根据美国法典第35篇第119条的规定，本申请要求于2012年10月8日递交的美国专利申请No.61/711,204、于2012年10月26日递交的美国专利申请No.61/719,281、于2013年6月27日递交的美国专利申请No.61/840,432以及于2013年8月30日递交的美国专利申请No.61/872,366的优先权，出于所有目的，以上四个专利申请的全部内容以引用的方式并入本申请中。
序列表
本文附有包括SEQ ID NOs:1～40的序列表，该序列表的所有内容以引用的方式并入本文。该序列表为ASCII格式，由_______产生，命名为_______.txt，共有_______字节。
背景技术：
突触核蛋白病，也被称为路易体病(Lewy body diseases，LBDs)，其特征是多巴胺能神经系统退化，行动改变，认知障碍以及路易小体(Lewy bodies，LBs)和/或路易神经突(Lewy neurites)形成(参考McKeith et al.，Neurology(1996)47:1113-24)。突触核蛋白病包括帕金森氏病(包括特发性帕金森氏病)，弥漫性路易体病(DLBD，也被称为路易体痴呆(DLB))、阿尔茨海默病路易体变异型、综合阿尔茨海默病和帕金森氏病、单纯性自主神经衰竭和多系统萎缩(multiple system atrophy，MSA，例如，橄榄桥脑小脑萎缩、纹状体黑质变性和Shy-Drager综合征)。在疾病的前驱阶段(例如，症状前阶段，亚临床阶段，临床前阶段或运动前期(premotor period)，一些非运动(nonmotor)信号和症状被认为是突触核蛋白病的预兆。这样的早期信号 包括，例如，REM睡眠行为紊乱(RBD)、嗅觉丧失以及便秘(参考Mahowald et al.,Neurology(2010)75:488-489)。在老年群体中，路易体病仍然是运动障碍和认知退化的普遍原因(参考Galasko et al.,Arch.Neurol.(1994)51:888-95)。
α-突触核蛋白是包括β和γ-突触核蛋白和synoretin(突触核蛋白新家族成员)在内的大蛋白家族的一部分。α-突触核蛋白在与突触相关的正常状态下表达，被认为在神经可塑性、学习和记忆中起到关键作用。几项研究已经暗示α-突触核蛋白在帕金森氏病发病机理中起到关键作用。在发病状态下，该蛋白能够聚集，形成不可溶性的原纤维。例如，突触核蛋白在LBs中聚集(参考Spillantini et al.，Nature(1997)388:839-40；Takeda et al.，J.Pathol.(1998)152:367-72；Wakabayashi et al.，Neurosci.Lett.(1997)239:45-8)。α-突触核蛋白基因的突变与帕金森氏病罕见的家族形式共分离(co-segregate)(参见Kruger et al.，Nature Gen.(1998)18:106-8；Polymeropoulos，et al.，Science(1997)276:2045-7)。α-突触核蛋白在转基因小鼠(Masliah et al.，Science(2000)287:1265-9)和果蝇(参见Feany et al.，Nature(2000)404:394-8)中的过度表达模拟了路易体病病理学的几个方面。此外，已有研究显示可溶性的突触核蛋白低聚体可能毒害神经(参见Conway et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97:571–576；Volles et al.，J.Biochemistry(2003)42:7871–7878)。在多个物种和动物模型(如人类、小鼠和果蝇)中具有相似形态和神经病变的α-突触核蛋白的聚集表明该分子在路易体病的发病中起了作用。
技术实现要素：
本发明提供一种具有单克隆抗体5C1由Kabat定义的3个轻链CDRs和由Kabat定义3个重链CDRs的单克隆抗体，除CDRH2之外的每个CDR具有高达4个缺失、插入或替代，CDRH2具有高达6个缺失、插入或替代。5C1是一种小鼠抗体，其特征是重链可变区具有包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列，轻链可变区具有包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。可选地，所述抗体具有单克隆抗体5C1由Kabat定义的3个轻链CDRs和由Kabat定义3个重链CDRs。可选地，所述单克隆抗体是单克隆抗体5C1的人源化抗体、嵌合抗体或饰面(veneered)抗体。可选地，所述抗体是Fab片段或 单链Fv。可选地，所述抗体具有人类IgG2同种型或IgG4同种型。
本发明提供一种包括成熟重链可变区和成熟轻链可变区的抗体，所述成熟重链可变区具有与H4(SEQ ID NO:17)具有至少90％的同一性的氨基酸序列，所述成熟轻链可变区具有与L3(SEQ ID NO:31)具有至少90％的同一性的氨基酸序列，其中所述抗体特异性结合人类α-突触核蛋白。某些此类抗体包括SEQ ID NO:9的3个Kabat CDRs和SEQ ID NO:24的3个Kabat CDRs。在某些抗体中，H11,H27,H30,H48,H73位中的至少一个分别被L,Y,T,I,K占据，且L12和L14位中的至少一个被S占据。在某些抗体中，H11,H27,H30,H48,H73位中的至少一个分别被L,Y,T,I,K占据，且L12和L14均被S占据。在某些抗体中，H67,H69,H91,H94位中的至少一个分别被A,L,F,S占据。在某些抗体中，H67,H69,H94位分别被A,L,S占据。在某些抗体中，H94位被S占据。在某些抗体中，L2,L45,L49,L87位中的至少一个分别被V,K,N,F占据。在某些抗体中，L2,L49,L87位分别被V,N,F占据。某些抗体包括氨基酸序列与H4(SEQ ID NO:17)具有至少95％同一性的成熟重链可变区和氨基酸序列与L3(SEQ ID NO:31)具有至少95％同一性的成熟轻链可变区。在某些抗体中，成熟重链可变区和成熟轻链可变区的CDRs与H4和L3(分别为SEQ ID NOS:17和31)的所有差异均位于H60～H65位。
某些抗体包括具有如H4(SEQ ID NO:17)所示的氨基酸序列的成熟重链可变区和具有如L3(SEQ ID NO:31)所示的氨基酸序列的成熟轻链可变区。某些抗体包括具有如H5(SEQ ID NO:18)所示的氨基酸序列的成熟重链可变区和具有如L3(SEQ ID NO:31)所示的氨基酸序列的成熟轻链可变区。
在任一上述抗体中，所述抗体在恒定区可能具有至少一个突变。任选地，所述突变通过恒定区降低了补体结合或活性。可选地，所述抗体在EU编号的241,264,265,270,296,297,322,329,331位的一个或多个发生突变。
在任一上述抗体中，所述成熟重链可变区可以融合到重链恒定区域，所述成熟轻链恒定区域可以融合到轻链恒定区域。
在任一上述抗体中，所述重链恒定区域可以是天然人类恒定区域的突 变形式，相对于天然人类恒定区域，其与Fcγ受体的结合能力下降。
在任一上述抗体中，所述重链恒定区域可以是人类IgG1同种型(isotype)的重链恒定区域。在某些抗体中，同种异型(allotype)是G1m3。在某些抗体中，同种异型是G1m1。
本发明提供了一种人源化(humanizing)抗体的方法，包括：确定小鼠抗体5C1的重链和轻链可变区序列；合成编码含有小鼠抗体重链CDRs的人源化重链核酸以及编码含有小鼠抗体轻链CDRs的人源化轻链的核酸；在宿主细胞中表达所述核酸，以产生人源化抗体。
本发明还提供了一种制备抗体5C1的人源化抗体、嵌合抗体或饰面型抗体的方法，包括培养转化了编码所述抗体的重链和轻链核酸序列的细胞，从而使得所述细胞分泌所述抗体；从细胞培养基中纯化所述抗体。
本发明还提供了一种制备产生抗体5C1的人源化抗体、嵌合抗体或饰面型抗体的细胞系的方法，包括：将编码抗体的重链和轻链以及选择标记的载体导入到细胞内；在一定条件下增殖所述细胞，选择所述载体复制数目增加的细胞；从所述选择的细胞中分离单细胞；存储基于抗体产量而选择的单细胞克隆的细胞。某些方法进一步包括在选择性条件下增殖所述细胞，筛选自然表达和分泌为至少100mg/L/106个细胞/24h的细胞系。
本发明进一步提供了一种含有上述任一种抗体的药物组合物。
本发明进一步提供一种治疗路易体病或实现路易体病预防的方法，包括：施用有效治疗方案的上述任一种抗体，从而治疗路易体病或实现路易体病预防。
本发明进一步提供了一种减少路易小体在患有路易体病或具有患路易体病风险的患者体内形成的方法，包括给所述患者施用有效剂量的上述任一种抗体。
本发明进一步提供了一种治疗患有路易体病或具有患路易体病风险的患者的方法，包括给患者施用有效治疗方案的上述任一种抗体。在某些方法中，该疾病是帕金森氏病。在某些方法中，该疾病是REM睡眠行为障碍(RBD)。在某些方法中，该疾病是路易体痴呆(DLB)或多系统萎缩症(MSA)。在某些方法中，患者的认知功能的衰退被抑制。在某些方法中，神经炎和/ 或轴突α突触核蛋白的聚集被减弱。在某些方法中，患者的神经炎性营养不良(neuritic dystrophy)缓解。在某些方法中，突触和/或树突细胞密度被维持。在某些方法中，该方法维持了患者的突触小泡蛋白(synaptophysin)和/或MAP2。
本发明进一步提供了一种抑制患有路易体病或具有患路易体病风险的患者体内的突触核蛋白聚集或减少路易小体的方法，包括给患者施用有效剂量的上述任一种抗体。在某些方法中，该疾病是帕金森氏病。在某些方法中，患者的认知功能的衰退被抑制。在某些方法中，神经炎和/或轴突α突触核蛋白的聚集被减弱。在某些方法中，患者的神经炎性营养不良缓解。在某些方法中，突触和/或树突细胞密度被维持。在某些方法中，该方法维持了患者的突触小泡蛋白和/或MAP2。
本发明进一步提供了一种检测患有路易体病或具有患路易体病风险的患者体内的路易小体的方法，包括：给患者施用有效剂量的上述任一种抗体，其中所述抗体结合到路易小体上；检测患者体内结合的抗体。可选地，所述抗体被标记。
本发明进一步提供一种分离的适于编码上述任一种抗体的核酸、载体和宿主细胞。
附图说明
图1显示了小鼠5C1重链成熟可变区的氨基酸序列。根据Kabat定义的CDR区有下划线并为粗体。
图2显示了小鼠5C1轻链成熟可变区的氨基酸序列。根据Kabat定义的CDR区有下划线并为粗体。
图3显示了在Morris水迷宫实验探测中，5C1对记忆功能被动免疫治疗的结果。
图4显示了在平衡木实验(round beam test)中，5C1对速度和失误被动免疫治疗的结果。
图5显示了测试不同人源化5C1抗体亲和力的ELISA实验结果。
图6显示了用于确定α突触核蛋白结合9E4抗体的表位的丙氨酸扫描 突变的实验结果。图6的上部分显示了全长α突触核蛋白(野生型或残基118～126各个位点突变型，如图标记)用9E4抗体(左边)或对照抗体1H7(右边)染色的Western blot结果图。图6的下部分显示了α突触核蛋白结合9E4抗体的表位。
图7显示了用于确定α突触核蛋白结合5C1抗体的表位的丙氨酸扫描突变的实验结果。图7的上部分显示了全长α突触核蛋白(野生型或残基118～126各个位点突变型，如图标记)用5C1抗体(左边)或对照抗体1H7(右边)染色的Western blot结果图。图7的下部分显示了α突触核蛋白结合5C1抗体的表位。
图8显示了用于确定α突触核蛋白结合5D12抗体的表位的丙氨酸扫描突变的实验结果。图8的上部分显示了全长α突触核蛋白(野生型或残基118～126各个位点突变型，如图标记)用5D12抗体(左边)或对照抗体1H7(右边)染色的Western blot结果图。图6的下部分显示了α突触核蛋白结合5D12抗体的表位。
图9显示了α突触核蛋白临近9E4,5C1和5D12抗体结合位点的氨基酸的球棒模型。
序列说明
SEQ ID NO:1是野生型人类α突触核蛋白。
SEQ ID NO：2是Jensen等人报道(1995年)的α-突触核蛋白的非淀粉样成分(NAC)结构域。
SEQ ID NO：3是Ueda等人报道(1993年)的α-突触核蛋白的非淀粉样成分(NAC)结构域。
SEQ ID NO:4是人类α突触核蛋白的5C1多肽免疫原氨基酸残基118～129。
VDPDNEAYEGGC
SEQ ID NO:5是编码小鼠5C1重链可变区的核酸序列以及编码信号肽的序列(下划线标记)。
atggaaaggcactggatctttctcttcctgttatcagtaactggaggtgtccactcccaggtccagctgcagc agtctggggctgaactggcaaaacctgggacctcagtgcagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttactaattactggatgaactggataaaagcgaggcctggacagggtctggaatggattggggctactaatcctaacaatggttatactgactacaatcagaggttcaaggacaaggccatattaactgcagacaaatcctccaatacagcctacatgcacctgagcagcctgacatctgaagactctgcagtctatttctgtgcaagtggggggcacttggcttactggggccaggggactgtggtcactgtctctgca
SEQ ID NO:6是小鼠5C1重链可变区以及信号肽(下划线标记)。
MERHWIFLFLLSVTGGVHSQVQLQQSGAELAKPGTSVQMSCKASGYTFTNYWMNWIKARPGQGLEWIGATNPNNGYTDYNQRFKDKAILTADKSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYFCASGGHLAYWGQGTVVTVSA
SEQ ID NO:7是编码小鼠5C1轻链可变区的核酸序列以及编码信号肽的序列(下划线标记)。
atgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgcttccagcagtgatgttgtgatgacccaaattccactctacctgtctgtcagtcctggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttttccatagtaaaggaaacacctatttacattggtatctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatcaacagggtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcggagtggaggctgaagatctgggagtttatttctgttctcaaagtgcacatgttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaga
SEQ ID NO:8是小鼠5C1轻链可变区以及信号肽(下划线标记)。
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQIPLYLSVSPGDQASISCRSSQSLFHSKGNTYLHWYLQKPGQSPKLLINRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDLGVYFCSQSAHVPWTFGGGTKLEIR
SEQ ID NO:9是小鼠5C1成熟重链可变区，CDRs用下划线标记出。下划线标记的CDRs是根据Kabat定义的，除了下划线标记的CDRH1是Kabat和Chothia共同定义的。
QVQLQQSGAELAKPGTSVQMSCKASGYTFTNYWMNWIKARPGQGLEWIGATNPNNGYTDYNQRFKDKAILTADKSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYFCASGGHLAYWGQGTVVTVSA
SEQ ID NO:10是5C1重链CDR1序列。
NYWMN
SEQ ID NO:11是5C1重链CDR2序列。
ATNPNNGYTDYNQRFKD
SEQ ID NO:10是5C1重链CDR3序列。
GGHLAY
SEQ ID NO:13是人类VH受体FR(Acc#AAY42876.1)。
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNNYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTTYAQKFQGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGNLNWLDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:14是人源化5C1H1序列。
QVQLVQSGAELKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEWIGATNPNNGYTDYNQRFKDRATLTADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGHLAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:15是人源化5C1H2序列。
QVQLVQSGAELKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEWIGATNPNNGYTDYNQRFKDRVTITADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGHLAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:16是人源化5C1H3序列。
QVQLVQSGAELKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEWIGATNPNNGYTDYNQRFKDRATLTADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYFCASGGHLAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:17是人源化5C1H4序列。
QVQLVQSGAELKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEWIGATNPNNGYTDYNQRFKDRATLTADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCASGGHLAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:18是人源化5C1H5序列。
QVQLVQSGAELKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEWIGATNPNNGYTDYNQRFKDRVTITADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCASGGHLAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:19是编码人源化5C1H1的核酸序列以及编码信号肽的序 列(下划线标记)。
ATGGAGTTCGGCCTGTCCTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGCGTGCAGTGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGCTGAAGAAGCCCGGCTCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCACCAACCCCAACAACGGCTACACCGACTACAACCAGCGCTTCAAGGACCGCGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCCACCAACACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGCGCTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGGCGGCCACCTGGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO:20是编码人源化5C1H2的核酸序列以及编码信号肽的序列(下划线标记)。
ATGGAGTTCGGCCTGTCCTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGCGTGCAGTGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGCTGAAGAAGCCCGGCTCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCACCAACCCCAACAACGGCTACACCGACTACAACCAGCGCTTCAAGGACCGCGTGACCATCACCGCCGACAAGTCCACCAACACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGCGCTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGGCGGCCACCTGGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO:21是编码人源化5C1H3的核酸序列以及编码信号肽的序列(下划线标记)。
ATGGAGTTCGGCCTGTCCTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGCGTGCAGTGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGCTGAAGAAGCCCGGCTCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCACCAACCCCAACAACGGCTACACCGACTACAACCAGCGCTTCAAGGACCGCGCCACCCTGACCGCCGACAAG TCCACCAACACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGCGCTCCGAGGACACCGCCGTGTACTTCTGCGCCTCCGGCGGCCACCTGGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO:22是编码人源化5C1H4的核酸序列以及编码信号肽的序列(下划线标记)。
ATGGAGTTCGGCCTGTCCTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGCGTGCAGTGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGCTGAAGAAGCCCGGCTCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCACCAACCCCAACAACGGCTACACCGACTACAACCAGCGCTTCAAGGACCGCGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCCACCAACACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGCGCTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCTCCGGCGGCCACCTGGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO:23是编码人源化5C1H5的核酸序列以及编码信号肽的序列(下划线标记)。
ATGGAGTTCGGCCTGTCCTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGCGTGCAGTGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGCTGAAGAAGCCCGGCTCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCACCAACCCCAACAACGGCTACACCGACTACAACCAGCGCTTCAAGGACCGCGTGACCATCACCGCCGACAAGTCCACCAACACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGCGCTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGGCCACCTGGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO:24是小鼠5C1成熟轻链可变区，CDRs用下划线标记出。下划线标记的CDRs是根据Kabat定义的。
DVVMTQIPLYLSVSPGDQASISCRSSQSLFHSKGNTYLHWYLQKPGQSPKLLINRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDLGVYFCSQSAHVPWTFGGGTKLEIR
SEQ ID NO:25是5C1轻链CDR1序列。
RSSQSLFHSKGNTYLH
SEQ ID NO:26是5C1轻链CDR2序列。
RVSNRFS
SEQ ID NO:27是5C1轻链CDR3序列。
SQSAHVPWT
SEQ ID NO:28是人类VL受体FR(Acc#CAB51293.1)。
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPPTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:29是人源化5C1L1序列。
DVVMTQSPLSLSVSPGEPASISCRSSQSLFHSKGNTYLHWYLQKPGQSPKLLINRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSAHVPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:30是人源化5C1L2序列。
DIVMTQSPLSLSVSPGEPASISCRSSQSLFHSKGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSAHVPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:31是人源化5C1L3序列。
DVVMTQSPLSLSVSPGEPASISCRSSQSLFHSKGNTYLHWYLQKPGQSPQLLINRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSAHVPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:32是人源化5C1L4序列。
DIVMTQSPLSLSVSPGEPASISCRSSQSLFHSKGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSAHVPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:33是编码人源化5C1L1的核酸序列以及编码信号肽的序列(下划线标记)。
ATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGATGCTGTGGGTGTCCGGCTCCTCCGGCGACGTGGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGTCCGTGTCCCCCGGCGAGCCCGCCTCCATCTCCTGCCGCTCCTCCCAGTCCCTGTTCCACTCCAAGGGCAACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCAACCGCGTGTCCAACCGCTTCTCCGGCGTGCCCGACCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTTCTGCTCCCAGTCCGCCCACGTGCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:34是编码人源化5C1L2的核酸序列以及编码信号肽的序列(下划线标记)。
ATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGATGCTGTGGGTGTCCGGCTCCTCCGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGTCCGTGTCCCCCGGCGAGCCCGCCTCCATCTCCTGCCGCTCCTCCCAGTCCCTGTTCCACTCCAAGGGCAACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTACCGCGTGTCCAACCGCTTCTCCGGCGTGCCCGACCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTCCCAGTCCGCCCACGTGCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:35是编码人源化5C1L3的核酸序列以及编码信号肽的序列(下划线标记)。
ATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGATGCTGTGGGTGTCCGGCTCCTCCGGCGACGTGGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGTCCGTGTCCCCCGGCGAGCCCGCCTCCATCTCCTGCCGCTCCTCCCAGTCCCTGTTCCACTCCAAGGGCAACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCAACCGCGTGTCCAACCGCTTCTCCGGCGTGCCCGACCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTG GGCGTGTACTTCTGCTCCCAGTCCGCCCACGTGCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:36是编码人源化5C1L4的核酸序列以及编码信号肽的序列(下划线标记)。
ATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGATGCTGTGGGTGTCCGGCTCCTCCGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGTCCGTGTCCCCCGGCGAGCCCGCCTCCATCTCCTGCCGCTCCTCCCAGTCCCTGTTCCACTCCAAGGGCAACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACCGCGTGTCCAACCGCTTCTCCGGCGTGCCCGACCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTCCCAGTCCGCCCACGTGCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:37是编码示例性人类IgG1恒定区的核酸序列。
gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagaccacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgtcaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacacgctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgcgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga
SEQ ID NO:38是示例性人类IgG1恒定区的氨基酸序列。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNVKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:39是编码示例性人类κ轻链恒定区的核酸序列。
ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO:40是示例性人类κ轻链恒定区的氨基酸序列。
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
定义
基本抗体结构单元是亚基四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每一对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50～70kDa)。每条链的氨基末端部分包括大约100～110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。该可变区最初表达时，连接到可切割的信号肽。不含信号肽的可变区有时称作成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区是指不含轻链信号肽的轻链可变区。每条链的羧基末端部分定义为恒定区，主要负责效应功能。恒定区包括CH1区,铰链区,CH2区和CH3区的任一个或全部。
轻链分为κ或λ。重链分为γ，μ，α，δ或ε，并将抗体的亚型分别定义为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。在轻链和重链内部，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接在一起，重链还包括大约10个或更多氨基酸的“D”区。(通常参见，Fundamental Immunology(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.,1989,Ch.7)，出于所有目的，其全文通过引用的方式并入本文中)。
每个轻/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整的抗体有两个结合位点。除了在双功能抗体或双特异性抗体外，这两个结合位点是相同的。这些链均表现出相同的一般结构，即被三个高变区连接的相对保守的框架区(FR)，高变区也称为互补决定区或CDR。每一对的两条链的CDR通过框架区匹配，使其能够结合到特定表位。从N末端到C末端，轻链和重链都包含FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4结构域。每个结构域中氨基酸的分配是按照Kabat(参考Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987和1991)或Chothia和Lesk(参考J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等,Nature 342:878-883(1989))定义的。Kabat还提供了一种广泛使用的编号规则(Kabat编号)，其中不同的重链之间或不同的轻链之间的对应残基被赋予相同的号码(例如，H83表示成熟重链可变区中由Kabat编号的第83号位置；同样L36位置表示成熟轻链可变区中由Kabat编号的第36号位置)。除非另有明确说明，在涉及抗体可变区的位置中全部使用Kabat编号。
术语“抗体”包括完整抗体和它们的结合片段。通常，片段与完整抗体竞争，片段从完整抗体衍生而来，特异性结合到靶标，它们包括单独的重链、单独的轻链、Fab、Fab'，F(ab')2、F(ab)C、Fv、单链抗体和单域抗体。单(可变)域抗体包括VH区，该VH区是从常规抗体中其对应VL分离的(反之亦然)(参考Ward et al.,1989,Nature 341:544-546)，以及来自例如骆驼或软骨鱼(例如，护士鲨)物种的VH区(有时也称为VHH)，在这些物种中，VH区与VL区无关联(参考，例如WO 9404678)。其中一条链是从其天然对应链分离的单域抗体有时也称为Dabs，来自骆驼或软骨鱼的单域抗体有时也称为纳米抗体。恒定区或部分恒定区可能存在于单域 抗体中，也可能不存在于单域抗体中。例如，来自骆驼的天然单可变域抗体包括VHH可变区，CH2和CH3恒定区。根据传统抗体的分类方法，单域抗体，例如，纳米抗体属于人源化抗体。Dabs抗体通常获自人类来源的抗体。片段可以通过DNA重组技术，或通过完整免疫球蛋白的酶或化学分解产生。
术语“抗体”还包括双特异性抗体和/或人源化抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体(参见，例如，Songsivilai and Lachmann,Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelny et al.,J.Immunol.148:1547-53(1992))。在一些双特异性抗体中，这两个不同重/轻链对包括人源化的5C1重链/轻链对以及对5C1结合的α-突触核蛋白具有不同特异表位的重链/轻链对。
在一些双特异性抗体中，一个重链轻链对是如下面进一步公开的人源化1H7抗体，并且所述重轻链对是来自于与表达在血脑屏障上的受体相结合的抗体，如胰岛素受体，胰岛素样生长因子(IGF)受体，瘦素受体，脂蛋白受体，或转铁蛋白受体(Friden等，PNAS88:4771-4775，1991；Friden等，Science 259:373-377，1993)。通过由受体介导的转胞吞作用，这些双特异性抗体能够转移越过血脑屏障。可以通过设计双特异性抗体进一步提高双特异性抗体的脑摄取，以降低其对血脑屏障受体的亲和力。降低对受体的亲和力导致了它在大脑中更广泛的分布(参见，例如，Atwal等.Sci.Trans.Med.3,84ra43,2011；Yu等.Sci.Trans.Med.3,84ra44,2011)。
示例性的双特异性抗体也可以是：(1)双可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和重链都含有两个通过短肽键串联的可变结构域(Wu等,Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-IgTM)Molecule,In:Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(2)Tandab，它是两个单链双抗体融合产生的四价双特异性抗体，它对每个靶抗原都有两个结合位点；(3)flexibody，它是scFvs与双抗体结合产生的多价分子；(4)所谓的“对接和锁定”分子，它基于蛋白激酶A中的“二聚化和对接结构域”，其中，当它应用到Fabs时，可以产生由连接到不同Fab片段的两个相同Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(5)所 谓的蝎子分子(Scorpion molecule)，包括，例如，两个融合到人Fc区的两个末端的scFv。用于制备双特异性抗体平台的实例包括但不限BiTE(MICROMET)，DART(MacroGenics)，Fcab和Mab2(F-star)，Fc-engineered IgGl(Xencor)或DuoBody(基于Fab臂交换，Genmab)。
“抗原”是指被抗体特异性结合的实体。
术语“表位”指的是抗原上与抗体结合的位点。表位可由连续的氨基酸形成，或由一种或多种蛋白质三级折叠并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位暴露在变性溶剂中时，通常被保留，而由三级折叠形成的表位用变性溶剂处理时，通常会丧失。表位通常包括至少2或3个，通常更多个，至少5或8～10个具有独特空间构象的氨基酸。确定空间构象的方法包括，例如，X射线晶体学和二维核磁共振。参考See,e.g.,Epitope Mapping Protocols,in Methods in Molecular Biology,Vol.66,Glenn E.Morris,Ed.(1996)。表位可能包括C端残基或N端残基。表位也可能包括，但不必须包括多肽的游离氨基基团或多肽的游离羧基基团。因此，表位可能包括C端残基或N端残基，但不必须包括游离的羧基基团或游离的氨基基团。特异性结合的抗体有时是由氨基酸范围(range)定义的。如果一个抗体结合到位于SEQ ID NO:1的118～126位氨基酸内的表位，意味着该表位位于氨基酸列举的范围内，所述氨基酸包括那些定义范围界限的氨基酸。这并不一定意味着位于范围内的每个氨基酸构成表位的一部分。因此，例如，位于SEQ ID NO:1的118～126位氨基酸内的表位可能包括118～124,119～125,120～126,120～124或120～122位，SEQ ID NO:1其他片段中的氨基酸组成。
识别相同或重叠表位的抗体可以在简单的免疫实验中鉴定，其显示一种抗体与另一种抗体竞争结合靶抗原的能力。也可以通过结合其抗原的抗体的X射线晶体结构来识别接触残基，确定抗体的表位。可选地，如果在抗原上所有减少或丧失与一种抗体结合的氨基酸突变减少或丧失与另一种抗体的结合，那么这两种抗体具有相同的抗原决定簇。如果某些减少或丧失与一种抗体结合的氨基酸突变减少或丧失与另一种抗体的结合，那么这两种抗体具有重叠的表位。
抗体间的竞争是通过实验来确定的，在实验中，受试抗体抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合(参见，例如，Junghans等,Cancer Res.50:1495,1990)在竞争性结合试验测量中，如果过量的受试抗体(例如，至少2倍，5倍，10倍，20倍或100倍)抑制参考抗体至少50％，75％，90％或99％的结合，那么这种受试抗体与参考抗体竞争。由竞争试验确定的抗体(竞争性抗体)包括结合到与参考抗体相同的表位的抗体，以及由于空间位阻发生，结合到足够接近参考抗体的表位的相邻表位的抗体。
本发明的抗体与其靶标结合的亲和力至少为106，107，108，109或1010M-1。只要其结合高于可检测的量级，其区别于与至少一个不相关的目标发生的非特异性结合，那这样的结合就是特异性结合。特异性结合可以是特定官能团形成键或特定空间拟合(例如，锁和钥匙的类型)的结果，然而非特异性结合通常是范德华力的结果。但是特异性结合不一定意味着单克隆抗体结合一个靶标且只结合一个靶标。
在比较抗体序列时，序列同一性百分比是通过Kabat编号惯例最大限度匹配的抗体序列来确定的。比对后，如果受试抗体区(例如，重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区域相比较，那么受试抗体和参考抗体区域之间的序列同一性百分比是受试抗体和参照抗体区域中相同氨基酸所占位置的数量除以这两个区域进行比对的位置的总数量，再乘以100来转换为百分比的。
为了将氨基酸替换归类为保守或非保守，氨基酸分组如下：第I组(疏水性侧链)：甲硫氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸；第II组(中性亲水侧链)：半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸；第III组(酸性侧链)：天冬氨酸，谷氨酸；第Ⅳ组(碱性侧链)：冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸；第V组(影响链取向的残基)：甘氨酸，脯氨酸；和第VI组(芳香族侧链)：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。保守替换包括同一类氨基酸之间的替换。非保守替换是把这些类中一个类的成员换成这些类中另一个类的成员。
单克隆抗体通常以分离的形式提供。这意味着抗体通常是重量百分数至少为50％的干扰蛋白质以及在其生产或纯化过程中产生的其他杂质，但 并不排除抗体与过量的药物上可接受的载体或其他的媒介物结合以便于其使用的可能性。有时，单克隆抗体是重量百分数至少为60％，70％，80％，90％，95％或99％的该单克隆抗体或其他蛋白质的聚合物或片段以及杂质。某些单克隆抗体可能包括重量百分数至少为99％的其他蛋白质的聚合物或片段以及杂质。
“包括”一个或多个列举的元素的组合物或方法可能包括未具体列举的其他元素。例如，一种包含抗体的组合物，可以包含单独的抗体或抗体与其他成分的组合。
值的范围的指定包括在所述范围内或界定所述范围的所有整数，以及由范围内的整数界定的所有子范围。
除非上下文中另有说明，术语“约”包括在规定值的测量标准误差(SEM)内的值。
统计学意义指P≤0.05。
“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人或其他哺乳动物受试者。
如果受试者有至少一种已知的风险因素(例如，遗传、生化、家族史、环境暴露)，这种风险因素使具有这种风险因素的个体比不具有这种风险因素的个体有统计学显著的更大的风险发展这种疾病，那么该个体患疾病的风险增加。
术语“症状(symptom)”指的是疾病的主观证据，如病人感知的步态改变。“信号(sign)”是指由医生观察到疾病的客观证据。
“认知功能”是指心理过程，如注意力，记忆力，产生和理解语言，解决问题，对周围环境感兴趣和自我护理中的任一种或所有。
“增强的认知功能”或“改善的认知功能”指的是相对于基准线(例如，诊断或治疗开始)的改善。“认知功能下降”是指相对于该基准线，功能上的降低。
在动物模型系统(如大鼠或小鼠)中，认知功能可能通过以下方法测量，包括使用：迷宫(例如，Morris水迷宫(Morris water maze)，巴恩斯圆形迷宫(Barnes circular maze)，高架旋臂迷宫(elevated radial arm maze)，T迷宫或其他迷宫)，在迷宫中，受试者使用空间信息；恐惧状况；主动回 避；被照明的开放地；黑暗活度仪(dark activity meter)；高架十字迷宫；二室探索性测试或强制游泳实验。
人类的认知功能可以通过几个标准化试验中的一个或多个测量。认知功能测试或分析的例子已被描述(参考Ruoppila,l.and Suutama,T.Scand.J.Soc.Med.Suppl.53,44-65,1997)，其中包括标准化的心理测验(参见Ruoppila,l.and Suutama,T.Scand.J.Soc.Med.Suppl.53,44-65,1997)，神经心理测验(如Luria-Nebraska)，元认知的自我评估(如元记忆问卷)，视觉空间筛查试验(如Poppelreuter图像,表盘认知,Honeycomb画图和划销)，认知筛查试验(如Folstein的简易精神状态测试)和反应时间测试。认知能力的其他标准测试包括阿尔茨海默病评估量表认知分量表(ADAS-cog)；临床总体印象变化量表(CIBIC-plus scale)；阿尔茨海默氏病合作研究活动的日常生活能力量表(ADCS-ADL)；简易精神状态检查(MMSE)；神经精神量表(NPI)；临床痴呆评定量表(CDR)；剑桥神经心理测试自动平台(CANTAB)或山德士临床评估-老年病人(SCAG)，Stroop测验，注意测验(Trail Making)，韦氏数字广度以及CogState计算机化的认知测试。此外，认知功能可使用成像技术来测量，例如，正电子发射断层扫描(PET)、功能磁共振成像(fMRI)、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)或任何其他测量脑功能的成像技术。
具体实施方式
I.概述
本发明提供了单克隆抗体5C1及相关抗体，例如，结合到α-突触核蛋白上相同表位(例如，α-突触核蛋白表位118～126)的抗体。本发明的抗体可以用于，例如，治疗α-突触核蛋白聚集(尤其是路易小体聚集)相关的紊乱。这样的紊乱包括路易体病，例如，帕金森氏病，弥漫性路易体病(DLBD)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、综合阿尔茨海默病和帕金森氏病、单纯性自主神经衰竭和多系统萎缩(MSA)。这些抗体也可用于路易体病的诊断。
II.目标分子
天然人类野生型α-突触核蛋白是一种含有140个氨基酸的多肽，其氨基酸序列如下：
MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA
(SEQ ID NO:1)
(参考Uéda等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11282-6,1993；GenBank登录号：P37840)。所述蛋白质具有三个识别域，覆盖氨基酸1～61的KTKE重复结构域，从约第60个氨基酸至第95个氨基酸的NAC(非淀粉样成分)域，和从约第98个氨基酸到第140个氨基酸的C-末端酸性结构域。Jensen等已经报道NAC具有以下氨基酸序列：
EQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFV(SEQ ID NO:2)
(参考Jensen等，Biochem.J.310(Pt 1):91-94,1995；GenBank登录号S56746)。但是，Uéda等(1993)报道NAC具有以下氨基酸序列：KEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGS(SEQ ID NO:3)
(参考Uéda等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11282-6)。
除非上下文另有说明，本文提到的α-突触核蛋白或其片段包括上文所述的天然人类野生型氨基酸序列及其人类等位变体，特别是与路易体病相关的那些序列(例如，E46K、A30P和A53T，第一个字母表示SEQ ID NO：1中的氨基酸，数字表示在SEQ ID NO：1中的编码位置；而第二个字母表示等位变体中的氨基酸)。此类变体可选择性地单独存在或以任何组合形式存在。增加α突触核蛋白聚集的诱发突变E83Q、A90V和A76T也可以单独存在或与彼此和/或人类等位变体E46K，A30P和A53T组合存在。
III.路易体病
路易体病(LBD)的特征在于多巴胺能系统退化，运动改变，认知障碍，路易体(LBs)形成(参考McKeith等，Neurology(1996)47:1113-24)。路易体是神经细胞中发现的球状蛋白质沉淀。其在大脑中的存在会扰乱大脑的正常功能，妨碍包括乙酰胆碱和多巴胺在内的化学信使的活动。路易体病包括帕金森氏病(包括特发性帕金森氏病)，弥漫性路易体病(DLBD)， 也被称为路易体痴呆(DLB)，阿尔茨海默病的路易体变体(LBV)，结合的阿尔茨海默病和帕金森病以及多系统萎缩(MSA；例如，橄榄体脑桥小脑萎缩，纹状体黑质变性和Shy-Drager综合征)。DLBD具有阿尔茨海默氏症和帕金森氏病的症状。DLBD不同于帕金森氏症，主要表现在路易小体的位置。在DLBD中，路易小体主要在皮层中形成。在帕金森氏病中，路易小体主要在黑质中形成。其他路易体疾病包括纯自主神经衰竭，路易体吞咽困难，偶发性LBD，遗传性LBD(例如，α-突触核蛋白、PARK3和PARK4突变)。
IV.抗体
A.结合特异性和功能属性
5C1是本发明的示例性抗体，其重链和轻链成熟可变区分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:24所示。本发明还提供了与5C1竞争性结合α-突触核蛋白的抗体，或与5C1结合到相同或重叠表位，且具有相似功能属性(例如，减少α-突触核蛋白的神经性聚集，改善认知功能和/或保持突触和/或树突细胞的密度)的抗体。
通过以下方法制备其他具有这种结合特异性的抗体：通过α-突触核蛋白或其片段(例如，含有氨基酸残基118～126或其一部分的片段)免疫小鼠，筛选所得抗体以结合α-突触核蛋白，可选地，与5C1竞争性结合。优选能够产生与5C1具有相同表位的抗体的片段。也可以通过以下效果筛选抗体：(1)α-突触核蛋白转基因小鼠模型，经过行为实验(例如，水迷宫实验(MWM)或平衡木实验)和/或检测脑组织中的α-突触核蛋白，α-突触核蛋白聚集,突触小泡蛋白,MAP2和/或PSD95的免疫学实验；(2)具有α-突触核蛋白聚集特征的小鼠或其他非人类动物模型,经过行为实验(例如，水迷宫实验(MWM)或平衡木实验)和/或检测脑组织中的α-突触核蛋白，α-突触核蛋白聚集,突触小泡蛋白,MAP2和/或PSD95的免疫学实验；和/或(3)具有与α-突触核蛋白聚集相关状况的人类，经过合适的行为实验。可选地，或除上述方法之外，还可以筛选抗突变形式的α-突触核蛋白的抗体，以确认抗体对突变集合体(a collection of mutational changes)显示了与5C1相同或相似的结合模式。突变可以是对整个α-突触核蛋白或其一部分 (其中表位是已知的残基，例如，残基118～126))用丙氨酸(或如果丙氨酸已存在，则用丝氨酸)一次一个残基(或更宽的空间间距)的系统性替换。
图6～8和实施例6显示了5C1与其他两个结合到残基118～126上的抗体(命名为9E4和5D12)的比较。丙氨酸突变检测了在α-突触核蛋白的118～126位上突变各个氨基酸(一次突变一个)的效果。用残基118～126位上不同氨基酸突变引起的结合亲和力的相对改变图谱(换句话说，也就是对结合的贡献)来表征表位。对于5C1，残基120～122的任一突变均导致结合的显著下降。残基123或124的突变导致结合的显著下降，但下降没有120～122位那么多。残基118,119,125或126的突变导致结合亲和力更少下降，基本上没有改变结合亲和力。为了简化，突变效果可以大致被分成三类：残基120～122导致结合亲和力基本上完全丧失(和阴性对照没有区别)；残基118,119,125或126基本上不导致结合亲和力下降(和阳性对照没有区别)；残基123或124导致结合亲和力中等程度下降。5C1的表位因此大致能够被认为是由SEQ ID NO:1的残基120～124构成或基本由残基120～124构成的线性表位，残基120～122对结合做出了最大贡献。具有本段任一描述的特征的5C1表位的抗体在此被提供。一些抗体具有基本上由残基120～122而排除残基119～120构成的表位，意味着残基120～122中的每一个残基对于结合比任何其他残基贡献更多，残基119和120对于结合没有做出可检测的贡献(例如，通过实施例的丙氨酸扫描方法)。残基123和124可能对该抗体的结合做出了微小的贡献，也可能没有贡献。
对于5D12，其表位由丙氨酸突变表征如下。残基120～122的任一突变均导致结合的显著下降。残基118,199,123或124的突变导致结合的显著下降，但下降没有120～122位那么多。残基125或126的突变导致结合亲和力更少下降，基本上没有改变结合亲和力。为了简化，突变效果可以大致被分成三类：残基120～122突变导致结合亲和力基本上完全丧失(和阴性对照没有区别)；残基125和126基本上不导致结合亲和力下降(和阳性对照没有区别)；残基118,119,123和124导致结合亲和力中等程度下降。5D12的表位因此大致能够被认为是由SEQ ID NO:1的残基118～124 构成或基本由残基118～124构成的线性表位，残基120～122对结合做出了最大贡献。具有本段或实施例6任一描述的特征的5D12表位的其他抗体在此被提供。
同样地，9E4表位可以用残基122和125表征，残基122和125比残基118～121,123,124或126中的任一残基显示出更多的结合亲和力下降。为了简化，突变效果可以大致被分成两类：残基122和125导致结合亲和力基本上完全丧失；118～121,123,124或126基本上不导致结合亲和力下降。9E4表位因此大致能够被认为是构象表位，其中残基122和125提供了与9E4的接触位点(或对结合做出最大贡献)。具有本段或实施例6任一描述的特征的9E4表位的其他抗体在此被提供。可选地，抗体不是9E4或具有与9E4相同CDRs的其他抗体，也不是具有至少5个与9E4对应CDRs有至少85％同一性的Kabat CDRs的抗体。
利用噬菌体展示变体的方法制备选择的小鼠抗体(例如，5C1)的具有结合特异性的抗体。参考Winter,WO 92/20791。该方法尤其适合制备人类抗体。在该方法中，不管是选定的小鼠抗体的重链还是轻链可变区均可用作起始材料。例如，如果选择轻链可变区作为起始材料，构建一个噬菌体展示文库，该文库中的成员显示相同的轻链可变区(例如，小鼠起始材料)和不同的重链可变区。重链可变区可以从，例如，重排的人类重链可变区文库获得。选择出展示了强α突触核蛋白结合特异性(例如，至少108M-1，优选为至少109M-1)的噬菌体。来自该噬菌体的重链可变区然后作为构建进一步噬菌体文库的起始材料。在该文库中，每个噬菌体展示出相同的重链可变区(例如，与第一次展示文库相同的区)和不同的轻链可变区。该轻链可变区可以从，例如，重排的人类轻链可变区文库获得。再一次选择出展示了强α突触核蛋白结合特异性的噬菌体。所得的抗体通常具有与小鼠起始材料相同或相似的表位特异性。
通过编码示例性抗体(例如，5C1)的重链和轻链cDNA的突变获得其他抗体。相应地，本发明也包括了那些与5C1的成熟重和/或轻链可变区氨基酸序列具有至少70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一性且维持其功能属性的单克隆抗体，和/或那些与各个抗体由于少量功能不重要 的氨基酸替代、缺失或插入而不同的单克隆抗体。
本发明还提供了具有部分或全部(例如，3,4,5个，优选为6个)完全或基本来自5C1CDRs的单克隆抗体。该抗体可能包括具有至少2个，通常为全部3个完全或基本来自5C1重链可变区的CDRs的重链可变区和/或具有至少2个，通常为全部3个完全或基本来自5C1轻链可变区的CDRs的轻链可变区。优选地，该抗体同时包括重链和轻链。当一个CDR包括不多于4,3,2或1个替代、插入或缺失，且CDRH2(当用Kabat定义时)具有不多于6,5,4,3,2或1个替代(例如，保守替代)、插入或缺失时，该CDR基本来自于相应的5C1CDR。这样的抗体优选与5C1的成熟重和/或轻链可变区氨基酸序列具有至少70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一性且维持其功能属性，和/或与5C1由于少量功能不重要的氨基酸替代(例如，保守替代)、缺失或插入而不同。
优选的抗体显示出与5C1相似的功能活性，例如，减少神经和/或轴突的α突触核蛋白聚集，减少神经炎性营养不良，改善认知功能，扭转、治疗或抑制认知能力下降，和/或保持或增加突触密度和/或树突细胞密度。
B.嵌合和饰面抗体
本发明进一步提供了嵌合和饰面形式的非人类抗体，尤其是5C1。
嵌合抗体是一种非人类(例如，小鼠)抗体的轻链和重链的成熟可变区与人类轻链和重链的恒定区相结合的抗体。典型地，轻链和重链的恒定区是人类来源的，但根据需要(例如，为了便于在合适的动物模型中测试非人类抗体)，恒定区也可能来源于不同的非人类物种。这样的抗体基本上或完全保留了小鼠抗体的结合特异性，约含有三分之二的来源于人类恒定区的人类序列。
饰面抗体是一种人源化抗体，其保留了部分或通常是全部的CDRs和部分非人类抗体的非人类可变区框架残基，但是用来自人类抗体序列对应位置的残基替换掉其他可能参与B或T细胞表位的可变区框架残基(例如，暴露的残基)(参考Padlan,Mol.Immunol.28:489,1991)。结果是抗体中的CDRs完全或基本来自于非人类抗体，非人类抗体的可变区框架通过替换而变得更像人类的。
C.人源化抗体
人源化5C1抗体特异性结合到人类α-突触核蛋白。某些人源化抗体(例如，Ka)的亲和力可以在，例如，小鼠5C1抗体亲和力的5倍或2倍内。某些人源化抗体的亲和力与小鼠5C1的亲和力在实验误差内相同。某些人源化抗体的亲和力高于小鼠5C1的亲和力。优选的人源化抗体结合到相同的表位和/或与小鼠5C1竞争性结合至α-突触核蛋白。
人源化抗体是一种遗传工程化抗体，其中来自非人类“供体(donor)”抗体的CDR被嫁接到人类“受体(acceptor)”抗体的序列上(参见，例如，Queen等，US 5,530,101和5,585,089；Winter等，US 5,225,539；Carter，US6,407,213；Adair,US 5,859,205和6,881,557；以及Foote,US 6,881,557)。受体抗体的序列可以是，例如，成熟人类抗体的可变区序列，该序列的组合物，人类抗体序列的共有序列或种系区域序列。因此，人源化5C1抗体是一种具有部分或全部完全或基本上来自于小鼠5C1的CDRs和可变区框架序列的抗体，如果其具有恒定区，恒定区完全或基本上来自于人类抗体序列。类似地，人源化重链具有至少2个或通常是全部3个完全或基本上来自于供体抗体重链的CDRs，如果其具有重链可变区框架序列和重链恒定区，重链可变区框架序列和重链恒定区基本上来自于人类重链可变区框架和恒定区序列。类似地，人源化轻链具有至少2个或通常是全部3个完全或基本上来自于供体抗体轻链的CDRs，如果其具有轻链可变区框架序列和轻链恒定区，轻链可变区框架序列和轻链恒定区基本上来自于人类轻链可变区框架和恒定区序列。除掉纳米抗体和dAbs，人源化抗体包括人源化重链和人源化轻链。优选地，各个CDRs之间，至少85％,90％,95％或100％的相应残基(由Kabat定义)是相同的。当至少有85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％由Kabat定义的相应残基相同，那么抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区分别是基本上来自人类可变区框架序列或人类恒定区。
尽管人源化抗体通常包含全部6个来自于小鼠抗体的CDRs(优选为由Kabat定义)，它们也可能不包括全部来自于小鼠抗体的CDRs(至少3,4或5个)(参考，例如,Pascalis et al.,J.Immunol.169:3076,2002；Vajdos et al., Journal of Molecular Biology,320:415-428,2002；Iwahashi et al.,Mol.Immunol.36:1079-1091,1999；Tamura et al,Journal of Immunology,164:1432-1441,2000).
在某些抗体中，仅仅需要部分CDRs，以维持人源化抗体的结合，这部分CDRs是结合必须的CDR残基群，也称为特异性决定残基(SDRs)(Kashmiri et al.,Methods(2005)36(1):25-34)。基于之前的研究，在位于Chothia高变区环(Chothia,J.Mol.Biol.196:901,1987)外的Kabat CDRs区域，通过分子模型和/或经验，或如Gonzales等人在Mol.Immunol(41:863,2004)中的描述确定不接触抗原且没有位于SDRs中的CDR残基(例如，CDR H2中的H60～H65残基中的一个或多个或全部有时是不需要的)。在这些人源化抗体中，在那些一个或多个供体CDR残基缺失或整个供体CDR被删除的位点，占据这些位点的氨基酸可以是受体抗体序列中占据相应位点(由Kabat编号)的氨基酸。CDRs中含有的受体氨基酸替换供体氨基酸的数目反映了竞争考量间的平衡。这些替换在降低人源化抗体中小鼠氨基酸的数目从而降低潜在的免疫原性方面具有潜在的优势。但是，替换也可能引起亲和力的改变，且要优选避免亲和力的显著下降。CDRs中替换的位点和用于替换的氨基酸可以根据经验来选择。
可选择地，人类受体抗体序列可以选自多种已知的人类抗体序列，以提供人类受体序列可变区框架和相应的供体抗体链的可变区框架之间高度的序列同一性(例如，65％～85％的同一性)。
基于对CDR构象和/或与抗原结合的影响，人类可变区框架残基中的某些氨基酸可以被选择作为替换。通过模型、特定位点氨基酸特性检测、替换效果的经验观察或特定氨基酸突变来调查这些可能的影响。
例如，当小鼠可变区框架残基和选择的人类可变区框架残基的氨基酸不同时，人类框架氨基酸可以被小鼠抗体的等位框架氨基酸替换，只要合理预期该氨基酸：
(1)直接非共价结合抗原；
(2)邻近CDR区域；
(3)或者与CDR区域相互作用(例如，位于CDR区域约)(例如， 通过在同源的已知免疫球蛋白抗体链的已知结构上模拟轻链或重链而确定)；以及
(4)是参与VL-VH相互作用的残基。
如Queen,US 5,530,101定义的来自第1种至第3种的框架残基有时被交互地称为标准(canonical)残基和游标(Vernier)残基。有助于确定CDR环构象的框架残基有时被称作标准残基(参考Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196,901-917(1987),Thornton&Martin J.Mol.Biol.,263,800-815,1996)。支撑抗原结合环构象且在调整抗体适应抗原中起作用的框架残基有时被称为游标残基(参考Foote&Winter,1992,J Mol Bio.224,487–499)。
其他作为候选替换的框架残基是产生潜在糖基化位点的残基。还有其他候选的替换是人类免疫球蛋白位点不常见的受体人类框架氨基酸。这些氨基酸可以用来自小鼠供体抗体的等位氨基酸或来自更典型的人类免疫球蛋白的等位氨基酸替换掉。
本发明提供了人源化形式的小鼠5C1抗体。该小鼠抗体包括分别具有SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:24氨基酸序列的成熟重链和轻链可变区。本发明提供了5种示例性人源化成熟重链可变区：H1,SEQ ID NO:14；H2,SEQ ID NO:15；H3,SEQ ID NO:16；H4,SEQ ID NO:17和H5,SEQ ID NO:18。本发明进一步提供了4种示例性人源化成熟轻链可变区：L1,SEQ ID NO:29；L2,SEQ ID NO:30；L3,SEQ ID NO:31和L4,SEQ ID NO:32。本发明提供了含有这些成熟重链和轻链可变区任一组合的抗体，例如，H1L2,H1L3,H1L4,H2L1,H2L2,H2L3,H2L4,H3L1,H3L2,H3L3,H3L4,H4L1,H4L2,H4L3,H4L4,H5L1,H5L2,H5L3或H5L4。包括8个重链回复突变和5个轻链回复突变的H4L3变体对α-突触核蛋白亲和力(基于Biacore说明书测定)不超过小鼠和嵌合5C1抗体亲和力的2倍。参考下表3。如ELISA所测定，H4L3变体对α-突触核蛋白亲和力基本上与嵌合5C1抗体的亲和力相等(在实验误差范围内)，但高于小鼠5C1抗体的亲和力。参见图5。此外，包括6个重链回复突变和5个轻链回复突变的H5L3变体对α-突触核蛋白亲和力(基于Biacore说明书测定)不超过小鼠和嵌合5C1抗体亲和力的4倍。参考下表3。包括9个重链回复突变和2个轻链回复突变的H3L4变体 对α-突触核蛋白亲和力(ELISA测定)基本上与嵌合5C1抗体的亲和力相等(在实验误差范围内)，包括9个重链回复突变和分别5个，6个轻链回复突变的H3L3和H3L1变体对α-突触核蛋白亲和力高于小鼠5C1抗体的亲和力(ELISA测定)。
本发明提供了H4L3人源化5C1抗体的变体，其人源化成熟重链可变区与H4(SEQ ID NO:17)具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％的同一性，其人源化成熟轻链可变区与L3(SEQ ID NO:31)具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％的同一性。在这些抗体中，保留了H4L3中至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或全部13个回复突变。本发明还提供了H5L3人源化5C1抗体的变体，其人源化成熟重链可变区与H5(SEQ ID NO:18)具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％的同一性，其人源化成熟轻链可变区与L3(SEQ ID NO:31)具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％的同一性。在这些抗体中，保留了H5L3中至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或全部11个回复突变。本发明还提供了H3L4人源化5C1抗体的变体，其人源化成熟重链可变区与H3(SEQ ID NO:16)具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％的同一性，其人源化成熟轻链可变区与L4(SEQ ID NO:32)具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％的同一性。在这些抗体中，保留了H3L4中至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或全部11个回复突变。在某些抗体中，Vh区域中的H11,H27,H30,H48和H73中的至少一个分别被L,Y,T,I和K占据。在某些抗体中，Vh区域中的H11,H27,H30,H48和H73分别被L,Y,T,I和K占据。在某些抗体中，Vh区域中的H67,H69,H91和H94中的至少一个分别被A,L,F和S占据。在某些抗体中，Vh区域中的H67,H69和H94分别被A,L和S占据，例如，在重链H4中。在某些抗体中，H94位被S占据，例如，在重链H5。在某些抗体中，Vh区域中的H67,H69,H91和H94位分别被A,L,F和S占据，例如，在重链H3中。在某些抗体中，Vk区域中的L12和L14中的至少一个被S占据。在某些抗体中，Vk区域中的L12和L14被S占据。例如，在轻链L3和L4中。在某些抗体中，Vk区域中的L2,L45,L49和L87 中的至少一个分别被V,K,N和F占据。在某些抗体中，Vk区域中的L2,L49和L87分别被V,N和F占据，例如，在轻链L3中。在某些抗体中，Vk区域中的L2,L45,L49和L87被V,K,N和F占据，例如，在轻链L1中。这些人源化抗体的CDR区与H4L3或H5L3的CDR区相同或基本相同，H4L3或H5L3的CDR区与小鼠供体抗体的CDR区相同。CDR区域可以用任何常规定义方法(例如，Chothia)来定义，但优选用Kabat定义。
人源化5C1变体额外变异的可能性是可变区框架的额外回复突变。多个不与人源化mAb中的CDRs接触的框架残基可以适应来自供体小鼠mAb或其他小鼠或人类抗体相应位点的氨基酸的替换，甚至多个潜在的CDR接触残基也可以接受替换，或甚至CDRs中的氨基酸可以被改变为，例如，位于用于提供可变区框架的人类受体序列对应位点的残基。此外，替换的人类受体序列可以用于，例如，重链和/或轻链。如果采用不同的受体序列，可能不进行上述推荐的一个或多个回复突变，因为没有回复突变的话，相应的供体和受体残基已经是一样的。例如，当采用的重链受体序列的H11位已经被L占据，H48已经被I占据，和/或H73已经被K占据，相应的回复突变是没有必要的。类似地，当采用的轻链受体序列的L12和/或L14被S占据，相应的回复突变是没有必要的。
本发明还包括成熟轻链和重链可变区与人源化5C1H1L1,H1L2,H1L3,H1L4,H2L1,H2L2,H2L3,H2L4,H3L1,H3L2,H3L3,H4L1,H4L2,H4L4,H5L1,H5L2或H5L4的成熟轻链和重链可变区具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％序列同一性的人源化抗体。这些人源化抗体的CDR区与小鼠供体抗体的CDR区相同或基本相同。CDR区可以用任何常规定义方法(例如，Chothia)来定义，但优选用Kabat定义。
D.恒定区的选择
嵌合抗体、人源化抗体(包括饰面抗体)或人类抗体的重链可变区和轻链可变区可以被连接到足以与Fc受体相互作用的恒定区的至少一部分。恒定区通常是人类的，但根据需要也可以选择非人类恒定区。
恒定区的选择部分取决于是否期望抗体依赖的补体和/或细胞介导的细胞毒作用。例如，人类同种型IgG1和IgG3有补体介导的细胞毒作用，而 人类同种型IgG2和IgG4只有很弱的补体介导的细胞毒作用或没有补体介导的细胞毒作用。适于包括在本发明抗体中的人类IgG1恒定区具有如SEQ ID NO:38所示的序列。轻链恒定区可以是λ或κ。适于包括在本发明抗体中的人类κ轻链恒定区具有如SEQ ID NO：40所示的序列。抗体可以表达为含有两条轻链和两条重链的四聚体，单独的重链，单独的轻链，Fab，Fab'，F(ab')2或Fv片段，或单链抗体，单链抗体中重链成熟可变区和轻链成熟可变区通过间隔区(spacer)连接。
人类恒定区显示不同个体之间的同种异型变异(allotypic variation)和同族同种异型变异(isoallotypic variation)。也就是说，不同个体的恒定区在一个或多个多态性位点可以是不同的。同族同种异型不同于同种异型，在血清识别中，同族同种异型结合到一个或多个其它同型的非多态性区域。如下所述，参考的人类恒定区包括具有任一天然同种异型的恒定区或具有占据天然同族同种异型多肽位点的残基任一排列组合的恒定区，或具有高达3,5或10个替换的恒定区，以减弱或增强效应因子的功能。
轻链和/或重链的氨基或羧基末端的一个或几个氨基酸，如重链的C-末端赖氨酸，可能会丢失或在部分分子或全部分子中衍生化。替换可以在恒定区进行，以减弱或增强效应因子的功能，例如，补体介导的细胞毒作用或ADCC(参见，例如，Winter等，US Patent No.5,624,821；Tso等，US Patent No.5834597；和Lazar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:4005,2006)，或延长在人体中的半衰期(参见，例如，Hinton等,J.Biol.Chem.279:6213,2004)。示例性的替换包括第250位的Gln和/或第428位的Leu(在本段中，恒定区使用EU编号)，以增加抗体的半衰期。第234，235，236和/或237位中的任一或全部替换降低对Fcγ受体(尤其是FcγRI受体)的亲和力(参见，例如，US 6,624,821)。在人类IgG1中第234，235和237位进行丙氨酸替换可以用于减弱效应因子的功能。可选地，人类IgG2中第234，236和/或237位被替换为丙氨酸，第235位被替换为谷氨酰胺(参见，例如，US5,624,821)。在某些方面，也可以使人类IgG1第241,264,265,270,296,297,322,329和331位(EU编号)中一个或多个位点突变。在某些方面，也可以使人类IgG1第318,320和322位(EU编号)中一个或多个位点突变。 在某些方面，同种型是人类IgG2或IgG4.
E.人类抗体
本发明通过以下描述的多种技术提供了抗α-突触核蛋白的人类抗体。一些人类抗体通过竞争结合实验被选择，或者具有与5C1相同或重叠的表位特异性。也可以仅通过一段α-突触核蛋白片段(例如，氨基酸残基118～126)作为免疫抗原和/或通过筛选抗α-突触核蛋白缺失突变集合体的抗体来筛选人类抗体的特定表位特异性。一种制备人类抗体的技术是三源杂交瘤(trioma)方法(参考Oestberg et al.,Hybridoma 2:361-367(1983)；Oestberg,U.S.Pat.No.4,634,664；和Engleman et al.,U.S.Pat.No.4,634,666)。另一种方法涉及免疫表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠，例如，AlivaMab小鼠或Veloceimmune小鼠(参考，例如，Lonberg et al.,W093/1222,U.S.Pat.No.5,877,397,U.S.Pat.No.5,874,299,U.S.Pat.No.5,814,318,U.S.Pat.No.5,789,650,U.S.Pat.No.5,770,429,U.S.Pat.No.5,661,016,U.S.Pat.No.5,633,425,U.S.Pat.No.5,625,126,U.S.Pat.No.5,569,825,U.S.Pat.No.5,545,806,Nature 148,1547-1553(1994),Nature Biotechnology 14,826(1996),Kucherlapati和WO 91/10741)。另一种技术是噬菌体展示(参考，例如，Dower et al.,WO 91/17271和McCafferty et al.,WO 92/01047,U.S.Pat.No.5,877,218,U.S.Pat.No.5,871,907,U.S.Pat.No.5,858,657,U.S.Pat.No.5,837,242,U.S.Pat.No.5,733,743和U.S.Pat.No.5,565,332)。在这些方法中，噬菌体文库被制备，文库的成员在其外表面展示不同的抗体。抗体通常表现为Fv或Fab片段。通过α-突触核蛋白多肽或其片段的亲和富集，选择展示了具有期望特异性抗体的噬菌体。另一种技术是根据Reddy et al.,Nat Biotechnol.2010Sept 28(9):965-9(Epub 2010Aug 29)和US 20110053803,20100099103,20100291066,20100035763和20100151471中描述的通用方法测定来自人类B细胞的DNA的序列。简单地说，可以从疑是具有抗α突触核蛋白抗体的人类(例如，用α突触核蛋白或其片段、更长的含有α突触核蛋白的多肽或其片段、或抗个体基因型抗体免疫过的人类)中获取B细胞。来自B细胞的抗体的mRNA随后被反转录成cDNA，利用测序技术(例如，454)进行测序。获得来自各个抗体 的链的序列后，这些链被配对到一起(例如，利用生物信息学)，克隆，表达，筛选所期望的特性。
F.重组抗体的表达
通过抗体表达细胞系(例如，杂交瘤)，已知有多种方法可用于制备嵌合和人源化抗体。例如，抗体的免疫球蛋白可变区可以通过已知的方法克隆和测序。在一种方法中，利用来自杂交瘤细胞的mRNA，重链可变VH区通过RT-PCR被克隆。通用引物被用作VH区前导肽，包括作为5'引物的翻译起始密码子和g2b恒定区特异3'引物。示例性引物如Schenk等人(下文称“Schenk”))申请的美国专利(公开号：US 2005/0009150)中所述。来自多个独立衍生的克隆的序列被比较，以确保在扩增过程中没有引入改变。还可以通过测定由5'RACE RT-PCR方法和3'g2b特异引物获得的VH框架的序列来确定VH区序列。
轻链可变VL区可以采用与VH区类似的方式克隆。在一种方法中，用于扩增VL区的通用引物对被设计成与包括转录起始密码子的VL区和V-J连接区Ck区下游特异性的3'引物杂交。在第二种方法中，采用5'RACE RT-PCR方法克隆VL编码cDNA。示例性的引物如之前的Schenk所述。克隆的序列随后与编码人类(或其他非人类物种)恒定区的序列相结合。示例性编码人类恒定区的序列如SEQ ID NO:37(编码人类IgG1恒定区)和SEQ ID NO:39(编码人类κ轻链恒定区)所示。
在一种方法中，重链和轻链可变区被重新设计成编码单独的VDJ或VJ连接的下游剪接供体序列，然后被克隆到哺乳动物表达载体中，例如，重链的pCMV-h1载体和轻链的pCMV-Mcl载体。这些载体编码人类1和Ck恒定区，如插入的可变区盒(cassette)的下游外显子片段。序列扩增后，重链和轻链表达载体可以被共转染到CHO细胞，以产生嵌合抗体。在转染48小时后收集条件培养基，用western blot分析抗体产量或用ELISA分析抗原结合。嵌合抗体采用前述方法人源化。
嵌合抗体、饰面抗体、人源化抗体和人类抗体通常均通过重组表达产生。重组核酸构建体通常包括可操纵地连接到抗体链编码序列的表达控制序列，包括天然相关或异源表达控制元件，例如，启动子。一旦载体整合 到适当的宿主中后，宿主将被保持在适合核酸高水平表达和适合收集纯化交叉反应抗体的条件下。
这些表达载体在宿主有机体中通常是可复制的，或者作为游离基因，或者作为宿主染色体DNA的组成部分。通常地，表达载体含有选择标记，例如，氨苄青霉素抗性或潮霉素抗性，以能够检测到那些转化了所期望的DNA序列的细胞。
大肠杆菌是一种原核宿主，它在抗体、尤其是抗体片段的表达中极其有用。微生物，如酵母，对于表达也很重要。酵母属的酵母菌是酵母菌宿主的一个例子，它含有具有表达调控序列的合适载体、复制起点、终止序列等所需的物质。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶启动子和其他糖酵解酶启动子，诱导型酵母启动子包括但不限于醇脱氢酶启动子、异细胞色素C启动子和酵解麦芽糖和半乳糖的酶启动子。
哺乳动物的细胞可用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核酸片段(可参考：Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,NY,1987)。许多能够分泌完整异源蛋白质的合适的宿主细胞系已被开发，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、HEK293细胞、L细胞、人胚胎肾细胞和骨髓瘤细胞。这些细胞可以是非人类细胞。这些细胞的表达载体可以包括表达调控序列，如复制起点，启动子，增强子(可参见：Queen et al.,Immunol.Rev.89:49(1986))和必要的信息加工位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。合适的表达调控序列包括来自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子(可参见：Co et al.,J.Immunol.148:1149(1992))。
可选择地，抗体编码序列可以并入到转基因中，以导入到转基因动物的基因组，随后在转基因动物的乳汁中表达(参考U.S.Pat.No.5,741,957,U.S.Pat.No.5,304,489,U.S.Pat.No.5,849,992)。合适的转基因包括重链和/或轻链编码序列，这些序列与乳腺特异性基因(例如，酪蛋白或β乳球蛋白)的启动子和增强子可操纵地连接。
含有目标DNA片段的载体可以被转入到宿主细胞，其方法取决于宿主细胞的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而钙磷酸盐处理、 电穿孔、脂质转染、基因枪或病毒性转染用于其他宿主细胞。其他用于转化哺乳动物细胞的方法包括使用聚凝胺法、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。为了产生转基因动物，转基因被显微注射到已受精的卵母细胞，或被整合到胚胎干细胞的基因组，将这些细胞的细胞核转移到无核的卵母细胞。
将编码抗体重链和轻链的载体导入细胞培养，在无血清培养基筛选细胞库，以保证生长率和产品质量。最佳产量的细胞库随后进行基于FACS(荧光激活细胞分离法)的单细胞克隆以产生单克隆系。每个细胞每天的具体产量在50pg或100pg以上是有优势的，对应大于7.5g/L培养物的产物滴度。单细胞克隆产生的抗体也可以进行浊度、过滤性质、PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)、IEF(等电聚焦)、UV扫描、HP-SEC(高效尺寸筛析色谱)、碳水化合物-寡糖映射、质谱和结合试验(如ELISA或Biacore)等测试。选定的克隆体可随后存储在多个小瓶中，冷冻保存，以备后用。
一旦被表达，抗体能够根据本领域标准步骤进行纯化，包括蛋白质A捕获、HPLC纯化、柱色谱、凝胶电泳法等(通常可参见：Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,NY,1982))。
抗体商业生产的方法包括密码子优化，启动子、转录元件和终止子的选择，无血清单细胞克隆，细胞库的建立，使用拷贝数扩增的选择性标记和CHO终止子，无血清单细胞克隆，蛋白滴度改进(可参见：US 5,786,464,US 5,888,809,US 6,063,598,US 6,114,148,US 7,569,339,WO2004/050884,WO2005/019442,WO2008/012142,WO2008/012142,WO2008/107388和WO2009/027471)。
G.抗体筛选实验
抗体经几种方式筛选，包括：结合实验，功能筛选，在α-突触核蛋白聚集相关疾病的动物模型中筛选以及临床试验。结合实验用于检测结合特异性，可选地，亲和力以及对α-突触核蛋白(或其片段，例如，氨基酸残基118～126)的表位特异性。这样的筛选有时是通过与示例性抗体(例如，5C1)竞争来进行的。可选地，在这些实验中，不管是抗体还是α-突触核蛋白目标物都是固定的。功能性实验可以在细胞模型中进行，包括天然表 达α-突触核蛋白的细胞或转染了编码α-突触核蛋白或其片段的DNA的细胞。合适的细胞包括神经元细胞。筛选降低了α-突触核蛋白水平(例如，通过Western blotting或细胞提取物/上清免疫共沉淀)，降低了聚集的α-突触核蛋白水平(例如，通过免疫组化和/或共聚焦方法)，和/或降低了由α-突触核蛋白引起的毒性的细胞。
动物模型筛选实验测试了抗体在模仿人类α-突触核蛋白聚集相关疾病(例如，路易体病)的动物模型中对治疗或预防治疗迹象或症状的能力。能够被监控的合适的迹象或症状包括运动平衡、协调能力和认知缺陷。可以通过与合适的对照(例如，接受了对照抗体(例如，对照抗体对应的同种型)、安慰剂或没有进行任何处理的对照动物)的运动平衡、协调能力和认知缺陷相比较来确定损伤程度。路易体病的转基因或其他动物模型能够表达人类α-突触核蛋白。为了便于在动物模型中进行实验测试，可以采用具有适于该动物模型的恒定区的抗体。可以得出结论的是：如果相应小鼠抗体或嵌合抗体在合适的动物模型中是有效的，该抗体的人源化形式也是有效的，且该人源化抗体具有类似的结合亲和力(例如，在实验误差范围内1.5，2或3倍)。
临床试验测试了在具有α-突触核蛋白聚集相关疾病的人类中的安全性和有效性。
H.核酸
本发明进一步提供了编码所述任意一种重链和轻链的核酸。通常，核酸也编码融合到成熟重链或轻链中的信号肽。合适的信号肽包括SEQ ID NO:6的氨基酸残基1～19(由SEQ ID NO:5的核酸1～57编码)和SEQ ID NO:8的氨基酸残基1～19(由SEQ ID NO:7的核酸1～57编码)。核酸的编码序列可操作地与调控序列如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止标记等连接，以保证编码序列的表达。编码重链和轻链的核酸可通过分离的形式出现或被克隆到一个或多个载体中。核酸能够被合成，如通过固定合成或重叠寡核酸的PCR扩增来合成。编码重链和轻链的核酸可以结合成为连续的核酸，如在一个表达载体中，或者可以是独立的，如单独被克隆到各自的表达载体中。
V.治疗应用
本发明为患有路易体病或具有患此病风险的病人提供了几种治疗该病或实现该病预防的方法。适于治疗的患者包括具有LBD患病风险但未表现出症状的患者，和最近出现症状或出现突触核蛋白病的早期风险信号，如脑电图缓慢、神经精神症状(抑郁症、呆痴、幻觉，焦虑、情感淡漠、快感缺乏)、植物神经变化(体位性低血压、膀胱障碍、便秘、大便失禁、流涎、吞咽困难、性功能障碍、改变脑血流)、感官上的变化(嗅觉、疼痛、颜色辨别异常感觉)、睡眠障碍(REM睡眠行为障碍(RBD)、不宁腿综合征/周期性肢体运动、嗜睡，失眠)和其他杂项的标志和症状(疲劳、复视、视力模糊、皮脂溢出、体重减少/增加)的患者。因此，本方法可以预防性地施用于具有已知的LBD遗传风险的个体。这样的个体包括具有经历过这种疾病的亲属的个体和通过遗传或生化指标的分析确定有患病风险的个体。具有PD(帕金森氏病)风险倾向的遗传标记包括突变的α-突触核蛋白或Parkin基因、UCHLI和CYP2D6基因，尤其是突变位置在第30位和第53位的α-突触核蛋白基因。目前，帕金森氏症患者可以从它的临床表现来辨别，临床表现包括静止性震颤，肌强直，运动迟缓和姿势不稳。
对于无症状的患者，治疗可以开始于任何年龄(例如10岁、20岁、30岁)。但是，通常在病人达到40岁、50岁、60岁或70岁之前是没有必要开始治疗的。治疗通常需要在一段时间内承受多种剂量。治疗可以通过检测抗体或者响应治疗剂的活化的T细胞或B细胞来监控，如果响应下降，则指示提高剂量。
通过在患者体内产生有益的治疗反应(例如，减少神经炎和/或轴突α-突触核蛋白聚集，缓解神经炎性营养不良症，改善认知功能和/或逆转、治疗或预防认知功能下降)的条件下施用抗体组合物，本发明提供了治疗患者的路易体病或实现路易体病预防的方法。在一些方法中，相对于对照，大脑皮质和/或基底神经节的神经毡的神经炎营养不良面积可减少10％、20％、30％、40％或更多。
认知障碍、认知功能逐渐衰退、脑形态改变以及脑血管功能改变通常可在患有LBD或者具有LBD患病风险的病人中观察到。施用本发明的抗 体能抑制或延缓此类患者认知功能的下降。
本发明还提供了保持或增加突触密度和/或树突细胞密度的方法。突触或树突细胞密度改变的指标可通过突触形成标记物(突触素)和/或树突细胞标记物(MAP2)来测定。在一些方法中，突触或树突密度可以恢复到健康受试者的水平。在一些方法中，相对于未治疗的对照患者，治疗患者的突触或树突密度的平均水平可以提高5％、10％、15％、20％、25％、30％或更多。
VI.药物组合物和治疗方法
在预防性应用中，抗体或组合物根据有效治疗方案(剂量，频率和途径施用)施用于易感或有患病风险的患者，该治疗方案可有效降低风险、减轻严重性，或延迟至少一个该疾病的标志或症状的发作。在某些预防性应用中，该治疗方案可有效地抑制或延迟突触核蛋白和截短片段在脑中的积累，或抑制或延缓它的毒性作用或抑或延缓行为缺陷的发展。在治疗性应用中，抗体根据可有效地改善或至少抑制至少一个路易体病的标志或症状进一步恶化的治疗方案(剂量，频率和途径施用)施用于疑似患者或已经患有该病的患者。在一些治疗应用中，该治疗方案可有效地减少或至少抑制与毒性或行为缺陷相关的突触核蛋白和截短片段的水平的进一步增加。
如果个体治疗的患者达到的结果优于不通过本发明的方法治疗的群体对照患者的平均结果，或者在对照临床试验(例如，II期，II/III期或III期试验)，治疗的患者的结果相对于对照患者被证明更有利，在p<0.05或0.01，甚至0.001的水平，那么这种治疗方案被认为在治疗或预防上有效。
有效剂量随许多不同的因素而变化，这些因素包括给药途径，靶位点，患者的生理状态(包括LBD疾病类型)，患者是否为ApoE基因的载体，患者是人还是动物，施用的其他药物和治疗是预防性的还是治疗性的。
示例性的抗体的剂量范围为约0.01～5mg/kg，优选为0.1～3mg/kg或0.15～2mg/kg或0.15～1.5mg/kg，以患者的体重为基数。所述剂量的抗体可以每天、隔日、每周、每两周、每月服用或者遵从通过实证分析确定的其他用量安排。一种示例性治疗方案是长期(例如，至少六个月)施用多种 剂量。另一种示例性治疗方案是两周施药一次、或一月施药一次或3～6个月施药一次。
抗体可以经由外部途径给药，即施用的或诱导的抗体穿过血脑屏障到达大脑中的预定部位。给药途径包括局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内或肌内。施用抗体的某些路径是在静脉内和皮下，这种注射方式最通常地是在手臂或腿部肌肉进行注射。在某些方法中，试剂直接注射到有沉淀物积累的特定组织，如颅内注射。
用于肠胃外给药的药物组合物可以是无菌、基本上等渗并在GMP条件下生产的。药物组合物可以以单位剂量(即单次给药剂量)形式来提供。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅料进行配制。配制取决于选择的施药途径。对于注射剂，抗体可在水溶液中配制，优选生理相容的缓冲液，例如，Hank氏溶液、林格氏溶液、生理盐水或乙酸盐缓冲液(以减少注射部位的不适感)。该溶液可以含有配制剂，例如，悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。备选抗体可以是冻干形式，以便在使用前与合适的赋形剂(如灭菌无热原水)组合。
例如，就帕金森氏病来说，对α-突触核蛋白的免疫疗法(可参见WO/2008/103472)、左旋多巴、多巴胺激动剂、COMT抑制剂、MAO-B抑制剂、金刚烷胺、或抗胆碱能药可与本治疗方案组合使用。
VII.其他应用
以上所述抗体可用于在临床诊断或治疗或研究的情况下检测α-突触核蛋白。该抗体也可作为研究试剂出售，用于实验室研究中检测含有α-突触核蛋白的细胞及其对各种刺激的响应。在所述应用中，单克隆抗体可以用荧光分子、自旋标记分子、酶或放射性同位素进行标记，也可以以试剂盒的形式提供测定α-突触核蛋白所有必要的试剂。该抗体也可用于纯化α-突触核蛋白，例如，通过亲和色谱法。
所述抗体可用于检测患者的LB(路易小体)。这些方法在诊断或确定PD(帕金森症)、或其他与LB在大脑中存在相关的疾病、或敏感性的诊断上是有用的。例如，这些方法可用于出现痴呆症症状的患者。如果患者有LB，那么这个患者很有可能患上LBD，如帕金森症。这些方法也可以用于 无症状的患者。路易体或其他异常的α-突触核蛋白沉淀的出现表明将来易感突触核蛋白病。该方法也可用于监测疾病进展和/或响应先前已诊断患有路易体病的患者的治疗。
该方法可通过施用抗体，然后检测结合的抗体来执行。如果需要，可以使用缺乏全长恒定区的抗体片段(如Fab)来避免清理反应。在一些方法中，同样的抗体可以同时作为治疗和诊断试剂。
为了诊断(例如体内成像)，抗体可通过静脉内注射进入患者体内，或通过颅内注射或在颅骨上钻一个洞使其直接进入大脑。试剂的用量应当与治疗方法所需剂量在相同的范围内。一般地，抗体需要标记。尽管在一些方法中，抗体未被标记，使用次级标记试剂与抗体结合。标记的选择取决于检测手段，例如，荧光标记物适于光学检测。顺磁性标签适用于无手术干预的断层探测。放射性标记物也可以通过PET或SPECT来检测。
诊断通过将标记位点的数目、大小和/或强度与相应的基线值进行比较来执行。基线值可以代表非患病群体的平均水平。基线值也可以代表同一患者以前的水平。例如，基线值可以在患者开始治疗前确定，测量值随后与基线值进行比较。测定值相对于基线值下降标志着对治疗有积极效果。
该抗体可用于产生抗独特型(anti-idiotype)抗体(可参见：Greenspan&Bona,FASEB J.7(5):437-444,1989；and Nissinoff,J.Immunol.147:2429-2438,1991)。这类抗独特型抗体可以用在药物动力学、药效学、生物分布研究以及临床上人抗人抗体(HAHA)在抗体治疗的患者体内的响应的研究。例如，抗独特型抗体特异性地结合人源化5C1抗体的可变区，因此可在药物动力学研究中利用它来检测人源化5C1抗体并有助于量化人抗人抗体(HAHA)在治疗患者体内的响应。
VIII.试剂盒
本发明还提供了含有α-突触核蛋白特异性抗体的试剂盒及其使用说明书。
该试剂盒可以被用于，例如，执行上述诊断方法。试剂盒还可能包括标签。试剂盒通常包括提供试剂盒使用指导的标签。该标签还可能包括图表或其他与抗α-突触核蛋白抗体水平相关的测量标签水平的相当剂量。术 语“标签”通常是指任何附带的书面或记录材料，或者在制备、运输、销售或使用过程中的任何时候一直伴随着试剂盒。例如，术语“标签”包括广告传单和小册子、包装材料、说明书、音频或视频磁带、电脑光盘以及直接打印在试剂盒上。
本发明还提供了进行活体成像的诊断试剂盒。该试剂盒通常包括本文所述的结合到α-突触核蛋白表位的抗体。该抗体可能被标记，该试剂盒还可能包括第二标记试剂。该试剂盒可能包括进行活体成像实验的说明书。
处于所有目的，以上或以下引用的所有的专利申请、网站、其他出版物、登录号等通过参考的方式将其全文并入本文，并视为是以明确和独立的方式引用每一个独立的对象。如果不同版本的序列在不同的时间与一个登录号相关，在本申请的有效申请日期与登录号相关的版本是有意义的。有效申请日期意味着早于实际申请日期，若适用优先权，则早于涉及到登录号的优先权申请的申请日期。同样，如果出版物、网站等在不同的时间出版的版本不同，则在本申请的有效申请日期最近出版的版本是有意义的，除非另有说明。本发明的任何特征、步骤、要素、实施方式或方面可以与任何其他组合来使用，除非特别注明。虽然本发明已经通过说明和举例的方式进行了相当详细的描述以实现清楚和便于理解的目的，但在所附权利要求的范围内实施的某些变化和修改将是显而易见的。
实施例
实施例1:小鼠5C1的分离
小鼠5C1抗体是在注射有多肽缀合物的小鼠中产生的，该多肽缀合物含有耦合羊抗鼠抗体的多肽免疫原VDPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:14)。该多肽含有融合到GGC多肽C末端的α-突触核蛋白的118～126残基，通过结合到C末端半胱氨酸残基的马来酰亚胺连接体(linker)被耦合到羊抗鼠抗体。
实施例2：α-突触核蛋白抗体的被动免疫
为了检测α-突触核蛋白抗体在路易体病动物模型中的效果，采用了多种α-突触核蛋白抗体被动免疫小鼠。使用了3～4个月龄的野生型、α-突触 核蛋白敲除型和α-突触核蛋白转基因(61行，line 61)型雌性小鼠。被检测的抗体包括：
9E4(IgG1，表位：α-突触核蛋白的第118～126位氨基酸)；
5C1(IgG1，免疫原：α-突触核蛋白的第118～126位氨基酸，cys-连接体)；
5D12(IgG2，免疫原：α-突触核蛋白的第118～126位氨基酸，n-连接体)；
1H7(IgG1，表位：α-突触核蛋白的第91～99位氨基酸)；以及
27-1(IgG1对照抗体)。
小鼠在5个月期间内接受10mg/kg的抗体剂量，总共注射21次。此外，该小鼠被注射表达人类α-突触核蛋白(wt)的慢病毒载体(LV)，单方面(unilateral)将人类α-突触核蛋白(wt)引入海马体中。
读出的抗体包括那些来自Chemicon(表位：全长α-突触核蛋白)，Millipore(表位：全长α-突触核蛋白)和ELADW105(表位：全长α-突触核蛋白的第121～124位氨基酸，优选采用在残基122～124处截断的α-突触核蛋白)的抗体。
终点：在实验终止前一直监测抗体滴度。行为分析采用Morris水迷宫测试(MWW)和平衡木实验。平衡木实验是使用两个直径不同的平衡木检测运动平衡、协调和步态。平衡木A(训练平衡木)的直径较大，因此更容易穿过，平衡木D直径较小(测试平衡木)，因此更难以穿过。在第10周时和实验即将结束时，进行水迷宫测试。在实验终点时，小鼠被处死，通过神经病理学测量获得α-突触核蛋白聚集、突触素和MAP2数据。此外，通过生物化学测量获得α-突触核蛋白、PSD95、突触素数据。利用突触、神经元和神经胶质标记来进行选择多标记和共聚焦标记。
结果：所有的抗体，除了5D12，均使α-突触核蛋白聚集以及突触和树突密度维持显著降低，与MWM试验中的阳性结果一样。9E4抗体在体外和体内研究以及行为测试中均是有效的。尤其是，该结果显示α突触核蛋白抗体可减少神经炎/轴突α-突触核蛋白聚集。
行为测试结果：在α-突触核蛋白转基因小鼠中，5C1和9E4抗体改善 了水迷宫测试的表现，1H7也改善了水迷宫测试的表现，尽管其改善程度低一些。参考图3。相反地，5D12抗体没有改善α-突触核蛋白转基因小鼠水迷宫测试的表现。关于平衡木实验，9E4和1H7抗体改善了以速度和失误次数衡量的平衡木实验的表现，而5D12和5C1抗体没有改善。参考图4。图4中的数据是每10cm打滑的次数(即“失误”)和穿行距离除以该距离所用的时间的比值(即“速度”，以10cm/sec的单位计算)。
神经病理学结果：5C1、9E4和1H7抗体减少了ELADW-105阳性神经炎营养不良，而5D12抗体没有。在α-突触核蛋白转基因小鼠中，与对照小鼠相比(即接受了27-1IgG1对照抗体的小鼠)，9E4抗体减少了大脑皮质中43％的神经毡面积，基底节中40％的神经毡面积。9E4抗体还维持了大脑皮质和基底节中的突触素和MAP2着色。
实施例3：5C1可变结构域测序
采用mRNA试剂盒从5C1杂交瘤细胞中提取mRNA并纯化。接着利用寡dT反义引物和II试剂盒将纯化的mRNA转录成cDNA。通过PCR，利用简并的VH和VL正向引物和基因特异性(CH/CL)的反义引物从cDNA中扩增编码5C1重链和轻链可变区的核酸序列。被设计成包括信号肽、可变结构域和恒定区(取决于反义引物)序列的PCR产物经过凝胶纯化，被克隆到blunt载体或TA载体中，随后被测序。从至少3个具有起始于甲硫氨酸且从可变区延伸到恒定区的开放阅读框的独立克隆的分析中推断出序列。
编码5C1重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:5所示，其对应的蛋白序列(图1)如下，包括位于第1～19位(下划线标记)的信号肽：
MERHWIFLFLLSVTGGVHSQVQLQQSGAELAKPGTSVQMSCKASGYTFTNYWMNWIKARPGQGLEWIGATNPNNGYTDYNQRFKDKAILTADKSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYFCASGGHLAYWGQGTVVTVSA(SEQ ID NO:6)
编码5C1轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:7所示，其对应的蛋白序列(图2)如下，包括位于第1～19位(下划线标记)的信号肽：
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQIPLYLSVSPGDQASISCRSSQSL FHSKGNTYLHWYLQKPGQSPKLLINRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDLGVYFCSQSAHVPWTFGGGTKLEIR(SEQ ID NO:8)
5C1成熟重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)如下表1所示，其对应的5C1成熟轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)如下表2所示。全部采用Kabat编号。
实施例4：小鼠5C1抗体的人源化
3H6Vh区CDRs分析显示CDR-H1为5个残基(SEQ ID NO:10)，CDR-H2为17个残基(SEQ ID NO:11)，CDR-H3为6个残基(SEQ ID NO:12)。3H6Vk区CDRs类似分析显示CDR-L1为16个残基(SEQ ID NO:25)，CDR-L2为7个残基(SEQ ID NO:26)，CDR-L3为9个残基(SEQ ID NO:27)。
5C1Vk和Vh连接处残基分析显示大部分残基都是通常发现的残基。
在NCBI的非冗余蛋白序列数据库搜索能够选择出合适的人类框架，将5C1小鼠CDRs植入到该框架中。对于Vk，选择了NCBI登录号为CAB51293.1的人类κ轻链(GI:5578786；SEQ ID NO:28)。对于Vh，选择了登录号为AAY42876.1的人类Ig重链(GI:66096557；SEQ ID NO:13)。
示例性的人源化的Vh和Vk设计(基于所选择的人类框架进行回复突变)分别如表1和表2所示。
示例性的人源化的Vh设计
设计了5个不同的人源化版本的5C1Vh区：H1,H2,H3,H4和H5。在选择回复突变时，最终聚焦在残基H11,H27,H30,H48,H67,H69,H73,H91和H94上。在每个人源化Vh设计中，残基H11,H27,H30,H48和H73分别被回复突变成L,Y,T,I和K，因为根据Chothia定义，这些残基(H27和H30)形成部分CDR-H1，或在人类框架序列中其对应残基是低频率残基(H11位的V,H48位的M，H73位的E)。对于版本H1(SEQ ID NO:14)，额外的残基H67和H69分别被回复突变成A和L，以维持CDR组装。在版本H2(SEQ ID NO:15)中，没有引入进一步的回复突变(即版本H1中的H67和H69位的回复突变被排除)。在版本H3(SEQ ID NO:16)中，额外的残基H67,H69,H91和H94分别被回复突变成A,L,F和S。H67,H69和H94回复突变是为了维持CDR组装，而H91(Vh/Vk交接处的残基)被回复 突变是为了检测其对交接的影响。在版本H4(SEQ ID NO:17)中，额外的残基H67,H69和H94分别被回复突变成A,L和S。因此，版本H4和H3不同，在H4中，H91的回复突变被排除。在版本
H5(SEQ ID NO:18)中，额外的残基H94也被回复突变成S，以维持CDR组装。
表1:人源化5C1Vh区
编码人源化5C1H1,H2,H3,H4和H5的示例性核酸序列分别如SEQ ID NOs:19,20,21,22和23所示。
示例性人源化Vk设计
设计了4个不同的人源化版本的5C1Vk区：L1,L2,L3和L4。在选择回复突变时，最终聚焦在残基L2,L12,L14,L45,L49和L87上。在每个人源化Vk设计中，残基L12和L14被回复突变成S，因为在人类框架序列中对应残基是低频率残基(分别为P和T)。对于版本L1(SEQ ID NO:29)，额外的残基L2,L45,L49和L87分别被回复突变成V,K,N和F。L2是标准/CDR交接残基；L45经历了从小鼠到人类框架序列的极性/电荷转换(K到Q)；L49是游标(Vernier)残基；L87是Vh/Vk交接界面残基。在版本L2(SEQ ID NO:30)中，额外的残基L45被回复突变成K。因此，相对于版本L1，残基L2,L49和L87回复突变被排除。在版本L3(SEQ ID NO:31)中，额外的残基L2,L49和L87分别被回复突变成V,N和F。因此，相对于版本L1，残基L45回复突变被排除。在版本L4(SEQ ID NO:32)中，没有额外的残基被回复突变(即只有残基L12和L14被回复突变)。
表2:人源化5C1Vk区
编码人源化5C1L1,L2,L3和L4的示例性核酸序列分别如SEQ ID NOs:33,34,35和36所示。
实施例5:人源化5C1抗体对α-突触核蛋白的亲和力
采用ELISA分析了5C1人源化重链和人源化轻链的各种组合对α-突触核蛋白的亲和力。如图5所示，在实验条件下，人源化5C1抗体的H1L1版本对α-突触核蛋白没有亲和力。相反，嵌合5C1抗体对α-突触核蛋白的亲和力高于小鼠5C1抗体。人源化版本H3L4,H4L3和嵌合H+L3的亲和 力相当，与嵌合5C1抗体的亲和力差不多一样高。此外，人源化版本H3L4,H4L3的亲和力相当，但比H3L4,H4L3和嵌合H+L3的亲和力稍微低一些。
还采用了Biacore分析各种人源化5C1抗体版本，以更精确地确定结合亲和力。根据GE Healthcare提供的操作方法，准备了抗人类IgG CM5Biacore芯片。每个人源化5C1抗体版本被独立地捕获，Rmax不超过50，采用以下方程式：
Rmax＝(被捕获抗体的RU)*(突触核蛋白MW)/(被捕获抗体的MW)*2
分母中的系数2是抗体上结合位点的数目。α-突触核蛋白在芯片上流动，其浓度从期望KD的10倍之上变化到期望KD的10倍之下。收集数据，重复两次以减去误差和一小部分非特异性结合。利用BIAcore评估软件采用1:1模型和整体模拟分析该数据。
Biacore分析的结果如下表3所示。数据指示对α-突触核蛋白的大部分亲和力损失是由于某些抗体版本的解离率(off rate)提高引起的。基于这些亲和力数据，H4L3被确定为优选抗体。
表3:Biacore确定的5C1变体抗体的亲和力
实施例6:丙氨酸扫描突变
抗体5C1,9E4和5D12的结合表位已经被大致确定在α-突触核蛋白的残基118～126内。通过对α-突触核蛋白第118～126位内的每个残基进行丙氨酸扫描突变，该实施例描述了更为精确的匹配。之所以采用丙氨酸，是因为丙氨酸的小体积，化学惰性和甲基官能团，其模拟了许多其他氨基酸所具有的二级结构偏好。图6、7和8的上部分分别显示了用抗体9E4,5C1和5D12染色的Western blots结果。印迹(bolts)包括全长α-突触核蛋白和对残基118～126进行丙氨酸扫描突变产生的α-突触核蛋白点突变，用0.5μg/ml的抗体进行染色。第122和125位的突变基本上破坏了9E4的结合，然而其他位点的突变几乎没有什么影响。因此，9E4主要接触残基122和125。第120～122位的突变基本上破坏了5C1的结合，第123和124位的突变大幅减弱了结合，但没有破坏结合。因此，5C1主要接触残基120～122，较少程度地接触残基123～124。第120～122位的突变基本上破坏了5D12的结合，第118,119,123和124位的突变大幅减弱了结合，但没有破坏结合。因此，5D12主要接触残基120～122，较少程度地接触残基118,119,123和124。在图6-8中每个图中，均采用1H7抗体作为对照。1H7结合到α-突触核蛋白的91～98残基，因此，即使残基118～126存在突变，其也结合α-突触核蛋白。
相对于5C1和5D12，9E4的不同结合特异性可能部分反映了它们各自的制备方法。9E4是用全长α-突触核蛋白作为免疫原产生的，导致抗体结合到构象表位。5C1和5D12是用10个氨基酸多肽免疫产生的，导致线性表位。
图9是α-突触核蛋白中9E4,5C1和5D12抗体结合位点附近的氨基酸的球棒模型。9E4结合表位的两个不连续的残基(残基122和125)在全长α-突触核蛋白构象中形成口袋。
在不脱离所附权利要求的精神或范围内，可以对本发明做出许多变化和修改。除非上下文中另有规定，任何步骤、特征、实施方式或特点可以任一组合起来来使用。在本说明书中提到的所有出版物、专利申请、网址、登录号等在此通过引用的方式并入本文，犹如每个单独的出版物或专利申请被特异地和单独地指示通过引用并入本文。如果专利申请存在不同版本，则以该申请有效申请日最近的版本为准。