芍药甙在镇痛药物领域的新用途

芍药甙在镇痛药物领域的新用途
【专利摘要】本发明公开了芍药甙在镇痛药物领域的新用途，具体公开芍药甙在制备增强阿片类药物镇痛效应、延缓或减轻阿片耐受的药物中的用途。所述芍药甙配合阿片类药物使用，或是与阿片类药物制成复方制剂使用，可以延长其镇痛时间，增强其镇痛效能，还可以延缓或减轻慢性阿片类药物治疗过程中出现的阿片耐受现象。这种作用具体是通过芍药甙抑制阿片类药物诱导脊髓小胶质细胞过度活化、抑制阿片诱导的过度上调的p-P38实现的。
【专利说明】芍药甙在镇痛药物领域的新用途
【技术领域】
[0001]本发明属于制药领域，涉及芍药甙在镇痛药物领域的新用途，具体涉及在制备增强阿片类药物镇痛效应、延缓或减轻阿片耐受的药物中的用途。
【背景技术】
[0002]疼痛是一种复杂的生理心理活动，包括伤害性刺激作用于机体所引起的痛感觉，以及机体对伤害性刺激的痛反应。痛觉可作为机体受到伤害的一种警告，引起机体一系列防御性保护反应，但是某些急性的或长期的剧烈疼痛，对机体是一种难以忍受的折磨。疼痛是临床上最常见的症状之一，也是医务工作者迫切需要解决的重要问题。
[0003]疼痛就病程而言，可分为急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛为新近产生并持续时间较短的疼痛，通常与损伤或疾病有关。慢性疼痛则为持续较长时间的疼痛，可能是急性疼痛治疗效果不好，或损伤愈合后仍然持续存在的疼痛，病人常伴有焦虑、抑郁等精神心理改变。无论是急性疼痛还是慢性疼痛，临床上对疼痛控制的需求远远没有得到满足。
[0004]阿片类镇痛药主要包括吗啡、 芬太尼、可待因、氢吗啡酮、羟考酮、美沙酮、哌替啶和曲马多等。阿片类物质有着强大的镇痛效应，广泛用于疼痛的治疗，例如术后急性疼痛，神经病理性疼痛与癌症疼痛等。阿片类药物发挥镇痛作用有着共同的作用机制，即主要通过作用于神经系统中的特异性的阿片受体，降低痛觉传递神经元的兴奋性而发挥强大的镇痛作用。
[0005]阿片类药物一直是治疗中、重度急性疼痛的首选药物，急性镇痛过程中阿片类药物的使用多伴随着多种不良反应，如恶心呕吐、镇静嗜睡、呼吸抑制、便秘、急性中毒、成瘾、依赖等，其中呼吸抑制是阿片类药物使用的最危险的并发症，而便秘则是几乎所有使用阿片类止痛药的患者都可能遇到的最难以处理的一种不良反应。这些不良反应严重限制了阿片类药物作为优良镇痛药物的广泛使用。这些不良反应多是阿片镇痛药剂量相关的，临床上需要在理想镇痛所需要的药效剂量与该剂量带来的难以处理的不良反应之间进行平衡，往往需要牺牲镇痛药效来减轻不良反应。临床也有改变给药途径或剂型，如舌下含片、透皮贴剂等来解决上述问题，但是效应并不令人满意。如果能有一种药物，能够增强阿片类药物的急性镇痛效应，延长阿片类药物的镇痛时间，能够降低阿片类药物控制急性镇痛时需要的“累积剂量”，那么该药物将会非常有助于阿片类药物在急性疼痛治疗中的应用。
[0006]阿片类药物同样是治疗中、重度慢性疼痛、尤其是慢性癌性疼痛的首选药物，这种类型疼痛治疗中，除了上述的若干不良反应之外，还有一个影响阿片类药物临床应用的重要问题是“阿片耐受”。阿片耐受是指已经按时服用阿片类药物达到一定剂量(每日总量至少为口服吗啡50mg、羟考酮30mg、氢吗啡酮8mg、羟吗啡酮25mg、芬太尼贴剂25 μ g / h或其他等效药物)至少I周以上时，阿片类药物的镇痛效应减低，表现为持续给予阿片类药物后镇痛作用逐渐减弱甚至消失，需增加阿片类药物剂量才能重建同等镇痛效应，即药物的量效曲线右移所呈现的临床现象。增加阿片药物剂量重建药物的镇痛效应，意味着病人需要承受更高剂量阿片类镇痛药带来的更难以控制的不良反应。同样，临床上没有能够消除阿片耐受，甚至仅仅是减轻或延缓阿片耐受发生的治疗手段，这是临床上急需解决的一个问题，严重限制了阿片类药物强大的镇痛作用的应用。
[0007]芍药甙(Paeonif lorin，PF)，也称芍药苷，为常用中药芍药的主要有效成分之一，是一种单萜类糖苷化合物。芍药具有平肝止痛，养血调经，敛阴止汗的功效。据《本经》记载，芍药“主邪气腹痛、除血痹、破坚积寒热、止痛、利小便、益气”，有养血柔肝、缓中止痛、敛阴收汗的功能，多用于治疗胸腹胁肋疼痛、泻痢腹痛、自汗、阴虚发热、月经不调、崩漏、带下等。在中医药处方及日本的汉方临床中，含芍药的处方大概占30%，极受历代医家重视。
[0008]芍药甙是芍药的主要活性成分，而芍药在临床上已有上千年的广泛应用，这表明芍药甙的临床应用有着良好的安全性。已有研究表明芍药总甙具有扩张血管、镇痛镇静、抗炎抗溃疡、解热解痉、利尿的作用。其中，芍药甙在镇痛方面的作用也有相关研究。芍药一直被认为是能够有效缓解各种疼痛的传统中药，芍药总甙能剂量依赖性地抑制醋酸诱导的扭体，也有研究报道芍药甙对蜂毒引起的继发性痛觉过敏和原发性痛觉过敏表现出明显的镇痛作用。发明人既往研究也表明，芍药甙对大鼠坐骨神经分支结扎切断(SNI)模型的热刺激痛和机械刺激痛有镇痛作用。
[0009]芍药甙作为一种自身具备镇痛作用的物质，其镇痛作用机制尚未得到清晰阐明，迄今为止也并无芍药甙与阿片相关的镇痛效应增强或阿片耐受方面的研究报道。需要指出的是，即使是相同用途的两种不同药物联合应用的药效也是复杂和难以预期的，可能产生药效协同、相加甚至拮抗的现象。因而，对于本领域专业技术人员，除非通过必要的实验数据，否则是难以简单的根据芍药甙自身具有镇痛作用而建立芍药甙能够增强阿片类药物镇痛效应或延缓阿片耐受的逻辑命题。
[0010]发明人在研究芍药甙对病理性疼痛镇痛作用及机制的过程中，通过大量的实验数据，研究得出:芍药甙具有在不影响正常动物痛阈的剂量下，能够显著延长阿片类药物的镇痛时间，增强其镇痛作用`，并能够延缓慢性阿片类药物导致的阿片耐受现象的发生。
[0011]大量的研究和权威文献显示，给予吗啡、芬太尼、氢考酮等多种阿片类药物，在其与阿片受体结合发挥强大镇痛作用的同时，阿片类药物还可以导致中枢神经系统，尤其是脊髓水平的小胶质细胞显著活化。阿片类药物导致小胶质细胞的机制虽然尚未完全阐明，但是学术界已经证明了至少存在两种不同的机制:一种是阿片类药物可以通过多种依赖于神经元的机制激活小胶质细胞，如阿片类药物可以激活神经元中的一氧化氮合成酶，通过合成释放一氧化氮导致临近的小胶质细胞激活；另外一种是阿片类药物可以直接通过作用于小胶质细胞上的阿片受体或者TLR受体,直接激活小胶质细胞。活化的小胶质细胞释放大量的炎症因子，如IL-1 β，TNF-a，IL-6等多活性物质，分别作用其对应的受体或者信号通路，一方面刺激活化更多的胶质细胞，形成正反馈，另外一个方面，小胶质细胞释放的这些活性物质，可以激动痛觉通路相关神经元导致神经元兴奋性增强，导致痛觉敏化，极大的抵消了阿片类药物的镇痛作用进而影响其镇痛效应的持续发挥，或者促进了耐受现象的发生。在这个过程中，MAPK信号通路，包括ERK，P38，c-JNK，ERK5可能发挥重要的作用。研究表明，阿片类药物诱导的MAPK活化，在脊髓中表现出明显的细胞类型的选择性。慢性阿片类药物处理导致的P38显著活化主要表现在脊髓小胶质细胞，进而导致多种促炎因子的合成和释放，削弱阿片类药物的镇痛效应，而阿片类诱导的P-ERK活化表现出相对弱的细胞类型选择性，在神经元、小胶质细胞、神经胶质细胞均能观察到P-ERK的活化。事实上，有动物在体研究表明在脊髓水平，阻断阿片诱导的小胶质细胞过度活化及多种炎症因子的合成和释放，阻断过度活化的P-P38可以延缓甚至取消慢性阿片耐受的发生。但是，这些干预研究的结果多是应用不具有临床开发潜力的实验室工具实现的，仅仅只能提示这些环节对阿片耐受是关键性的环节，就干预手段而言，并不具备开发或者广泛应用的潜力。
[0012]与慢性阿片耐受中小胶质细胞受阿片药物诱导活化，P38磷酸化显著上调类似，也有文献报道急性阿片类药物镇痛过程中，也存在阿片诱导小胶质细胞过度活化现象，并且有报道表明鞘内给予米诺环素(一种小胶质细胞活化的抑制剂)能够增强阿片类药物的急性镇痛效应。
[0013]发明人既往研究结果以及少量文献报道表明，芍药当归散提取液或芍药甙可以抑制脂多糖或者脑缺血引起的小胶质细胞活化，但是此种条件下小胶质细胞活化机制与阿片类药物诱导的小胶质细胞活化机制显然是不同的，所以，芍药甙能否同样抑制阿片类药物诱导的小胶质细胞活化及P-P38上调而发挥其阿片镇痛增强及延缓或减轻阿片耐受作用尚不得而知。

【发明内容】

[0014]本发明的目的在于提供芍药甙在镇痛药物领域的新用途。
[0015]本发明所提供的芍药甙在镇痛药物领域的新用途是其在制备增强阿片类药物镇痛效应、延缓或减轻阿片 耐受的药物中的用途。
[0016]本发明的目的是通过以下技术方案的内容来实现的:
[0017]第一方面，本发明涉及芍药甙在制备增强阿片类药物镇痛效应的药物中的用途。
[0018]本发明中，所述芍药甙配合阿片类药物使用。
[0019]本发明中，是以所述芍药甙为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂配合阿片类药物使用。
[0020]所述辅料或辅助性成分包括药学领域的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
[0021 ] 本发明中，所述芍药甙与阿片类药物制成复方制剂使用。
[0022]本发明中，所述配合阿片类药物使用的制剂选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。
[0023]本发明中，所述复方制剂选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。
[0024]上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
[0025]第二方面，本发明还涉及芍药甙在制备延缓或减轻阿片类药物的阿片耐受现象的药物中的用途。
[0026]本发明中，所述芍药甙配合阿片类药物使用。
[0027]本发明中，是以所述芍药甙为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂配合阿片类药物使用。
[0028]本发明中，所述芍药甙与阿片类药物制成复方制剂使用。
[0029]本发明中，所述配合阿片类药物使用的制剂选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。[0030]本发明中，所述复方制剂选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。
[0031]上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
[0032]第三方面，本发明涉及一种复方制剂，是以芍药甙、阿片类药物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
[0033]本发明具有的有益效应为:本发明首次公开了芍药甙作为一种来源丰富，具有良好安全性的传统中药活性成分，可以用于增强阿片类药物的镇痛作用，延缓或减轻阿片耐受的发生，并且阐述了芍药甙上述效应的作用机制:阿片类药物急性或者慢性处理可以诱导小胶质细胞活化、P-P38上调，释放多种炎症因子，这在阿片类药物急性镇痛效应及慢性耐受过程中发挥关键的作用，芍药甙通过阻断上述环节而发挥急性阿片镇痛增强的效应与减轻阿片耐受现象的发生。本发明也提供了可以实现的制剂形式。本发明预期能够加强阿片类药物在中重度疼痛治疗领域的应用空间:芍药甙能够降低急性阿片镇痛过程中的使用剂量，减轻不良反应的发生，能够对抗慢性阿片应用过程中难以克服的耐受现象，充分发挥阿片类药物强大的镇痛作用，为疼痛治疗提供更多的选择。
【专利附图】

【附图说明】
[0034]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0035]图1为局部鞘内给药模式下，芍药甙对急性吗啡镇痛效应作用的示意图。
[0036]图2为局部鞘内给药模式下，芍药甙与吗啡的复方制剂给药的镇痛效应示意图。
[0037]图3为全身给药模式下，芍药甙对急性吗啡镇痛效应作用的示意图。
`[0038]图4为全身给药模式下，芍药甙减轻慢性吗啡处理导致的阿片耐受现象的示意图。
[0039]图5为局部鞘内给药模式下，P-P38抑制剂和P-ERK抑制剂对急性吗啡镇痛效应作用的示意图。
[0040]图6为在细胞体外水平上，芍药甙对急性吗啡处理诱导的小胶质细胞相关效应作用的不意图。
[0041]图7为在动物在体水平上，芍药甙对急性吗啡处理诱导的小胶质细胞相关效应作用的不意图。
[0042]图8为在动物在体水平上，芍药甙对慢性吗啡处理诱导的小胶质细胞相关效应作用的不意图。
[0043]图9为在动物在体水平，芍药甙减轻持续芬太尼处理导致的阿片耐受现象的示意图。
【具体实施方式】
[0044]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂盒材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0045]吗啡是阿片类镇痛药中应用的最为广泛的代表性药物，其它阿片类药物与吗啡具有相似的作用机制，如在通过与阿片受体结合发挥强大镇痛效应的同时，都能诱导神经小胶质细胞活化及P-P38显著上调，并且这种神经小胶质细胞炎症及P-P38上调影响其镇痛效应的发挥和促进耐受现象的发生。因此，本实施例主要公开最经典的阿片类药物吗啡的研究结果，同时也公开了另一种广泛应用的阿片类药物芬太尼的研究结果，吗啡和芬太尼有着广泛的代表性，专业领域技术人员可以在其他的阿片类药物中重现类似的研究结果O
[0046]实施例1、鞘内给予吗啡的镇痛效应消失后，再给予芍药甙可重现显著的镇痛效应
[0047]a)试验动物:
[0048]健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,清洁级,体重为180_220g。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2°C，自由饮水和摄食，在适应环境I周后进行实验。对动物的所有处理均遵循国际疼痛研究协会伦理委员会的要求。
[0049]b)试验药品及试剂:
[0050]药物芍药甙，纯度98%，市售。盐酸吗啡，购自沈阳第一制药厂。
[0051]c)试验方法:
[0052]大鼠鞘内注射:按压大鼠腰骶部两侧固定，自L5-L6棘突间进针，以鼠尾突然出现侧向运动为注射成功标志。用25 μ I微量进样器，注射容积为20 μ 1，注射时间10s，留针20so
[0053]芍药甙给药剂量和方法:芍药甙用生理盐水溶解，剂量为10 μ g / 20 μ 1、20 μ g /20 μ I>40 μ g / 20 μ I 溶媒,给药方式均为鞘内注射(intrathecal injection, 1.t.)。
[0054]热刺激缩足反射阈值测定:热刺激缩足反射阈值(TWT)的测定，在安静环境中，维持环境温度20~25°C，将大鼠放入热痛刺激仪的有机玻璃箱内，全身可以自由活动。待大鼠静置20min后，用红外光从玻璃桥架下面向上照射大鼠足掌，测定大鼠的抬脚潜伏期(PWL)，并以此作为热刺激缩足反射阈值。
[0055]SD大鼠随机分为五组:单给芍药甙高剂量组、吗啡模型组、吗啡联合低剂量芍药甙给药组、吗啡联合中剂量芍药甙给药组和吗啡联合高剂量芍药甙给药组，按照鞘内注射的方法，吗啡模型组和治疗组大鼠在开始测定时鞘内注射15 μ g morphine / 20 μ I溶媒，随后进行疼痛的行为学测定。芍药甙治疗组、单给高剂量芍药甙组在测试第90min时分别鞘内注射IOyg PF / 20 μ I溶媒、20 μ g PF / 20 μ I溶媒、40 μ g PF / 20 μ I溶媒，然后在相应时间点进行疼痛的行为学测定。记录给药后O到ISOmin时大鼠的缩足时间，超过20s者立即取出，以防足部烫伤，痛阈计为20s。利用以下公式计算％ MPE值(最大效应百分t匕):100% *[(给药后反应时间-基础反应时间)/ (20秒-基础反应时间)]=%MPE。
[0056]d)试验结果描述
[0057]如图1所示:鞘内注射吗啡镇痛效应在第90min时消失，此时鞘内注射芍药甙可以显著升高急性吗啡造模大鼠热刺激缩足反射阈值，延长吗啡镇痛作用至180min，且作用存在剂量依赖性。值得指出的是:不给予吗啡，而仅仅鞘内注射高剂量芍药甙(40ug PF /20ul)，对大鼠的热刺激缩 足反射阈值无显著性影响。以上结果表明:芍药甙能够显著提升并延长吗啡的镇痛时间，增强吗啡的镇痛效应。[0058]需要强调的是，芍药甙对于已经发生的病理性疼痛，如蜂毒、醋酸等刺激制备的疼痛模型是有镇痛效应的，发明人既往研究结果也显示芍药甙对大鼠坐骨神经分支结扎切断模型的热刺激痛和机械刺激痛有镇痛作用，但是这种对已经发生的病理性疼痛、神经痛的镇痛效应，与本实施例的结果是有显著不同的。在本实施例中，在正常大鼠单独给予芍药甙并不影响其痛阈，不能改变大鼠对疼痛刺激的敏感度，但却可以显著延长吗啡的镇痛效应，甚至是在吗啡镇痛效应已经消失的情况下给予芍药甙，可以“重现”吗啡的镇痛效应。这在后续实施例中也将对此进行更为清晰的机制阐述。
[0059]实施例2、鞘内给予芍药甙与吗啡复方制剂能够增强吗啡的急性镇痛效应
[0060]a)试验动物:健康成年雄性SD大鼠，清洁级，体重为180_220g。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2°C，自由饮水和摄食，在适应环境I周后进行实验。对动物的所有处理均遵循国际疼痛研究协会伦理委员会的要求。
[0061]b)试验药品:取实施例12制备的芍药甙与吗啡的复方制剂进行相应稀释而得。
[0062]c)试验方法:大鼠鞘内注射:按压大鼠腰骶部两侧固定，自L5-L6棘突间进针，以鼠尾突然出现侧向运动为注射成功标志。用25μ I微量进样器，注射容积为20μ 1，注射时间10s，留针20s。
[0063]热刺激缩足反射阈值测定:热刺激缩足反射阈值(TWT)的测定，在安静环境中，维持环境温度20~25°C，将大鼠放入热痛刺激仪的有机玻璃箱内，全身可以自由活动。待大鼠静置20min后，用红外光从玻璃桥架下面向上照射大鼠足掌，测定大鼠的抬脚潜伏期(PWL)，并以此作为热刺激缩足反射阈值。
[0064]SD大鼠随机分为三组:单给芍药甙组、吗啡模型组、芍药甙联合吗啡复方制剂组。按照鞘内注射的方法，分别给予相应药物，随后进行疼痛的行为学测定。记录给药后O到ISOmin时大鼠的缩足时间，超过20s者立即取出，以防足部烫伤，痛阈计为20s。利用以下公式计算％ MPE值(最大效应百`分比):100% *[(给药后反应时间-基础反应时间)/ (20秒-基础反应时间)]=% MPE0
[0065]d)试验结果描述:
[0066]如图2所示，单独鞘内注射吗啡镇痛效应在第90min时消失，而鞘内注射注射芍药甙与吗啡复方制剂可以显著升高急性吗啡造模大鼠热刺激缩足反射阈值，至少延长吗啡镇痛作用至180min，与模型对照组相比具有显著性差异，而鞘内注射高剂量芍药甙(40ugPF / 20ul)，对热刺激缩足反射阈值无显著性影响。
[0067]实施例3、全身给予芍药甙能够增强系统给予吗啡的急性镇痛效应
[0068]a)试验动物:健康成年雌性ICR小鼠，清洁级，体重18_22g。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2°C，自由饮水和摄食，在适应环境I周后进行实验。对动物的所有处理均遵循国际疼痛研究协会伦理委员会的要求。
[0069]b)试验药品及试剂:
[0070]药物芍药甙，纯度98%，市售。盐酸吗啡，购自沈阳第一制药厂。
[0071]c)试验方法:
[0072]芍药甙及吗啡给药剂量和方法:芍药甙用生理盐水溶解，给药剂量为80mg/kg，给药方式均为腹腔注射(1.P.)。吗啡注射剂量分别为IOmg / kg, 20mg / kg,40mg / kg,给药方式均为皮下注射(s.c.)。[0073]ICR小鼠随机分为六组:吗啡模型组(IOmg / kg, 20mg / kg和40mg / kg共三组)、芍药甙80mg / kg伴随给药组三组。治疗组小鼠在开始测定前45min腹腔注射芍药甙80mg / kg,模型组和治疗组在开始测定前30min皮下注射苟药式吗啡IOmg / kg, 20mg /kg和40mg / kg,随后进行疼痛的行为学测定。
[0074]热板法测定芍药甙伴随给药对小鼠基础痛阈以及吗啡镇痛效能的影响。逐一将小鼠置于恒温热板[(55±0.2) °C ]，记录从其足部接触热板到开始舔后足的反应时间作为该小鼠的基础痛阈，剔除5s内即舔后足、30s内不舔后足或迅速跳跃者。选用不同剂量的吗啡(IOmg / kg, 20mg / kg和40mg / kg)皮下注射后连续测定180min内的缩足反应时间(55°C热板)。记录给药后30，60，90，120，150和180min时小鼠的舔足时间，超过30s者立即取出，以防足部烫伤，痛阈计为30s。利用以下公式计算％ MPE值(最大效应百分比):100% *[(给药后反应时间-基础反应时间)/ (30秒-基础反应时间)]=% MPE。
[0075]d)试验结果描述:
[0076]如图3所示,其中A为全身给予苟药式80mg / kg对皮下给予吗啡IOmg / kg的镇痛效应示意图，B为全身给予芍药甙80mg / kg对皮下给予吗啡20mg / kg的镇痛效应示意图，C为全身给予苟药式80mg / kg对皮下给予吗啡40mg / kg的镇痛效应示意图。由图3可知，芍药治疗组(80mg / kg)的MPE值，在20mg / kg和40mg / kg组在给药后显著高于模型组，镇痛曲线下面积(AUC)也证实这一点。以上结果表明:芍药甙能够显著延长吗啡的镇痛时间，提升吗啡镇痛效应。
[0077]实施例4、芍药甙能够减轻慢性给予吗啡导致的阿片耐受现象
[0078]a)试验动物:
[0079]雌性ICR小鼠，清洁级，体重18~22g。实验动物饲养于12h~12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2 C，自由饮水和摄食，在适应环境I周后进彳丁实验。对动物的所有处理均遵循国际疼痛研究协会伦理委员会的要求。
[0080]b)试验药品及试剂:
[0081]药物芍药甙，纯度98%，市售。盐酸吗啡，购自沈阳第一制药厂。
[0082]c)试验方法:
[0083]芍药甙给药剂量和方法:芍药甙用生理盐水溶解，剂量为20mg / kg、40mg / kg、80mg / kg，给药方式均为腹腔注射。
[0084]ICR小鼠随机分为四组:吗啡模型组、吗啡芍药甙低剂量给药组、吗啡芍药甙中剂量给药组和吗啡芍药甙高剂量给药组，治疗组小鼠在开始测定前45min腹腔注射芍药甙20mg / kg、40mg / kg、80mg / kg,模型组和治疗组在开始测定前30min皮下注射苟药式吗啡IOmg / kg，随后进行疼痛的行为学测定，每天重复以上方式，连续7天。
[0085]测试慢性耐受:每天吗啡注射(IOmg / kg,皮下)，连续7天,每次注射30min后测定镇痛效应(55°C热板)。热板法测定芍药甙伴随给药对小鼠基础痛阈以及吗啡镇痛效能的影响。逐一将小鼠置于恒温热板[(55±0.2)°C ]，记录从其足部接触热板到开始舔后足的反应时间作为该小鼠的基础痛阈，剔除5s内即舔后足、30s内不舔后足或迅速跳跃者。记录给药后30，60，90和120min时小鼠的舔足时间，超过30s者立即取出，以防足部烫伤，痛阈计为30s。利用以下公式计算％ MPE值(最大效应百分比):100% *[(给药后反应时间-基础反应时间)/ (30秒-基础反应时间)]=% MPE0[0086]d)试验结果描述:
[0087]如图4所示，其中A为全身给予芍药甙延缓慢性给予吗啡导致的镇痛耐受的最大镇痛百分率-时间动态变化示意图，B为全身给予芍药甙延缓慢性给予吗啡导致的镇痛耐受的终点镇痛曲线下面积图。由图4可知，7天慢性吗啡皮下注射使小鼠对吗啡镇痛效应出现耐受，第7天MPE值仅为22%。而芍药治疗组(40或80mg / kg)的MPE值显著高于模型组，第7天高剂量组的MPE值为55%，较吗啡耐受组提高1.5倍以上。第7天的镇痛曲线下面积分析也表明芍药甙持续给予能够剂量依赖性的减轻吗啡的镇痛耐受现象的发生。以上结果表明:芍药甙能够减轻慢性给予阿片类药物导致的阿片耐受现象。
[0088]实施例5、p_P38抑制剂，能够增强急性吗啡的镇痛效应，而p_ERK抑制剂并不影响吗啡的镇痛效应
[0089]a)试验动物:
[0090]健康成年雄性SD大鼠，180_220g，清洁级。实验动物饲养于12h_12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24 土 2 C，自由饮水和摄食，在适应环境I周后进彳丁实验。对动物的所有处理均遵循国际疼痛研究协会伦理委员会的要求。
[0091]b)试验药品及试剂:
[0092]药物SB203580 (p_P38 抑制剂)、U0126 (P-ERK 抑制剂)，购于美国 Calbiochem 公司。盐酸吗啡，购自沈阳第一制药厂。
[0093]c)试验方法:
[0094]大鼠鞘内注射:按`压大鼠腰骶部两侧固定，自L5-L6棘突间进针，以鼠尾突然出现侧向运动为注射成功标志。用25 μ I微量进样器，注射容积为20 μ 1，注射时间10s，留针20so
[0095]抑制剂给药剂量和方法:抑制剂用生理盐水溶解，剂量均为10 μ g / 20 μ I溶媒，给药方式均为鞘内注射。
[0096]SD大鼠随机分为三组:吗啡模型组、吗啡Ρ-Ρ38抑制剂治疗组、吗啡P-ERK抑制剂治疗组，按照鞘内注射的方法，吗啡模型组和治疗组大鼠在开始测定时鞘内注射吗啡15 μ g / 20 μ I溶媒，随后进行疼痛的行为学测定。各抑制剂治疗组在测试第90min时分别鞘内注射10 μ g药物/ 20 μ I溶媒，继续进行疼痛的行为学测定。
[0097]热刺激缩足反射阈值测定:热刺激缩足反射阈值(TWT)的测定，在安静环境中，维持环境温度20~25°C，将大鼠放入热痛刺激仪的有机玻璃箱内，全身可以自由活动。待大鼠静置20min后，用红外光从玻璃桥架下面向上照射大鼠足掌，测定大鼠的抬脚潜伏期(PWL)，并以此作为热刺激缩足反射阈值。
[0098]d)试验结果描述:
[0099]结果如图5所示，鞘内注射吗啡镇痛效应在第90min时消失，此时鞘内注射SB203580可以显著升高急性吗啡造模大鼠热刺激缩足反射阈值，至少延长吗啡90min镇痛作用，而鞘内注射U0126对热刺激缩足反射阈值无显著性影响。以上结果表明:p-P38抑制剂能延长急性吗啡镇痛时间，增强吗啡类药物的急性镇痛效应，而P-ERK抑制剂并不影响吗啡的镇痛效应。
[0100]实施例6、芍药甙能够抑制吗啡诱导的小胶质细胞P-P38上调、P65的核转移、多种炎症闵子mRNA的h调[0101]a)试验细胞:
[0102]BV2小胶质细胞培养含10%胎牛血清的DMEM培养基，5% C02，37°C恒温孵箱培养。覆盖培养瓶底面80%时可传代。实验前24小时，将培养基换成0.5%胎牛血清高糖DMEM。
[0103]b)试验药品及试剂:
[0104]Tris、TEMED、Bovine SerumAlbumin、β -Mercaptoethanol> 甘氨酸、甘油、吐温 _20、溴酌.蓝、SDS> TritonlOO、Marker 购于 Sunshine ；30 % Acrylamide / Bis、Ammonium Persulfate购于Bio-Rad ;甲醇、氯化钠、丙三醇购于南京化学试剂有限公司；P38MAPK (p-Tyrl82)购于 Epitomics ;GAPDH 购于 Bio-World ;anti_rabbit 购于 R&D ；p65 /RelA购于Cell Signaling ;驴抗兔突光二抗购于Jackson Lab ;胎牛血清购于Hyclone ；DMEM> Trizol购于Invitrogen ；TaKaRa PrimeScript试剂盒购于大连宝生物工程有限公司。
[0105]c)试验方法:
[0106]细胞蛋白免疫印迹(Western blotting):取BV-2细胞，加入裂解液，冰上超声处理IOs后，沸水浴中5min变性，15，000转离心15min，吸取上清，_70°C保存。取10 μ I样品/泳道上样于10% SDS-PAGE进行凝胶电泳，4°C IlOV电转90min。5% BSA-TBS封闭I小时后，加入 P-P38 抗体(p-Tyrl82) (1: 1,000，Epitomics)、GAPDH 抗体(1:8000，Bio-fforId) 4°C过夜。TBST漂洗10minX3次后，加入HRP标记二抗羊抗兔-HRP 二抗(1:1000, R&D)室温孵育3小时后加入ECL(Pierce)发光底物显色。用分子显影仪(Gel DocTM XR，170-8170)联合Quantity One-4.6.5 (Bio-Rad Laboratories)软件分析数据。用目的蛋白灰度值与胞浆蛋白内参GAPDH灰度值之比进行半定量分析。
[0107]实时定量PCR:应用Trizol法抽提各组细胞RNA。逆转录反应应用TaKaRaPrimeScript 试剂盒的 SYBR GreenAssay,反应体系为:5XPrimeScriptBuf f er2 μ I, Prime Script RT Enzyme0.5μ I, Oligo dT Primer0.5 μ I,Random6mers0.5 μ I, Total RNA 定量至 500ng, RNase Free ddH20，终体系为 10 μ I。反转录反应条件如下:37°C 15min (反转录反应)；85°C 5sec (反转录酶的失活反应)。Real-timePCR 应用 7300Real_time PCR 系统(Applied Biosystems, Warrington, UK)。cDNA 样品米用三步法PCR扩增标准程序。反应体系为:00嫩模板4 4 I,上游引物I μ I,下游引物I μ I,ddH20, R0X10 μ I，终体系为 20 μ I。
[0108]引物序列如下:
【权利要求】
1.芍药甙在制备增强阿片类药物镇痛效应的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述芍药甙配合阿片类药物使用。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，以所述芍药甙为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂配合阿片类药物使用。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述芍药甙与阿片类药物制成复方制剂使用。
5.如权利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述制剂、复方制剂分别选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。
6.芍药甙在制备延缓或减轻阿片类药物的阿片耐受现象的药物中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述芍药甙配合阿片类药物使用。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，以所述芍药甙为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂配合阿片类药物使用。
9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述芍药甙与阿片类药物制成复方制剂使用。
10.一种复方制剂，其特征在于，是以芍药甙、阿片类药物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成`的制剂。
【文档编号】A61K31/485GK103768083SQ201410030098
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】王森, 刘文涛 申请人:上海唐果医药科技有限公司