可用于治疗银屑病的小rna及其衍生物和药物制剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了能够用于治疗银屑病的小RNA及其衍生物和药物制剂。该小RNA通过抑制CREB1和ATF1的表达，抑制银屑病的致病相关基因产物——TNFα，IL-1a，IL6和IL的表达。该小RNA药物通过皮肤给药的方式能够显著改善5％的咪喹莫特乳膏涂抹小鼠皮肤形成的银屑病模型鼠的皮肤症状，减轻病变皮肤的表皮增厚程度，改善皮肤的角质化，促进病变皮肤的毛发生长，对治疗银屑病具有一定的作用。
【专利说明】可用于治疗银屑病的小RNA及其衍生物和药物制剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因药物领域，特别是指可用于治疗银屑病的的小RNA及其衍生物和药物制剂。
【背景技术】
[0002]银屑病，又名牛皮癣，是一种慢性感染性皮肤失调证，患病率占世界人口的1~3%。1984年我国24个省、市、自治区进行流行病学调查，其患病率为0.123%，约占皮肤科门诊的5~6%。
[0003]患者病变皮肤处出现无传染性红色浸润斑，边界明显，其角质细胞异常增生和异常分化并导致表皮增生，同时伴有淋巴细胞渗透和表皮血管扩张、蔓延的特征。
[0004]至今人们对银屑病发病机制的认识仍非常有限，通常认为是人体免疫细胞的复杂调控网络和炎症细胞因子相互作用的结果。易感个体在诱发因素的作用下，凋亡细胞释放的自身DNA和自身RNA与银屑病皮损中过度表达的抗菌肽LL37结合形成复合体，诱发浆细胞样树突状细胞激活，通过产生Thl型细胞因子诱导T细胞向Thl型细胞增殖分化。浆细胞样树突状细胞特异性亚型可产生TNF-α及促进一氧化氮合酶产生。活化的树突状细胞移行进入引流淋巴结，初始T细胞在IL-12和IL-23的作用下树突状细胞刺激分化成为Thl和Thl7型效应细胞，经体液循环回流移行进入皮肤组织。T细胞产生大量的TNF- a、IFN_ y、IL-17等细胞因子，刺激角质形成细胞增生活化，产生一系列趋化因子和细胞因子诱导促炎症活动。其结果导致皮肤内出现大量炎症细胞的浸润，表皮角质形成细胞的过度增殖，真皮乳头微小血管的过度增生，临床上逐渐出现银屑病典型的皮疹一-鳞屑性红斑。在银屑病样皮肤病灶中表达的细胞因子主要是Th-Ι和Th-17免疫细胞亚型分泌的，并且主要增加促炎症反应细胞因子，如肿瘤坏死因子-α，干扰素-Υ，白介素-1，白介素_2，白介素-12，白介素-17，白介素-23，以及粘合素-LFA-1。虽然这些促炎症细胞因子并不见得是银屑病的根本原因，但它们在维持银屑病皮肤病灶的炎症方面起着关键性的作用。因此降低或抑制一个或数个促炎症细胞因子的表达是治疗银屑病的一个颇有希望的策略。
[0005]不久前人们通过人源化抗体的技术方法，研究发现针对一个或几个促炎症因子的单克隆抗体，能够有效地治疗某些银屑病病人，其中研究比较多的是针对TNFa的单克隆抗体，其商品名有infliximab和adalimumab,这种抗体通过直接结合TNFa蛋白从而抑制TNFa效应基因，达到临床治疗银屑病的效果。IL-12/23抑制剂(乌司奴单抗)等新的高选择性生物制剂在国外也已被批准用于治疗银屑病。为此有报道研究通过小RNA干扰技术直接沉默TNFa的表达，实验研究表明对人银屑病的动物模型也具有一定的治疗作用。然而单纯的针对某一个银屑病致病细胞因子的治疗存在着停药治疗后病情反弹等副作用。因此急需选取新的，对银屑病致病细胞因子进行新靶点的新型药物的研发。
[0006]在对小分子的药物活性筛选研究中发现针对p38MAPK通路的蛋白激酶抑制剂小分子化合物能够有效的用于银屑病的治疗，但由于其毒性大，所以这类药物除了用于某些肿瘤的治疗外，在银屑病等慢性疾病的治疗中一直没能进入二期临床。由于小分子药物的毒性有多种原因，如小分子作用靶点不专一，小分子化合物的代谢产物具有毒性等原因，选取p38 MAPK通路中的调控基因作为银屑病的基因治疗靶点仍具有可行性。近年来对银屑病病理学的研究进一步佐证了这一点。Yu XJ等和Funding AT等分别报道在银屑病人的病理组织p38的磷酸化要比正常组织中高出2倍左右，同时在该通路上的MEK，ERK1/2和CREB1的磷酸化也比正常对照组显著提高。沉默MSK1，MSK2能够抑制CREB1的表达，同时敲除MSK1还能够有效的降低和银屑病直接相关的免疫分子的表达，如IL-6，IL-8和TNF α.然而上述研究并没有阐明CREB1基因的敲除是否能够同样抑制细胞因子TNFa等的表达。
[0007]近年发展起来的小RNA干扰技术为银屑病治疗的基因药物研发带来新的发展机会。干扰小RNA是一类长度为20个碱基的能与基因的mRNA互补，经过Dicer-Ag02复合物能使mRNA降解的一类天然或合成小RNA。小RNA药物的特点是靶点的特异性强，降解产物没有毒性，是当前新药研究的一个新的突破点。本发明就是在选择银屑病的新靶点的基础上，结合小RNA的设计技术和小RNA的透皮传递技术，对银屑病的小鼠模型进行治疗，以发现新的高效、低毒的治疗银屑病的潜在小RNA药物。
【发明内容】
[0008]本发明提出了可用于治疗银屑病的小RNA，其可以沉默靶基因CREBl(genebank基因号:ΝΜ_004379.3 和 NM_134442)、ATF1 (genebank 基因号 ΝΜ_005171.3)的基因表达，并通过直接抑制上述基因的表达而有效抑制皮肤细胞中能够诱导银屑病的细胞因子靶基因的TNFa，IL6和IL8的表达，并能够改善、减轻银屑病样动物模型的皮肤组织的炎症程度。
[0009]本发明的技术方案是这样实现的:
[0010]可用于治疗银屑病的小RNA，其具有如SEQ ID N0:1(或如附图5)所示的核心核苷酸序列。
[0011]本发明通过大量的筛选、优化和研究，提供了此种能有效沉默CREB1和ATF1的双链小RNA的序列，小RNA s1-CRl具有核心核苷酸序列的双链结构:
[0012]5' -GAAACCCCAUCUCUACUAA-3,
[0013]3' -CUUUGGGGUAGAGAUGAUU-5,
[0014]其中小RNA s1-CRl的反义链能够通过碱基互补直接作用在CREBlmRNA (匪134442)的1156-1174序列上，同时也能通过碱基互补直接作用在ATF1基因mRNA 的 1022-1040 序列上。
[0015]此外，核苷酸序列如SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:30所示(或见表1)的小RNA分子，其也具有相似的抑制靶基因CREB1和ATF1的效果。
[0016]本发明还提供了由此衍生的含有上述核酸的核心结构的小RNA，包括不同长度的小核酸以及在体内能转录生成此类小核酸的小核酸表达载体，也具有相同的抑制炎症相关因子的功能。
[0017]本领域的技术人员应该理解，本发明所述的核苷酸序列中的任意一个核苷酸可以是天然无修饰的，也可以是经不同化学方法修饰的，包括肽核苷酸(PNA)、闭锁核苷酸(LNA)、或甲氧-或乙氧修饰的核苷酸等。
[0018]另外，本领域的技术人员还应该理解，本发明所述的核苷酸还可以包括由上述双链核酸衍生出来的单链核酸、发卡核酸等。[0019]此外，本发明的小RNA药物可以多肽纳米颗粒透皮技术传送到皮肤的病变组织，实现小RNA药物的功能，并且本发明的小RNA可以制成各种制剂，制剂的形式包括霜剂、膏剂、酊剂等各种剂型，用于银屑病的预防和治疗。
[0020]由上可知，本发明提供了一种能够用于治疗银屑病的小RNA及其衍生物和药物制剂。该小RNA通过抑制CREB1和ATF1的表达，抑制银屑病的致病相关基因产物——TNF α，IL-la，IL6和IL的表达。该小RNA药物通过皮肤给药的方式能够显著改善5%的咪喹莫特乳膏涂抹小鼠皮肤形成的银屑病模型鼠的皮肤症状，减轻病变皮肤的表皮增厚程度，改善皮肤的角质化，促进病变皮肤的毛发生长，对治疗银屑病具有一定的作用。
【专利附图】
【附图说明】 [0021]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1为人角质细胞HaCaT中转染siR_l小RNA后靶基因CREB1以及ATF1表达相对水平柱状图，NC对照小RNA的序列为正义链为5’ -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反义链为 5， -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3，；
[0023]图2为siR-Ι与透皮多肽纳米颗粒组成的透皮剂配方对小鼠皮肤组织的炎性因子基因的表达影响柱状图；
[0024]图3为siR-Ι与透皮多肽纳米颗粒组成的透皮剂配方对咪喹莫特药膏涂抹小鼠CD-1皮肤形成的银屑病动物模型的皮肤组织的增生及角质化破损的影响对照图；其中图3A为正常对照小鼠；图3B为给造模药咪喹莫特药膏50mg/cm221天的银屑病阳性对照小鼠；图3C为给造模药造模药咪喹莫特药膏50mg/cm214天形成银屑病样皮肤后，再给予生理盐水的自然恢复组；图3D为给造模药14天形成银屑病样皮肤后，只给小RNA药物siR-12 μ g/cm2连续7天的治疗组小鼠；图3E为正常小鼠只给小RNA药物siR-12 μ g/cm2连续7天的对照组；
[0025]图4为siR-Ι和透皮多肽纳米颗粒组成的药物对小鼠皮肤治疗组织切片的HE染色图，实验条件同图3 ；
图5为本发明小RNA s1-CRl的核心核苷酸序列的双链结构。
【具体实施方式】
[0026]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027]本发明的可用于治疗银屑病的小RNA，其具有如SEQ ID NO:1(或如附图5)所示的核心核苷酸序列。
[0028]本发明通过大量的筛选、优化和研究，提供了此种能有效沉默CREB1和ATF1的双链小RNA的序列，小RNA s1-CRl具有核心核苷酸序列的双链结构:[0029]5, -GAAACCCCAUCUCUACUAA-3,
[0030]3' -CUUUGGGGUAGAGAUGAUU-5'
[0031]其中小RNA s1-CRl的反义链能够通过碱基互补直接作用在CREBlmRNA(NM_l34442)的1156-1174序列上，同时也能通过碱基互补直接作用在ATF1基因mRNA 的 1022-1040 序列上。
[0032]此外，核苷酸序列如SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:30所示(或见表1)的小RNA分子，其也具有相似的抑制靶基因CREB1和ATF1的效果。
[0033]本发明还提供了由此衍生的含有上述核酸的核心结构的小RNA，包括不同长度的小核酸以及在体内能转录生成此类小核酸的小核酸表达载体，也具有相同的抑制炎症相关因子的功能。
[0034]本领域的技术人员应该理解，本发明所述的核苷酸序列中的任意一个核苷酸可以是天然无修饰的，也可以是经不同化学方法修饰的，包括肽核苷酸(PNA)、闭锁核苷酸(LNA)、或甲氧-或乙氧修饰的核苷酸等。
[0035]另外，本领域的技术人员还应该理解，本发明所述的核苷酸还可以包括由上述双链核酸衍生出来的单链核酸、发卡核酸等。
[0036]此外，本发明的小RNA药物可以多肽纳米颗粒透皮技术传送到皮肤的病变组织，实现小RNA药物的功能，并且本发明的小RNA可以制成各种制剂，制剂的形式包括霜剂、膏剂、酊剂等各种剂型，用于银屑病的预防和治疗。
[0037]以下为具体实施例:
[0038]实施例1:
[0039]小RNA siR-Ι能显著抑制CREB1、ATF1的mRNA在人角质化细胞中的表达，通过设计上百条小RNA分子进行大量实验，最终筛选出其中29条，它们能不同程度的抑制靶基因Crebl和Atfl的表达，此29条小RNA分子的序列见表1。
[0040]表1.小RNA单链序列(另一条为互补链)。
[0041]
【权利要求】
1.可用于治疗银屑病的小RNA，其特征在于:具有如SEQID NO:1至SEQ ID NO:30任一序列所示的核苷酸序列及其互补序列的双链小RNA，其反义链可通过碱基互补同时直接作用在CREB1 mRNA的1156-1174序列和ATF1基因mRNA的1022-1040序列上，并抑制此两基因的表达。
2.根据权利要求1所述的可用于治疗银屑病的小RNA，其特征在于:所述小RNA还包括由所述双链小RNA衍生出来的单链核酸、发卡核酸等。
3.根据权利要求2所述的可用于治疗银屑病的小RNA，其特征在于:所述的核苷酸序列中的任意一个核苷酸可以经化学方法修饰。
4.根据权利要求3所述的可用于治疗银屑病的小RNA，其特征在于:所述化学修饰方法包括肽核苷酸、闭锁核苷酸、或甲氧-或乙氧修饰等。
5.根据权利要求1至4任一项所述的可用于治疗银屑病的小RNA，其特征在于:所述小RNA以多肽纳米颗粒透皮技术传送到皮肤的病变组织，实现小RNA药物的功能。
6.包含权利要求1至5任一项所述的可用于治疗银屑病的小RNA的小核酸衍生物。
7.能够在体内转录生成权利要求6所述的小核酸衍生物的小核酸表达载体。
8.根据权利要求1至5任一项所述的可用于治疗银屑病的小RNA制成的药物制剂。
9.根据权利要求8所述制剂，其`特征在于，所述药物制剂形式包括霜剂、膏剂、酊剂等。
【文档编号】A61K48/00GK103736102SQ201310567383
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】黄兵, 殷勤伟, 张洪杰 申请人:黄兵