作为雌性不育的治疗靶标和诊断标记的无细胞dna的制作方法

作为雌性不育的治疗靶标和诊断标记的无细胞dna的制作方法
【专利摘要】本发明涉及DNA酶治疗雌性不育的应用和cfDNA作为雌性不育标记的应用。
【专利说明】作为雌性不育的治疗靶标和诊断标记的无细胞DNA
[0001] 本发明涉及雌性不育领域。更精确地，其涉及一种雌性不育的新标记，以及增加有 此需要的雌性患者的孕育能力的新型治疗。
[0002] 在最近几年里，作者已经报道了无法解释的不育的流行程度高达20%至25%。不 育是指夫妻在尝试孕育持续至少一整年后仍然不能怀孕。
[0003] 不育的诊断以考虑病史和体检开始。如果检查局限于经过一年的尝试未能怀孕的 任何夫妻中的卵巢功能评价、子宫输卵管造影片和腹腔镜检查，那么大量的不育病例是无 法解释的。通过增加大量的测定（测量多种激素和细胞因子的水平，检测与雌性不育相关 的基因中的任意突变的基因检验技术）扩大诊断检测仅仅略微减少"无法解释的"不育。
[0004] 吸烟、过量咖啡因摄入或饮酒的有害影响是已知的。然而，它们对不育的影响因个 体而大大不同，并且目前还没有生物学标志能够定量这种影响。因此，通过目前可用的检测 并不能精确地评估这些影响。
[0005] 在临床不育的治疗中，辅助性的繁殖技术（ART)具有最高的活产率/治疗。ART自 其开始已经在世界范围内有助于超过一百万婴儿的孕育。然而，这些技术的失败率仍然是 显著的，并且在一次尝试失败后，由于治疗的身体、精神和经济成本，夫妻对于继续ART或 重复ART治疗的决定通常是一个艰难的决定。
[0006] 体外受精（IVF)和精子卵浆内注射技术（ICSI)数据清楚表明，甚至在最成功的程 序中，相对于转运的胚胎数的低植入率。导致植入问题的缺陷可能比目前所评价的要常见 得多，并且构成另一个无法解释的不育领域。
[0007] 测定植入因子，如整联蛋白、LIF、G-CSF或其他生长因子，可能导致对其他不育病 例的理解，并且因此降低被归类为患有"无法解释的不育"的患者的百分数，但是，在大部分 病例中，这在关于治疗的最初的审慎考虑中并没有帮助。在法国，关于每次卵母细胞抽取 (oocyte retrieval)的活产，ART 的成功率为 25% -28 % 〇
[0008] 从上文可以看出，似乎雌性不育所涉及的多种参数完全被目前的检测忽视了。
[0009] 1948年，Mendel和Metais报道了在人血衆中存在循环的无细胞DNA (circulating cell-free DNA)[1]。无细胞循环DNA(cfDNA)已经在宽泛的生理和病理学病症中进行研 宄，所述病症包括炎性紊乱、氧化应激和恶性病。其在健康受试者中以〇-l〇〇ng/ml的血液 浓度存在，平均为30ng/ml [2]。假定正常细胞的DNA含量总计为6. 6pg，这些数值代表平均 0 - 15, 000个基因组当量/ml血液，平均为5000个基因组/ml。这种DNA的大部分是双链 的，并且外观上以核蛋白复合物的形式存在。
[0010] CfDNA在低百分数琼脂糖凝胶上的电泳已经显示出0. 18-21kb的DNA片段的尺寸 的变化，在DNA片段的尺寸分布上随样品而变化。检测大的、准基因组（quasi-genome)尺 寸的DNA片段是常见的。
[0011] 尽管与游离DNA释放到血流中相关的精确机制尚是不确定的，但是其可能来源于 凋亡、坏死和从细胞的主动释放的组合。
[0012] cfDNA从血流中的清除是快速发生的：胎儿DNA在分娩后以16. 3分钟的半衰期从 母亲血液中消失[3]。已知cfDNA对血浆核酸酶（例如，DNA酶I)敏感，但是肾[4]和肝
[5]清除机制也参与了 cfDNA的消除。
[0013] 迄今为止，cfDNA的释放是否具有任何生物学作用还是未知的。培养的细胞已经 表现出向培养基中释放双链DNA[6]，并且cfDNA可能结合在细胞中[7]。这些发现导致引 入"基因组转移（genometastasis)"的概念[8]。然而，这种假说有待证明。
[0014] 循环DNA可以从血浆和血清两者中分离，但是血清中含有约6倍高浓度的循环 DNA。近来，Umetani等表明所述6倍高的血清DNA水平中少于10%是由于被其他来源的污 染所导致的（即，在血清分离期间从白细胞释放的）[9]。关于高血清水平的原因是未知的， 但是排除在纯化步骤期间血浆中DNA的损失[9]。
[0015] 无细胞循环DNA是潜在有用的生物标记。DNA水平和断裂模式为诊断和预后 目的提供有意义的可能性。近来，Bartoov等记述了用于评估男性受试者的孕育状态的 方法，所述方法是基于来自所述受试者的流体样品中的cfDNA的测量（W02008/047364)。 他们还提议了通过向低生育力的男性施用DNA酶来治疗男性低生育能力的方法。无细 胞DNA还被提议为用于非侵入性监测恶性和良性增生和炎性病症（如子宫内膜异位症 (endometriosis))的生物标志[10]。
[0016] 最近，Czamanski-Cohen等报道在37名进行IVF治疗的妇女团体中，与怀孕的妇 女相比，在f3HCg检测那天，没怀孕的妇女中的血浆cfDNA浓度在统计学上更高。然而，如 作者所承认，由于其中所包括的所有妇女都处于IVF治疗期间，所以该研宄不能确定雌性 不育与cfDNA浓度之间的相关性[11]。
[0017] 如本文所述，本发明人现在已经证明不育妇女中的cfDNA水平在统计学上高于能 生育的妇女。因此，cfDNA水平可以用于不育的诊断和预后。cfDNA水平还可以用于不患有 子宫内膜异位症的妇女中的不育诊断和预后。可以不经侵入性或痛苦的程序获得cfDNA的 事实使其特别适合用于诊断女性不育。并且，如下文实验部分所证明的，导致无细胞DNA水 平降低的治疗显著提高被治疗的雌性患者的生育能力。
[0018] 因此，本发明的第一方面是用于体外诊断哺乳动物雌性的不育的方法，所述方法 包括下述步骤：
[0019] (i)确定来自所述雌性的体液样品中的无细胞DNA的水平，并且
[0020] (ii)将所述水平与预先确定的阈值进行比较，
[0021] 其中高于所述预先确定的阈值的无细胞DNA的水平指示不育。
[0022] 所述方法可以用于诊断人或动物雌性、优选人中的不育。其可以与在研宄夫妻不 育原因时进行的首次检测一起进行，或者，在所述检测不能鉴别不育原因的患者中，在这些 检测之后进行。特别地，其可以用于体外诊断不患有子宫内膜异位症的雌性中的不育。
[0023] 当然，在前文所述，具有"指示不育"的cfDNA水平的雌性意指所述雌性具有的不 育可能性高于cfDNA低于预先确定的阈值的雌性的不育可能性。
[0024] 在上述方法中，所述体液样品可以是血浆、血清、血液或卵泡液样品。
[0025] 如下文的实验部分所示，测量94名可育妇女和96名不育妇女的血浆中的cfDNA 浓度。在这一团体中，在可育妇女中，平均cfDNA血浆浓度约为50ng/ μ 1，并且在不育妇女 中约为109ng/ μ 1。因此，当上述方法涉及人类雌性并且当所述体液样品是血浆样品时，所 述阈值可以在这两个值之间选择，并且优选约50至约IOOng/μ 1。当然，熟练的技术人员能 够通过在更大的患者团体上进一步研宄这一参数而提炼并且修改这些数值。通过测量来自 更大量的患者的样品中的cfDNA水平，本领域技术人员还将确定关于cfDNA水平的值的量 表，其具有相应的不育可能性。在更大的团体（包括同类的妇女亚组（取决于她们的年龄 和/或行为参数，如她们是否吸烟，和/或身体参数，如体重、HbAlc等））中的测量也可以 导致确定反应不同状况的不同阈值。在这种情形中，本领域技术人员将通过关于其他相关 参数解释她的cfDNA水平来确定妇女的不育可能性。
[0026] 如已经提及的，所述方法可以通过测量不同于血浆样品的体液样品中的cfDNA水 平来进行。当然，对于每种体液，测量必须在包括可育和不育雌性的显著的雌性团体中进 行，以确定相关的阈值。
[0027] 如果目的是鉴别所有或几乎所有可能是不育的雌性，则选择所述阈值使其与可育 雌性的平均值接近。在这一情形中，可育雌性也可能被诊断为可能是不育的（假阳性）。相 反，如果目的是仅鉴别具有最高的不育可能性的那些，则选择所述阈值使其与不育雌性的 平均值接近。
[0028] 在一个具体的实施方案中，通过测量来自所述妇女的血浆样品中的cfDNA水平来 实施本发明所述的方法，用于体外诊断妇女的不育，并且，高于60ng/ μ 1的血浆cfDNA水平 指示不育。
[0029] 在另一个实施方案中，通过测量来自所述妇女的血浆样品中的cfDNA水平来实施 本发明所述的方法，用于体外诊断妇女的不育，并且，高于70ng/ μ 1的血浆cfDNA水平指示 不育。
[0030] 在另一个实施方案中，通过测量来自所述妇女的血浆样品中的CfDNA水平来实施 本发明所述的方法，用于体外诊断妇女的不育，并且，高于80ng/ μ 1的血浆cfDNA水平指示 不育，其中高于所述预先确定的阈值的无细胞DNA水平指示不育。
[0031] 在另一个实施方案中，通过测量来自所述妇女的血浆样品中的cfDNA水平来实施 本发明所述的方法，用于体外诊断妇女的不育，并且，高于90ng/ μ 1的血浆cfDNA水平指示 不育，其中高于所述预先确定的阈值的无细胞DNA水平指示不育。
[0032] 在另一个实施方案中，通过测量来自所述妇女的血浆样品中的cfDNA水平来实施 本发明所述的方法，用于体外诊断妇女的不育，并且，高于IOOng/μ 1的血浆cfDNA水平指 示不育。
[0033] 按照另一方面，本发明涉及用于实施上述方法的试剂盒。具体地，本发明涉及包含 用于测量生物样品中的cfDNA水平的反应物以及特异性用于测量生物样品中的至少一种 其他生理学参数的反应物的试剂盒，其中所述生理学参数选自由以下组成的组：抗米勒管 激素（anti-milllerian hormone) (AMH)的水平、端粒末端转移酶活性和高半胱氨酸浓度。
[0034] 生物样品中的cfDNA水平可以通过本领域已知的任意技术来测量，诸如，但不限 于，任意的核酸染色，如，例如，嵌入剂。可以用来测量cfDNA水平并且包含在本发明所述的 试剂盒中的DNA嵌入剂的非限制性实例包括小檗碱，溴乙啶，原黄素，道诺霉素，多柔比星， 沙立度胺，Sybr? Green, Sybr? Gold 和 Pico Green?。
[0035] 抗米勒管激素（AMH)还称为MIS (米勒管抑制物质）。由于AMH由卵泡直接产生， 所以AMH水平与卵巢中囊状卵泡的数量相关。已经证明，与具有较高水平的妇女相比，具有 较低AMH的妇女具有较低的囊状卵泡计数并且产生较低数量的卵母细胞。认为血液AMH水 平反映剩余的卵子供应-或"卵巢储库"的大小。AMH可以通过免疫测定如ELISA进行测 量。因此，本发明所述的试剂盒可以包含抗-AMH抗体。
[0036] 端粒末端转移酶是一种修复DNA降解的酶。然而，如果其以不足的浓度存在，则其 可以是无效的。除此之外，当以过高的浓度存在时，端粒末端转移酶产生凋亡因子。因此， 端粒末端转移酶还参与生育并且影响早期胚胎发育。其水平可以通过免疫测定进行测量， 并且因此，本发明所述的试剂盒可以包含特异性识别端粒末端转移酶的抗体。
[0037] 高半胱氨酸是氨基酸半胱氨酸的一种非蛋白同系物，区别在于额外的亚甲基 (-CH2-)基团。其是氧化应激的标记，并且因此，可以提供关于个体的生育能力状况的信 息。高半胱氨酸水平可以通过酶测定来测量：结合的或二聚体化的高半胱氨酸（氧化形式） 被还原成游离的高半胱氨酸，然后其在胱硫醚β-合酶（CBS)的催化下与丝氨酸反应形成 L-胱硫醚。胱硫醚又通过胱硫醚β-裂合酶（CBL)分解而形成高半胱氨酸、丙酮酸酯和氨。 然后，丙酮酸酯被乳酸脱氢酶（LDH)和作为辅酶的NADH转化为乳酸酯。NADH转化为NAD的 速率与高半胱氨酸的浓度成正比（ΔΑ340ηπι)。
[0038] 按照一个具体的实施方案，本发明所述的试剂盒包含至少一种DNA嵌入试剂和特 异性识别AMH的抗体。
[0039] 如下文的实验所述，已经进行了几次治疗（包括几次IVF)而未成功的不育妇女用 脱氧核糖核酸酶进行治疗。在用脱氧核糖核酸酶仅进行一轮治疗之后，然后ART治疗，这些 患者中超过50%怀孕。因此，本发明还涉及脱氧核糖核酸酶，其用于治疗雌性不育，尤其是 当所述不育与高于在可育妇女中统计学上观察到的无细胞DNA水平的无细胞DNA水平相关 时。
[0040] 脱氧核糖核酸酶（DNA酶）是一种催化DNA骨架中的磷酸二酯键水解裂解的酶。因 此，脱氧核糖核酸酶是一种核酸酶。各种各样的脱氧核糖核酸酶是已知的，它们的不同在于 它们的底物特异性、化学机制和生物学功能。
[0041] -些DNA酶仅切割在DNA分子末端的残基（脱氧核糖核酸外切酶，一种外切核酸 酶）。其他切割链的任何位置（脱氧核糖核酸内切酶，核糖核酸酶的子集）。一些对于其所 切割的DNA序列是非常序列特异性的，如限制性酶，而另一些完全是无差别的。一些仅切割 双链DNA，另一些特异性针对单链分子，还有一些对二者都起作用。
[0042] 脱氧核糖核酸酶I优先在邻近嘧啶核苷酸的磷酸二酯键处切割DNA，产生在3'位 置具有游离的羟基的5' 5' -磷酸-封端的多核苷酸，平均起来产生四核苷酸。其作用在单 链DNA、dsDNA和染色质上。
[0043] 脱氧核糖核酸酶II (酸性DNA酶）水解天然和变性的DNA中的脱氧核糖核苷酸 键，产生具有3'-磷酸的产物。如名称所暗示的，其在酸性pH下更有效率。存在一些已知 的DNA酶II，包括a DNA酶II (通常仅称为DNA酶II)和DNA酶II β (还称为DLAD或DNA 酶II样酸性DNA酶）。
[0044] 尽管任何类型的DNA酶都可以用于本发明，但是优选DNA酶I。重组人DNA酶I 已经在临床上使用。可以使用雾化器让囊性纤维化（cystic fibrosis)患者吸入DNA酶。 由于在黏液中积聚的白血球分解并且释放DNA，所述释放的DNA增加了黏液的'厚度'，因此 DNA酶有帮助。DNA酶分解DNA，并且所述黏液更容易从肺中清除。
[0045] 本发明还涉及用于治疗雌性不育的方法。在具体的实施方案中，本发明涉及用于 治疗不患有子宫内膜异位症的雌性中的雌性不育的方法。在另一个具体的实施方案中，本 发明涉及用于治疗表现出比在可育雌性中统计学观察到的无细胞DNA水平高的无细胞DNA 水平的雌性中的雌性不育的方法。在任一实施方案中，本发明所述的方法包括向雌性施用 足以使其无细胞DNA水平降至与在可育雌性中观察到水平相似的水平的量的脱氧核糖核 酸酶。在前文所述，"无细胞DNA水平"应该理解为在任意相关的体液中的无细胞DNA的浓 度，所述任意相关的体液诸如血浆、血清、血液或卵泡液。在下文中，（与可育雌性相比）具 有高水平的cfDNA的不育雌性被指定为"需要"本文公开的治疗。本发明对于治疗妇女中 的不育症是特别有利的。
[0046] 在本发明中，可以有利地使用重组的人DNA酶，特别是用于治疗妇女。当然，当治 疗另一种物种的雌性时，优选来自该物种的重组DNA酶。如已经提及的，可以使用任意DNA 酶来实施本发明，但是优选DNA酶I。
[0047] 当进行本发明时，可以使用任意的施用途径，条件是其能够递送足够量的DNA酶， 以获得循环无细胞DNA的减少。例如，所述DNA酶可以通过静脉内或肌内途径施用。
[0048] 对于不育症的治疗，DNA酶以足以获得血液中和/或卵泡液中无细胞DNA水平降 低的量施用。例如，在至少2天期间，优选至少3天或4天或更多天期间，每天可以向不育 雌性中施用最少2500UI的DNA酶I。当然，由于个体间的差异，可以观察到不同的反应，并 且可以因此修改剂量方案，以使施用的剂量足以获得无细胞DNA水平的降低，其必须变得 与在可育患者中观察到的水平相似。可以追踪cfDNA水平，以检验其降低并且避免不必要 的治疗。
[0049] 已经观察到，在cfDNA水平降低后和治疗终止后，cfDNA水平没有迅速增加至达到 其之前的值。在至少几天期间，cfDNA水平大致保持稳定。因此，在黄体后期期间，可以有 利地将DNA酶施用给需要其的不育雌性中。
[0050] 按照下文实验部分举例说明的本发明的一个具体的实施方案，在7天的黄体后期 期间，向需要其的不育雌性每天两次施用2500UI的DNA酶I。
[0051] 当然，上述治疗不育的方法可以与ART联合，如下文实验中所述。
[0052] 通过下述附图和实施例进一步举例说明本发明。
[0053] 附图标记
[0054] 图1 :在73名可育和88名不育男性和在94名可育和96名不育妇女的血浆中的 平均cfDNA浓度。
[0055] 图2 :在来自37名妇女的血浆（黑色框）和卵泡液（灰色框）中的CfDNA浓度。 该组中怀孕的那些妇女在血浆和/或卵泡液中的平均cfDNA水平低于该组所有妇女（包括 怀孕的那些和没有怀孕的那些）的平均值。 实施例
[0056] 实施例1 :患者、材料和方法
[0057] 精液样品
[0058] 在3-6天的节欲后通过手淫收集年龄小于50岁的可育和不育男性的精液样品。按 照世界卫生组织指南进行精子计数和运动性、活力和形态分析。该研宄中总共包括161名 男性：73名可育的男性和88名不育的男性。
[0059] 来自女性的血浆和卵泡液样品
[0060] 在年龄小于37岁的94名可育（AMH>2ng/ml)和96名不育妇女中测量血浆中的无 细胞DNA (cfDNA)的量。进行基因组研宄来验证该cfDNA的来源，特别是在不育妇女中的来 源。
[0061] 当获得样品时，还在相对应的不育妇女的卵泡液样品中进行cfDNA定量。该研宄 中总共包括37份卵泡液样品。
[0062] 卵巢刺激和卵泡液提取
[0063] 大部分患者利用使用重组 FSH (Gonal F? (Merck laboratory)或 Pliregon? (Schering Plough laboratory))或HMG(Menopur? :Ferring laboratory)的长期激动 剂方法或拮抗剂方法刺激而进行ART。在激素和超声图像控制后，在卵母细胞抽取前36小 时，按照公知技术，用重组或尿HCG促排卵。分离并离心两个或三个主要的卵泡液，之后储 存。然后，使用如在血浆/血清中相同的方法评估cfDNA含量。
[0064] CfDNA分离和PCR扩增
[0065] 使用高纯度 PCR 模板制备试剂盒（High Pure PCR template preparation kit， Roche)按照供应商的推荐分离血浆cfDNA。通过使用ddH20将洗脱缓冲液稀释至20%溶 液，并且在70°C预热。样品以16, OOOg离心5分钟，避开细胞碎片，将400 μ 1血浆转移至 2ml Eppendorf管中。将400 μ 1结合缓冲液和40 μ 1重构的蛋白酶K与所述样品混合。短 暂涡旋后，将管在70°C温育10分钟。温育后，将200 μ 1 100%的异丙醇与样品混合，随后 转移至高纯度PCR模板制备试剂盒中提供的高纯度滤器收集管的上部储器中。柱在室温以 8, OOOg离心1分钟。将流过液和收集管弃掉，并且将滤器与新的收集管组合。重复该上样 步骤，直到全部样品已经上样到所述滤器上。将500 μ 1抑制剂去除缓冲液添加到所述上部 储器中，并且在室温以8, OOOg离心1分钟。弃去流过液和收集管，并且将滤器与新的收集管 组合。通过向上部储器中加入500 μ 1洗涤缓冲液并且在室温离心1分钟将管洗涤两次。通 过以最大速度（约13, 000g)离心10秒而甩干柱，并且将柱转移到新的I. 5-ml Effendorf 管中，并且在温箱中在70°C温热5分钟。将100 μ 1预热的20%洗脱缓冲液小心地添加到 滤器中。将所述管和滤器放置在70°C的温箱中，并且低速（约400rpm)摇动5分钟。通过 以8, OOOg离心5分钟从柱上洗脱DNA样品，然后保存在4°C备用或者冷冻在_70°C用于长 期保存。
[0066] PCR 扩增
[0067] 用于扩增JmJC2和DXS1285基因座的主混合液在15 μ 1反应体积中包含200mM的 每种dNTP，lXTaq聚合酶缓冲液，2μM每种引物组，1.5mMMgC12和0,5UBiotaq TMDNA聚合 酶（Bioline)。用于扩增JmJC2 (Y染色体的标记）和DXS1285 (X染色体的标记）的引物的 序列分别为：
[0068] 5,-GAGTATGCGACCAGT-3，（SEQ ID No:l)，
[0069] 5' -TGGCACACCATGGGA-3'（SEQ ID No:2)和
[0070] 5,-CGTGCTTAGGCTTAATCCC-3'（SEQ ID No:3)，
[0071] 5'-GAACTGACTGTAGAGAAGG-3'（SEQ ID No:4)，在 60°C 退火。
[0072] CfDNA 定量
[0073] 血液样品收集在含有EDTA的真空血液收集管（vacutainer tube)中。将其离心 (3, 400rpm，15分钟），进行血浆分离。在cfDNA定量之前，将血浆和卵泡液样品以3, 400g离 心20分钟。样品必须是透明的，没有红血球。实际上在有色样品中cfDNA定量可能改变。 将标准DNA溶液在166 μ 1中稀释至20, 50, 100和500ng/ml，以绘制标准曲线。将166 μ 1 IN HCLO4 (高氯酸）和664 μ 1二苯胺添加到每个166 μ 1的血浆或卵泡液上清样品中。将 样品在37°C温育20小时，然后以15, OOOg离心10分钟。将300 μ 1上清液转移至96-孔板 中，并且在分光光度计（Tecan，Genios)中在600nm进行测量。
[0074] DNA酶治疗
[0075] 在获得其书面知情同意书后招募患者。
[0076] 在上一周期的黄体后期中，10名选出的具有非常高的cfDNA水平OlOOng/微升） 的妇女用一安瓿的脱氧核糖核酸酶α (阿法链道丨酶⑧（:Pulinozyine?))2,5mg(2500IU) 治疗，通过肌内途径施用，每天两次，持续七天。
[0077] 阿法链道酶? (脱氧核糖核酸酶α)吸入溶液是无菌、澄清、无色、高度纯化的重 组人脱氧核糖核酸酶I (rhDNA酶）的溶液，所述重组人脱氧核糖核酸酶I选择性切割DNA。
[0078] 阿法链道酶⑧通常通过吸入由压缩空气驱动的雾化系统产生的气雾剂雾气进行 施用。但是，在吸入后，rhDNA酶的系统水平非常低（最大15%)，因此，决定定购其相同的 用于頂注射的产品，以增加 DNA酶浓度，假定这样的事实：在阿法链道酶的毒性学研宄中没 有副作用，甚至提供过静脉内途径也没有副作用。
[0079] 统计学
[0080] 利用双向t-检验来评价可育与不育个体之间的cfDNA水平的差异。利用Spearman 相关性双侧检验计算相关性系数。当P〈〇. 05时认为统计学差异是显著的。
[0081] 实施例2 :cfDNA和男件不育症
[0082] 该第一初级研宄的目的是验证男性不育症与高水平的cfDNA之间的相关性的概 念，假定这样的事实：DNA断裂可能参与增加的cfDNA。
[0083] 为了评价cfDNA的完整性，在分离的cfDNA样品上进行PCR。用从男性和妇女的血 浆中分离的cfDNA扩增X染色体标记。用从男性血浆而不是从雌性血浆分离的cfDNA扩增 Y染色体标记。
[0084] 与各自的可育对照相比，在来自不育个体的血衆样品中检测到更高水平的cfDNA。 已经在73名可育（60. 7ng/μ 1 ±46. 9)和88名不育男性（83. 3ng/μ 1 ±64. 8)中测量血浆 中的 cfDNA 的量，ρ = 8. 7e-3 (图 1)。
[0085] 实施例3 :在来自妇女的血浆中的cfDNA
[0086] 如在男性中一样，与各自的可育对照相比，在来自不育妇女的血浆样品中检测到 更高水平的cfDNA。然而，在妇女中的可育与不育个体间的差异大于在男性中的可育与不育 个体间的差异。
[0087] 事实上，证明在94名可育妇女的血浆中的cfDNA量（49. 2ng/μ 1 ±58. 0)是96名 不育妇女中的量（l〇9.4ng/yl±88. 1)的两倍低，ρ = 1.02e_7(图1)。
[0088] 实施例4 :在37名不育妇女的血浆vs卵泡液中的CfDNA的量
[0089] 将血浆中的cfDNA浓度与卵泡液中的浓度进行比较。在血浆cfDNA浓度与卵泡液 之间发现统计学显著的正相关性（r = 0. 43, p = 6. 4eT3)(图3)。在初级研宄中，与未怀孕 的妇女相比，怀孕的妇女在卵泡液和血清中具有较少的cfDNA(数据未显示）。
[0090] 实施例5 :DNA酶治疗对血浆cfDNA浓度和牛育能力的影晌
[0091] 迄今为止，对10名已经超过四年不育和/或具有没有任何解释的几次IVF/ICSI 失败的病史的患者，在前一周期的黄体后期治疗七天，紧接着排卵诱导治疗，其在下一周期 的第二天开始并且使用重组或尿FSH与GnRH激动剂或拮抗剂。所有的患者获得裂开的胚 芽，并且在第3天每名患者移植一个或几个胚胎。
[0092] 对于每名患者，在DNA酶I治疗之前和之后立即收集血液样品，以定量血浆中的 cfDNA。
[0093] 这些患者中的六名在仅一次这样的治疗后怀孕，生下七个孩子（一流产，4个单胎 和1个三胞胎）。与治疗的患者相关的数据显示在下表1和2中：
[0094] 表1 :所包括的患者的年龄和不育病史
【权利要求】
1. DNA酶，其用于治疗雌性不育。
2. 权利要求1的DNA酶，其用于治疗与统计学上高于可育雌性中的无细胞DNA水平的 无细胞DNA水平相关的雌性不育。
3. 权利要求1或权利要求2的DNA酶，其用于治疗雌性不育，其中所述雌性不具有子宫 内膜异位症。
4. 权利要求1-3中任一项的DNA酶，其用于治疗雌性不育，其中所述DNA酶是重组DNA 酶。
5. 权利要求1-4中任一项的DNA酶，其用于治疗雌性不育，其中所述DNA酶是DNA酶 Io
6. 权利要求1-5中任一项的DNA酶，其用于治疗雌性不育，其中所述DNA酶通过静脉内 或肌内途径施用。
7. 权利要求1-6中任一项的DNA酶，其用于治疗雌性不育，其中所述DNA酶在黄体后期 期间施用给不育雌性。
8. 权利要求1-7中任一项的DNA酶，其用于治疗人类雌性不育。
9. 权利要求1-8中任一项的DNA酶，其用于治疗人类雌性不育，其中在至少4天期间， 每天给不育的妇女施用至少2500Π的DNA酶I。
10. 权利要求1-9中任一项的DNA酶，其用于治疗人类雌性不育，其中在黄体后期的7 天期间，向不育的妇女每天两次施用2500Π的DNA酶I。
11. 一种用于体外诊断哺乳动物雌性不育的方法，所述方法包括下述步骤： (i) 确定来自所述雌性的体液样品中的无细胞DNA的水平，和 (ii) 将所述水平与预先确定的阈值进行比较， 其中高于所述预先确定的阈值的无细胞DNA水平指示不育。
12. 权利要求11的方法，其中所述雌性不具有子宫内膜异位症。
13. 权利要求11或权利要求12的方法，其中所述体液样品是血浆、血清、血液或卵泡液 的样品。
14. 权利要求11-13中任一项的方法，其中所述雌性是人类。
15. 权利要求14的方法，其中所述体液样品是血浆样品，并且所述预先确定的阈值包 括在 50ng/ μ 1 与 IOOng/ μ 1 之间。
16. -种用于实施权利要求11-15中任一项所述的方法的试剂盒，其包括特异性用于 测量生物样品中无细胞DNA水平的反应物和特异性用于测量生物样品中至少一种其他生 理学参数的反应物，其中所述生理学参数选自由以下组成的组：抗米勒管激素（AMH)的水 平，端粒末端转移酶活性和高半胱氨酸浓度。
17. 根据权利要求16所述的试剂盒，其包含至少一种DNA嵌入剂和特异性识别AMH的 抗体。
【文档编号】A61P15/08GK104519906SQ201380041011
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年8月1日 优先权日:2012年8月3日
【发明者】安德烈·哈祖特 申请人:辉凌公司