿状回区caspase-3和TUNEL阳性细胞没有共定位关系，标尺，20 μ m(小标尺，2 μ m)；
[0118]G，H:脑中风后14天，脑室下区和海马齿状回区的caspase-3阳性细胞没有呈现核固缩现象(箭头)，标尺，20 μ m ;
[0119]1:脑中风后14天，侧脑室下区和海马齿状回的组织经过琼脂糖凝胶电泳未检测到DNA阶梯状分布(第三道和第四道)，DNA标识在第一道展示，第二道是取自脑中风后三天缺血区的组织作为阳性对照，标尺，20 μ m ;
[0120]J:脑中风后14天，缺血侧脑室下区和海马齿状回通过甲酚紫染色未检测到神经元损伤，底部是取自脑中风后一天的缺血区作为阳性对照，标尺，20 μ m ;
[0121]K:脑中风后14天，缺血侧脑室下区和海马齿状回通过Fluoro-JadeB染色未检测到坏死的神经元，底部是取自脑中风后一天的缺血区作为阳性对照，标尺，20 μ m,每项观察重复3次实验。
[0122]图4.在脑中风恢复期，caspase抑制脑室下区神经前体细胞的增殖，
[0123]其中，A:脑中风后14天，假手术组小鼠和对照剂或caspase-3抑制剂Z-DEVD-fmk处理的小鼠脑室下区的BrdU免疫染色的代表性照片，DEVD, Z-DEVD-fmk,标尺，50 μ m ;
[0124]B:脑中风后14天，假手术组小鼠和对照剂或caspase-3抑制剂Z-DEVD-fmk处理的小鼠脑室下区BrdU和DCX双染的代表性照片，DEVD, Z-DEVD-fmk，标尺，50 μ m (左侧)，10 μ m (右侧)；
[0125]C:定量测定每组的BrdU阳性细胞数。数值表示为平均值土标准差(每组n=6)，*P<0.05 ；
[0126]D:定量测定每组的BrdU和DCX共标的细胞数，数值表示为平均值土标准差
[0127]每组η=6，*Ρ〈0.05。
[0128]图5.Caspase-3调节体外培养的脑室下区神经前体细胞的自我更新能力，未见引起神经前体细胞的死亡，
[0129]其中，
[0130]A:显示从脑中风后7天缺血大脑中分离和培养脑室下区神经前体细胞的步骤；
[0131]Biffesternblot显示增殖条件的神经球中caspase-3的表达情况,标示的时间点为神经球在增殖培养基中培育的时间，在加入Z-DEVD-fmk3天后，caspase-3的表达明显减少，Cas-3, caspase-3; DEVD, Z-DEVD-fmk ；
[0132]C:免疫细胞化学染色显示神经球中的caspase-3表达，细胞核采用DAPI染色，标尺,50 μ m(小标尺，5 μ m)；
[0133]D:神经球中caspase-3和TUNEL的双标染色。，箭头指不TUNEL和caspase-3双阳性的细胞，标尺，15 μ m(小标尺，2.5 μ m)；
[0134]E:TUNEL阳性和阴性细胞在caspase-3阳性细胞中所占的百分比，数值表示为平均值土标准差(每组n=15)，数据来自三次独立的实验；
[0135]F:对照剂或Z-DEVD-fmk处理7天后，代表的神经球流式细胞仪AnnexinV/PI染色的图片；
[0136]G:流式细胞仪定量显示在对照剂和Z-DEVD-fmk处理的神经球中凋亡发生的频率没有实质差别，。数值表示为平均值土标准差(每组η=ιο)，数据来自于三次独立的实验；
[0137]H:对照剂或Z-DEVD-fmk处理7天后，神经球的代表性照片，标尺，100 μ m ；
[0138]1:Z-DEVD-fmk抑制caspase-3活性7天增加二代神经球的数量，数值表示为平均值土标准差(每组n=10)，数据来自于三次独立的实验，。*P〈0.05。
[0139]图6.Akt磷酸化介导caspase-3对神经前体细胞增殖的作用，
[0140]其中，A:脑中风后12天，Z-DEVD-fmk(DEVD)抑制caspase-3对脑室下区Akt磷酸化的作用，其中的Z-DEVD-fmk对磷酸化ERK (pERK)，磷酸化JNK (pJNK)和磷酸化p38(p-p38)信号没有影响；
[0141]B:定量测定磷酸化Akt，磷酸化ERK(pERK)，磷酸化JNK(pJNK)和磷酸化p38的表达水平，数值表示为平均值土标准差(每组n=6)，*P〈0.05。；
[0142]C，D: LY294002 (LY)消除Z-DEVD-fmk对神经前体细胞自我更新的影响，标尺，100 μ m，数值表示为平均值土标准差(每组n=8)，数据来自于三次独立的实验，*P〈0.05。
[0143]图7.脑中风后抑制caspase-3活性促进大脑皮层神经元的再生并改善神经功能的恢复，
[0144]其中，A:实验设计示意图，在脑中风前10天埋入套管，在脑中风后第3，6，9，和12天每天两次经侧脑室(1.c.V.)注射Z-DEVD-fmk(DEVD),在脑中风后第5到13天每天两次由腹腔(1.P.)注射BrdU，在第14天或42天时处死小鼠，dMCAO,远端大脑中动脉闭塞；
[0145]B:第42天时损伤侧大脑皮层BrdU免疫染色的代表照片，标尺，50 μ m ；
[0146]C:第42天时损伤侧大脑皮层BrdU阳性神经元免疫染色的代表照片，标尺，20 μ m(左侧)，10 μ m (左侧)；
[0147]D, E:第42天时脑室下区BrdU标记的细胞明显减少，Z-DEVD-fmk抑制 caspase-3活性增加42天时损伤侧大脑皮层BrdU的阳性细胞数，和BrdU阳性的神经元数目；数值表示为平均值土标准差(每组n=6), *P〈0.05 ；
[0148]F，G: Z-DEVD-fmk对脑中风42天时小鼠运动活性的影响，数值表示为平均值土标准差(每组 η=7)，*Ρ〈0.05 ；
[0149]H, 1: Z-DEVD-fmk对小鼠运动缺失的影响，在脑中风后不同的时间点测定小鼠前肢和后肢的错步数，数值表示为平均值土标准差，假手术组n=6，其它各组n=10，*P〈0.05。
[0150]图8显示了，
[0151]A:脑中风后第3天时，给予caspase-3抑制剂Z-DEVD-fmk减少第6天时脑室下区caspase的表达水平，数据来自于三次独立的实验；
[0152]B:脑中风后24小时，caspase-3 (cas,箭头)在缺血区的表达增加；
[0153]C:缺血区域充斥着大量的TUNEL阳性死亡细胞，标尺，20 μ m ;
[0154]D:脑中风后24时，caspase-3在缺血区的细胞核和细胞浆中都有表达；
[0155]E:在脑中风后14天，H&E染色的对照剂或caspase抑制剂Z-DEVD-fmk处理的小鼠代表性的脑片照片；
[0156]F:脑梗死体积的定量测定，数值表示为平均值土标准差(每组n=6)。
【具体实施方式】
[0157]实施例1
[0158]1、材料和方法
[0159](I)材料
[0160]①试剂和抗体
[0161]5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)，多聚甲醛，蔗糖，二甲基亚砜，层黏连蛋白，LY294002 (购自 Sigma-Aldrich), Dulbecco， smodifiedEagle’ s 培养基(DMEM)/F-12培养基，链霉素，L-谷氨酰胺，B27添加剂，表皮生长因子和成纤维细胞生长因子，购自Invitrogen)；
[0162]氟甲基酮，RIPA裂解缓冲液，化学发光溶液，Fluoro-JadeB (购自MerckMillipore)；
[0163]AnnexinV-FITC 凋亡检测试剂盒(购自 BDB1sciences), BCAprotein assay,购自ThermoScientific ；Vectashield, 4’ , 6_ 二脉基 _2_ 苯基Π引噪(DAPI),苏木素，亲和素生物素过氧化物酶复合物(VectastainEliteABCkit)，二氨基联苯胺(DAB)及MOM免疫检测试剂盒，购自 VectorLaboratories ；
[0164]蛋白酶抑制剂cocktails，原位细胞死亡检测试剂盒(荧光素)和原位细胞死亡检测试盒(P0D),购自 RocheDiagnostics ；
[0165]实验中所采用的一级抗体包括:兔抗cleavedcaspase-3 (9661)，兔抗cleavedcaspase-7 (8438),兔抗 cleavedcaspase—8 (8592),兔抗 phospho-ERKl/2 (9101),兔抗 phospho-JNK (9251)，兔抗-phospho_p38 (9211)，兔抗 phospho-Akt (4060)，兔抗Akt (9272),兔抗 β -actin (4970)(上述抗体均购自 CellSignalingTechnology),大鼠抗BrdU (ab6326, Abeam),兔抗 cleavedcaspase-3 (abl3847, Abeam),羊抗 doublecortin (DCX)(sc-8066, SantaCruzB1technology),小鼠抗 neuronalnuclei(NeuN, MAB377, MerckMillipore),小鼠抗 glialfibriIlaryacidicprotein (GFAP, MAB360, Merck Millipore)；
[0166]二级抗体包括:AlexaFluor594_连接的驴抗兔IgG,驴抗羊IgG和驴抗小鼠IgG,AlexaFluor488-连接的驴抗大鼠IgG,驴抗羊IgG,均购自Invitrogen ;生物素标记的驴抗大鼠二级抗体购自 Jackson ImmunoResearch Laboratories ；
[0167]②脑中风模型
[0168]实验计划得到复旦大学上海医学院动物关爱和使用委员会的批准；实验采用8到10周龄的C57BL/6成年雄性小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司；参照文献报道，通过电凝右侧大脑中动脉(MCA)远端部分制作局部皮层脑中风模型；已有文献证明局部皮层脑中风刺激海马齿状回的神经再生；将小鼠用水合氯醛麻醉后(360毫克每千克体重)，分离出MCA，电凝和剪断MCA的远端，立即用血管夹将右侧颈总动脉结扎15分钟(为了得到重复性较好的皮层梗死，本实验夹闭小鼠的同侧颈总动脉)；采用体温维持仪(WorldPrecis1nInstruments)将小鼠体温保持在37°C ±0.5°C范围内，假手术组不结扎或电凝MCA及颈总动脉；
[0169]取6片冠状动脉切片(20 μ m)进行H&E染色后测量脑梗死的大小；梗死采用NIHImageJ软件分析测定，并表示为对侧半脑的百分比；
[0170](2)方法
[0171]①fcdU标记
[0172]在脑中风或假手术后，每天两次、持续两天(如第6、7天或第12、13天)腹腔注射BrdU(50mg/kg体重)，在随后的一天处死小鼠；在脑中风后第5到13天每天两次经腹腔注射BrdU (50mg/kg体重)，在第14天或第42天处死小鼠；
[0173]②注射Caspase-3抑制剂
[0174]水合氯醛麻醉小鼠(360mg/kg体重)后，采用标准的立体定位技术，将26G无菌钢针套管按照如下坐标插入侧脑室:前囟后0.2_，旁开0.9mm,深1_ ;采用牙科粉和螺丝钉将套管固定在头骨上，再用配套的小帽封闭；
[0175]小鼠在手术后恢复适应10天后接受脑脑中风造模；Caspase-3抑制剂Z-DEVD-fmk首先溶于DMSO后，进一步使用PBS稀释(pH7.40);参照报道，每天两次经脑室注入Z-DEVD-fmk (240ng溶于2 μ 11.8%DMS0)或对照剂(1.8%DMS0)，一周注射两次持续两周(在脑中风后第3、6、9、12天注射)；经检测，结果显示，与对照剂处理的小鼠相比，在脑中风后第3天注射Z-DEVD-fmk的小鼠在第6天时脑室下区的caspase-3水平显著降低(支持数据Fig.1A);已有报道脑中风后早期给予Z-DEVD-fmk会减少梗死大小，因此，为排除caspase-3抑制剂起神经保护作用的可能性,在脑中风后第3天开始注射Z-DEVD-fmk ；
[0176]③行为学测试
[0177]在脑中风后第42天，在27.3X27.3X40厘米的箱子中测量小鼠的运动活力(MedAssociates Inc.);箱子中有三组16条红外光束队列，间距2.9厘米；在测试中,将小鼠放在箱子的正中间，让其自由运动30分钟；通过摄像头记录小鼠在30分钟内的运动情况，采用S0D-811分析软件(Med Associates Inc.)分析数据；运动能力通过小鼠运动的总距离以及小鼠穿过红外线光束的次数评价；
[0178]在脑中风造模前及造模后第1、3、7、14、28、42天，采用横木行走测试(beamwalking test)来测量小鼠的运动缺失；将小鼠放在横木(直径12毫米，长1.2米，高45厘米)的一端，通过录像记录小鼠通过横木时四肢的使用情况；记录下总的运动步数及前肢和后肢错步的次数，计算10分钟内错步数占总步数的百分比；任何一个爪子从横木表面滑开被认为是错步；
[0179]④免疫组织化学
[0180]将小鼠依次用冰冷的PBS和4%PFA经心脏灌注；大脑经30%蔗糖4°C过夜处理后，冷冻切片机(Leica Microsystems Inc.)切20微米厚的冠状切片；采用已报道的方法进行免疫组化染色；在BrdU染色时，所有的脑切片都先经过2N盐酸处理30分钟，以断开DNA双链；在免疫荧光染色中，脑切片分别用AleXaFluor594或Alexa Fluor488标记的二抗染色；细胞核用DAPI染色；在免疫过氧化酶染色时，脑切片经亲和素抗生素过氧化酶复合物孵育，生物素标记二抗处理后，用DAB酶作用物显色，再采用苏木素复染；用奥林巴斯BX51显微镜和奥林巴斯FV1，000共聚焦显微镜拍照后，使用OlympusFVlO-ASW软件对共定位进行重现和判定；
[0181]⑤TUNEL 染色
[0182]根据产品说明书采用原位细胞死检测试剂盒(荧光素或P0D)做TUNEL (末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸切口末端标记)染色；脑切片经通透性处理，断裂的DNA双链用链霉素辣根过氧化物酶标记，用DAB或异硫氰酸荧光素显色；
[0183]⑥DNA凝胶电泳
[0184]小鼠经冰冷的PBS灌注后，取脑保存于-80°C ;参照已报道的方法，从脑组织中分离DNA ;大脑样本经匀浆后，在裂解液中(lOmmol/LTrisHCl, PH8.0, 0.lmol/LEDTA, 0.5%十二烧基硫酸钠，50ug/mL RNaseA) 37°C消化I小时。样本加入等量的phenol/chloroform/amyl (25:24:1)进行萃取，然后加入蛋白酶K (0.lmg/mL) 55°C反应3小时；DNA小球加入70%的乙醇后，再溶解于50 μ LTris-EDTA液中；将DNA加到含溴化乙锭的2%琼脂糖胶上电泳，紫外显影；缺血后第3天从梗死区分离到的DNA呈现清晰的DNA阶梯状分布，用作阳性对昭.>、、、?
[0185]⑦Fluoro-JadeB 染色
[0186]将小鼠依次用冰冷的PBS和4%PFA灌注；大脑先在4°C中经4%PFA固定，再经过30%蔗糖4°C过夜处理；大脑冰冻切片(20 μ m)依次经100%乙醇和70%乙醇脱水，0.06%的高锰酸钾中孵育10分钟，经双蒸水洗，置0.0004%Fluoro-Jade B染液(溶于0.1%的乙酸)中孵育15分钟；脑片经水洗，脱水，二甲苯中透明，用OlympusFVlOOO共聚焦显微镜拍照；
[0187]⑧细胞计数
[0188]脑室下区，海马齿状回，及皮层梗死边缘的BrdU阳性细胞数、caspase-3阳性细胞数及TUNEL阳性细胞数的定量检测，使用20倍物镜明视野拍照；数据表示为每个脑片的DAB阳性细胞数；新生的未成熟神经元的定量，使用荧光显微镜在40倍物镜下拍取BrdU和DCX双染的照片进行细胞计数；采用40倍物镜下拍摄的照片，计数缺血侧皮层新生的神经元；计数整个缺血侧皮层BrdU与NeuN或GFAP共标的阳性细胞数，用于新生NeuN或GFAP的定量，数据表示为每张脑切片共标的细胞数；对于每一只小鼠，脑室下区部分取三张脑片(间隔0.6mm)，海马齿状回部分取四张脑片(间隔Imm)进行分析；采用ImageJ软件进行统计测量被分析的区域，并计数分析区域的阳性细胞数；
[0189]⑨神经球培养和免疫细胞化学
[0190]根据已有的报道，分离脑中风7天后缺血侧半球脑室下区的细胞；消化后，按照10，000cells/ml的浓度，将细胞含有1%青霉素加链霉素(10，000U/ml)，2mML_谷氨酰胺，2%B27supplement, 20ng/ml表皮生长因子和20ng/ml成纤维细胞生长因子的DMEM/F-12培养基中培养；细胞在含5%C02高湿度的37°C恒温箱中培养；机械分离原代神经球后，接种到含生长因子的DMEM/F-12培养基的96孔板(每孔1，OOOcells)中；接种后将Z-DEVD-fmk (25 μ Μ)或LY294002 (25 μ Μ)加到培养基中；培养至第7天时，计数神经球的数量;
[0191]caspase-3免疫染色时,神经球经多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被后转移至载玻片上，经4%PFA固定，用10%的驴血清封闭后，加入兔抗caspase-3抗体4°C孵育过夜；清洗三次后，加AlexaFluor594驴抗兔IgG室温反应30分钟,使用Vectashield封片；采用原位细胞死亡检测试剂盒(荧光素)进行TUNEL染色检测凋亡；
[0192]⑩流式细胞术
[0193]收集神经球轻，按照使用说明书用AnnexinV-FITC和Propidium1dide (PI)(Annexin V-FITC apoptosis detect1n kit)标记 100，000 个细胞，通过 Epics AltraFACScan Flow Cytometer (BeckmanCoulter)检测细胞存活状态；数据通过 EXP032V1.2 软件(Beckman Coulter)进行分析；
[0194](3)分析
[0195]① Western blot 分析
[0196]分离脑中风后第12天的缺血侧大脑半球的脑室下区，使用含有蛋白酶抑制剂cocktails的RIPA裂解液提取脑室下区或神经球中的蛋白；离心后，通过BCA蛋白分析法测定蛋白浓度；等量的蛋白样本分别加到8%，10%和12%Tris-甘氨酸凝胶上电泳，转移到PVDF膜上；膜用5%的脱脂牛奶(脱脂奶粉溶于含0.1%吐温20的TBS)封闭，一抗孵育，力口入辣根过氧化物酶结合的二抗后，然后通过B1-1mage Analysis System(B1-Rad)扫描光密度进行定量；
[0197]②数据分析
[0198]数值用平均值土标准差来表示；在经过Bonferroni ’ s多重比较检测后，采用单因素方差分析进行数据处理；两组比较时，采用未配对双尾Student t检验或Mann WhitneyU检验，P〈0.05为有统计学差异；
[0199]2、结果
[0200](I)脑中风后神经干细胞和细胞死的时间、空间分布情况
[0201]脑中风刺激脑室下区和海马齿状回区的神经再生反应，梗死周边的皮层区对脑中风后脑功能的恢复起关键作用；
[0202]测定脑中风小鼠神经再生区域和梗死周边皮层区域的神经再生现象和细胞死亡的情况；在脑室下区、海马齿状回及梗死周边的皮层区，结果显示，BrdU的免疫反应活性在脑中风3天后急剧增加，在7天时达到最高峰，并且一直持续到第14天(如图1A，IB所示)，该结果与以前的报道基本一致，此外，在脑中风后I到14天，仅仅在脑室下区和海马齿状回检测到少量的TUNEL阳性死亡细胞(如图1C，ID所示)；在梗死周边皮层区，脑中风后I到3天的TUNEL阳性细胞数目显著增加，但在7到14天回到基础值(如图1C，ID所述);上述结果表明，缺血大脑中神经再生和细胞死亡展现着不同的时间和空间模式，并且在损伤侧大脑皮层区神经再生比细胞死亡持续的时间更长；
[0203](2)在脑中风恢复期caspase-3在神经再生区的表达明显上升
[0204]实验结果显示，在脑中风后24小时缺血区的caspase-3表达明显上升(如图1B所示)，上述区域可见广泛的TUNEL阳性细胞分布(如图1C所示)；通过免疫组化染色，发现caspase-3在细胞核和胞浆中都有表达(如图1D所示);相反，在脑中风后7到14天，观察到与假手术组相比，脑室下区(如图2A所示)和海马齿状回(如图2B所示)该两个神经再生区内caspase-3的表达显著增加；定量分析结果表明，随着脑中风时程的进展，增殖的神经前体细胞中的caspase-3也同步大量增加(如图2C和图1B所示)，但是死亡的细胞却没有同步增加(如图2C和图1D所示)；上述数据表明，在脑中风的恢复期，caspase-3可能与其在急性期所起的作用不同；
[0205]首先，确定caspase-3的细胞定位；Caspase_3与BrdU或DCX双染发现，caspase-3在脑室下区(如图3A，3B所示)和海马齿状回(如图3C，3D所示)区的BrdU阳性新生细胞和DCX阳性的神经前体细胞中都有表达，表明上述caspase-3阳性细胞是增殖的神经前体细胞；另外，在上述区域检测到没有caspase-7和caspase-8 ；
[0206]其次，采用抗caspase-3抗体和断裂DNA标记物(TUNEL )进行双染，结果显示，caspase-3阳性细胞并不呈现TUNEL阳性(如图3E，3F所示)，caspase-3阳性细胞的核为非固缩(如图3G，3H所示)；此外，采用DNA凝胶电泳检测(如图31所示)或采用甲酚紫(如图3J所示)、Fluoro-JadeB(如图3K所示)染色检测组织学特征，结果显示，脑室下区和海马齿状回区既无DNA损伤也无神经元损伤的组织学特征；结果表明，在脑中风恢复期，神经再生区域增殖的神经前体细胞激活caspase-3但与凋亡无关；
[0207](3)脑中风后抑制caspase-3活性促进神经前体细胞的增殖
[0208]检测caspase-3的延迟上调是否参与脑中风后的神经再生过程；从脑中风后第3天开始往小鼠侧脑室注入caspase-3抑制剂Z-DEVD-fmk或对照剂，在第14天时检测小鼠；为确定caspase-3对小鼠长期的行为学及组织学结果的影响，采用小鼠永久性远端大脑中动脉闭塞脑中风模型(采用该种皮层脑中风模型是因其造成的脑中风后死亡率更低)，模型总的死亡率不超过10% ;结果显示，在14天时Z-DEVD-fmk处理组和对照组的小鼠缺血损伤程度没有显著性差异(如图1E，IF所示);结果表明，caspase-3抑制对神经再生的影响不是在减少脑梗死损伤之后产生；与对照组比较，Z-DEVD-fmk处理组的小鼠脑室下区的BrdU阳性细胞数和BrdU阳性的神经前体细胞分别增加45.8%(如图4A，4C所示)和34.3%(如图4B, 4D所示)；
[0209]检测caspase-3是否会间接影响神经前体细胞的存活；检测脑中风后14天时Z-DEVD-fmk处理组和对照组脑室下区的细胞死亡情况，结果显示，Z-DEVD-fmk对14天的TUNEL阳性细胞数没有影响(Z-DEVD-fmk处理组，2.00 ±0.89 ；对照组，
1.50 ± 1.22; P=0.34, n=6)；
[0210]综上所述，上述数据表明，caspase-3在脑中风后对神经前体细胞的增殖起着重要的作用；
[0211](4) Caspase限制体外培养神经前体细胞的自我更新
[0212]选取脑中风后第七天小鼠缺血侧脑室下区的神经球进行体外培养(如图5A所示)，在神经球形成阶段，观察到caspase-3在神经球中的表达(如图5B所示)，免疫细胞化学染色也进一步确认上述现象；实验结果还显示，87.3%的caspase-3阳性细胞为TUNEL阴性(如图5D, 5E所示)，表明神经球中表达的caspase-3可能不参与细胞的凋亡过程；
[0213]采用caspase-3抑制剂Z-DEVD-fmk处理培养的神经球，尽管该处理明显抑制了 caspase-3的表达(如图5B所示)，但没有观察到Z-DEVD-fmk处理组和对照组神经球凋亡率有实质的差异(如图5F，5G所示)；此外，对TUNEL阳性的神经前体细胞计数显示Z-DEVD-fmk处理没有改变细胞的死亡率(Z-DEVD-fmk处理组和对照组TUNEL阳性细胞百分率:1.92±0.04 比 1.86±0.03;n=15)；
[0214]分离出原代神经球，检验caspase-3对二代神经球形成的影响，结果显示，Z-DEVD-fmk处理虽然对神经球的直径和BrdU阳性率都没有影响，但Z-DEVD-fmk处理能够产生更多的二代神经球(如图5H, 51所示);结果表明，caspase-3不是神经前体细胞死亡的执行因子，caspase-3参与调节神经前体细胞的自我更新；
[0215](5) Akt憐酸化介导caspase-3的作用
[0216]监测脑中风后12天Z-DEVD-fmk处理小鼠的脑室下区caspase-3已知底物的表达水平，结果显示，Z-DEVD-fmk没有改变磷酸化ERK、磷酸化JNK和磷酸化p38的水平，但显著增加了磷酸化Akt的水平(如图6A，6B所示);结果表明，在脑中风期，抑制caspase-3的活性可能通过调节磷酸化Akt促进神经前体细胞的增殖；进一步，表明神经球的培养基中预先加入Akt抑制剂LY294002后，Z-DEVD-fmk对神经前体细胞自我更新的调节能力明显降低；
[0217]上述结果表明，脑中风后caspase-3对神经前体细胞增殖的调节作用可能通过磷酸化Akt途径；
[0218](6)抑制caSpaSe3活性促进神经元再生和脑中风后神经功能的重塑
[0219]采用对照剂或Z-DEVD-fmk处理小鼠，并在脑中风后14天和42天检测其大脑，结果如图7A显示，在脑中风后42天而不是14天时对照剂和Z-DEVD-fmk处理的小鼠脑室下区BrdU阳性细胞数均减少(如图7D和图4C所示)，表明神经前体细胞已经从脑室下区迁移到缺血半球受损区；与对照组相比，Z-DEVD-fmk处理组42天时大脑皮层的BrdU阳性细胞数明显增加(如图7B，7D所示)，表明抑制caspase-3促进脑中风后新生细胞的迁移；所述Z-DEVD-fmk没有改变BrdU和GFAP阳性的细胞数目(BrdU和GFAP双阳性细胞数，Z-DEVD-fmk 处理组与对照剂组:104.61 ±38.71 比 85.56 ±15.28; P=0.29，n=6)，但其显著增加了损伤皮层区域BrdU和NeuN双阳性的细胞数目(如图7C，7E所示)；结果表明，抑制caspase-3能够促进神经元细胞的再生；抑制caspase-3提高了脑中风后小鼠的运动活性(如图7F，7G所示)；
[0220]采用beam-walking实验检测小鼠的运动缺失,结果显示,在脑中风后一天时所有小鼠呈现相似的功能缺失，且Z-DEVD-fmk处理组和对照组小鼠在功能缺失方面没有显著差异(如图7H，71所示)；与对照组比较，Z-DEVD-fmk处理组的小鼠在脑中风后14天时前肢错步数显著减少，在28天时后肢的错步数显著减少；3、本实验的结果表明，所述caspase-3在脑中风恢复期起着非凋亡的作用；caSpaSe-3限制体外培养的缺血脑室下区的神经前体细胞的自身更新，采用小鼠脑中风模型，发现在神经再生区caspase-3的局部上调对于神经前体细胞的增殖、迁移和成熟具有重要的影响；进一步，结果表明，抑制caspase-3的活性可改善脑中风后的功能恢复(如图7J所示)；上述结果还表明caspase-3是调控脑中风后神经再生的一种关键要素；
[0221]所述Caspase-3在发育过程对神经元凋亡起主要作用，并被认定是脑缺血、脑外伤、脊髓损伤和脑出血后细胞死亡的关键调节因子(但是，也有证据显示caspase-3在细胞增殖和分化中起非凋亡的作用；现有几种证据表明caspase-3在中枢神经系统中起着不同的非凋亡作用)；所述Caspase-3在鼠类大脑有丝分裂期和有丝分裂期后的细胞中有表达，且有证据证实caspase-3激活的细胞能从神经再生区迁移到嗅球；Caspase_3可能对突触可塑性和轴突导向有帮助(目前，也有关于caspase-3能够促进秀丽隐杆线虫受损轴突再生的报道；大量的研究表明，caspase-3在发育及成年神经系统中扮演着非凋亡的良性作用)；
[0222]本实验的结果表明，caspase-3表达的增加与脑中风诱导的神经前体细胞的增加时间基本一致，在增殖的神经前体细胞中caspase-3的表达与脑中风后细胞的凋亡过程无关(但是，当前至少有一项研究证明在阿尔兹海默病中caspase-3会引起轴突损伤和增加认知障碍);
[0223]本实验的结果进一步证明，抑制caspase-3的活性不但增加神经前体细胞的增殖，也促进再生的神经元的增殖；上述结果与caspase-3缺失会增加皮层神经元密度的发现相符；本实验没有检测到caspase-3抑制剂对梗死大小有影响,但是观察到caspase-3抑制剂对神经功能恢复起重要的作用；因此，抑制caspase-3引起的神经元再生是导致神经功能恢复的主要原因；
[0224]此外，所述丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt为一种细胞生存信号，是凋亡过程中已知的caspase-3祀点；Akt也已被证明在脑中风后的神经前体细胞增殖中起关键作用；清除PTEN，一种PI3K-AKT信号通路中的负调节因子会导致持续的神经前体细胞自我更新；本实验的数据表明，Akt失活介导了 caspase-3对神经前体细胞增殖的作用(如图7J所示)；进一步，证明caspase-3的作用与ERK, JNK或p38通路无关；然而，除Akt通路外，多种其它的caspase-3底物也会参与caspase-3的作用；
[0225]本发明的实验结果显示，在脑中风的恢复期，caspase-3在脑室下区和海马齿状回的新生神经前体细胞中的表达明显增加，然而上述神经前体细胞却没有表现出凋亡的迹象；提取缺血小鼠的脑室下区和海马齿状回的神经前体细胞进行体外培养，观察到caspase-3限制神经前体细胞的自我更新能力，但并不引起细胞的凋亡；所述caspase-3通过降低Akt的磷酸化对神经再生进行调控；结果表明，使用caspase-3抑制剂抑制其活性能够显著促进脑室下区的神经前体细胞的增殖和迁移，从而促进神经元的再生和脑中风后的神经功能恢复；抑制caspase-3对急性脑中风具有保护作用，caspase-3可成为治疗脑中风的药物新靶点。
【权利要求】
1.Caspase-3抑制剂在制备促进脑中风后神经再生的制剂中的用途。
2.Caspase-3抑制剂在制备促进脑中风后神经功能重塑制剂中的用途。
3.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的Caspase-3抑制剂选自Caspase-3 抑制剂 Z-DEVD-fmk。
4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的caspase-3抑制剂抑制Caspase-3其活性，促进脑室下区的神经前体细胞的增殖和迁移，促进神经元的再生和脑中风后的神经功能恢复。
【文档编号】A61K45/00GK104415333SQ201310371351
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】范文英, 赵冰樵, 戴义琴, 朱西民, 徐昊辰, 蔡萍 申请人:复旦大学