一种抗胰腺癌药物组合物及其应用、药盒和包装件的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医药【技术领域】，涉及一种抗胰腺癌用药物组合物及应用、药盒和包装件。所述药物组合物、药盒及包装件含有作为联合制剂供同时、分开或顺序使用的治疗有效量的阿米洛利和治疗有效量的表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼，其中，阿米洛利与厄洛替尼的摩尔比为500:1～1:50。本发明的药物组合物、药盒及包装件用于治疗肿瘤时，能获得优于厄洛替尼单独使用的药效，提高临床化疗的效果。
【专利说明】一种抗胰腺癌药物组合物及其应用、药盒和包装件
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种抗胰腺癌用药物组合物及其应用、药盒和包装件。
【背景技术】
[0002]据统计报道，胰腺癌的发病率逐年上升，在欧美居常见恶性肿瘤的第四位，在我国居恶性肿瘤死亡的第九位。胰腺癌早期诊断困难，80%的患者在确诊时为中晚期，能进行根治性手术者仅10%-15%，术后5年生存率仅15%-20%。通常，进展期胰腺癌患者的生存期不到3个月，5年生存率不到1%。
[0003]目前，药物治疗(包括化疗、分子靶向治疗、中医药以及支持对症治疗)对于晚期胰腺癌是重要的治疗手段。吉西他滨(gemCitabine，GEM)仍然是临床治疗晚期胰腺癌一线化疗的金标准药物 ，但其疗效远不能令人满意。随着分子生物学和基因组学的飞速发展，研究发现胰腺癌的发生、发展和转移与多种基因突变及细胞信号传导通路的异常密切相关，因此，分子靶向药物单独或联合化疗已成为胰腺癌治疗的新的研究热点。目前，EGFR-TKI中的厄洛替尼(erlotinib，特罗凯)，是惟一被FDA批准用于治疗晚期胰腺癌的分子靶向药物，但其生存获益仍非常有限，尚需大规模的临床试验以评估疗效。
[0004]盐酸阿米洛利是一种临床长期应用的口服保钾利尿药，具有保钾排钠作用强、起效快、作用持续时间长、副反应轻、用量少等优点，且有降压及改善心功能的作用。盐酸阿米洛利常和氢氯噻嗪、呋塞米合用，因不经肝代谢，肝功能损害者仍可应用，其临床应用安全性较好。有研究发现阿米洛利尚有其他靶点的抑制作用，包括调节肿瘤细胞内PH值的Na+-H+交换体I (Na+-H+exchangerI，NHEI)、介导肿瘤迁移、入侵以及转移的尿激酶型纤溶酶原激活物(the urokinase-type plasminogen activator, uPA),因而具有一定的抗肿瘤作用；但其体外抗肿瘤作用的起效浓度均在几个毫摩尔的范围，是体内很难达到的浓度；因此，阿米洛利是否具有体内抗肿瘤的应用前景以及深入的机制阐述仍有待进一步研究。
[0005]迄今为止，尚未见有关联合盐酸阿米洛利与厄洛替尼药物组合用于抗胰腺癌治疗的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供阿米洛利及其衍生物的一种新的药用用途，同时为抗肿瘤药厄洛替尼提供一种增强疗效的新药物组合物以及应用；具体涉及一种抗胰腺癌用药物组合物及其应用、药盒和包装件。
[0007]本发明的抗胰腺癌药物组合物，含有作为联合制剂供同时、分开或顺序使用的治疗有效量的阿米洛利和表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)厄洛替尼(Erlotinib);该组合物含有阿米洛利和厄洛替尼，两者的摩尔比为500:1~1:50 ;
[0008]上述的药物组合物中，阿米洛利可以碱基形式或者盐的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐等；[0009]所述的药物组合物中，以阿米洛利为母核的衍生物，包括但不限于二甲基氨氯批咪(dimethyl amiloride, DMA)、5_N_ 乙基-N-异丙基阿米洛利(5-ethylisopropylamiloride, EIPA)、甲基异丁基阿米洛利(methylisobutyl amiloride, MIBA)和 5-N, N-环己烧阿米洛利(5-N, N-hexamethylene amiloride, HMA)等；
[0010]所述的药物组合物中，厄洛替尼可以碱基形式或者盐的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐等。
[0011]本发明中所述的阿米洛利和厄洛替尼的药物组合可用于制备抗胰腺癌药物；
[0012]所述阿米洛利和厄洛替尼的药物组合中，含有阿米洛利和厄洛替尼，两者的摩尔比为500:1~1:50 ;该药物组合中的阿米洛利可以碱基形式或者盐的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐等；
[0013]所述阿米洛利和厄洛替尼的药物组合中，以阿米洛利为母核的衍生物，包括但不限于二甲基氨氯吡咪(dimethyl amiloride, DMA)、5_N_乙基-N-异丙基阿米洛利(5-ethylisopropyl amiloride, EIPA)、甲基异丁基阿米洛利(methylisobutylamiloride, MIBA)和 5-N, N-环己烧阿米洛利(5-N, N-hexamethylene amiloride, HMA)等；
[0014]所述厄洛替尼可以碱基形式或者盐的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐等。
[0015]本发明还提供了一种抗胰腺癌用药盒，包括含有盐酸阿米洛利的第一药盒单元和含有厄洛替尼的第二 药盒单元；
[0016]其中，所述含有盐酸阿米洛利的第一药盒单元包括临床有效剂量的盐酸阿米洛利，所述含有厄洛替尼的第二药盒包括临床有效剂量的盐酸厄洛替尼。
[0017]本发明同时提供了一种包装抗胰腺癌药物用的包装件，包括包装空间彼此独立的含有阿米洛利的第一包装单元和含有厄洛替尼的第二包装单元；
[0018]其中，所述含有盐酸阿米洛利的第一包装单元包括临床有效剂量的盐酸阿米洛利，所述含有EGFR-TKI的第二包装单元包括临床有效剂量的盐酸厄洛替尼。
[0019]本发明中，所述的药盒或包装件中，还包括说明书，该说明书中规定，所述含有临床有效剂量盐酸阿米洛利的单元和所述含有临床有效剂量的盐酸厄洛替尼的单元，作为联合应用于抗胰腺癌治疗的制剂。
[0020]本发明进行了盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼(Erlotinib)对人胰腺癌Bxpc_3细胞的细胞毒作用试验，盐酸阿米洛利和盐酸厄洛替尼联用对细胞周期的影响试验，并采用Western Blot法检测盐酸阿米洛利联用盐酸厄洛替尼对EGFR及其下游STAT3、Akt、Erk磷酸化的影响；结果表明，所述盐酸阿米洛利和厄洛替尼联合应用，能显著增加抗胰腺癌的效果;
[0021]本发明的试验中，将盐酸阿米洛利与厄洛替尼的组合物用于人胰腺癌Bxpc-3细胞，结果显示，比单独使用厄洛替尼对细胞的抑制作用更明显；本发明所述的组合物与单用厄洛替尼达到相同抗肿瘤效果时，明显降低了厄洛替尼的使用量，其增效作用随阿米洛利的用量增加而增加；
[0022]本发明的试验结果还表明，所述盐酸阿米洛利与厄洛替尼联用，显著增加了厄洛替尼对细胞Gl期阻滞的作用；同时，盐酸阿米洛利能显著增加厄洛替尼对其靶点EGFR下游信号分子的抑制作用，包括抑制了 EGFR下游STAT3、Akt以及Erk的磷酸化水平。
[0023]本发明提供了盐酸阿米洛利的制药新用途，即作为肿瘤化疗增敏剂，和厄洛替尼联用增加其抗胰腺癌的作用，提高临床化疗的效果；所述药物组合物、药盒及包装件含有作为联合制剂供同时、分开或顺序使用的治疗有效量的阿米洛利和治疗有效量的表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)厄洛替尼(Erlotinib);该药物组合物、药盒及包装件用于治疗肿瘤时，能获得优于厄洛替尼单独使用的药效。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1显示了盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼对人胰腺癌Bxpc-3细胞的细胞毒作用，其中，细胞存活率采用MTT法测定，*，p〈0.05VS阿米洛利O组，**，p〈0.01VS阿米洛利O组；
[0025]其中，还显示了盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼对人胰腺癌PANC-1，Aspc-1和CFPAC-1细胞的细胞毒作用，其中，细胞存活率采用MTT法测定，*，p〈0.05VS阿米洛利O组，**，p〈0.01VS阿米洛利O组。
[0026]图2显示了盐酸阿米洛利和盐酸厄洛替尼联用对细胞周期的影响，其中，
[0027]*, p〈0.05VS Control 组；**, ρ〈0.01VS Control 组;#，ρ〈0.05VS Erlotinib 组，##, ρ〈0.01VS Erlotinib 组；
[0028]其中，还显示了盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼对人胰腺癌Bxpc-3, PANC-1,Aspc-1和CFPAC-1细胞的长期生长抑制作用，其中，细胞采用吉姆萨染液染色并在显微镜下计数克隆数， *，P<0.05VS对照组，**，p<0.01VS对照组，#，p<0.05VS阿米洛利组，##，p〈0.05VS阿米洛利组。
[0029]图3显示了 Western Blot法检测盐酸阿米洛利联用盐酸厄洛替尼对EGFR及其下游STAT3、Akt、Erk磷酸化的影响。
【具体实施方式】
[0030]以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。但并不意味着本发明仅限于此。
[0031]实施例1盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼(Erlotinib)对人胰腺癌Bxpc_3细胞的细胞毒作用
[0032]实验材料:
[0033]人胰腺癌Bxpc-3细胞(中科院上海细胞库)于37°C，5%C02条件下常规培养，培养基为含10%胎牛血清(Hyclone)的RPM1-1640 (Gibco)0盐酸阿米洛利标准品购自中国药品生物制品检定所，母液50mM由DMSO配制。盐酸厄洛替尼原料药由轩鸿医药(济南)提供，母液IOmM DMSO配。MTT购自Sigma (美国)。
[0034]实验方法:
[0035]1.分化良好的细胞经胰酶消化，悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为5 X IO4细胞/ml。100 μ I/孔接种于96孔培养板中，于培养箱中培养过夜。
[0036]2.次日更换培养基，10μ I/孔加入工作液，使单独用药组盐酸阿米洛利的终浓度分别为20，50，100 μ Μ(加入的系列工作液由PBS稀释，DMSO的浓度小于0.2%)，盐酸厄洛替尼的终浓度分别为3，10，30 μ Μ，联合用药组则10 μ I/孔分别加入两种药物上述浓度的工作液。空白对照组含DMS00.5%。
[0037]3.将给药后的细胞于37°C，5%C02条件下培养48小时。[0038]4.每孔加入10 μ I MTT (5mg/ml)溶液，继续在培养箱中培养4小时。
[0039]5.洗去培养基，加入100μ I DMS0，置于摇床上37°C使充分溶解，以检测波长570nm测定吸光度的值。计算细胞的生长抑制率。N=4，实验平行三次。
[0040]实验结果显示，在Bxpc-3细胞上盐酸阿米洛利增加了盐酸厄洛替尼的细胞毒作用(如图1所示)。
[0041 ] 实施例2盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼对人胰腺癌PANC-1，Aspc-1和CFPAC-1细胞的细胞毒作用
[0042]实验材料:
[0043]人胰腺癌PANC-1，Aspc-1和CFPAC-1细胞(中科院上海细胞库)于37°C，5%C02条件下常规培养，培养基为含10%胎牛血清(Hyclone)的DMEM, RPM1-1640和MDM (Gibco)0盐酸阿米洛利标准品购自中国药品生物制品检定所，母液50mM由DMSO配制。盐酸厄洛替尼原料药由轩鸿医药(济南)提供，母液IOmM DMSO配。MTT购自Sigma (美国)。
[0044]实验方法:
[0045]1.分化良好的细胞经胰酶消化，悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为5 X IO4细胞/ml。100 μ I/孔接种于96孔培养板中，于培养箱中培养过夜。
[0046]2.次日更换培养基，10μ I/孔加入工作液，使单独用药组盐酸阿米洛利的终浓度分别为20，50，100 μ Μ(加入的系列工作液由PBS稀释，DMSO的浓度小于0.2%)，盐酸厄洛替尼的终浓度分别为3，10，30 μ Μ，联合用药组则10 μ I/孔分别加入两种药物上述浓度的工作液。空白对照组含DMS00.5%。
[0047]3.将给药后的细胞于37°C，5%C02条件下培养48小时。
[0048]4.每孔加入10 μ I MTT (5mg/ml)溶液，继续在培养箱中培养4小时。
[0049]5.洗去培养基，加入100μ I DMS0，置于摇床上37°C使充分溶解，以检测波长570nm测定吸光度的值。计算细胞的生长抑制率。N=4，实验平行三次。
[0050]实验结果显示:在PANC-1, Aspc-1和CFPAC-1细胞上盐酸阿米洛利增加了盐酸厄洛替尼的细胞毒作用(如图1所示)。
[0051]实施例3盐酸阿米洛利联合盐酸厄洛替尼对人胰腺癌Bxpc-3，PANC-1, Aspc-1和CFPAC-1细胞的长期生长抑制作用
[0052]实验材料:
[0053]人胰腺癌Bxpc-3，PANC-1, Aspc-1和CFPAC-1细胞(中科院上海细胞库)于37°C，5%C02条件下常规培养,培养基为含10%胎牛血清(Hyclone)的RPM1-1640, DMEM, RPM1-1640和MDM (Gibco)0盐酸阿米洛利标准品购自中国药品生物制品检定所，母液50mM由DMSO配制。盐酸厄洛替尼原料药由轩鸿医药(济南)提供，母液IOmM DMSO配。吉姆萨染液购于
Sigma0
[0054]实验方法:
[0055]1.分化良好的细胞经胰酶消化，悬浮于常规培养基中，3000/孔接种于6孔培养板中，于培养箱中培养过夜。
[0056]2.48h后更换培养基后加药，使盐酸阿米洛利和盐酸厄洛替尼的终浓度分别为30，3 μ Mo空白对照组含DMS00.5%。
[0057]3.将给药后的细胞于37°C，5%C02条件下培养14天。[0058]4.洗去培养基，加入吉姆萨甲醇染液，拍照并在显微镜下计数克隆数。
[0059]实验结果显示，在Bxpc-3，PANC-1，Aspc-1和CFPAC-1细胞上盐酸阿米洛利增加了盐酸厄洛替尼的细胞毒作用(如图2所示)。
[0060]实施例4盐酸阿米洛利联合盐酸厄洛替尼对Bxpc-3细胞周期的影响
[0061]实验材料:
[0062]碘化丙唳(propidum iodide, PI)、RNase酶购自Sigma。其余材料同实施例1。
[0063]实验方法:
[0064]1.分化良好的细胞经胰酶消化，悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为2 X IO5细胞/ml。2.5mL/孔接种于6孔培养板中，于培养箱中培养过夜。
[0065]2.48h后更换含药培养基，使单独用药组盐酸阿米洛利的终浓度为20 μ Μ，盐酸厄洛替尼的终浓度为3μΜ，联合用药组含有上述两种相同终浓度的药物。空白对照组含DMS00.7%ο
[0066]3.将给药后的细胞于37°C，5%C02条件下培养24h。
[0067]4.消化收集细胞，冰PBS洗一遍，加入含PI和RNase酶的溶液300 μ I/孔，避光孵育30min后流式细胞仪检测。
[0068]实验结果显示，在Bxpc-3细胞上盐酸阿米洛利增加了盐酸厄洛替尼对肿瘤细胞的长期抑制作用(Gl期阻滞作用)。
[0069]实施例5盐酸阿米洛利联用盐酸厄洛替尼对EGFR及其下游信号分子磷酸化的影响实验材料:
[0070]RIPA裂解液、PMSF购自碧云天生物生物技术研究所(江苏)。Protease InhibitorCocktail购自Merck公司(德国)。其余材料同实施例1。
[0071]实验方法:
[0072]1.细胞培养及给药
[0073]分化良好的细胞经胰酶消化，悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为5 X IO3细胞/孔接种于6孔培养板中。
[0074]培养48h后加入含药培养基，使盐酸阿米洛利的终浓度为20 μ Μ，盐酸厄洛替尼的终浓度为3 μ Μ，空白对照组含DMS00.3%。
[0075]将给药后的细胞于37°C，5%C02条件下培养24小时。
[0076]2.蛋白提取:
[0077]临用前将PMSF (IOOmM, 1:100)及 Protease Inhibitor Cocktail Set III (1:200)加入RIPA裂解液；
[0078]6孔板培养的细胞倒去培养基后，用PBS清洗一遍，加入150 μ I裂解液冰浴裂解20min ；
[0079]裂解后转移至EP管中，9000g离心5min ；
[0080]吸取上清进行定量 ，同时取部分上清,加入1/4体积的上样缓冲液(5X )，90_95°C煮 8min ；
[0081]变性后的蛋白保存于_80°C冰箱中。
[0082]3.Western Blot 检测 P-EGFR、p_STAT3、P-Akt、P-Erk 的表达
[0083]上样量:BCA蛋白定量药盒对各组提取的蛋白样品进行定量，校正后蛋白样品上样量为60 μ g ;
[0084]电泳方法:60V恒压电泳50分钟进行样品的浓缩；120V电泳I小时进行样品的分离，根据marker判断电泳程度；
[0085]转膜:采用湿转，200mA,横流转膜2小时；
[0086]抗体杂交:首先用5%的BSA (封闭液)在37°C摇床上封闭I小时；用封闭液将一抗按说明书稀释，将转好的膜在杂交袋中4°C杂交过夜；TBST洗膜四次(37°C摇床，每次5mL，5min);用封闭液将二抗稀释，在杂交袋中37°C摇床杂交I小时；TBST洗膜四次后进行化学发光检测；
[0087]化学发光检测:采用增强型化学发光法(ECL法)进行目的蛋白的检测。
[0088]实验结果:
[0089]选取代表性的实验结果如图3。结果显示，在Bxpc-3细胞上盐酸阿米洛利增加了盐酸厄洛替尼对 P-STAT3、p-Akt以及p-Erk的抑制作用。
【权利要求】
1.一种抗胰腺癌药物组合物，其特征在于，含有作为联合制剂供同时、分开或顺序使用的治疗有效量的阿米洛利和表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼。
2.根据权利要求1所述的抗胰腺癌药物组合物，其特征在于，其中的阿米洛利和厄洛替尼，两者的摩尔比为500:1~1:50。
3.根据权利要求1或2所述的抗胰腺癌药物组合物，其特征在于，所述阿米洛利以碱基形式或者盐的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐。
4.根据权利要求1或2所述的抗胰腺癌药物组合物，其特征在于，所述的以阿米洛利为母核的衍生物，包括但不限于二甲基氨氯吡咪、5-N-乙基-N-异丙基阿米洛利、甲基异丁基阿米洛利和5-N，N-环己烷阿米洛利。
5.根据权利要求1或2所述的抗胰腺癌药物组合物，其特征在于，所述的厄洛替尼以碱基形式或者盐的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐。
6.阿米洛利和厄洛替尼的药物组合在制备抗胰腺癌药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述阿米洛利和厄洛替尼的药物组合中，含有阿米洛利和厄洛替尼，两者的摩尔比为500:1~1:50。
8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述阿米洛利以碱基形式或者盐的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐。
9.根据权利要 求6或7所述的用途，其特征在于，所述阿米洛利和厄洛替尼的药物组合中，以阿米洛利为母核的衍生物，包括但不限于二甲基氨氯吡咪、5-N-乙基-N-异丙基阿米洛利、甲基异丁基阿米洛利和5-N，N-环己烷阿米洛利。
10.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述的厄洛替尼以碱基形式或者盐的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐。
11.一种抗胰腺癌用药盒，包括含有盐酸阿米洛利的第一药盒单元和含有厄洛替尼的第二药盒单元。
12.根据权利要求11所述的药盒，其特征在于，所述含有盐酸阿米洛利的第一药盒单元包括临床有效剂量的盐酸阿米洛利，所述含有厄洛替尼的第二药盒包括临床有效剂量的盐酸厄洛替尼。
13.—种包装抗胰腺癌药物用的包装件，包括包装空间彼此独立的含有阿米洛利的第一包装单元和含有厄洛替尼的第二包装单元。
14.根据权利要求13所述的包装件，其特征在于，所述含有盐酸阿米洛利的第一包装单元包括临床有效剂量的盐酸阿米洛利，所述含有EGFR-TKI的第二包装单元包括临床有效剂量的盐酸厄洛替尼。
15.根据权利要求11-12中任一项所述的药盒或权利要求13-14中任一项所述的包装件，其特征在于，还包括说明书，该说明书中规定，所述含有临床有效剂量盐酸阿米洛利的单元和所述含有临床有效剂量的盐酸厄洛替尼的单元，作为联合应用于抗胰腺癌治疗的制剂。
【文档编号】A61P35/00GK103933046SQ201310753515
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年1月22日
【发明者】郑媛婷, 蔡卫民, 李涛, 邵腾飞 申请人:复旦大学