一种从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法
【专利摘要】一种从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法，属于灰毡毛忍冬提取纯化化学活性成分的【技术领域】，本发明先以灰毡毛忍冬叶粉为原料，经脱脂、水提、萃取及析出、结晶制得灰毡毛忍冬活性成分。本发明具有工艺简单，节约能源，无有害废物排放，资源综合利用率高，产品纯度高等特点。采用本发明方法制备出的产品，可广泛应用于医药、保健、化妆品等行业中。在医药行业中，作为合成抗生素、抗肿瘤、降压药等的原料，或作为抗氧化、抗菌等功能性添加剂等。
【专利说明】一种从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物化学领域中化学成分的提取，更具体的说涉及一种从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法。
技术背景
[0002]灰毡毛忍冬是忍冬科忍冬属植物，具有清热解毒，凉散风热的功效，常用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热等。灰毡毛忍冬不仅是常用中药，而且是一种“药食同源”的绿色天然产物，其含有大量黄酮类化合物、绿原酸以及皂苷等活性物质。黄酮类化合物有明显的抗溃疡、解痉、抗炎及降血脂等系列的生物活性，其制备的制剂，对心脑血管、动脉硬化、高血压等疾病有治疗有价值且长期服用无毒副作用。绿原酸有对透明质酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用，对自由基的清除及抗脂质过氧化作用，抗诱变作用，保肝利胆作用，抗菌、抗病毒、预防心脑血管疾病及解痉等作用。总皂苷有双向调节免疫作用；
[0003]抗缺氧和抗疲劳作用；抗低温应激作用；抗脂质氧化作用；对中枢神经系统的作用；抗致突变作用等生理活性。同时它们在卫生保健品及化妆品行业方面也有广阔的应用前景。在医药和食品上应用广泛，为合理开发利用这一废弃资源，所以从灰毡毛忍冬中提取总黄酮、绿原酸和总皂苷有很重要的意义。
[0004]现有提取纯化灰毡毛忍冬中总黄酮、绿原酸和总皂苷的方法，如《吉首大学学报》2011年9月第32卷第5期的“金银花叶茎藤中黄酮与绿原酸同时提取分离工艺”一文，公开的方法是:超声辅助乙醇提取金银花叶茎藤中的绿原酸与黄酮，乙酸乙酯萃取分离黄酮与绿原酸，DlOl大孔树脂梯度洗脱绿原酸与黄酮，乙醇及正己烷分相法纯化黄酮与绿原酸。该方法的主要缺点是:①使用大量有机试剂，没有回收利用，引起严重的环境污染问题产品的质量不容易得到保障，有机试剂容易有残留；③产品的纯度不高，杂质较多，色泽不好等生产仪器的要求较高，提高了生产成本，浪费能源不环保；⑤只得到两种产品，物料利用不够充分。
[0005]吕盼等，在《成都中医药大学学报》公开了“同时分离富集细毡毛忍冬中总黄酮和绿原酸的工艺研究”其提供了一种采用聚酰胺树脂吸附柱提取绿原酸和总黄酮的方法；依次用水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇梯度洗脱，最后确认用10-30%浓度乙醇洗脱的是绿原酸，用50-70%洗脱的是总黄酮。
【发明内容】
[0006]采用吸附柱提取绿原酸和总黄酮是目前工业化生产中的常用工艺，但是不论是大孔树脂或者聚酰胺树脂提取，在工业化生产中都涉及到一个不可回避的问题，就是柱子的活化，这需要用大量的酸液和碱液，这些废水无害化处理难度很大，及其容易对环境造成损害。本发明提供的方法避免了吸附柱的使用；解决了植化提取对环境污染的问题。本发明的具体
【发明内容】
是:[0007]—种从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法，采用降低绿原酸在溶剂的溶解度的方式提取绿原酸。
[0008]所述方法包括以下步骤:
[0009]I)用石油醚或汽油对灰毡毛忍冬花蕾和叶进行脱脂处理；
[0010]2)采用乙醇提取灰毡毛忍冬花蕾和叶中的活性成分，回收提取液乙醇无醇味，得到提取水溶液；
[0011]3)静置过滤水溶液，除去杂质，用乙酸乙酯萃取水溶液，分别收集乙酸乙酯溶液和母液；
[0012]4)挥去母液中残留的乙酸乙酯，加热浓缩母液，至母液温度高于25°C无沉淀析出，低于25°C有沉淀析出；
[0013]5)在母液中混入三氯甲烷或四氯甲烷，迅速搅拌，形成絮状沉淀，至母液中不再产生白色絮状物质为止；
[0014]6)过滤母液中的絮状物质，纯化结晶絮状物质得到绿原酸晶体。
[0015]将步骤2)得到乙酸乙酯溶液50°C浓缩成饱和溶液；将饱和溶液自然条件下冷却至低于25°C，析出沉淀，过滤沉淀，沉淀为灰毡毛忍冬花蕾和叶的总黄酮。
[0016]所述在母液中混入三氯甲烷或四氯甲烷为，添加母液总体及大于4%的氯仿，并通过不断的搅拌使氯仿在母液中呈混悬状态，直至无絮状沉淀析出。
[0017]步骤5)中所述的纯化工艺为:料液比1:7在絮状物质中加入水HCL调pH值至3，再加入等体积的乙酸乙酯，萃取时间为4min，萃取次数为4次，合并萃取液，按分相剂/萃取液=0.4，加入正己烷分液，取下层水溶液层，(TC静置24h，过滤；50°C，0.09Mp真空干燥晶体，时间30min，得白色晶体，为绿原酸。
[0018]本发明的有益技术效果是:本发明提供的方法的工艺成本较低，绿原酸和总黄酮提取的转移率高，更重要的是不采用吸附柱进行分离，工艺对环境的危害小，有利于大规模的工业化生产。
【具体实施方式】
[0019]实施例1不同纯化方法对活性成分转移率的影响
[0020]称取灰毡毛忍冬花蕾和叶的混合物1000g，用60-901:石油醚2000、1500和1500mL回流3次，每次30min，得到预处理药材，将预处理药材用3000、2000和2000mL60%的乙醇回流提取，每次30min。得到灰毡毛忍冬花蕾和叶提取液，回收至无醇味，静置过滤，将上述溶液均分为2份，一份为实验组，另一份为对照组。
[0021]对照组的处理
[0022]将500g聚酰胺以工业乙醇浸泡过夜，先洗去悬浮的细小粉末，装柱用95%乙醇洗脱，至流出液滴加于水中不产生浑浊，改用20倍5% NaOH洗脱，之后用蒸馏水冲洗至中性，再用20倍5%盐酸溶液洗，最后用蒸馏水冲至中性，备用；
[0023]参考现有技术的方法，将对照组提取液以0.2,0.4,0.6,0.8和1.0mL / min的流速通过色谱柱，收集过柱液，测定总黄酮、绿原酸含量，计算吸附率。发现在0.4mL / min，总黄酮和绿原酸吸附率分别为
[0024]由现有技术的数据得知，洗脱速率对结果有一定影响，是1.5mL / min比较适宜的洗脱速度。吸附静置的聚酰胺树脂，依次用水、10 %乙醇、30 %乙醇、50 %乙醇、70 %乙醇梯度洗脱，收集各个洗脱部400mL(共8BV)50ml每瓶，不同浓度乙醇洗脱液浓缩到相同体积，高效液相法测得10%、30%乙醇洗脱液中绿原酸含量最高，紫外分光光度法测得50%、70%乙醇洗脱部分总黄酮含量最高，综合上述结果表明，总黄酮在50%乙醇洗脱部位，绿原酸富集在10%乙醇洗脱部位。两者可以同时富集且分离。其中在10-30%乙醇浓度洗脱时，绿原酸的洗脱率为89%，总黄酮的洗脱率为7%，收集洗脱液回收至干，粗提物绿原酸的浓度为88%，作为对照组绿原酸粗提物；在50-70%乙醇浓度洗脱时，绿原酸的洗脱率为2%,总黄酮的洗脱率为77%。
[0025]实验组处理
[0026]用800、400和400mL乙酸乙酯萃取实验组提取液，得到乙酸乙酯溶液和母液，经过检测，乙酸乙酯溶液中总黄酮的转移率达到89%，绿原酸的转移率为3% ;将乙酸乙酯溶液回收至干，50°C浓缩成饱和溶液；将饱和溶液自然条件下冷却至低于25°C，析出沉淀，过滤沉淀，沉淀为灰毡毛忍冬花蕾和叶的总黄酮；总黄酮的转移率为57%。
[0027]将实验组母液分为两份，分别为实验组母液I和实验组母液II ;将按实验组母液I总体积的比例向各组母液中添加氯仿，观察产生沉淀情况，观察到在氯仿添加量达到母液总体积的4%时，不再继续产生沉淀，过滤沉淀，将沉淀烘干，绿原酸的转移率为96%，纯度为71% ;作为实验组I绿原酸粗提物。
[0028]将按实验组母液II总体积1%、2%、4%、6%、8%的比例向各组母液中添加四氯甲烷，并不断搅拌，观察产生沉淀情况，观察到在四氯甲烷添加量达到母液总体积的6%时，不再继续产生沉淀，过滤沉淀，将沉淀烘干，绿原酸的转移率为91 %，纯度为72%;作为实验组II绿原酸粗提物。
[0029]分别将实验组1、II绿原酸粗提物和对照组绿原酸粗提物将沉淀按料液比1:7在绿原酸粗品中加入水HCL调 pH值至3，再加入等体积的乙酸乙酯，萃取时间为4min，萃取次数为4次，合并萃取液，按分相剂/萃取液=0.4，加入正己烷分液，取下层水溶液层，(TC静直24h,过滤；50 C，0.09Mp真空干媒晶体，时间30min,得白色晶体，为绿原酸。称量绿原酸晶体重量。实验组I制备得到纯度大于98% (内标法)的绿原酸18.25g，实验组II制备得到纯度大于98% (内标法)的绿原酸16.14g，对照组得到纯度大于98% (内标法)的绿原酸 10.57g。
[0030]实施例2不同脱脂工艺对活性成分转移率的影响
[0031]分别称取灰毡毛忍冬花蕾和叶4组，各300g，分别作为石油醚前处理组(第一组)，石油醚后处理组(第二组)、对照组(第三组)，用均质机破碎，各组取IOg作绿原酸含量测定，余备用；第一组用IOOOml石油醚在30°C ±2°C动态提取6小时，滤出石油醚溶液，再以800ml石油醚重复提取一次，滤出石油醚溶液；滤液合并回收石油醚得金银花浸膏。被石油醚提取后的金银花；加热回收石油醚后。取出5g，在通风柜中挥去残留溶剂作绿原酸含量测定，其余部分转入下道工序。另外，需要说明的是，石油醚和汽油的物理性质相近，都可以在植化提取中作为脱脂处理的溶剂，由于在实验室获得汽油受到一定的限制，所以在实验中一般采用是石油醚，但根据现有技术可知，对于脱脂是完全可以采用汽油代替石油醚的。
[0032]第一步处理:[0033]本别称取已经处理过的第一组，第二组和第三组药材各200g，分别用70%的乙醇1000mL、800mL、800mL65°C温浸提取30min，分别按组收集提取溶液，回收乙醇至无醇味，并用石油醚IOOOmL和800mL萃取，得到石油醚后处理组的提取溶液，检测各组中绿原酸和总黄酮的含量，并计算个成分相对于原药材中含量的转移率。
[0034]第二步处理:
[0035]在完成时上述处理后，分别用800、600、600mL乙酸乙酯萃取各组的提取溶液，分别得到第一组乙酸乙酯萃取液、母液，第二组乙酸乙酯萃取液、母液，第三组乙酸乙酯萃取液、母液；检测各组中绿原酸和总黄酮的含量，并计算各组相对原药材转移率。
[0036]第三步处理:
[0037]分别在第一、二、三组中按实施例1所述的方法添加氯仿，观察形成絮状物质的过程。发现，第一、二组能够形成絮状沉淀，第三组无法形成絮状沉淀，检测絮状物质中绿原酸含量，并计算各组相对原药材转移率。具体内容如表I所示。
[0038]表I石油醚处理对灰毡毛忍冬花蕾和叶中绿原酸的提取的影响
[0039]
【权利要求】
1.一种从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法，其特征在于:采用降低绿原酸在溶剂的溶解度的方式提取绿原酸。
2.根据权利要求1所述的从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法，其特征在于:所述方法包括以下步骤: 1)用石油醚或汽油对灰毡毛忍冬花蕾和叶进行脱脂处理； 2)采用乙醇提取灰毡毛忍冬花蕾和叶中的活性成分，回收提取液乙醇无醇味，得到提取水溶液； 3)静置过滤水溶液，除去杂质，用乙酸乙酯萃取水溶液，分别收集乙酸乙酯溶液和母液； 4)挥去母液中残留的乙酸乙酯，加热浓缩母液，至母液温度高于25°C无沉淀析出，低于25 °C有沉淀析出； 5)在母液中混入三氯甲烷或四氯甲烷，迅速搅拌，形成絮状沉淀，至母液中不再产生白色絮状物质为止； 6)过滤母液中的絮状物质，纯化结晶絮状物质得到绿原酸晶体。
3.根据权利要求2所述的从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法，其特征在于:将步骤2)得到乙酸乙酯溶液50°C浓缩成饱和溶液；将饱和溶液自然条件下冷却至低于25°C，析出沉淀， 过滤沉淀，沉淀为灰毡毛忍冬花蕾和叶的总黄酮。
4.根据权利要求2所述的从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法，其特征在于:所述在母液中混入三氯甲烷或四氯甲烷为，添加母液总体及大于4%的氯仿，并通过不断的搅拌使氯仿在母液中呈混悬状态，直至无絮状沉淀析出。
5.根据权利要求2所述的从灰毡毛忍冬花蕾和叶中提取纯化活性成分的方法，其特征在于:步骤5)中所述的纯化工艺为:料液比1:7在絮状物质中加入水HCL调pH值至3，再加入等体积的乙酸乙酯，萃取时间为4min，萃取次数为4次，合并萃取液，按分相剂/萃取液=0.4，加入正己烷分液，取下层水溶液层，(TC静置24h，过滤；50°C，0.09Mp真空干燥晶体，时间30min，得白色晶体，为绿原酸。
【文档编号】A61K133/00GK103450019SQ201310426157
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】周兴, 李隆云, 秦剑, 李卿, 宋国红 申请人:重庆市中药研究院