壳聚糖聚合物用于治疗和预防冠状病毒引起的感染的用途
【专利摘要】式（I）的壳聚糖聚合物HTCC和HM-TCC，其中R选自H，COCH3（HTCC）或选自H，COCH3，C12H25（HM-HTCC），具有用于治疗和预防冠状病毒引起的感染的用途。
【专利说明】壳聚糖聚合物用于治疗和预防冠状病毒引起的感染的用途
[0001] 本发明涉及壳聚糖聚合物通过抑制冠状病毒的复制而用于治疗其引起的感染的 用途。属于冠状病毒家族的人类病毒引起的呼吸道感染表现为正确的呼吸功能的不足和损 伤。一些冠状病毒也可以感染许多动物物种(包括蝙蝠，小鼠，大鼠，猫，狗，兔，马，牛，鸡，火 鸡和野生鸟类)，引起了广泛的疾病，其中影响呼吸系统、消化道、肝、心血管系统和中枢神 经系统。
[0002] 具体地，本发明包括壳聚糖聚合物，具有用于治疗人与动物的上呼吸道感染、下呼 吸道感染、哮吼、胃肠感染、神经系统感染、肝感染、心血管系统感染和川崎病的用途。
[0003] 冠状病毒是具有一个正义单链RNA形式的基因组的有包膜病毒。最初，根据血清 学方法将冠状病毒家族分成三组。
[0004] 随着分子技术的实施，该病毒家族被重新组织，目前它由α-，β_，Y-和δ冠状 病毒组成。
[0005] α冠状病毒包括多种动物病原体(例如，猫腹膜炎病毒、猪流行性腹泻病毒）与 两种人类冠状病毒（HC〇V-229E和HC 〇V-NL63)。β冠状病毒包括动物病毒，如鼠肝炎 病毒（MHV)，马冠状病毒，犬冠状病毒，和三种人类冠状病毒（HC〇V-〇C43、HCoV-HKUI和 SARS-CoV)。Y-和δ-冠状病毒包括感染鸟类和海洋哺乳动物的病原体。
[0006] 现有技术已知壳聚糖及其衍生物具有结合病毒并抑制其复制的能力。例如，已知 壳聚糖的糖衍生物具有通过血凝素蛋白结合流感病毒的能力，该血凝素蛋白是流感病毒的 典型蛋白具有结合糖残基的能力（李X.等（2011).生物大分子，12: 3962 -3969;卡拉 什尼科娃I.等（2008).分析化学80: 2188-2198,牧村Υ.等（2006).碳水化合物研 究 341: 1803 - 1808，U.S. 6,680,054]。
[0007] 类似地，微粒状未修饰壳聚糖用于抑制口蹄疫（FMDV)感染的复制。已证明，对乳 鼠施用以微粒状壳聚糖，能够使其疾病症状减少（李D. (2010).病毒学杂志7: 125)。
[0008] 也已证明磺化壳聚糖衍生物具有抑制HIV-I病毒复制的抗病毒活性，其可能是通 过阻断gpl20病毒蛋白与其定位于易感细胞（CD4)表面的受体之间的相互作用实现（阿 尔坦M.等（2010)碳水化合物研究345:656 - 662)。有文献报道，壳聚糖的磺酸衍生物 能够抑制其它逆转录病毒和疱疹病毒家族的成员的复制（US2009286757, US2005209189， EP0497988，DE4242813和C石原等（1993)疫苗11:670 - 674)。类似地，低分子量的壳聚 糖具有对抗猫杯状病毒和小鼠诺罗病毒的抗病毒活性(苏X.等（2009)食品保护杂志72 : 2623 - 2628)。还有关于壳聚糖和壳聚糖衍生物的抗病毒活性的专利申请和专利。
[0009] 然而，可溶性壳聚糖以及壳聚糖的磺酸衍生物，未表现出抗冠状病毒的活性。类似 地，在体外条件下使用其它阳离子修饰的聚合物不具有抑制病毒复制的效果。已研发的聚 合物，相对于上述的那些，表现出对其他人类病毒没有活性，如人类偏肺病毒，肠道病毒，流 感病毒A和B，和人疱疹病毒1型。
[0010] 本发明的目的是应用壳聚糖通过抑制冠状病毒的复制，治疗和预防冠状病毒引起 的感染。
[0011] 本发明的实质是应用式I的壳聚糖聚合物，其中R选自H或COCH3 (HTCC)，或式I 的壳聚糖聚合物，其中R选自H，COCH3，或C12H25 (HM-HTCC)，治疗和预防冠状病毒引起的感 染。
[0012] 优选地，该聚合物用于治疗和预防α冠状病毒引起的感染，且特别优选的是 HC〇V-NL63引起的感染的情况。
[0013] 优选地，该聚合物用于治疗和预防β冠状病毒引起的感染，且特别优选的是鼠冠 状病毒MHV引起的感染的情况。
[0014] 优选地，本发明的聚合物用于治疗和预防人或动物的症状表现为呼吸功能不足和 损伤的呼吸道感染，特别优选的治疗和预防的感染为：上呼吸道感染，下呼吸道感染，儿童 哮吼，胃肠感染，神经系统感染，以及川崎病。
[0015] 壳聚糖聚合物HTCC是通过壳聚糖与氯化缩水甘油基三甲基铵反应而得到的。 HTCC可以通过用疏水性基团取代进一步修饰，特别优选的是当所述疏水性基团是正十二烷 基,给出了 HM-HTCC。
[0016] 这些聚合物优选地用作溶液，以液体或气雾剂的形式局部给药于上呼吸道（喉，鼻 腔，呼吸道树)，口服至胃肠系统，或静脉注射治疗和预防冠状病毒引起的疾病。
[0017] 本发明的主题还可以是将式I的壳聚糖聚合物，用作溶液以液体或气雾剂的形式 向呼吸道给药；其中式I的壳聚糖聚合物的R选自H或C0CH 3(HTCC)，或式I的壳聚糖聚合 物的 R 选自 H，COCH3,或 C12H25 (HM-HTCC)。
[0018] 本发明通过应用实施例作更详细的说明。
[0019] 实施例1.壳聚糖衍生物HTCC的合成。
[0020] 该聚合物的修饰基于先前在文献中描述的方法进行(卡明斯基K.等（2010)医学 化学杂志53 :4141-4147)。如图1中所示反应获得HTCC，将2. 5g壳聚糖分散在IOOml的 蒸馏水中，然后加入IOml 0. 5%的醋酸溶液并将该混合物搅拌30分钟。在下一步骤中滴入 6.9ml的氯化缩水甘油基三甲基铵（GTMAC)。
[0021] 该反应在55°C下进行18小时，同时用磁力搅拌器进行混合。该时间之后，将反应 混合物以4000rpm速度离心10分钟以除去悬浮的未修饰的壳聚糖。然后，将上清液倾入过 量的丙酮中，将所得悬浮液以4000 rpm速度离心20分钟。
[0022] 倾出上清液，将沉淀物预先在空气中干燥后溶解在水中。将所得溶液再次离心，并 用一个新的批次的丙酮使溶解在上清液中的该聚合物析出。该溶解和析出的循环重复再进 行2次。最终析出的产物在真空烘箱中干燥24小时即获得HTCC。获得修饰度63%的该聚 合物，修饰度定义为GTMC取代的葡萄糖单位的百分比。
[0023] 阳离子修饰的壳聚糖HTCC的结构由图2所示的FTIR傅立叶变换红外光谱证实， 其中暗线表示壳聚糖修饰之前的光谱，以及亮线表示壳聚糖修饰之后（即HTCC)的光谱。
[0024] FTIR中的修饰后壳聚糖的两个频带，能够在1520 cm-Ι区别于其他的是甲基基团 的特征，其存在于修饰后壳聚糖中，而不存在于未修饰壳聚糖中，以及在1595 cnT1的频带是 伯胺的特征，该伯胺的特征可以在未修饰壳聚糖的光谱中观察到，但不存在于修饰后壳聚 糖的光谱中。两种情况下都能观察到在1650 cnT1的一个频带，来源于乙酰氨基中存在的伯 酰胺键C = 0。
[0025] 修饰后壳聚糖（HTCC)的结构也被使用I H-NMR核磁共振氢谱证实。在D2O和 CD3COOD的混合物中进行I H NMR测定。在该聚合物修饰后的波谱中的一个频带出现在3. 2 ppm，其是甲基的质子与季胺氮键合连接的特征。未修饰壳聚糖的IH-NMR谱如图3中所示 以及HTCC的IH-NMR谱如图4中所示。
[0026] 实施例2.壳聚糖衍生物HM-HTCC的合成。
[0027] HTCC (I g，3mmol葡萄糖单位）溶解于甲醇与1 %乙酸溶液（pH= 5. 5)的比例为 1:1的混合物中。〇.3mmol N-十二烷基醛和1.2568g (20mmol)氰基硼氢化钠 （NaCNBH)溶 解在20ml甲醇中，并加入到HTCC溶液内。将反应混合物在20°C搅拌36小时直至形成溶胶。 在反应完成后，将聚合物用甲醇和乙醚的50:50体积比的混合物进行沉淀。沉淀的聚合物 用甲醇和乙醚洗涤并真空干燥。所得到的产物（HM - HTCC)的结构通过测定其I H NMR频 谱证实。
[0028] 实施例3.聚合物HTCC和HM-HTCC的细胞毒性及其抗α冠状病毒活性的研究，以 人类冠状病毒NL63为例。
[0029] 研究聚合物HTCC和HM-HTCC细胞毒性，通过使用对HCoV-NL63病毒感染敏感 的LLC-MK2细胞（ATCC CCL-7 ;来自猕猴肾上皮细胞衍生的细胞系）和Α549细胞（ATCC CCL-185细胞系来自于肺癌细胞，智人）（范德胡克L.等（2004)自然医学10 :368-373;希 尔德根〇等（2006)病毒学方法杂志138 :207 - 210)。
[0030] 细胞毒性使用两个试验测定。首先，进行一个比色测试，该比色测试是基于线粒 体酶(琥珀酸脱氢酶）减小XTT染料（2, 3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-2H-四 唑-5-甲酰基苯胺）着色甲酸盐的能力。
[0031] 由于细胞活力和染料形成量之间有直接的关系，通过测定这个特定染料最大吸光 度对应波长处的吸光度，能够评估细胞的状态。还使用了中性红染料对细胞活力进行评估。
[0032] 中性红（NR)被动输送到活细胞的细胞质中并累积于溶酶体。活细胞的数目和它 们的状态的分析是通过对样品随着细胞裂解的色度的评估。
[0033] 在研究中1^01?2或4549细胞在有汉克和厄尔盐补充有3%牛血清的最小必需培 养基(MEM)中培养6天，以增加 HTCC或HM-HTCC聚合物的浓度。在该时间后，对细胞毒性 使用上述两种方法进行评估。另外，用相差显微镜检查细胞对病毒特异性改变的细胞形态 的存在。该结果表示在表1中。
[0034] 表1细胞毒性和细胞病变的测试结果。
【权利要求】
1. 式I
的壳 聚糖聚合物HTCC和HM-TCC，其中R选自H，⑶CH3(HTCC)或选自H，COCH3，C12H25(HM-HTCC)， 其用于治疗和预防冠状病毒引起的感染的用途。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的聚合物用于治疗和预防α冠状病毒 引起的感染。
3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的聚合物用于治疗和预防HC〇V-NL63引 起的感染。
4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的聚合物用于治疗和预防β冠状病毒 引起的感染。
5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的聚合物用于治疗和预防鼠冠状病毒 MHV引起的感染。
6. 如权利要求1至5所述的用途，其特征在于，所述的聚合物用于治疗和预防人或动物 表现为呼吸功能的不足和损伤的呼吸道感染。
7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的聚合物用于治疗和预防选自下组的 感染： -上呼吸道感染； -下呼吸道感染； -儿童哮吼； -胃肠道感染； -神经系统感染； -川崎病。
8. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的聚合物HTCC通过壳聚糖与氯化缩水 甘油基三甲基铵反应获得。
9. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的聚合物HTCC通过用疏水性基团取代 进一步修饰得到HM-HTCC。
10. 如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的疏水性基团是正十二烷基。
11. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的壳聚糖聚合物用作一种溶液，以液 体或气雾剂的形式向呼吸道给药。
【文档编号】A61K31/722GK104321063SQ201380025825
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2013年5月16日 优先权日:2012年5月18日
【发明者】克日什托夫·彼拉斯, 亚历山德拉·米卢斯卡, 玛丽娅·诺娃柯斯卡, 克日什托夫·斯库巴拉卡, 卡米拉·卡明斯基 申请人:积克隆斯基大学