包含作为活性成分的蓝靛果忍冬的果实提取物用于预防或改善缺血性脑血管病的药物组 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种药物组合物，其包含作为活性成分的蓝靛果忍冬果实提取物，所述药物组合物用于预防或治疗缺血性脑血管病。根据本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物具有保护神经细胞的作用，从而显著地减少缺血性脑血管病所致的神经行为损伤和梗死体积。因此，根据本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物可以提供作为用于预防或治疗缺血性脑血管病的药物组合物，以及可以提供作为用于预防或治疗缺血性脑血管病的保健食品。
【专利说明】包含作为活性成分的蓝靛果忍冬的果实提取物用于预防或 改善缺血性脑血管病的药物组合物或保健食品
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物组合物或保健食品，其包含作为活性成分蓝靛果忍冬（S3 0I)的果实提取物，该药物组合物或保健食品用于预防和治疗缺血性脑血管病。
【背景技术】
[0002] 据世界卫生组织估计，每年1700万人死于血管疾病，并且血管疾病是死亡的第一 大原因，占总死亡人数的三分之一。在美国，65岁或更大的成人中血管疾病位列死亡的第一 大原因，且在45岁到64岁的成人中是紧随癌症之后的死亡的第二大原因。随着老龄化人 口的不断增长，因血管疾病的死亡的人数预计将增加。在韩国，癌症是死亡的第一大原因， 随后依次为脑血管病和心脏疾病。近期被列为死亡的第二个和第三个原因的血液循环系统 疾病的患者人数，相对于20世纪80年代初，迅速增长到7倍。
[0003] 中风通常被称为"脑血管意外"，且指的是局灶性神经功能缺损，如意识丧失，偏 瘫，构音障碍，其是因脑血管阻塞或破裂的影响，任何脑部供血突然中断。中风大致分为缺 血性中风和出血性中风。缺血性中风是由于脑组织供血的减少或中断导致脑组织缺血引起 的，而出血性中风是由于血管破裂导致在脑组织中出血引起的。换言之，根据原因，中风被 分成脑血管阻塞引起的脑梗死和脑血管破裂引起的脑出血，并且脑出血进一步分为脑内出 血和由于脑血管的气球状变形所致的脑动脉瘤破裂引起的蛛网膜下腔出血（SAH)。进一步 地，脑梗死分为脑血栓（由于脑血管内血块的形成所致的血管的梗阻）和脑栓塞（由于心 脏疾病所致血栓或血块的移动到脑，引起的脑动脉的阻塞）。因为中风可以发生在脑的任何 部位，它可能引起全部身体功能损害。进一步地，产生的脑损伤是由严重程度和损伤自身的 位置所决定的，而由于中风所致的严重的脑损伤引起的运动和感觉障碍，并能抑制较高级 的功能，例如记忆，学习，计算和推理等，并且还造成如中风，弱智，学习障碍，癫痫等的严重 后果。甚至在中风恢复后，在大部分情况下相关的后遗症仍然存在，从而造成每年多达70 亿美元的社会和经济损失（Davenport等人，JournalofNeurology, 2000,第68卷，第277 页）。
[0004] 缺血性脑损伤取决于血液循环。当脑部供血血管中的一些病理情况引起正常的脑 血流障碍（50毫升/克/分钟）时，短暂性脑缺血迅速发展成完全性中风，导致死亡。因为 缺血性中风发生突然，伴随有神经障碍，并在短时间内进一步发展，即使有紧急溶栓治疗， 也不可能完全治疗。即使其可能不会导致立即死亡，其副作用和后遗症依然严重，直接或间 接地造成社会和经济损失。因此，其预防是非常重要的。
[0005] 缺血性中风的预防分为的初级预防和次级预防，初级预防用于去除引起血流变化 的危险因素，如血清胆固醇水平上升、高血压、心脏疾病等；而次级预防用于预防缺血性中 风发作后进一步恶化。以往关于食品能够预防缺血性中风的研究，集中于降低因特定危险 因素所致的伤害。特别地，当脑供血减少引起的大脑缺血发生时，谷氨酸介导的钙离子通道 的开放导致Ca离子过量内流从而引起兴奋性中毒，或通过再灌注产生的氧自由基在神经 细胞中破坏酶组（芟仝λ有关的神经元损伤机制的特定目标的研究依然不尽如人意，需要 在相关研究中取得进一步进展（HagbergH等人，NeurosciLett. 78 :311-317,1987)。
[0006] 近年来，国际研究报道食品成分，如肌肽、鞣花酸衍生物、胡萝卜素衍生物、S-半胱 氨酰衍生物影响缺血性脑损伤的初级和次级预防。作为用于中风的治疗剂，已研制了用于 预防初级（急性）脑损伤的谷氨酸受体阻断剂，以及使用抗氧化剂的治疗剂。然而，由于在 临床试验中观察到的缺少疗效或毒性问题，这些研究还未成功。因为严重的毒性反应，NMDA 受体拮抗剂还未被使用，且其中大部分未能通过临床试验。
[0007] 在国内外还没有足够的特定目标的研究以阐明食物成分和神经元损伤的机制之 间的关系。此外，也有少数成功案例已在动物的大脑内证实食品成分的作用，并由此成功地 开发成产品。事实上，在韩国大多数研究已在进行了实验性水平的试验，而还未很好的进行 更复杂的研究，例如功能性材料、基于体内的生理活动的机理、用于材料改性的平台技术。
[0008] 目前在韩国可用的大部分功能材料是简单的复合型，而一些功能性食品由于暴露 于氧气中所致的氧化和褐变而具有低的有效性，并且作为食品原料它们还具有低品级的外 观。因此，需要发展能够通过涂布形成阻隔膜，以确保贮存稳定性并保持活性成分活性的基 础技术，以及能够应用活性材料于合适的食物载体以增加可用性的加工工艺。但是，所作的 努力尚未成功。
[0009] 迄今为止，大多数已开发的这样的药物是谷氨酸受体拮抗剂，抗氧化剂，钙或钠离 子通道阻断剂等，而有效的药物尚未研制出来。因此，有必要采用突破性的理念和新的概念 以完成特异性目标药物的发现。
[0010] 同时，据报道，炎症反应发生在中枢神经系统中，由此成为神经元变性的主要原因 之一。因此，在脑缺血性中风发生之后出现炎症反应将成为用于中风的新治疗剂的发展目 标。此类治疗剂，预期包含的药物抑制参与分离细胞毒性物质的酶活性，或抑制嗜中性粒细 胞的沉积（Dirnagl,U.等人；TINS.，22,pp391-397, 1999)。
[0011] Hewett等人发现，激活的神经胶质细胞可能影响神经细胞死亡（Hewett,S.J.等 人：Neuron, 13 :487-494，1994，Hewett，S.J.等人，Stroke, 27:1586-15911996)。激活的神 经胶质细胞增加炎性因子、可引起细胞毒性的细胞因子（如肿瘤坏死因子-α，白细胞介 素）的产生，从而增加对神经细胞和神经胶质细胞的细胞毒性。
[0012] 巨噬细胞和小神经胶质细胞分泌的炎症分子，以及神经细胞的死亡是重要的，并 且特别地，神经胶质细胞活化的控制和保护神经细胞是用于中风的预防和控制以及治疗发 展的主要目标。
[0013] 开发为使用植物用于特殊目的新的作物的努力使它们的年产量增加，但是，作通 过简单的工艺，如用油提取工艺而作为一般的添加剂，或以提取物形式加入到东方药物中 的利用率是低的。但是，因为植物是非常有望包含对缺血性中风显示预防活性的活性物质， 并且在东方药物中，在传统上几种植物一直用于中风的预防，植物作为保健食品原料的开 发有望显示植物的附加值。因此，需要系统的方法来开发的功能保健食品，其是通过发展能 够从国内植物中筛选用于预防缺血性中风的食品原料，在动物实验中研究它们的疗效，然 后将它们应用于功能性食品的技术。
[0014] 蓝靛果忍冬是属于忍冬科茜草目的双子叶植物。其是长至1.5米高的落叶灌木， 分枝密集，并且在树枝的节点具有盾状苞片。分枝的内部部分是白色的。叶子是对生的，矛 形或椭圆形，钝的或尖的端部，边缘缺齿，在边缘和表面具有短毛，并在底面有许多茸毛。花 通常有短梗，从叶腋处长出，有漏斗形乳白色的花冠，夏季开花。每个花萼有五片有齿萼片。 在花冠是黄白色，圆柱形钟状，长1. 2-1. 5厘米，并有些许毛。雄蕊比花柱短并且无毛，并且 两个子房融为一体。果实为椭圆形或近圆形，在七月和十月之间成熟至紫黑色，并覆盖着白 粉。这种灌木是北极植物，广泛分布于西伯利亚，库页岛，中国北部地区，西藏，朝鲜等。
[0015] 目前，作为涉及蓝靛果忍冬提取物应用的发明，韩国专利第10-0699790号公开了 一种含有蓝靛果忍冬提取物的药物组合物，用于肝脏疾病的预防和治疗，其中所述组合物 表现出对肝癌、肝硬化和脂肪肝的预防和治疗效果，而韩国专利第10-0454150号公开了一 种抗刺激的化妆品组合物，以所述组合物的总重量计，包括0. 001重量％ -10重量％的一种 或多种草本植物提取物，其选自鬯查，、徐长卿（扮翻玛）和蓝靛果忍冬，其可用于预防 瘙痒，存在较少的如皮疹或皮肤过敏的副作用。然而，还没有关于使用蓝靛果忍冬的果实提 取物用于缺血性脑血管病的发明。
[0016] 因此，本发明人开发了可用于缺血性脑病预防或治疗的物质，并发现蓝靛果忍冬 的果实提取物抑制神经行为障碍，并减少脑梗死体积，由此其可以用作缺血性脑病的预防 或治疗剂的活性成分，从而完成本发明。
【发明内容】
[0017] 本发明的一个目的是提供一种药物组合物，其包含作为活性成分的蓝靛果忍冬的 果实提取物，该药物组合物用于预防或治疗缺血性脑血管病。
[0018] 本发明的另一个目的是提供一种保健食品，其包含作为活性成分的蓝靛果忍冬的 果实提取物，所述保健食品用于预防或改善缺血性脑血管病。
[0019] 本发明的又一个目的是提供用于治疗缺血性脑血管病的方法，包括向受试者施用 药学上有效量的蓝靛果忍冬的果实提取物的步骤。
[0020] 本发明的再一个目的是提供一种用于保护神经细胞免受氧化应激的方法，包括向 受试者施用药学上有效量的蓝靛果忍冬的果实提取物的步骤。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1是显示通过阻塞大鼠大脑中动脉的基底诱发脑缺血90分钟后进行24小时 的神经行为分数的图，其中盐水表示对照组，而SH-1013表示本发明蓝靛果忍冬的果实提 取物（〇,无神经行为障碍（正常）；1，当通过尾巴将大鼠完全抬起时，左前肢无法伸展（轻 度）；2,向病变的对侧转圈（中度）；3,休息时倒向病变对侧或无自主运动（重度））；
[0022] 图2是显示本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物对MCAO(大脑中动脉闭塞）的梗死 体积的影响的图；
[0023] 图3是典型的TTC染色组织图像，其显示本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物对 MCAO(大脑中动脉阻塞）的梗死体积的影响，其中对应于每个实验组，从额极的4mm到16mm 范围内切割颅顶制得6个截面（2mm厚）；以及
[0024] 图4是典型的甲酚紫染色组织图像，显示了本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物对 MCAO(大脑中动脉阻塞）的神经细胞损伤的影响，其中，从各实验组的大脑皮层和纹状体观 察甲酚紫染色的椎体形神经细胞。
【具体实施方式】
[0025] 在下文中，将详细描述本发明。
[0026] 实现上述目的一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含作为活性成分的蓝靛 果忍冬的果实提取物，该组合物用于缺血性脑血管病的预防和治疗。
[0027] 如本文使用的，术语"蓝靛果忍冬"是指所有的器官，例如，天然的，杂交的或变异 类型的蓝靛果忍冬的根、枝条、茎、叶、花和果实，但优选表示蓝靛果忍冬的果实。
[0028] 如本文使用的，术语"缺血性脑血管病"统指任何理由所致脑血管阻塞且脑部供血 中断时发生的疾病，并且也被称为缺血性脑病。缺血性脑血管病是指当大脑血液流量减少 而氧气或葡萄糖耗尽引起的已知对脑缺血敏感的脑组织中的神经细胞死亡而发生的疾病。 缺血性脑血管病可以包括脑梗死、中风、脑内出血、蛛网膜下腔出血、白质异常、血管性痴呆 等。
[0029] 优选地，本发明的缺血性脑血管病可以是选自血管性痴呆、脑梗死、中风、脑内出 血、蛛网膜下腔出血和白质异常中的任一种。
[0030] 优选地，本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物具有神经细胞保护作用，但不限于此。
[0031] 如本文使用的，术语"提取"是指一系列工序以获得提取物，而术语"提取物"指的 是用的适当的提取溶液提取草药并蒸发提取液而得到的浓缩产物。所述提取物可以是，但 不限于，由提取处理获得的液体提取物，稀释或浓缩的液体提取物液体，通过干燥液体提取 物制得的干燥提取物，或其粗纯化的或其纯化的提取物。所述本发明提取物可以通过用提 取溶剂提取，或通过添加分馏溶剂到通过用提取溶剂提取制得的提取物中分馏制备。提取 溶剂可以是，但不限于，水、有机溶剂或它们的混合溶剂，其中有机溶剂可以是C1-C4醇、如 乙酸乙酯或丙酮的极性溶剂，如己烷或二氯甲烷的非极性溶剂或其混合溶剂。优选地，溶剂 可以是水、C1-C4的醇或其混合溶剂。蓝靛果忍冬的果实提取物可以通过本领域中已知的常 规提取，分离和纯化的方法来制备。提取方法可以是，但不限于，优选加热提取、热水提取、 冷浸泡提取、回流冷提取，或超声提取。
[0032] 本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物优选通过包括下列步骤的制备方法制备，但并 不限于此。
[0033] 本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物可通过这样的方法制备，包括以下步骤：1)在 搅拌下将醇或醇水溶液加入蓝靛果忍冬果实中，接着在80-KKTC提取温度下回流提取3至 5小时；2)分离步骤1)回流提取制得的溶液的滤液，随后在40至70°C下，减压并冷冻干燥 以浓缩。
[0034] 在步骤1)中，提取溶剂可以是水、醇或其混合溶剂，优选地，选自Cl至C4的低级 醇或其混合溶剂、1，3-丁二醇中的任一溶剂，但不限于此。最优选地，是使用1，3-丁二醇提 取，但不限于此。最优选地，所述提取的溶剂是1至100%的乙醇或1至100%的甲醇，但不 限于此。
[0035] 在步骤1)中，提取溶剂的量优选为蓝靛果忍冬果实干重的10重量％至40重 量％，更优选30重量％，但不限于此。
[0036] 在步骤1)中，提取温度为KTC至KKTC，但不限于此，优选80至KKTC，而更优选 为90至95°C，但不限于此。
[0037] 在步骤1)中，提取时间优选为1小时至7小时，更优选为3小时至5小时，但不限 于此。最优选地，提取的时间是3小时，但不限于此。根据本发明的方法，提取频率优选为 1至5次，但不限于此。
[0038] 提取物的制备方法，可以是本领域已知的典型的提取方法，亦即，使用提取装置的 方法，如热水提取、浸渍提取、回流冷提取、超临界提取、亚临界提取、加热提取，高压提取或 超声提取，或用包含XAD和HP-20的吸附树脂的方法，优选在低温下超声提取的方法，但不 限于此。
[0039] 如本文使用的，术语"预防"是指所有施用提取物或包含该提取物作为活性成分的 组合物以抑制或延迟缺血性脑血管病的行为。如本文使用的，术语"治疗"是指所有施用提 取物或包含该提取物作为活性成分的组合物以恢复或有利改变缺血性脑血管病的行为。
[0040] 在本发明的一个实施方式中，给缺血性脑血管病的动物模型施用本发明的蓝靛果 忍冬的果实提取物，该模型是通过在麻醉状态下阻塞大鼠大脑中动脉基底诱发的脑缺血， 然后使用该模型对缺血性脑血管病的治疗进行评价。
[0041] 在本发明的一个实施方式中，通过神经学得分评价实验动物的神经行为障碍，而 其结果是，它们的神经学评分较对照组显著较低。
[0042] 在本发明的一个实施方式中，评价了本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物在梗死体 积上的功效，而其结果是，以l〇〇mg/kg蓝靛果忍冬的果实提取物治疗，梗死体积显著减少。 [0043] 进一步地，在本发明的一个实施方式中，通过染色神经细胞评估其疗效。结果，蓝 靛果忍冬的果实提取物表现出显著地抑制由于脑缺血所致的神经细胞死亡的效果，暗示提 取物具有优异的神经细胞保护功效。
[0044] 因此，本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物具有神经细胞保护效果，从而显著地减 少神经行为障碍以及缺血性脑血管病的梗死体积。因此，本发明提供了组合物，其包含作为 活性成分的蓝靛果忍冬的果实提取物，该组合物用于预防和治疗缺血性脑血管病。
[0045] 在本发明的一个具体的实施方式中，本发明的提取物是来自天然植物的提取物， 并显示无副作用，并在缺血性脑血管病的动物模型中具有神经细胞保护效果，从而抑制神 经行为障碍，并减少梗死体积。因此，其可以在包含该提取物的药物组合物中作为活性成分 使用，用于预防或治疗缺血性脑血管病的。
[0046] 以所述组合物的总重量计，含有本发明提取物的组合物可包括0. 1至50重量％的 提取物，但不限于此。
[0047] 在本发明的组合物还可以进一步包含典型地用于制备药物的合适的载体、赋形剂 和稀释剂。
[0048] 本发明的组合物可以根据典型方法配制成口服制剂，例如粉剂、颗粒剂、片剂、胶 囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆、气雾剂等，外用制剂，栓剂或用于注射的无菌溶液剂。可在本发明 的组合物中使用的载体，赋形剂和稀释剂可以示例性的为乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露 醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶树胶（0卜汧人l〇l·卫￥)、海藻酸盐、明 胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、无定形纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸 甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。制剂可以通过使用常规使用的赋形剂 或稀释剂如填充剂、增量剂（吾葑刻）、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂来制备。所 述为口服施用的固体制剂可以包含片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，除了可以使用简单 的赋形剂、润滑剂，例如，硬脂酸镁、滑石等，还通过混合本发明的组合物与例如，淀粉、碳酸 钙、蔗糖或乳糖、明胶等的一种或多种赋形剂以制备。用于口服施用的液体制剂的实施例包 括混悬剂，供内用的液体、乳剂、糖浆等，除了通常使用的简单稀释剂诸如水和液体石蜡，还 可以含有各种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等。在制备用于肠胃外施用的实施 例可包含无菌的水性溶液、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干剂，以及栓剂。作为非水溶剂和 混悬剂可以使用，丙二醇、聚乙二醇，如橄榄油的植物油，如油酸乙酯的可注射酯。作为栓剂 基质可以使用Wit印sol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂酸脂、甘油明胶等。
[0049] 药物组合物可通过口服或胃肠外施用。肠胃外施用是通过局部施用和全身施用方 式的任一种进行。更优选地是全身性施用，而最优选地是静脉内注射。
[0050] 在本发明的治疗性组合物的优选剂量可以基于病情以及体重、疾病的严重程度、 药物的制备、施用途径和时间，由本领域技术人员适当地确定本发明合适的剂量。以蓝靛果 忍冬的果实提取物的量计，本发明的治疗组合物优选施用剂量〇. 0001至l〇〇〇mg/kg/日，为 更好的效果更优选为〇. 01至l〇〇mg/kg/日。施用频率可一天一次或一天几次。上述施用 剂量和施用频率不以任何方式限制本发明的范围。
[0051] 本发明的包含作为活性成分的蓝靛果忍冬果实提取物的药物组合物（该药物组 合物用于预防和治疗缺血性脑血管病）可通过单剂量大丸剂类型或输液相对短时间对患 者施用，或通过分级治疗方案以多剂量长时间对患者施用。关于本发明药物组合物的施用 浓度，考虑各种因素，如患者的年龄和健康状况，以及药物的施用途径和治疗频率，用于患 者的有效施用剂量是确定的。因此，考虑各种因素，本领域的技术人员可以适当地确定有效 的施用剂量。
[0052] 在本发明的组合物除了蓝靛果忍冬的果实提取物，还可以进一步包括营养素、维 生素、电解质、矫味剂、着色剂、增稠剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体 增稠剂、PH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。该组合物可 以进一步单独地或与其他组分组合。以100重量份蓝靛果忍冬的果实提取物计，附加组分 的含量可以优选为〇. 1至20重量份。
[0053] 所述本发明的药物组合物可配制成安瓿作为单一剂量形式或者多剂量容器使用， 根据本领域技术人员容易实现的本发明适合的方法，使用的药学上可接受载体和/或赋形 齐U。在这方面，制剂可以使用任何类型的适合的药物制剂，其中包括如粉剂、颗粒剂、片剂、 胶囊剂、混悬剂、乳液、糖浆、气雾剂等的口服制剂，如软膏、乳膏等的外用制剂，栓剂或注射 用无菌溶液剂。
[0054] 本发明的另一个方面，提供一种保健食品，其含有作为活性成分的蓝靛果忍冬的 果实提取物，该保健食品用于预防或改善缺血性脑血管病。
[0055] 在本发明中，蓝靛果忍冬的果实提取物和缺血性脑血管病，与所描述相同。
[0056] 本发明一个【具体实施方式】中，本发明的提取物在缺血性脑血管病的动物模型中具 有神经细胞保护效果，从而抑制神经行为障碍，并减少梗死体积，因此，其可以在包含该提 取物的保健食品中作为活性成分使用，用于预防或治疗缺血性脑血管病。
[0057]食品的种类没有特别地限制。可以添加物质到其中的食品的例子可包括饮料、肉 类、香肠、面包、饼干、年糕、巧克力、糖果、小吃、曲奇、比萨饼、方便面、其他的面、口香糖、包 括冰淇淋的乳制品、汤、饮料、酒精饮料、维生素复合物等，以及普遍接受的各种类型保健食 品。
[0058] 本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物可按原样或者与其它食品或食品组分一起添 加到食品中，并根据典型的方法恰当地使用。所述活性成分的混合比可通过使用的目的 (用于预防或改善）适当确定。通常，以所述食品的总重量计，提取物可以〇. 1至90重量份 的量添加到保健食品中。然而，如果出于健康和保健的目的或健康管理的目的而长期施用， 其用量可以低于该范围。因为不存在安全问题，所述活性成分也可以在上述范围内使用。
[0059] 在包含所示比例的上述提取物作为必需成分的液体的范围内，本发明的功能性保 健饮料组合物不限于任何特定的组合物。如普通的饮料，其可以包含各种甜味剂或天然糖 类作为附加组分。上述天然糖类的实施例可包括普通糖如，例如葡萄糖和果糖的单糖，例如 麦芽糖和蔗糖的二糖，例如糊精和环糊精的多糖，和例如木糖醇，山梨糖醇和赤藓糖醇的糖 醇。作为甜味剂除上面提到的之外，天然甜味剂（索马甜（E丨罕0[包），甜叶菊提取物（例 如，莱鲍迪甙A)，甘草甜素），和合成的甜味剂（糖精，阿斯巴甜等）可以有效地使用。每 100毫升的本发明组合物中天然碳水化合物的含量一般为约1至20g，优选约5至12g。
[0060] 除了上述组分外，本发明的提取物可包括各种营养素，维生素，矿物质（电解质）， 如合成香料和天然香料的矫味剂，着色剂和增强剂（奶酪，巧克力等），果胶酸和及其盐，海 藻酸及其盐，有机酸，保护胶体增稠剂、PH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇，以及用于碳酸 饮料中使用的碳酸剂等。此外，本发明的提取物可包括天然果汁和果肉用于果汁饮料和蔬 菜饮料的供应。这些组分可以单独或组合使用。这些添加剂的含量并非如此决定性的，但 以每100重量份的本发明提取物计，一般可以选择0. 1至约20重量份。
[0061] 在又一个方面中，本发明提供一种预防或治疗缺血性脑血管病的方法，包括向受 试者施用含有药用有效量的以蓝靛果忍冬的果实提取物为活性成分的组合物的步骤。
[0062] 如本文使用的，术语"施用"是指以适当的方式将预定材料的引入患者体内。所述 组合物的施用没有特别的限制。只要其允许该组合物在体内到达目标，可以采取任何施用 途径。施用的实施例包括腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内和直肠内 施用。然而，由于肽以口服施用会被消化，用于口服施用的组合物的活性成分为防止在胃中 降解应当包衣或是配制的。
[0063] 又一方面，本发明提供了保护神经细胞免受氧化应激的方法，包括给受试者施用 含有药物有效量的蓝靛果忍冬的果实提取物作为活性成分的组合物的步骤。
[0064] 如本文使用的，术语"氧化应激"是指一种活性氧类生产和消除系统之间平衡的障 碍，其是由各种因素，如化学品，辐射，缺血等引起的。细菌中具有一组由活性氧类诱导的 酶，这是由于直接氧化所致的转录因子活化引起的。在高等生物中，许多基因也由氧化应激 诱导，这被认为是由细胞内信号转导通路的活化引起的。因此，氧化应激也诱导病理状态， 如细胞的损伤（特别地，细胞膜脂质的氧化），DNA修饰所致的突变，细胞凋亡或坏死的诱导 等。
[0065] 氧化应激可通过活性氧类或活性氮类引起。所述活性氧类表示超氧（02〇、过氧化 氢（H2O2)、羟自由基（OH)、和单线态氧（1O2),其通过逐步还原三线态氧（3O2)的产生，以及活 性氮，包括一氧化氮自由基（NO)，和过亚硝酸盐（0N00)等。
[0066] 在再一个方面中，本发明提供了蓝靛果忍冬的果实提取物在制备用于缺血性脑血 管病预防剂或治疗剂中的应用。
[0067] 在本发明中，蓝靛果忍冬的果实提取物和缺血性脑血管病是相同的，与如上描述 相同。
[0068] 在下文中，本发明将根据实施例，实验实施例和制备实施例详述。
[0069] 但是，以下的实施例，实验实施例和制备实施例仅用于说明的目的，而本发明并不 旨在通过这些实施例，实验实施例和制备实施例进行限制。
[0070]〈实施例1>蓝靛果忍冬的果实提取物的制备
[0071] 〈1-1>使用水溶剂热水提取
[0072] 将在中国延边和长白山亲自收获的野生蓝靛果忍冬果实干燥并用于制备蓝靛果 忍冬的果实提取物。将IOOg粉碎的蓝靛果忍冬果实加入到1升的蒸馏水中，并充分搅拌， 接着以90至95°C的提取温度回流提取3小时。然后，分离滤液，并且草本植物提取物在 55-65°C下，减压浓缩，接着冷冻干燥以得到21. 2克的草药粉末提取物。
[0073] 〈1_2>使用水-醇混合溶剂热水提取
[0074] 将1升25 %的乙醇加入到IOOg在实施例1-1中粉碎的蓝靛果忍冬果实中，并充 分搅拌，接着在80至90°C的提取温度（通过加热维持）下回流提取3小时。然后，分离滤 液，并且草本植物提取物在55-65°C下，减压浓缩，然后冷冻干燥以得到19. 5克的草药粉末 提取物。
[0075]〈实施例2>局灶性的缺血模型的制备
[0076] 使用Sprague-Dawley(SD)大鼠（250-300克）作为试验动物。SD大鼠禁食24小 时，然后利用7:3比例的氮气和氧气混合气体，用2. 5%异氟烷麻醉。将颈总动脉和颈外动 脉结扎，将17毫米长的探针从颈内动脉分叉点插入到颈内动脉以阻塞大脑中动脉的基底 90分钟以诱导缺血。在诱导缺血过程中，插入直肠温度计、监测温度并保持37±0. 3°C的正 常体温。大脑中动脉阻塞预定的时间后，拉出插入颈内动脉的探针以完成再灌注。
[0077]〈例3>缺血性脑损伤的评估
[0078] 〈3_1>2, 3, 5-氯三苯四唑（TTC)染色
[0079] 为了根本上观察短暂性脑缺血诱导的脑组织损伤，进行TTC染色。将脑从实验组 中转移，并且用大脑基质制备2毫米厚的片，并用2% 2, 3, 5-氯三苯四唑（TTC)溶液在37°C 下染色60分钟。TTC溶液染色的脑切片在10%中性福尔马林缓冲溶液中固定以测量梗塞 体积（Lee等人，Glia，50 :168-181，2005)。
[0080] 〈3_2>组织染色
[0081] 缺血后，正常组和各实验组均在预定时间点腹膜内注射水合氯醛（400毫克/)以 全身麻醉。打开实验动物的胸腔，一个套管通过左心室插入升主动脉。当动物通过右心室 放血时，用注射器（ColeParmer，美国）用生理盐水（pH7. 4)以每分钟10毫升的速率进行 灌注清洗。接着，将动物灌注4%多聚甲醛[0.IM磷酸盐缓冲液（PB)，pH为7. 4]以固定， 然后在颅骨用骨刀破开从其中取出脑。固定的脑组织通过典型的组织处理过程包埋在石蜡 中，然后用显微镜以薄片切片机（Reichert-Jung，德国）对5μηι厚的石錯连续切片制备。 在用二甲苯脱蜡后，将切片用100 %，95 %，90 %，80 %，70 %和50 %的乙醇处理，随后用甲 酚紫和酸性品红染色检查正常细胞的分布及变形。经过典型的脱水和清洁流程，用封片剂 将切片密封。
[0082]〈实验实施例1>神经行为观察评分的分析
[0083] 在诱导脑缺血3小时后，观察手术后SD大鼠的神经行为障碍。神经行为试验是通 过尾巴将老鼠在空中完全抬起直到发生左侧偏瘫，或通过检查是否发生自发向左转圈来评 分。神经学评分如下：〇,无神经行为障碍（正常）；1，当通过尾巴完全抬起时，左前肢无法伸 展（轻度）；2,向病变的对侧转圈（中度）；3,休息时倒向病变对侧或无自主运动（重度）。
[0084] 在诱导脑缺血约30分钟和3小时后，当通过尾巴将大鼠完全抬起时，检测是否发 生逆时针转圈。95%或更多的大鼠中观察到逆时针转圈，并且神经学评分为2. 8±0. 28。与 此相反，蓝靛果忍冬的果实提取物处理的组中自发转圈减少，并且用蓝靛果忍冬的果实提 取物处理过的组中（SH-1013) (100毫克/千克），神经学评分为1.48±0.23,显示了显著地 神经行为障碍抑制（图1)。
[0085] 这些结果提示，本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物显著地降低了缺血性脑血管病 动物模型的神经行为障碍。
[0086]〈实验实施例2>药物的缺血性脑损伤保护作用
[0087] 为了根本上评估因短暂性MCAO(大脑中动脉阻塞）引起的脑损伤，进行TTC染色， 并测定总梗死体积。正常组织由于TTC被线粒体酶还原而染成暗红色，而梗死组织由于线 粒体损伤没有还原而从正常组织中区分开来。连续地从所述前部区域切割6个2_厚的截 面，但不包括每个实验组的脑嗅球，这6个2mm厚的截面分别用TTC染色，并且作为结果， 第2,第3和4号组织中观察显著的梗死区域，在缺血后24小时的组中总梗塞体积测量为 25. 38±2. 85%，而用蓝靛果忍冬的果实提取物处理的组中总梗塞体积（8. 59±4. 68% )显 著降低（SH-1013)，显示了用蓝靛果忍冬的果实提取物处理的组中脑梗死体积降低了 60% 或更多（图2和图3)。
[0088] 进一步地，在大脑中动脉2小时阻塞和24小时再灌注后，进行甲酚紫染色。其结 果是，缺血性脑皮层和缺血性纹状体中甲酚紫染色细胞的数目减少了。特别地，未发现锥体 形神经细胞。与之相反，在用本发明蓝靛果忍冬的果实提取物处理的组中，缺血性脑皮层和 缺血性纹状体中观察到大量锥体形神经细胞（图4)。
[0089] 这些结果提示，在缺血性脑血管病的动物模型中，本发明蓝靛果忍冬的果实提取 物显著地减小了梗死体积并显示出了显著的神经细胞保护效果。
[0090] 〈制备实施例1>药物制剂的制备
[0091] 〈1-1>粉剂的制备
[0092] 蓝靛果忍冬的果实提取物20mg
[0093]乳糖 20mg
[0094] 将上述组分混合，然后装入密闭袋，以制备粉剂。
[0095] 〈1_2>片剂的制备
[0096]
[0097] 蓝靛果忍冬的果实提取物IOmg 米淀粉 IOOmg 乳糖 IOOmg 硬脂酸镁2mg
[0098] 将上述组分混合，然后按照典型的制备片剂方法压片以制备片剂。
[0099] 〈1_3>胶囊剂的制备
[0100] 蓝K果忍冬_果实提取物謂mg结晶纤维素 3mg 乳糖 14 Jmg 硬脂酸镁〇.2mg
[0101] 将上述组分混合，然后按照典型的制备胶囊剂方法装填胶囊以制备胶囊剂。
[0102] 〈1_4>液体制剂的制备
[0103] 蓝腚采忍冬的果实提取物20mg异构化糖 IOg H'illfSg 纯净水足贵
[0104] 按典型液体制剂的方法将各组分加入并溶解于纯净水中，而后加入适量柠檬味香 料。然后，将上述组分混合，并加入纯净水至总体积100ml。将所得物填充到棕色瓶中，而后 灭菌以制备液体制剂。
[0105] 〈1_5>注射用制剂的制备
[0106] 蓝靛果忍冬的果实提取物10 μ g/ml
[0107]稀盐酸BP 至 ρΗ7·6
[0108] 注射用氯化钠BP 直至Iml
[0109] 蓝靛果忍冬的果实提取物溶解于足够量的注射用氯化钠BP中，然后用稀盐酸BP 将所得溶液的PH调节至ρΗ7. 6,并用注射用氯化钠BP调节体积，随后充分混合。该溶液装 入I型5毫升安瓿瓶中（透明玻璃），在空气环境下通过熔化玻璃密封，然后，以120°C进行 15分钟或更长时间的高压灭菌以制备可注射制剂。
[0110] 〈制备实施例2>食品的制备
[0111] 如下制备含本发明蓝靛果忍冬的果实提取物的食品。
[0112] 〈2_1>小麦粉食品的制备
[0113] 0. 5-5. 0重量份的本发明蓝靛果忍冬的果实提取物中加入面粉中，而该混合物用 于制备面包，蛋糕，曲奇，薄饼干和面条作为用于健康改善的食品。
[0114] 〈2_2>乳制品的制备
[0115] 将5-10重量份的本发明蓝靛果忍冬的果实提取物加入到牛奶中，而后该牛奶用 于制备各种如黄油和冰淇淋的乳制品。
[0116] 〈2_3>保健粉状食品的制备
[0117] 将糙米、大麦、糯米，和薏苡预胶化，干燥，然后按已知的常规方法焙烤。然后，使用 压碎机制成60目大小的粉末。
[0118] 将黑豆、黑芝麻，和紫苏的种子蒸制，干燥，然后按已知的常规方法焙烤。然后，使 用压碎机制成60目大小的粉末。
[0119] 将本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物在真空中浓缩机中真空浓缩，且通过喷雾和 热风干燥机进行干燥。然后，将得到的干燥产物用压碎机制备成60目大小的干燥粉末。
[0120] 谷粒、种子和干燥的蓝靛果忍冬的果实提取物的粉末以下述比例共混。
[0121] 谷粒（30重量份糙米，15重量份薏苡，20重量份大麦），
[0122] 种子（7重量份紫苏种子，8重量份黑豆，7重量份黑芝麻），
[0123] 蓝靛果忍冬的果实提取物（3重量份），
[0124] 灵芝（0. 5重量份），以及
[0125] 地黄（0. 5重量份）。
[0126] 〈2_4>保健食品的制备
[0127] 蓝镟果忍冬的果实提取物IOOmg维斗:索浞介物 足设 维生索Aif酸_ 7_g 维牛索ELOmg 维生素B丨 O.Bmg 维生素B2 OJSmg
[0128] 维^索Bf> O.Smg 潍::?索Β〗2 0.2μ§ 维生素€ IOmg 生物素 IOpg iJlftitL7mg 叶酸 5%ig 泛酸侧' 0.5mg 无机混介物 硫酸亚铁 1.75mg 氣化_ 0.82mg 碳酸镁 25.3mg 磷酸二氢钾 15mg 晴酸M钙 55mg 柠檬酸钾 90mg 碳酸例 IOOmg 氯化镁 24.8mg
[0129] 在含有多种维生素和矿物质的上述组合物中，将各组分以适于保健食品的比例混 合，但混合比例可以改变。将上述组分按典型的保健食品的方法制备颗粒剂，该颗粒剂可按 常规方法，用于制备保健食品组合物。
[0130] 〈制备实施例3>保健饮料的制备
[0131] 蓝靛果忍冬的果实提取物 IOOmg 柠檬PtIOOmg 寡糖 IOOmg 李子浓缩物 2mg 牛磺酸 IOOmg 纯化水 至总体积500ml
[0132] 按典型的保健饮料将上述组分混合，并在搅拌下加热至85°C约1小时。将所得溶 液过滤并加入到IL灭菌的容器中，并将该溶液进行密封和杀菌处理，并保存在冰箱中。然 后，最终的溶液用于在制备本发明的保健饮料组合物。
[0133] 在上述组合物中，各成分以用于保健饮料的适当比例混合，但混合比例可以根据 地区/国家的偏好，如阶级，国家，消费者的用途来改变。
[0134] 在本发明并不局限于如上描述的实施例、实验实施例和制备实施例，而且本领域 技术人员将理解，各种修改和变更是可能的，未脱离如公开在所附权利要求书中的本发明 范围和精神。
[0135] 本发明的效果
[0136] 本发明的蓝靛果忍冬的果实提取物是来自天然植物的提取物，并显示较少的副作 用，并在缺血性脑血管病的动物模型中具有神经细胞保护作用，从而抑制神经行为障碍且 减少梗死体积。因此，含有该化合物作为活性成分的组合物对缺血性脑血管病有优异的预 防和治疗效果。
【权利要求】
1. 一种药物组合物，其包含作为活性成分的蓝靛果忍冬的果实提取物，所述药物组合 物用于预防或治疗缺血性脑血管病。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述缺血性脑血管病为选自血管性痴呆、脑梗 死、中风、脑出血、蛛网膜下腔出血和白质异常中的任一种。
3. -种果实提取物保健食品，其包含作为活性成分的蓝靛果忍冬的果实提取物，所述 保健食品用于预防或改善缺血性脑血管病。
4. 根据权利要求3所述的保健食品，其中所述缺血性脑血管病为选自血管性痴呆、脑 梗死、中风、脑出血、蛛网膜下腔出血和白质异常中的任一种。
5. -种用于治疗缺血性脑血管病的方法，包括向受试者施用包含药学上有效量的作为 活性成分的蓝靛果忍冬的果实提取物的组合物的步骤。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述缺血性脑血管病为选自血管性痴呆、脑梗死、 中风、脑出血、蛛网膜下腔出血和白质异常中的任一种。
7. 保护神经细胞免受氧化应激的方法，其包括给受试者施用包含药学上有效量的作为 活性成分的蓝靛果忍冬的果实提取物的组合物的步骤。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述氧化应激是由活性氧类或活性氮类引起的。
【文档编号】A61P25/00GK104302302SQ201380025820
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年3月19日 优先权日:2012年3月19日
【发明者】S·H·曹, W·K·金, J·C·李 申请人:庆熙大学校产学协力团