一种细胞破壁低温提取杜仲绿原酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种天然产物提取的方法，尤其是涉及一种采用细胞破壁技术从杜仲叶中提取绿原酸的方法。该方法是将杜仲叶粉碎后，采用弱碱破坏叶片上的角质层，通过低温提取、膜处理、反渗透结合树脂吸附洗脱工艺及低温连续带式干燥而成。本发明采用细胞壁破技术将绿原酸从杜仲叶中释放，绿原酸溶出率高；采用低温提取、低温干燥工艺，减少了热敏性成分绿原酸因受热不稳定热产生的损失，同时降低了能耗；采用膜处理结合树脂进行纯化，杂质去除效果好，绿原酸品质好。
【专利说明】一种细胞破壁低温提取杜仲绿原酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药材加工领域，具体为一种细胞破壁低温提取、膜分离技术结合树脂工艺制备杜仲绿原酸的方法。
【背景技术】
[0002]绿原酸(chlorogenic acid)是一种从双子叶植物(如忍冬叶、咖啡豆、向日葵等)的叶和果实分离得到的酚类，也是许多中草药(如杜仲、金银花、茵陈等)及中药复方制剂抗菌消炎、清热解毒的主要活性成分，目前已成为中草药制剂质量控制的主要指标之一。中草药是中华民族几千年文明的瑰宝，是我们炎黄子孙的骄傲。千百年来，我们的祖先运用中草药及其复方制剂在防病治病方面取得了异常丰富的临床经验，留下了一大批医药名著。近些年，由于西药的泛滥，病原微生物的变异及抗药性也取得了长足的“进步”，于是，人们重新将目光投向了中草药。特别是在人们日益崇尚天然、无污染食品的“后抗生素”时代，中草药以其独到的优势逐渐受到人们前所未有的青睐，中草药中有效成分的提取工艺、作用机理、应用研究也重新成为医药界追逐的热点，并逐渐成为动物营养界研究的一大方向。
[0003]绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。它是一种由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(鸡纳酸，quinic acid,即1-轻基六氢没食子酸)缩合而成的缩酹酸，异名咖啡鞋酸，化学名3-0-咖啡酰奎尼酸(3-0-caffeoylquinicacid)，分子式为C16H18O9，分子量:345.30，半水合物为针状晶体，110°C时变为无水化合物，易溶于水、乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，常温下呈淡黄色固体。
[0004]植物中绿原酸的生物合成包括了一系列的酶促反应。在酶的催化下，葡萄糖转化成莽草酸(shikimic acid)，后者再转化成苯丙氨酸，最后经合成酶作用得绿原酸。其可能的生物合成途径如下:绿原酸在植物中分布广泛，从高等双子叶植物到蕨类植物均有报道，但含量较高的植物不多，主要存在于忍冬科忍冬属(Lonicera)、菊科蒿属(Artemisia)植物中，其中包括杜仲、金银花、向日葵、咖啡。
[0005]由于绿原酸是极性较强的有机酸，易溶于醇、水，难溶于氯仿、乙醚，因此绿原酸的提取方法较多，有醇(甲醇、乙醇)溶法、水提醇沉、醇提铅沉法及聚酰胺柱层析法等。
[0006]醇溶法:先用氯仿进行连续提取至流出液呈无色，再改用95%工业乙醇提取，提尽绿原酸；将所得乙醇提取液减压浓缩成浸膏，与干净的细沙拌合后，用热水提取数次，使绿原酸转溶于水中，弃去残渣；所得水溶液用乙醚萃取，进一步除去脂溶性杂质；向脱脂后的水溶液中加入饱和无机盐溶液，至沉淀完全，并稍有过量为止。此时，水中的绿原酸与金属离子结合生成不溶性盐；用离心分离法分离出沉淀并除去沉淀中的金属离子后，将所得滤液用有机溶剂萃取数次，回收溶剂，得绿原酸粗品，经分步结晶和重结晶等方法精制，即得绿原酸纯品，得率约为0.5%。醇溶法的弊端:溶剂损耗量大、严重增加了生产成本。
[0007]水提醇沉法:采用水为溶剂，加热煮沸提取，但相应地增加其他水溶性成分如蛋白质、多糖、鞣质等杂质，可用传统的醇沉法除去。醇沉过程中伴随吸附和包夹,致使绿原酸有不同程度的损失。提取水提液中绿原酸时，分次醇沉比一次醇沉所得产品纯度高；当乙醇浓度最终为90%时，一次醇沉的损失率比分次醇沉较大。
[0008]以上提取方案中存在着提取率不高、产品纯度低、能源消耗量大的问题，严重制约了杜仲产业的发展。
【发明内容】
[0009]本发明的目的:为了克服上述存在的问题及缺陷，本发明提供一种细胞破壁低温提取杜仲绿原酸的方法。该方法是将杜仲叶粉碎后，采用弱碱破坏叶片上的角质层，通过低温提取、膜处理、反渗透、树脂吸附洗脱工艺、浓缩及低温连续带式干燥制备杜仲绿原酸。
[0010]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:采用一种细胞破壁低温提取杜仲绿原酸的方法步骤包括:
1、提取:第一次:用pH值为9的碱水浸泡(杜仲叶重量的3倍水量)20分钟,然后把碱水放回储罐内作为下一批原料第一次浸泡备用碱水；第二次:加入杜仲叶重量的7倍pH值为2的纯水动态常温提取2小时，放料液；第三次:加入杜仲叶重量的6倍pH值4的纯水常温动态提取2小时，放料液;第四次:加入杜仲叶重量8倍的纯水，加温到60°C，动态提取I小时，放料液，出液时用板框冷却至30°C以下，本次料液作为下一批原料的第二次提取溶剂；
2、离心:用高速管式离心机离心提取后的料液，去除悬浮杂质，流速不超过lt/h；
3、膜分离:用0.5微米的陶瓷膜分离出杜仲叶中的蛋白质、多糖、鞣质；
4、反渗透浓缩:用反渗透膜回收水，浓缩到杜仲叶原料重量的4倍体积；
5、上树脂柱:树脂型号为NKA-9大孔吸附树脂，上柱流速为柱体积的0.6倍量每小时；
6、洗脱:用柱体积3倍量的50%乙醇洗脱，流速控制在柱体积的0.6倍量每小时，收集洗脱液；
7、回收洗脱液:浓缩回收乙醇，浓缩到相对密度为1.08出液；
8、干燥:连续低温带式干燥、粉碎，温度控制在45°C-60°C。
[0011]本发明中，所述树脂再生方法为:新树脂用90%乙醇浸泡12小时，90%乙醇用量为能全部浸泡到树脂为准，再用柱体积两倍量的5%Na0H进行处理，用纯水洗至pH值为8.0，再用柱体积两倍量的3%HC1进行处理，用纯水洗至pH值为6即可。
[0012]本发明具有的有益效果:
1、本发明采用细胞壁破技术将绿原酸从杜仲叶中释放，绿原酸溶出率高；
2、本发明采用低温提取、低温干燥工艺，减少了热敏性成分绿原酸因受热不稳定热产生的损失，同时降低了能耗；
3、本发明采用膜处理结合树脂进行纯化，杂质去除效果好，绿原酸品质好。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1表示本发明工艺流程图。
【具体实施方式】
[0014]为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
[0015]实施例1:称取IKg的杜仲叶，提取分四次。第一次:用pH值为9的碱水3千克浸泡20分钟，然后把碱水放回储罐内作为下一批原料第一次浸泡备用碱水；第二次:加入7KgpH值为2的纯水动态常温提取2小时，放料液；第三次:加入6Kg pH值为4的纯水常温动态提取2小时放料；第四次:加入8Kg纯水，加温到60°C，动态提取I小时，放料液，出液时用板框冷却至30°C以下，本次料液作为下一批原料的第二次提取溶剂；离心:用高速管式离心机离心提取后的杜仲母液，去除悬浮杂质，流速不超过lt/h ;膜分离:用0.5微米的陶瓷膜分离出杜仲叶中的蛋白质、多糖、鞣质；反渗透膜:用反渗透膜回收水，浓缩到体积为4L ；上树脂柱:树脂型号为NKA-9大孔吸附，上柱流速为柱体积的0.6倍量每小时；洗脱:用柱体积3倍量的50%乙醇洗脱，流速控制在柱体积的0.6倍量每小时，收集洗脱液；回收洗脱液:用外循环浓缩回收乙醇浓缩到相对密度为1.08出液；干燥:连续低温带式干燥、粉碎，温度控制在45°C -60°C，即得16.2g纯度为65.6%的绿原酸。
[0016]实施例2:称取IKg的杜仲叶，提取分四次。第一次:用实施例1第一次浸泡后回收的碱水并用新配置的PH值为9的碱水补足至3千克浸泡20分钟，然后把碱水放回储罐内作为下一批原料第一次浸泡备用碱水；第二次:加入7Kg pH值为2的纯水动态常温提取2小时，放料液；第三次:加入6Kg pH值为4的纯水常温动态提取2小时放料；第四次:加入实施例I第四次提取所得的料液并用纯水补足至8Kg，加温到60°C，动态提取I小时，放料液，出液时用板框冷却至30°C以下，本次料液作为下一批原料的第二次提取溶剂；离心:用高速管式离心机离心提取后的杜仲母液，去除悬浮杂质，流速不超过lt/h ;膜分离:用0.5微米的陶瓷膜分离出杜仲叶中的蛋白质、多糖、鞣质；反渗透膜:用反渗透膜回收水，浓缩到体积为4L ;上树脂柱:树脂型号为NKA-9大孔吸附，上柱流速为柱体积的0.6倍量每小时；洗脱:用柱体积3倍量的50%乙醇洗脱，流速控制在柱体积的0.6倍量每小时，收集洗脱液；回收洗脱液:用外循环浓缩回收乙醇浓缩到相对密度为1.08出液；干燥:连续低温带式干燥、粉碎，温度控制在45°C -60°C，即得16.5g纯度为65.0%的绿原酸。
[0017]实施例3:称取IKg的杜仲叶，提取分四次。第一次:用实施例2第一次浸泡后回收的碱水并用新配置的PH值为9的碱水补足至3千克浸泡20分钟，然后把碱水放回储罐内作为下一批原料第一次浸泡备用碱水；第二次:加入7Kg pH值为2的纯水动态常温提取2小时，放料液；第三次:加入6Kg pH值为4的纯水常温动态提取2小时放料；第四次:加入SKg实施例2第四次提取所得的料液并用纯水补足至8Kg，加温到60°C，动态提取I小时，放料液，出液时用板框冷却至30°C以下，本次料液作为下一批原料的第二次提取溶剂；离心:用高速管式离心机离心提取后的杜仲母液，去除悬浮杂质，流速不超过lt/h ;膜分离:用0.5微米的陶瓷膜分离出杜仲叶中的蛋白质、多糖、鞣质；反渗透膜:用反渗透膜回收水，浓缩到体积为4L ;上树脂柱:树脂型号为NKA-9大孔吸附，上柱流速为柱体积的0.6倍量每小时；洗脱:用柱体积3倍量的50%乙醇洗脱，流速控制在柱体积的0.6倍量每小时，收集洗脱液；回收洗脱液:用外循环浓缩回收乙醇浓缩到相对密度为1.08出液；干燥:连续低温带式干燥、粉碎，温度控制在45°C -60°C，即得16.0g纯度为66.4%的绿原酸。
[0018]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【权利要求】
1.一种细胞破壁低温提取杜仲绿原酸的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)提取:第一次:用pH值为9的碱水浸泡(杜仲叶重量的3倍水量)20分钟，然后把碱水放回储罐内作为下一批原料第一次浸泡备用碱水；第二次:加入杜仲叶重量的7倍pH值为2的纯水动态常温提取2小时，放料液；第三次:加入杜仲叶重量的6倍pH值为4的纯水常温动态提取2小时，放料液；第四次:加入杜仲叶重量8倍的纯水，加温到60°C，动态提取1小时，放料液，出液时用板框冷却至30°C以下，本次料液作为下一批原料的第二次提取溶剂； (2)离心:用高速管式离心机离心提取后的料液，去除悬浮杂质，流速不超过lt/h； (3)膜分离:用0.5微米的陶瓷膜分离出杜仲叶中的蛋白质、多糖、鞣质； (4)反渗透浓缩:用反渗透膜回收水，浓缩到杜仲叶原料重量的4倍体积； (5)上树脂柱:树脂型号为NKA-9大孔吸附树脂，上柱流速为柱体积的0.6倍量每小时； (6)洗脱:用柱体积3倍量的50%乙醇洗脱，流速控制在柱体积的0.6倍量每小时，收集洗脱液； (7)回收洗脱液:浓缩回收乙醇，浓缩到相对密度为1.08出液； (8)干燥:连续低温带式干燥、粉碎，温度控制在45°C-60°C。
【文档编号】A61K127/00GK104490980SQ201310726468
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】田洪全, 任治军, 刘冬成 申请人:湖北老龙洞杜仲开发有限公司