动脉硬化预防或治疗用药剂学组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供动脉硬化预防或治疗用药剂学组合物，上述动脉硬化预防或治疗用药剂学组合物包含：(a)药剂学有效量的由SEQ?ID?NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质；以及(b)药剂学上接受的载体。本发明的组合物不对肝和肾脏产生毒性，并有效减少粥样斑块的形成，从而发挥对动脉硬化治疗有效的功效。
【专利说明】动脉硬化预防或治疗用药剂学组合物
【【技术领域】】
[0001]本发明是在韩国知识经济部的支援下根据项目编号10037336而进行的，上述项目的研究管理专业机构为韩国产业技术评价管理院，研究项目名为“知识经济技术革新项目-产业源泉技术开发项目”，研究项目名为“糖尿病性视网膜病变治疗剂开发”，主管机关为爱吉恩(EYEGENE)公司，研究期间为2010年06月01日?2015年03月31日。
[0002]本专利申请针对2012年03月12日向韩国专利厅提出的韩国特许申请第10-2012-0024903号主张优先权，上述专利申请的公开事项插入于本说明书作为参照。
[0003]本发明涉及动脉硬化预防或治疗用药剂学组合物。
【【背景技术】】
[0004]最近，随着生活方式西方化，心绞痛、间歇性跛行、心肌梗死、脑梗死等动脉硬化性疾病的发病率与癌症一同逐渐增加。这些疾病一旦发生，就非常难以治愈，并明显降低生活质量，因而用于预防这种问题或者调节疾病的病情进展的对策在社会上也极其重要。
[0005]动脉硬化是脂肪经过长时间堆积在血管壁，使得血管壁变厚的疾病。主要为高脂血症，尤其高胆固醇血症为主要危险因子，且已知高血压及糖尿病等也是危险因子。最近，随着西方化的饮食及人口老龄化，动脉硬化的发病及与其相关的脑心血管疾病大大增加。察看动脉硬化的发展过程可知，由于脂质过氧化、高血压和快的血流等，组成血管内面的血管内皮细胞优先受损，脂肪逐渐堆积在血管壁，进行巨噬细胞及T细胞等的浸润和炎症反应，且血管平滑肌细胞的增殖使血管壁变厚。其结果，血管变窄，导致血液流动不顺畅。在心脏的冠状动脉变窄的情况下，由于过度运动等，向心脏供给的血液量不足，从而出现感到疼痛的心绞痛的症状。另一方面，在变厚的血管壁(动脉粥样硬化斑块)内通过巨噬细胞来生成的蛋白酶活性旺盛的情况下，覆盖斑块的一部分组织将破碎。此时，斑块内的脂肪及周边蛋白质等出来，并进入血管内，从而形成血栓，并经常堵住心脏的冠状动脉或脑血管等，从而引起心肌梗死或脑卒中。
[0006]本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的【技术领域】的水平及本发明的内容。
【
【发明内容】
】
[0007]【发明要解决的技术课题】
[0008]本发明人为了开发对动脉硬化具有预防或治疗活性的物质而锐意研究努力。其结果，发现了由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质对动脉硬化具有改善效果的事实，从而完成了本发明。
[0009]因此，本发明的目的在于，提供动脉硬化预防或治疗用药剂学组合物。
[0010]本发明的再一目的在于，提供动脉硬化预防或治疗方法。
[0011]本发明的其他目的及优点能够根据以下
【发明内容】
、发明要求保护范围及附图变得更加明确。
[0012]【解决课题的技术方案】
[0013]根据本发明的一实施方式，本发明提供动脉硬化预防或治疗用药剂学组合物，上述动脉硬化预防或治疗用药剂学组合物包含:(a)药剂学有效量的由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质；以及(b)药剂学上接受的载体。
[0014]根据本发明的一实施方式，本发明提供动脉硬化预防或治疗方法，上述动脉硬化预防或治疗方法包括将组合物给药到对象(subject)的步骤；上述组合物包含:(a)药剂学有效量的由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质，以及(b)药剂学上接受的载体。
[0015]本发明人为了开发对动脉硬化具有预防或治疗活性的物质而锐意研究努力。其结果，发现了由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质对动脉硬化具有改善效果的事实。
[0016]本发明的药剂学组合物包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质作为有效成分。本发明的蛋白质其本身呈现稳定性，但能够使氨基酸残基发生变形来更加提高稳定性。例如，SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的至少一个氨基酸与乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蘧基、硬脂酰基或聚乙二醇(PEG, polyethylene glycol)保护基相结合。
[0017]在本发明中利用的包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质在具有可治疗动脉硬化的能力的范围内不局限于本发明的序列表中所记载的氨基酸序列，这对于本发明所属【技术领域】的普通技术人员来说是显而易见的。
[0018]例如，在使SEQ ID NO:1的氨基酸序列发生变化的突变的情况下，也能够获得呈现与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质几乎相同的活性的蛋白质。
[0019]在本发明中利用的可包含在蛋白质的生物学功能等同物限定于发挥与SEQ IDNO:1的氨基酸序列的蛋白质等同的生物学活性的氨基酸序列的突变，这对于本发明所属【技术领域】的普通技术人员来说是显而易见的。
[0020]这种氨基酸突变基于氨基酸侧链取代体的相对类似性，例如疏水性、亲水性、电荷、大小等而发生。根据氨基酸侧链取代体的大小、形状及种类的分析结果可知，精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带有阳电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有类似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有类似的形状。因此，基于这种考虑事项，可视为精氨酸、赖氨酸和组氨酸，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸在生物学上是功能等同物。
[0021]在导入突变的过程中，可考虑氨基酸的疏水性指数(hydropathic idex)。各个氨基酸根据疏水性和电荷被赋予疏水性指数:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);蛋氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);以及精氨酸(-4.5)。
[0022]在赋予蛋白质的相对生物学功能(interactive b1logical funct1n)的过程中，疏水性氨基酸指数非常重要。用具有类似的疏水性指数的氨基酸取代才可以保有类似的生物学活性，这一点是公知的事实。在参照疏水性指数导入突变的情况下，在呈现优选为±2以内、更优选为±1以内、尤其优选为±0.5以内的疏水性指数差异的氨基酸之间进行取代。
[0023]另一方面，具有类似的亲水性值(hydrophilicity value)的氨基酸之间的取代引起具有等同的生物学活性的蛋白质，这也是熟知的。如美国专利第4554101号中所公开，以下的亲水性值被赋予在各个氨基酸残基:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0 + 1);谷氨酸(+3.0 + 1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸
(O);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5 + 1);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。
[0024]在参照亲水性值导入突变的情况下，在呈现优选为±2以内、更优选为±1以内、尤其优选为±0.5以内的亲水性值差异的氨基酸之间进行取代。
[0025]不整体上变更分子的活性的蛋白质中的氨基酸交换公知在该领域中OLNeurath，R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。最通常发生的交换为氛基酸残基 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/IIe、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly 之间的交换。
[0026]若考虑如上所述的具有生物学等同活性的突变，则解释为SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质也包含与序列表中所记载的序列呈现实质等同性(substantial identity)的序列。如上所述的实质等同性以使得如上所述的本发明的序列与任意其他序列最大限度地相对应的方式进行排比，在通过该领域中通常利用的算法来分析排比的序列的情况下，意味着表示最小61%的同源性、更优选为70%的同源性、尤其优选为80%的同源性、最优选为90%的同源性的序列。用于序列比较的排比方法公知在该领域中。对于排比的各种方法及算法公开在 Smith and Waterman, Adv。Appl? Math。2:482(1981) ；Needlemanand Wunsch,J。 Mol0 B1。 48:443(1970) ；Pearson and Lipman,Methods in Mol0 B1l。24:307-31 (1988) ；Higgins and Sharp, Gene 73:237-44 (1988) ；Higgins and Sharp,CAB1S 5:151-3(1989) ；Corpet et al.，Nuc。Acids Res。16:10881-90 (1988) ；Huanget al., Comp。Appl。B1Sci。8:155-65(1992)and Pearson et al., Meth。Mol。B1l。24:307-31(1994)oNCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al.，J0 Mol。B1l。215:403-10(1990))可在国家中心生物信息(NBCI, Nat1nal Center forB1logical Informat1n)等访问，可在互联网上与 blastp、blasm、blastx、tblastn 及tblastx 等序列分析程序联动地利用。BLSAT 可在 http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/访问。利用该程序的序列同源性比较方法可在http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html 石角认。
[0027]本发明的组合物对动脉硬化具有预防或治疗功效。
[0028]在本说明书中使用的术语“动脉硬化”指动脉弹力下降，且脂肪质、纤维组织、血栓等堆积在动脉壁而使血管壁变窄或被堵住的现象，若脑血管发生动脉硬化，则发生脑卒中，若心脏发生动脉硬化，则发生心肌梗死症、心绞痛，若动脉完全被堵住，则发生被堵住的动脉供给血液的身体各部位死亡的坏死，这是一种致命的疾病。
[0029]根据本发明的优选实例，本发明的动脉硬化是动脉粥样硬化(athe1scle1sis)、中皮层I丐化硬化(medialcalcific sclerosis)或小动脉硬化(arter1losclerosis),优选为动脉粥样硬化或中皮层钙化硬化，更优选为动脉粥样硬化。
[0030]根据本发明的优选实例，动脉硬化是发生在载脂蛋白E基因存在缺陷的患者上的动脉硬化。[0031 ] 根据本发明的优选实例，本发明的组合物在动脉硬化动物模型中减少粥样斑块的形成。粥样斑块形成的减少量优选为10?80%，更优选为20?70%，尤其优选为30?60%。
[0032]在本发明的组合物由药剂学组合物制备的情况下，本发明的药剂学组合物包含药剂学上接受的载体。包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体通常用于制剂，上述载体包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、轻基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸续及矿物油等，但并不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外，还可包含润滑齐?、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。适合的药剂学上接受的载体及制剂详细记载于 Remington’s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)中。
[0033]本发明的药剂学组合物可采用口服或肠胃外给药方式，优选地，以口服给药方式适用。
[0034]本发明药剂学组合物的适合的给药量可根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性等因素多样地开处方。以成人为基准，本发明药剂学组合物的优选给药量在0.0001?100mg/kg范围内。
[0035]本发明的药剂学组合物能够根据本发明所属【技术领域】的普通技术人员可容易实施的方法利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，由此以单位容量形态制备，或者放入大容量容器内来制备。此时，剂型也可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或乳化液形态、或者浸膏剂、散剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可包含分散剂或稳定剂。
[0036]【发明效果】
[0037]归纳本发明的特征及优点如下。
[0038](i)本发明提供包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质的动脉硬化预防或治疗用药剂学组合物。
[0039](ii)本发明的组合物不对肝和肾脏产生毒性，并有效减少粥样斑块的形成，从而发挥对动脉硬化治疗有效的功效。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0040]图1为表示在ApoE-KO小鼠中随着由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质给药而发生的大动脉病变变化的病理学分析结果的图。
[0041]图2为表示在ApoE-KO小鼠中随着由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质给药而发生的粥样斑块面积变化的定量分析结果的图。
[0042]图3为表示在ApoE-KO小鼠中基于由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质给药的肝组织的病理学分析结果的图。
[0043]图4为表示在ApoE-KO小鼠中基于由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质给药的肾脏组织的病理学分析结果的图。
【【具体实施方式】】
[0044]以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例仅用于更加具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不受这些实施例的限制，这对于本发明所属【技术领域】的普通技术人员来说是显而易见的。
[0045]【实施例】
[0046]【实验材料及方法】
[0047]【试验物质的制备】
[0048]向由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质粉放入Iml的蒸馏水并完全溶解，从而制备了 lmg/ml的母液(stock)。为了制备100 μ g/kg的样品，以50倍的方式稀释(A)了母液(添加(共5ml)磷酸盐缓冲液(PBS)4.9ml+试验物质母液0.1ml)。之后，针对每Ig体重的小鼠给药了 5μ1。为了制备10 μ g/kg的样品，以10倍的方式稀释了(A)(添加(共5ml)磷酸盐缓冲液4.5ml+试验物质0.5ml)。之后,针对每Ig体重的小鼠给药了 5 μ I。
[0049]【试验动物】
[0050]作为利用于试验的小鼠(C57BL/6.KOR/Stm Slc-Apoesh1)，从中央实验动物(韩国)购入6周龄雄性36只(体重20?25g)，用一周的时间饲养并环境驯化之后，利用于实验。在温度为22±2°C、湿度为50±10%、通风次数为10?20次/时间、明暗周期为12小时、光照度为150?300Lux的条件下，在每个笼子放入3只小鼠并进行饲养。实验根据动物保护法(制定1991年5月31日法律第4379号、部分修改2008年2月29日法律第8852号)规定实施。
[0051]【评价动物的试验组结构】
[0052]试验组的结构如表I。
[0053]【表I】
[0054]试验组结构
[0055]
组处理组个体数
N.Con 鱗酸盐缓冲液正常饮食6
\.Con__礴酸盐笔冲液6
EGT-l7 EGT022^g/kg 动脉硬化诱发饮食12
EGT-H EGT022 lOOpg/kg12
[0056]【按评价动物的不同组的评价方法】
[0057]为了评价动脉硬化模型，购入了最频繁利用的C57BL/6.KOR/Stm Slc-Apoesh1,并经过一周的驯化期间之后，以随机的方式编制成共4组。作为饲料，以一般啮齿目饮食(Diet)和动脉硬化诱发饮食(Piagen D12336)的方式实现自由饮食。一周一次测定动物的体重，并三周一次从眼眶静脉进行采血。以动脉硬化诱发饮食进行12周的饮食，并在引起动脉硬化之后，以10 μ g/kg和100 μ g/kg浓度且以I次100 μ I容量通过皮下注射方式将由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质给药到背部。
[0058]【动脉硬化部位的组织病理学分析】
[0059]在经过一周的由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质给药之后，使动物牺牲，采集血液，并切除了从心脏及升主动脉到胸部大动脉，从而固定于10%中性福尔马林。在使心脏硬化在20%蔗糖溶液之后进行切割，从而包埋在OCT化合物，并利用冰冻切片机来以ΙΟμπι的厚度切割大动脉弓，来制作了载玻片。并且，为了评价形成于大动脉弓的粥样斑块，利用油红O染色来对脂肪成分进行染色，从而测定粥样斑块的面积，由此确认了基于对象药物的疾病是否发生变化。利用图像测量软件(LAS 3.8，徕卡微系统框架(LeicaMicrosystem Framework),美国(USA))来测定面积，并与对照组进行了比较。在将切除的肝组织固定于10%中性福尔马林之后，实施了常规的组织处理过程，并以4μπι的厚度对石蜡包埋的组织进行切片之后，实施苏木精-伊红染色，并利用光学显微镜来进行观察。
[0060]【评价统计分析】
[0061]所有结果用标准偏差来表示，对于获得的资料的统计分析利用多重比较检验法来实施。针对平均值，利用巴特利特检验(Bartlett Test)来检查均质性，在具有均质性的情况下，为了检查赋形剂对照组和给药组之间是否存在差异，实施了作为多重比较法的邓尼特检验(Dunnett Test)。根据巴特利特检验结果，若没有认定均质性，则实施作为利用排名的数据的非参数方法的克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal Wallis Test),在p< 0.05的情况下，利用邓尼特检验来调查了组之间的显著差。这种分析利用作为统计程序的GraphPadInStat (vers1n 3.05, GraphPad Software Inc.)来实施。检验的危险率定为 5%及 I %。
[0062]【实验结果】
[0063]【对于形成于大动脉弓的粥样斑块的组织病理学观察】
[0064]为了评价对于向ApoE-KO小鼠供给12周的高胆固醇饮食来引起的动脉粥样硬化的由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质的效果，执行了对于大动脉弓的油红O染色。其结果，在正常对照组中，观察不到血管内的任何病变，而在供给高胆固醇饮食的对照组(V.Con)中，清楚地观察到血管内皮被沉着，从而形成了因油红O阳性反应而被染红的粥样斑块。相反，观察到了通过作为试验物质的由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质的给药，与对照组相比，明显减少了粥样斑块的形成。观察到了由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质10μ g/kg给药组(EGT-L)和100μ g/kg给药组(EGT-H)与对照组相比，有效减少了粥样斑块的厚度及面积(图1)。在利用对于这种粥样斑块的面积相关图像分析程序的分析中，也观察到了 EGT-L组与对照组相比，减少了约57%左右的粥样斑块的形成，EGT-H组也与对照组相比，减少了约30%左右的病灶(图2)。
[0065]【用于评价对于由SEQID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质给药的安全性的对于肝和肾脏的组织病理学观察】
[0066]实施由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质的安全性及毒性评价，其结果，在对于肝和肾脏的组织病理学观察中，在供给高胆固醇饮食的对照组中，在中心静脉周围呈现了轻微的脂肪变性(microvacoular change)。但是,观察到作为试验物质的由SEQ IDNO:1的氨基酸序列组成的蛋白质给药对于肝没有引起任何毒性变化(图3)，肾脏也在所有试验组中呈现正常(图4)。
[0067]【考察】
[0068]在供给高胆固醇饮食的ApoE-KO小鼠中，根据针对动脉硬化由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质给药产生的影响评价结果，观察到在?ο μ g/kg的低浓度(EGT-L)和100 μ g/kg的高浓度(EGT-H)给药组中，均明显减少了粥样斑块病灶。观察到EGT-L给药组减少了约57%，EGT-H给药组减少了 30%左右，从而与对照组相比，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质给药抑制粥样斑块的形成。另一方面，观察到由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质给药在低浓度和高浓度条件下均不对肝和肾脏等脏器产生任何毒作用。
[0069]以上，详细记述了本发明的特定部分，对于本发明所属【技术领域】的普通技术人员来说，这些具体记述内容仅属于优选实例，能够明确的是，本发明的范围并不局限于此。因此，本发明的实质性范围根据所附的发明要求保护范围及与其等同的技术方案来定义。
[0070]【参考文献】
[0071]Nakashima, Y.，A.S.Plump, et al.〃ApoE-deficient mice develop les1ns ofall phases of atherosclerosis throughout the arterial tree.^Arter1scler Thromb1994。 14(1):133-40o
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[0074]Yamakawa, T.，K0 Ogihara，et al."Effect of dehydroepiandrosterone onatherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.〃J Atheroscler Thromb 2009。16(4):501-8o
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【权利要求】
1.一种动脉硬化预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，包含: (a)药剂学有效量的由SEQID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质；以及 (b)药剂学上接受的载体。
2.权利要求1的组合物，其中所述动脉硬化是动脉粥样硬化、中皮层钙化硬化或小动脉硬化。
3.权利要求1的组合物，其中所述动脉硬化是动脉粥样硬化。
4.权利要求1的组合物，其中所述动脉硬化是发生在载脂蛋白E基因存在缺陷的患者上的动脉硬化。
5.一种动脉硬化预防或治疗方法，其特征在于， 包括将组合物给药到对象的步骤； 上述组合物包含: (a)药剂学有效量的由SEQID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质，以及 (b)药剂学上接受的载体。
6.根据权利要求5所述的动脉硬化预防或治疗方法，其中所述动脉硬化是动脉粥样硬化、中皮层钙化硬化或小动脉硬化。
7.根据权利要求5所述的动脉硬化预防或治疗方法，其中所述动脉硬化是动脉粥样硬化。
8.根据权利要求5所述的动脉硬化预防或治疗方法，其中所述动脉硬化是发生在载脂蛋白E基因存在缺陷的患者上的动脉硬化。
【文档编号】A61K38/16GK104168909SQ201380013748
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年3月11日 优先权日:2012年3月12日
【发明者】赵良济, 张镇旭, 林亨骏 申请人:艾金株式会社