专利名称：：一种中药微粉细胞破壁率的测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药微粉细胞破壁率的测定方法。技术背景中药超微粉体是一种微米级新型中药粉体，主要通过机械粉碎使中药植物细胞壁破裂，促使有效成分快速释放。中药的有效成分主要存在于细胞内，在细胞完整无损的状态下，有效成份只能透过细胞壁及细胞膜释放被利用，当细胞壁(或膜)内外浓度达到平衡时，有效成分不再透过细胞壁(或膜)而被利用。因此中药有效成分的溶出及释放不完全导致了利用不完全，最终造成中药资源的浪费。采取超微粉碎技术，将细胞壁打破以使有效成份直接接触溶媒，能加快有效成分的溶出速度，提高溶出率。细胞壁的破裂程度直接影响着有效成分的溶出，关系到药效的发挥及临床疗效，因此，细胞破壁率常被认为是评价中药微粉质量的重要指标之一。由于中药的超微粉碎技术是一个中药行业的新技术，很多技术关键有待深入研究，关于中药细胞破壁率测定的方法研究至今未见报道。中药材中绝大多数品种来源于植物，植物药材是由多种功能的植物细胞组成，关于植物药材细胞破壁率的研究不多，品种仅限于花粉与孢子类中药，方法主要是电镜扫描和血球计数板法，且未设定统一标准。中药超微粉体细胞破壁率是其产品质量评价体系中一个关键参数，为保证超微粉体的质量，应建立中药超微粉体的细胞破壁率测定标准。
发明内容为克服上述缺陷，本发明对中药超微粉体细胞破壁率的测定进行了大量研究工作，建立了中药超微粉体细胞破壁率的测定方法。本发明提供了一种中药微粉细胞破壁率的测定方法，应用显微观测计数法，测定中药微粉的细胞破壁率；根据中药不同入药部位选择适宜的细胞类型，即特征细胞作为测定观测对象；选择原则为有规则的细胞形状，易于观察与计数；细胞壁较厚，比较坚韧难破，对其种类有代表性。上述中药微粉细胞破壁率的测定方法根据不同入药部位种类中药，选择观测的细胞如下根及根茎类首选木栓细胞，次选薄壁细胞，或选石细胞；皮类木栓细胞；花类花粉粒；叶类表皮细胞；果实类首选果皮细胞，次选表皮细胞，或选石细胞。上述中药微粉细胞破壁率的测定方法，具体实施包括以下步骤1)取中药样品干燥，按常规方法制备中药细粉和微粉；2)在0.051.5g范围内称取5-8个不同重量的步骤l)所述细粉，均匀分散于溶媒中，按显微观测计数法观察细粉中完整的特征细胞为显微计数物，并进行线性回归，绘制标准曲线，得回归曲线方程，反复进行此步骤至回归曲线方程中相关系数r大于0.9，再进行下一步；3)分别按照步骤2)所述方法称取步骤1)所述微粉和细粉，按显微观测计数法观察其中完整的特征细胞为显微计数物，按下列公式计算细粉和微粉的显微特征细胞个数XV中药粉体显微特征细胞个数<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中，X为每个视野内的特征细胞数，V为药液总体积，V'为盖玻片下药液体积，W为样品称取量；4)根据样品细粉和微粉的显微特征细胞个数，按下列公式计算细胞破壁率:Y=(A-B)/Axl00%，其中，Y为细胞破壁率，A为细粉显微特征细胞个数，B为微粉的显微特征细胞个数。上述步骤l)所述中药样品干燥为水分低于6%;所述常规方法制备中药细粉和微粉是将中药样品粉碎成80-100目的细粉，再将细粉进行超微粉碎至过300目的微粉。上述溶媒为水合氯醛或稀甘油。植物中药的组织结构除了草酸钙晶体、淀粉粒、菊糖、油滴等后含物外，它们主要有许多来源相同、形态机构相似、机能相同而又互相联系的细胞组成的细胞群，如薄壁组织中的薄壁细胞、木栓组织中的木栓细胞、韧皮部的韧皮纤维、木质部的木纤维等；另外，还有导管、管胞、筛管等输导组织及散在的石细胞、花粉粒等。在选择适宜的细胞破壁率评价指标时，由于微粉中的纤维、导管等长条形的细胞均已被截断，所以不宜作为具有代表性的细胞来进行评价。薄壁细胞由于壁薄，通常简单的机械力量即可将其破碎，因此仅在微粉显微观测中没有其它特征细胞可供选择时选用。木栓细胞在根及根茎、皮类中药中大量存在，其细胞壁稍厚，有规则的形状，有代表性，易于观察，适宜作为这几类中药微粉细胞破壁率测定的特征细胞。花粉粒壁坚实，内含丰富营养，单个散在，有规则的性状，这些都使其成为花类中药细胞破壁率测定的评价指标。表皮细胞在叶类、果实类中药中大量存在，均匀规则，壁坚韧，难以破裂，宜于作为测定该类中药细胞破壁率的评价指标。不同类别的中药粉末具有不同的显微特征，通过对稀甘油、水合氯醛等分散溶媒的对比分析，宜通过试验选择不同的分散溶媒来进行处理，在目镜10x，物镜10x的显微镜下观察，方可拍摄较为清晰的显微图像，便于观察计数，确保结果的准确性。影响细胞破壁率检测精确度的主要因素是回归方程的精确性和未破壁细胞计数的精确性。对于回归方程，由于称样量的误差可以忽略，每个计数单位内细胞平均数的精确性是最主要的影响因素。通过直观分析法得出，混悬液浓度为主要因素，观察倍数和展开面积次之，因此宜选择最佳混悬液浓度。超微粉碎工艺对于不同质地的中药，粉碎效果不同；关于细胞破壁率与粒径的相关性均有待深入研究。本发明首次对中药微粉细胞破壁率进行测定，以中药粉体完整的细胞作为特征计数物，采用细胞计数法考察超微粉碎对中药细胞破壁率的影响。方法学研究结果表明，采用细胞计数法考察中药粉体细胞破壁率，方法稳定，操作简便。该法对于测定中药粉末的细胞破壁率具有借鉴作用，也为中药超微粉体的质量研究及评价提供了细胞破壁率测定的新思路。图l:苍术细粉标准回归曲线；图2:番泻叶细粉标准回归曲线；图3:金银花细粉标准回归曲线。具体实施方式收集多种中药材，经鉴定符合《中国药典》2005年版一部有关规定。FF1-15型柴日式粉碎机(湖南雪峰机械厂)，BFM-T6BI型振动研磨混炼机(济南贝利公司)，微量吸管，WINNER99显微颗粒图像分析仪(包括三目显微镜、CCD图像采集系统、计算机图像处理软件)。所有试剂为分析纯。实施例1苍术微粉的细胞破壁率测定根及根茎类中药材的粉末显微特征可见导管、木栓细胞、厚壁细胞、分泌组织等，其后含物菊糖、草酸钙簇晶等不在选择之内。研究以苍术为例，说明根及根茎类中药微粉的细胞破壁率测定方法的建立。苍术微粉的细胞破壁率测定宜选择木栓细胞作为检测指标，进行其细胞破壁率的测定。分别精密称取O.1133g、0.2142g、0.3414g、0.4621g、0.5014g、0.6735g、0.7073g、0.8249g细粉，分别置于25mL容量瓶中，加水合氯醛适量，超声处理5分钟，使粉末分散均匀，定容至刻度。精密吸取药液30uL，装片(装片时，使混悬液布满整个玻片，不溢出，无气泡为度)，分别置WINNER99显微图像分析仪下观察。要考察苍术细粉的细胞破壁率，主要是测定其木栓石细胞的破壁率，对其进行计数(以一个视野为一个计数单位的平均值)，结果见表l表l不同称样量中完整木栓石细胞的个数(n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以细粉的称样量为横坐标，每个计数中完整的木栓石细胞平均数为纵坐标，绘制标准曲线(附图1)，得到回归曲线方程Y=5.0517X+3.4246，r=0.9977，说明苍术细粉中完整的木栓细胞在0.H330.8249g范围内线性关系良好，可用来作为显微特征计数。分别取苍术细粉与微粉，精密称定，照前述方法制片，于显微镜(XIOO)下观察，分别观察25个视野，根据两者完整木栓石细胞个数、混悬液体积、称样量，按下列公式计算苍术细粉和微粉的显微特征个数苍术粉末显微特征个数/mg-XV/V'W,式中X为每个盖玻片下的特征数；V为样品混悬液总体积(mL);V'为盖玻片下混悬液体积(mL);W为样品称取量(mg)。再根据苍术细粉和微粉的显微特征个数，按下列公式计算细胞破壁率Y=(A—B)/AX100%Y:细胞破壁率A:苍术细粉显微特征个数；B:苍术微粉的显微特征个数。各项参数见表2。表2苍术粉末显微特征(木栓细胞)个数计算的相关参数(n=25)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结论超微粉碎可使苍术的细胞破壁率达到90.1%。实施例2番泻叶微粉的细胞破壁率测定叶肉组织和气孔是叶类药材的主要标志。显微观察时可见表皮细胞、气孔、毛茸、非腺毛、石细胞、晶体等。研究以番泻叶为例，说明叶类中药微粉的细胞破壁率测定方法的建立。番泻叶微粉宜选择表皮细胞作为检测指标，进行其细胞破壁率的测定。分别精密称取0.1323、0.2478、0.3174、0.4527、0.5277、0.6052、0.7246、0.8144g细粉，分别置于25mL容量瓶中，加水合氯醛适量，超声处理5分钟，使粉末分散均匀，定容至刻度。精密吸取药液30uL，装片(装片时，使混悬液布满整个玻片，不溢出，无气泡为度)，分别置WINNER99显微图像分析仪下观察。要考察番泻叶细粉的细胞破壁率，主要是测定其表皮细胞的破壁率，对其进行计数(以一个视野为一个计数单位的平均值)，结果见表3.表3不同称样量中完整表皮细胞的个数(n=8)称样量(g)0.13230.24780.31740.45270.5277细胞个数22.82424.82626.6称样量(g)0,60520.72460.8144细胞个数27.628.429.9以细粉的称样量为横坐标，每个计数中完整的表皮细胞平均数为纵坐标，绘制标准曲线(附图2)，得到回归曲线方程Y=9.9525X+21.508，r2=0.9940，说明番泻叶细粉中完整表皮细胞在0.13230.8144g范围内线性关系良好，可用来作为显微特征计数。分别取番泻叶细粉与微粉，精密称定，照前述方法制片，，于显微镜(X100)下观察，分别观察25个视野，根据两者完整表皮细胞个数、混悬液体积、称样量，按下列公式计算番泻叶细粉和微粉的显微特征个数番泻叶粉末显微特征个数/mg:XV/V'W，式中X为每个盖玻片下的特征数；V为样品混悬液总体积(mL);V'为盖玻片下混悬液体积(mL);W为样品称取量(mg)。再根据番泻叶细粉和微粉的显微特征个数，按下列公式计算细胞破壁率Y=(A—B)/AX100%,Y:细胞破壁率A:番泻叶细粉显微特征个数；B:番泻叶微粉的显微特征个数。各项参数见表4表4番泻叶粉末显微特征(表皮细胞)个数计算的相关参数(n=25)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>结论超微粉碎可使番泻叶的细胞破壁率达到93%。实施例3金银花微粉的细胞破壁率测定花类药材显微观测可见花粉粒、花粉囊内壁细胞、毛茸、柱头表皮细胞，其附属物草酸钙簇晶等不在选择之内。研究以金银花为例，说明花类中药微粉的细胞破壁率测定方法的建立。金银花微粉宜选择花粉粒作为检测指标，进行其细胞破壁率的测定。分别精密称取0.1291、0.2247、0.3015、0.4461、0.5375、0.6713、0.7583、0.8195g细粉，分别置于25mL容量瓶中，加水合氯醛适量，超声处理5分钟，使粉末分散均匀，定容至刻度。精密吸取药液30uL，装片(装片时，使混悬液布满整个玻片，不溢出，无气泡为度)，分别置WINNER99显微图像分析仪下观察。考察金银花微粉的细胞破壁率，主要是测定其花粉粒的破壁率，对其进行计数(以一个视野为一个计数单位的平均值)，结果见表5.表5不同称样量中完整花粉粒的个数(n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以细粉的称样量为横坐标，每个计数中完整的花粉粒平均数为纵坐标，绘制标准曲线(附图3)，得到回归曲线方程Y-13.891X+10.624,F0.9961，说明金银花细粉中完整花粉粒在0.12910.8195g范围内线性关系良好，可用来作为显微特征计数。分别取金银花细粉与微粉，精密称定，照前述方法制片，于显微镜于显微镜(X100)下观察下，分别观察25个视野，根据两者完整花粉粒个数、混悬液体积、称样量，按下列公式计算金银花细粉和微粉的显微特征个数金银花粉末显微特征个数/mg:XV/V'W，式中X为每个盖玻片下的特征数；V为样品混悬液总体积(mL);V'为盖玻片下混悬液体积(mL);W为样品称取量(mg)。再根据金银花细粉和微粉的显微特征个数，按下列公式计算细胞破壁率Y=(A—B)/AX100%,Y:细胞破壁率A:金银花细粉显微特征个数；B:金银花微粉的显微特征个数。各项参数见表6.表6金银花粉末显微特征(花粉粒)个数计算的相关参数(n=25)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结论超微粉碎可使金银花的细胞破壁率达到94%。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结果表明，样品的取样量与完整的特征细胞数均呈线性关系，其线性相关系数r大于0.9，通过方法学考察证明其细胞破壁率测定方法简便，稳定与可靠。细胞破壁率多为90%左右。权利要求1、一种中药微粉细胞破壁率的测定方法，其特征在于，应用显微观测计数法，测定中药微粉的细胞破壁率；根据中药不同入药部位选择适宜的细胞类型，即特征细胞作为测定观测对象；选择原则为有规则的细胞形状，易于观察与计数；细胞壁较厚，比较坚韧难破，对其种类有代表性。2、根据权利要求l所述的中药微粉细胞破壁率的测定方法，其特征在于根据不同入药部位种类中药，选择观测的细胞如下根及根茎类首选木栓细胞，次选薄壁细胞，或选石细胞；皮类木栓细胞；花类花粉粒；叶类表皮细胞；果实类首选果皮细胞，次选表皮细胞，或选石细胞。3、根据权利要求2所述的中药微粉细胞破壁率的测定方法，其特征在于，具体实施包括以下步骤1)取中药样品干燥，按常规方法制备中药细粉和微粉；2)在0.051.5g范围内称取5-8个不同重量的步骤1)所述细粉，均匀分散于溶媒中，按显微观测计数法观察细粉中完整的特征细胞为显微计数物，并进行线性回归，绘制标准曲线，得回归曲线方程，反复进行此步骤至回归曲线方程中相关系数r大于0.9，再进行下一步；3)分别按照步骤2)所述方法称取步骤1)所述微粉和细粉，按显微观测计数法观察其中完整的特征细胞为显微计数物，按下列公式计算细粉和微粉的显微特征细胞个数XV中药粉体显微特征细胞个数/mg=-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，X为每个视野内的特征细胞数，V为药液总体积，V'为盖玻片下药液体积，W为样品称取量；4)根据样品细粉和微粉的显微特征细胞个数，按下列公式计算细胞破壁率:Y=(A-B)/Axl00%，其中，Y为细胞破壁率，A为细粉显微特征细胞个数，B为微粉的显微特征细胞个数。4、根据权利要求3所述的中药微粉细胞破壁率的测定方法，其特征在于，步骤l)所述中药样品干燥为水分低于6%;所述常规方法制备中药细粉和微粉是将中药样品粉碎成80-100目的细粉，再将细粉进行超微粉碎至过300目的微粉。5、根据权利要求1至4之一所述的中药微粉细胞破壁率的测定方法，其特征在于，所述溶媒为水合氯醛或稀甘油。全文摘要本发明提供了一种中药微粉细胞破壁率的测定方法，首次对根及根茎、皮、叶、花、果实类等不同入药部位的中药微粉进行了细胞破壁率的测定，并与细粉进行比较，探讨了不同入药部位中药细胞破壁率测定的共性，确定了不同入药部位中药宜选择不同的特征细胞计数指标，以中药粉体完整的某一细胞作为特征计数物，采用细胞计数法考察超微粉碎对中药细胞破壁率的影响。方法学研究结果表明，采用细胞计数法测定中药微粉细胞破壁率的方法稳定，操作简便、重复性较好。该法对于测定中药粉体的细胞破壁率具有借鉴作用，也为中药超微粉体的质量研究及评价提供了细胞破壁率测定的新思路。文档编号G01N33/48GK101403738SQ200810143609公开日2009年4月8日申请日期2008年11月14日优先权日2008年11月14日发明者雅李,瑛杨,杨永华,温俊达,蔡光先申请人:湖南省中医药研究院