海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1及其基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及属于生物医学领域，具体的说是一种海南湍蛙（Amolops?hainanensis）抗癌肽Hainanenin-1及其基因和应用。抗癌肽Hainanenin-1序列为SEQ?ID?No.1中氨基酸所示。Hainanenin-1分子量小、结构简单，仅含有一个二硫键，方便化学合成及基因工程制备。Hainanenin-1作为制备抗肿瘤药物被应用，具有广谱的抗肿瘤活性，对MCF-7细胞有明显的杀伤作用，对其他多种肿瘤细胞也有明显的生长抑制作用。外还具有溶血性低、对正常细胞几无毒性等有益特点。最重要的是，由于Hainanenin-1特殊的癌细胞杀伤机制，不易产生传统化学药物应用时产生的肿瘤多药耐药性。
【专利说明】海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1及其基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及属于生物医学领域，具体的说是一种海南湍蛙(Am010pShainanensis)抗癌肽Hainanenin-1及其基因和应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤是全世界死亡率最高的重大恶性疾病之一，随着工业发展、环境污染以及人们生活节奏的改变，肿瘤的发病率及死亡率呈逐年上升趋势。近年来，尽管随着治疗手段的翻新进步，肿瘤早期诊断的高灵敏化，及抗癌新药和单克隆抗体药物的不断问世，给许多癌症患者带来了福音，但是人类想要攻克癌症，目前仍面临有几大难点:1.癌症治疗过程中常常伴随着肿瘤的多药耐药性(multidrug resistance, MDR)产生,且癌细胞对于抗癌药物的抗性呈越演越烈的趋势，最终造成化疗的失败；2.由于常规小分子抗癌药物不仅针对癌细胞.而是所有快速增殖的细胞起作用，因此现有的抗癌治疗常常存在严重的副作用；
3.近年来发展迅速的单克隆抗体药物，尽管具有高度特异性，可以进行靶向治疗，但是作为大分子糖蛋白，结构复杂，不利储存和口服，进入体内5-7天才能到达靶位置，药物的质量标准高但生产技术却复杂，成本高昂，导致价格昂贵，以致被喻为“经济负作用”。因此，寻找到一类新型抗肿瘤药物以克服化疗中的肿瘤细胞MDR，同时降低其对正常细胞的杀伤作用，使更多的癌症患者得到有效治疗，成为国际上现阶段肿瘤药物的研究热点。
[0003]抗菌肽是一种普遍存在生物体内由生物基因组编码的具有抵抗外源性微生物侵害、清除体内病变细胞活性的一类小分子多肽，早期抗菌肽的研究集中在其广谱的杀菌性包括对革兰氏阴性、阳性菌，真菌，原虫奶汁部分病毒的的抑制作用，随着研究的不断深入，人们发现一些抗菌肽还具有明显的抗肿瘤活性，并且在作用细胞时有很强的选择性。由于它们特殊的抗肿瘤机制，不易产生耐药性，
[0004]以及对正常细胞毒性较低等特点.已经成为具有逆转活性强、低毒的抗MDR抗肿瘤药物研发的热点，因此又被称为抗癌肽(anticancer peptides, ACPs)。
[0005]抗癌肽从结构上来看，可分为a螺旋结构抗癌肽、0折叠结构抗癌肽、线性抗癌肽。从两栖动物中分离得到的抗癌肽绝大多数是a螺旋的结构类型，这也是抗癌肽最普遍存在的一种形式^折叠结构抗癌肽多数来源于哺乳动物，并且折叠程度在不同肽之间差别较大，一般P折叠结构抗癌肽中会含有较多的半胱氨酸(Cys),使分子内形成二硫键结构。许多抗癌肽都是同时含有a螺旋和0折叠结构。而线性结构抗癌肽，没有二级结构但却具有抗肿瘤活性，典型的代表是PR-39，一类富含精氨酸和脯氨酸的抗菌肽，现已被证明除了有很强的抗菌作用外，还对肝癌细胞HLF有明显抑制生长的作用。将已知的抗癌肽分子，对某些氨基酸残基做替换、删减或者用本身的一些氨基酸残基或与另外一种抗癌肽的片段融合，可以得到活性更高，结构更稳定的杂合肽。
[0006]对于抗癌肽的抗癌机制，目前并没有一个明确的阐述，但是不可否认的是抗癌肽分子通常都是富含碱性氨基酸和疏水性氨基酸，因此分子会表面带有大量的正电荷，而癌变细胞的细胞膜表面会高表达一系列带负电荷的分子，比如磷脂酰丝氨酸、0-糖基化的黏蛋白、唾液酸化的神经节苷酯、硫酸乙酰肝素等，但正常细胞的细胞膜主要是由磷脂类和甾醇类等中性电荷分子构成，因此在解释为何抗癌肽会对癌细胞有很强的靶向性时，我们通常会认为大部分带正电荷的抗癌肽会通过静电相互作用与表面带负电的肿瘤细胞结合而发挥具有靶向性的抗肿瘤活性，除此之外肿瘤细胞和正常细胞的另外一个区别源于肿瘤细胞相对于正常细胞所含的微绒毛数目。这些微绒毛促使肿瘤细胞与更多数目的抗癌肽接触。除了溶膜的作用方式，抗癌肽还可以通过下调癌细胞相关抗原、细胞分化相关酶的表达来抑制癌细胞的增殖。此外，有些抗癌肽对肿瘤部位的血管生成也有一定的抑制作用。 [0007]我国是一个物产资源丰富的国家，两栖类动物作为一个复杂且具有多样性的生态类型，广泛分布在全国各地，尤其在南方气候潮湿、物种丰富的山间雨林里。自古以来，各种医学药典中就有关于两栖类物种，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans),大踐铃蟾(Bombinamaxima)等背皮入药的记载，因此等很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而被广泛应用，如，黑斑娃(pelophylaxnigromaculata),沼娃(Hylarana guentheri)和泽娃(Euphlyctis Iimnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。
[0008]两栖类动物体内，除了具有生物碱等一系列有机药用小分子外，两栖类皮肤还含有大量的活性肽类物质，这是新药发现的一个重要来源。生活在海南省山岭间的海南湍蛙，其潮湿、温热的气候环境促使其体内进化形成较为强化的防御机制，体内含有丰富的活性肽。
【发明内容】
[0009]本发明目的在于提供一种海南瑞娃(Amolops hainanensis)抗癌肽Hainanenin-1及其基因和应用。
[0010]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0011]一种海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1,抗癌肽Hainanenin-1序列为SEQ ID N0.1中氨基酸所示。所述抗癌肽Hainanenin-1的C端含有一个由二硫键形成的七元Rana Box的环分子量为2278.9Da，等电点为9.5。
[0012]所述海南瑞娃Hainanenins的基因序列为SEQ ID N0.2中核苷酸所示。
[0013]—种海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1的应用，所述海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1有广谱抗肿瘤活性，用于制备抗肿瘤药物。
[0014]进一步的说，所述海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1用于制备A-549人肺癌细胞、SGC-7901人胃癌细胞、MDA-MB-453人乳腺癌细胞、PC-3人前列腺癌细胞或MCF-7乳腺癌细胞的抗肿瘤药物。
[0015]更进一步的说,所述海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1用于制备MCF-7乳腺癌细胞的抗肿瘤药物。
[0016]所述合成的Hainanenin-1抗癌肽具有很强的体外杀伤癌细胞作用，溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。
[0017]本发明所具有的优点:
[0018]本发明采用基因克隆得到编码海南湍蛙Hainanenin-1抗癌肽的基因，通过化学合成方法得到成熟肽Hainanenin-1,结构简单,仅含有一个二硫键,方便化学合成及基因工程制备。Hainanenin-1具有广谱抗肿瘤活性，在亚微摩尔剂量下即具有很强的抗肿瘤活性，体外对肿瘤细胞A-549，SGC-7901，MDA-MB-453，PC-3均有较强的抑制生长作用，24h用药时间内，IC5tl值在10-13 u M/L之间。尤其对乳腺癌细胞MCF-7有明显体外抑制生长作用，24h用药时间内，IC50仅为6.9 ii M/L，相比传统化疗药物阿霉素(IC50为15.6 ii M/L)，效应更强。且Hainanenin-1作为阳离子小肽家族一员，杀伤癌细胞机制在于破坏胞体结构,细胞膜的完整性，使其内容物溶出，细胞死亡。相比作用于肿瘤DNA，抑制癌细胞有丝分裂的化疗药物如阿霉素、紫杉醇等，Hainanenin-1不易引起肿瘤细胞多药耐药性，且几无细胞毒性和溶血性。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明实施例提供的Hainanenin-1三级空间结构图。
[0020]图2为本发明实施例提供的Hainanenin-1对不同肿瘤细胞的生长抑制作用图。
[0021]图3为本发明实施例提供的不同浓度Hainanenin-1引起MCF-7细胞形态变化图，其中，A:DMS0 对照组；B:2.15 u M/L ；C:4.3u Mm/L ；D:8.6u Mm/L ；E:13u Mm/L。
[0022]图4为本发明实施例提供的Hocheset33258染色观察Hainanenin-1对MCF-7细胞形态变化的影响图，其中A:DMS0对照组；B:2.15 u M/L ；C:4.3u Mm/L ；D:8.6u Mm/L ；E: 13 u Mm/L。
[0023]图5为本发明实施例提供的SEM观察Hainanenin-1对MCF-7细胞超显微结构的影响图，其中A、B:对照组；C:药物作用6h ；D:药物作用12h ；E:药物作用18h ；F:药物作用24h
[0024]图6为本发明实施例提供的AV/PI双染检测Hainanenin-1对MCF-7细胞凋亡的量效关系图；其中，A:DMS0 对照组；B:3.5iiM/L (1/2IC50) ；C:6.9 u Mm/L (IC50)o
【具体实施方式】
[0025]下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
[0026]海南瑞娃Hainanenin-1的基因的克隆包括:
[0027]海南湍蛙背皮总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选海南湍蛙Hainanenin基因。5’端引物为5’ -CCAAAGATGTTCACCTTGAAG-3,PCR 另一扩增引物为 CL0NTECH 公司 CreatorTMSMART TM cDNA Library Construction Kit中的3’ PCR Primer引物，其序列为5’ CGGGGTACGATGAGACACCAT3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码海南湍蛙Hainanenins的基因开放阅读框由204个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:
[0028]I ATGTTCCCCT TGAAGAAATC CATGTTACTC CTTTTCTTCC TTGGGACCAT
[0029]51 CAACTTATCT CTCTGTGAGC AAGAGAGAGA GCCGAAGAAG AAAGAAGAGG
[0030]101 TAAAAGGGAT GTTGAAGTGG AAAAACGATT TGCATTAGGT GCGGTTACTA
[0031]151 AGCTTTTGCC ATCACTGTTA TGTATGATTA CCAGAAAATG TTGA
[0032]编码海南湍蛙成熟肽Hainanenin-1为第88-181位核苷酸，其氨基酸序列为:[0033]Phe-Ala-Leu-Gly-Ala-Val-Thr-Lys-Leu-Leu-Pro-Ser-Leu-Leu-Cys-Met-1le-Thr-Arg-Lys-Cys (FALGAVTKLLPSLLCMITRKC)。Hainanenin-1 为 C 端含有七元 Rana Box 的环状多肽，含有21个氨基酸残基，理论等电点(pi)为9.5，理论分子量为2279.8，含有3个碱性氨基酸残基(I个精氨酸和2个赖氨酸)，不含有酸性氨基酸，静电荷为+3，说明它是一种碱性多肽。Hainanenin-1含有2个半胱氨酸,因此分子内形成一个二硫键，结构简单。
[0034]根据成熟肽序列化学合成的抗癌肽Hainanenin-1可以溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。
[0035]实施例1
[0036]海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1基因克隆
[0037]I)海南湍蛙皮肤总RNA提取:
[0038]①取300mg海南湍蛙皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入Iml总RNA提取缓冲液(Trizol,美国Invitrogen公司产品)，充分混匀，而后于4°C,12000rpm 离心 lOmin。
[0039]②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4°C，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
[0040]③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4°C，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75% (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为海南湍蛙皮肤总RNA。
[0041 ] 2)海南湍蛙皮肤cDNA文库构建:采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer?Directional cDNA Library Construction Kit。
[0042]1.cDNA第一链合成(mRNA反转录):
[0043]①经DEPC处理(DEPC处理是在含0.1%( V/V)DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干)的离心管中加入I U I海南湍蛙皮肤总RNA、1 ii 13’端一链合成引物(3’In-Fusion SMARTerCDS Primer)和2.5 yl DEPC处理的水(DEPC处理的水是含0.1%DEPC (V/V)的水，放置过夜，高压灭菌)使总体积达到4.5iU，混匀后短暂离心(2000rpm，30s)，离心后于72°C保温3分钟；保温后再将离心管在42°C孵育2分钟。
[0044]②在上述离心管中加入以下试剂(均为CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer ?Directional cDNA Library Construction Kit 建库试剂盒中配备)，2.0 u 15 X 第一链缓冲液、0.25 ii IlOOmM DTTU.0u IlOmM dNTP MixU.0u I SMARTer V Oligonucleotide、0.25 u I RNase Inhibitor 和 1.0u I SMARTScribe Reverse Transcriptase 反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心(2000rpm,30s),在42°C保温90min,然后68°C保温lOmin。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2 Ul所合成的cDNA第一链备用。
[0045]I1.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链(所用试剂均为CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 建库试剂盒中配备)
[0046]①将2iil cDNA 第一链(mRNA 反转录)、80ii I 去离子水、IOii 110XAdvantage2PCR缓冲液、2iil50XdNTP 混合物、2iU5’ PCR 引物、2yl CDS 111/3’ PCR 引物以及2 U 150 X Advantage2Polymerase Mix 在 95°C预热的 PCR 管中进行混合。
[0047]②在PCR 仪中按以下程序扩增:95°C，lmin ; 18 个循环:95°C，15sec，65°C，30sec，68°C，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链一 80°C保存。
[0048]3)海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1基因克隆筛选:
[0049]根据蛙科抗菌肽信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列为 5’ -CCAAAGATGITCACCTTGAAG-3’，PCR 另一扩增引物为 CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3，-PCR 引物，其序列为 5’ -CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR 反应在如下条件下进行:94°C 4min,94°C 30sec,57°C 30sec和72°C lmin，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到PMD19-T载体(Takara，大连)，转化进CaCl2-MgCl2法制备好的DH5 a感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落,摇菌提取质粒,使用Applied Biosystems DNAsequencer, model ABI PRISM377进行核苷酸测序,并翻译成氨基酸序列。
[0050]4)同源建模模拟Hainanenin-1三级结构
[0051]利用同源建模的方法模拟了Hainanenin-1的3D结构，如图1所示，显示主要由a螺旋结构构成，两端带有random coil,该类型结构与已知的阳离子抗菌肽的基本结构相符。
[0052]实施例2
[0053]海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1的细胞增殖抑制实验，
[0054]MTT法检测Hainanenin-1对不同肿瘤细胞株的细胞毒作用
[0055]实验用细胞株`MCF-7, SGC-7901, MDA-MB-453, A-549, PC-3, HUVEC 均由中科院昆明动物研究所友情提供，且都为贴壁生长细胞。均用含有20%胎牛血清(Gibico，Life Tech,USA)以及 lOOU/ml 青链双抗(Gibico，Life Tech，USA)的 DMEM (Gibico, Life Tech, USA)培养基悬浮细胞沉淀，转入25ml培养瓶中，于37°C，5%C02培养箱内培养至对数期。胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，通过血细胞计数板的计数调整其浓度至5-10 X IO4个/ml。于96孔板内，每孔加入lOOul，使得待测细胞密度为5000-10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层贴壁长满孔底即可加药。
[0056]浓度药物(Hainanenin-1)浓度分别是0.005mg/ml, 0.010mg/ml, 0.015mg/ml, 0.020mg/ml, 0.025mg/ml.0.030ml/m,和 0.040mg/ml。阴性照为 0.1%DMS0,阳性对照为阿霉素(0.005mg/ml)。每个梯度5个复孔，每孔加药100ul，终体积为200ul。5%C02，37°C培养箱内孵育48h后，每孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml)，继续避光培养4h。
[0057]终止培养，吸去孔内液体，加入200ul DMSO (此处要向空白孔内加入一组DMSO做为调零组)，放在摇床上慢摇lOmin，溶解紫色结晶，在酶联免疫检测仪0D490nm处测量各孔的吸光值。每种细胞检测重复三次。根据公式:细胞死亡率=1 一(对照组OD—实验组OD)/对照组ODX 100%计算细胞存活率，并利用软件SPSS计算药物的IC5tl值，进行显著性分析(参见图2)。
[0058]IC50是对50%细胞产生细胞毒作用时的药物浓度。Hainanenins-2对不同细胞的IC5tl值如下表1所示。
[0059]表1
[0060]
【权利要求】
1.一种海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1,其特征在于:抗癌肽Hainanenin-1序列为SEQID N0.1中氨基酸所示。
2.按权利要求1所述的海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1,其特征在于:所述抗癌肽Hainanenin-1的C端含有一个由二硫键形成的七元Rana Box的环分子量为2278.9Da,等电点为9.5。
3.按权利要求1所述的海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1,其特征在于:所述海南瑞娃Hainanenins的基因序列为SEQ ID N0.2中核苷酸所示。
4.一种权利要求1所述的海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1的应用,其特征在于:所述海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1有广谱抗肿瘤活性,用于制备抗肿瘤药物。
5.按权利要求4所述的海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1的应用,其特征在于:所述海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1用于制备A-549人肺癌细胞、SGC-7901人胃癌细胞、MDA-MB-453人乳腺癌细胞、PC-3人前列腺癌细胞或MCF-7乳腺癌细胞的抗肿瘤药物。
6.按权利要求4所述的海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1的应用,其特征在于:所述海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1用于制备MCF-7乳腺癌细胞的抗肿瘤药物。
7.按权利要求3所述的海南瑞娃抗癌肽Hainanenin-1基因的应用,其特征在于,所述合成的Hainanenin-1抗癌肽具有很强的体外杀伤癌细胞作用，溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。
【文档编号】A61K38/17GK103755796SQ201410029739
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】于海宁, 王义鹏, 张嵩岩 申请人:大连理工大学