苹果多酚在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种从苹果渣中分离提取的苹果多酚在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用。其特征是：所述的苹果多酚在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应用。本发明的苹果多酚是从苹果渣中分离提取出来，用于骨质疏松的治疗和预防，同时解决苹果渣的废物利用，降低苹果多酚的生产成本，减少环境污染。
【专利说明】苹果多酚在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及苹果多酚，特别是关于从苹果渣中分离提取的苹果多酚在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用。
【背景技术】
[0002]骨质疏松是一个全球性老年人共同面对的问题，严重影响人们的生活质量，尤其是接踵而来的骨折，更是导致骨质疏松患者致残、致死的主要原因。骨质疏松是一种持续性进展性疾病，患者需要终身服药。目前，虽然治疗骨质疏松的药物很多，一些药物价格昂贵，长期使用均可引起毒副作用，患者依从性差。苹果是人们经常食用的水果，安全无毒。本实验室利用苹果渣分离、提取、得到苹果多酚，用于骨质疏松的治疗或保健；不仅原料来源方便廉价，且能提升苹果渣自身的价值，减少环境污染。
【发明内容】
[0003]本发明涉及一种来源于苹果渣的苹果多酚在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用。本发明涉及的苹果多酚是从苹果渣中分离提取出来，用于骨质疏松的治疗，同时解决了苹果渣的废物利用和环境污染问题。本发明涉及从苹果渣中制备苹果多酚的方法，该产品能够有效地预防或治疗骨质疏松。
[0004]本发明的技术方案是:苹果多酚在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用，其特征是:所述的苹果多酚在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应用。
[0005]所述的苹果多酚的来源是从榨汁后的苹果渣中获得的，其提取方法是梯度乙醇浸泡法结合柱分离法获得苹果多酚。
[0006]所述的苹果多酚的提取方法具体步骤如下:步骤I)将苹果榨汁后，取苹果渣100克，立即用为95%的乙醇1000毫升浸泡，然后5-7日后换用80%的乙醇1000毫升浸泡，3_5日后换用70%的乙醇1000毫升浸泡，3-5日后再换用50%的乙醇1000毫升浸泡；步骤2)将4次的浸泡液合并，浓缩；步骤3)浸泡后的苹果渣用50%的乙醇1000毫升回流2h，共2次；回流液合并，浓缩；将步骤2)和步骤3)浓缩液用柱分离法进行分离:用大孔树脂进行粗分离，以60%乙醇1000毫升洗脱液收集、浓缩；浓缩液冻干，采用凝胶柱再次纯化，以50%的乙醇1000毫升洗脱，获得精制苹果多酚，上述百分数均为质量百分比浓度。
[0007]所述的用大孔树脂进行粗分离:将预处理好的大孔树脂分别采用乙醇湿法装柱，装柱高度40cm，柱半径5.0cm ;然后用无水乙醇冲洗至流出液不再出现白色浑浊为止，再用大量蒸馏水进行冲洗至流出液无醇味；将等量的浓缩液上柱，上样时流速为0.5^1.0ml/min,流出液重新上柱吸附一次，关闭柱子吸附过夜，然后依次用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、75%乙醇、95%乙醇4倍柱体积溶液洗脱，洗脱流速为3~5min/ml，上述百分数均为质量百分比浓度。
[0008]所述采用凝胶柱再次纯化指的是:将预处理好的Sephadex LH-20凝胶用乙醇湿法装柱，在凝胶柱上加入浓度为0.163g/ml经DlOl大孔树脂初步纯化后的苹果多酚样品，上样时流速为0.5^1.0ml/min,关闭柱子吸附过夜，然后依次用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、75%乙醇、95%乙醇4倍柱体积溶液洗脱，洗脱流速为0.5ml/min ;上述百分数均为质量百分比浓度。
[0009]所述的苹果多酚在制备防治骨质疏松药物的剂型是胶囊剂、片剂、口服液、散剂或注射剂。
[0010]所述的大孔树脂为大孔树脂AB-8、D101、XDA-7或XDA-8。
[0011]所述的Sephadex LH-20凝胶为轻丙基葡聚糖凝胶。
[0012]本发明的特点:
I.苹果多酚来源于苹果，用于治疗骨质疏松，长期服用，没有毒副作用，患者的依从性将大大提闻。
[0013]2.苹果多酚治疗骨质疏松呈现多靶点的特点，契合了骨质疏松多种病因的发病特点，相对于目前单靶点的治疗药物，作用靶点的多样性，长期疗效将各更为满意。
[0014]3.与雌激素相比，苹果多酚治疗骨质疏松不引起动物的体重下降。
[0015]4.从苹果渣中提取苹果多酚不仅原料来源方便廉价，可大幅度降低苹果多酚的成本，且能提升苹果渣自身的价值，减少环境污染。
[0016]5.苹果多酚具 有明显的抗氧化作用，也是苹果多酚治疗骨质疏松的机制之一。
[0017]下面通过给出的具体实施例和附图可以进一步清楚的说明本发明，但不作为对本发明的限定。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1本发明实施例苹果多酚对绝经后骨质疏松大鼠体重的影响；
图2本发明实施例苹果多酚对绝经后骨质疏松大鼠子宫内膜的影响；
图3本发明实施例苹果多酚对绝经后骨质疏松大鼠子宫脏体比的影响；
图4本发明实施例苹果多酚对绝经后骨质疏松大鼠股骨总骨矿物密度(BMD)的影
响；
图5本发明实施例苹果多酚对绝经后骨质疏松大鼠骨应力的影响；
图6本发明实施例苹果多酚对绝经后骨质疏松大鼠弹性模的影响；
图7本发明实施例苹果多酚对去卵巢大鼠股骨干骺端骨小梁微结构特性的影响； 其中，(A)假手术，(B)去卵巢(C)雌二醇，(D)阿伦膦酸钠，(E)苹果多酚高剂
量;
图8HE染色观察苹果多酚对大鼠股骨骨小梁结构特性的影响；
其中，(A)假手术，(B)去卵巢，(C)雌二醇，(D)阿伦膦酸钠，(E)苹果多酚低，(F)苹果多酚中；(G)苹果多酚高。
【具体实施方式】
[0019]实施例1:
苹果多酚的提取方法具体步骤如下:步骤I)将苹果榨汁后，取苹果渣100克，立即用浓度为95%的乙醇1000毫升浸泡5-7日，之后换用80%的乙醇1000毫升浸泡3_5日，之后换用70%的乙醇1000毫升浸泡3-5日，之后再换用50%的乙醇1000毫升浸泡3_5日，离心，分离浸泡液；步骤2)将4次的浸泡液合并，浓缩；步骤3)浸泡后的苹果渣用50%的乙醇1000毫升回流2h，共2次；回流液合并，浓缩；将步骤2)和步骤3)浓缩液合并，用柱分离法进行分离:用大孔树脂进行粗分离，以水、10%，20%，30%，40%，50%，60%，75%，80%，95%乙醇1000毫升进行洗脱，洗脱液收集、浓缩；浓缩液冻干，采用S印hadex LH-20凝胶柱再次纯化，以水、10%，20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%，80%, 95%的乙醇1000毫升洗脱，获得精制苹果多酚，上述百分数均为质量百分比浓度。
[0020]所述的用大孔树脂进行粗分离:将预处理好的大孔树脂分别采用乙醇湿法装柱，装柱高度40cm，柱半径5.0cm ;然后用无水乙醇冲洗至流出液不再出现白色浑浊为止,再用大量蒸馏水进行冲洗至流出液无醇味；将苹果多酚冻干粉末，配置为0.5%、1%、2%、3%、4%或者5%的终浓度，上柱，根据柱体积，决定上样量，上样时流速为0.5^1.0ml/min,流出液重新上柱吸附一次，关闭柱子吸附过夜，然后依次用水、10%，20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%，80%，95%的乙醇4倍柱体积溶液洗脱，洗脱流速为:T5min/ml，上述百分数均为质量百分比浓度。所述采用凝胶柱再次纯化指的是:将预处理好的S印hadex LH-20凝胶用乙醇湿法装柱，使柱体积保持在的内经2-10cm X高度10-200cm:将多酚浓度配置为0.5%、1%、2%、3%、4%或者5%的终浓度，在S印hadex LH-20凝胶柱上加入配置好的苹果多酚，该多酚为经DlOl大孔树脂初步纯化后的苹果多酚；上样时流速为0.5^1.0ml/min，关闭柱子底端开关，使多酚吸附过夜，然后依次用水、10%，20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%，80%, 95%的乙醇4倍柱体积溶液洗脱，洗脱流速为0.5ml/min ;上述百分数均为质量百分比浓度。
[0021]所述的大孔树脂指还可以是大孔树脂AB_8、XDA-7或XDA-8。
[0022]所述的大孔树 脂柱:装柱高度10_200cm，柱内径5.0-100.0cm。
[0023]所述的Sephadex LH-20凝胶为轻丙基葡聚糖凝胶。
[0024]所述的凝胶柱为:内经2-10cm，高度10_200cm。
[0025]本发明用于制备苹果多酚的苹果渣首先采用95%的乙醇浸泡，其后采用梯度乙醇浸泡，解决苹果渣不易保存，易腐败的问题；以减少苹果多酚在分离纯化中的损失。
[0026]下面将描述本发明所涉及药物及保健品的制剂通过镇抗骨质疏松的药理实验结果来说明本发明在骨质疏松中的新用途，但本发明并不局限于下述实施例。下述实施例中的苹果多酚是采用实施例1方法制备的产品，但也可以采用现有的公知技术或直接购得。
[0027]实施例2:
苹果多酚对绝经后骨质疏松大鼠体重的影响
采用卵巢摘除术复制大鼠绝经后骨质疏松模型，手术后将大鼠分为模型组给予生理盐水，阳性对照组给予阿伦膦酸钠和雌二醇。苹果多酚分为剂量分别为50 mg/kg/d (低)、150mg/kg/d (中)、250mg/kg/d(高)三个剂量组。
[0028]图1所示苹果多酚对卵巢摘除大鼠体重的影响。结果表明，卵巢摘除术后第五周大鼠体重显著高于假手术组，并且这种显著性差异随着时间增加始终存在(P < 0.05)。给予雌二醇的动物从第五周开始大鼠体重显著低于假手术组，这种区别一直保持到实验结束。给予阿伦膦酸钠组的大鼠体重处于假手术和去卵巢大鼠组之间，但是未见显著性差异，苹果多酚低剂量可维持大鼠体重，体重增加低于阿伦膦酸钠而高于雌二醇。
[0029]实施例3:
苹果多酚对绝经后骨质疏松大鼠子宫的影响采用卵巢摘除术复制大鼠绝经后骨质疏松模型，手术后将大鼠分为模型组给予生理盐水，阳性对照组给予阿伦膦酸钠和雌二醇。苹果多酹分为50 mg/kg/d(低)、150 mg/kg/d(中)、250mg/kg/d(高)三个剂量组。
[0030]卵巢摘除大鼠的子宫内膜(图2B)较假手术组(图2A)明显萎缩，图2B示子宫内膜极薄，内膜上皮以扁平上皮细胞和立方上皮细胞为主；雌二醇(图2C)可部分地对抗去卵巢大鼠子宫内膜增厚，但仍然低于假手术组，苹果多酚治疗组(图2D)和阿伦膦酸钠组(图2E)对子宫内膜增生几乎没有影响，和去卵巢组比较接近。
[0031]将大鼠的子宫重量与体重做比值。计算脏体系数，(图3)结果显示:去卵巢后大鼠子宫重量明显下降(P <0.01)，雌二醇可显著对抗去卵巢大鼠子宫内膜的萎缩，对抗子宫的减轻，苹果多酚三个治疗剂量和阿伦膦酸钠没有明显对抗去卵巢大鼠子宫质量的下降。[0032]实施例4:
苹果多酚对绝经后骨质疏松大鼠血清及尿液生化指标的影响采用卵巢摘除术复制大鼠绝经后骨质疏松模型，手术后将大鼠分为模型组给予生理盐水，阳性对照组给予阿伦膦酸钠和雌二醇。苹果多酚分为高中低三个剂量进行治疗。
[0033]表1可见，在大鼠去卵巢前，各组大鼠血清及尿液生化指标检测未见显著性差异。卵巢摘除后，大鼠尿钙和尿磷的水平显著性增高(P < 0.01)。苹果多酚能够剂量依赖性地对抗去卵巢大鼠尿液中钙和磷水平的升高(P < 0.01或P < 0.05)，与阳性药阿伦膦酸钠和雌二醇对抗去卵巢大鼠尿钙和尿磷水平升高的作用一致(P < 0.01)。卵巢摘除20周后，与假手术组相比较，大鼠的血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、I型原胶原分子N端前肽(PlNP)、I型原胶原分子C端前肽(PlCP)和尿中羟脯氨酸(Hyp)、胶原吡啶诺啉交联(Pyr)、I型胶原交联氨基末端肽(NTx)、I型胶原交联羧基末端肽(CTx)均显著升高(P < 0.01)。给予药物干预后，苹果多酚与E2和Alen作用类似，都能够显著抑制OVX所诱导的反映骨转化的相关指标的升高(P < 0.01或P < 0.05)。
[0034]实施例5:
苹果多酚对绝经后骨质疏松大鼠股骨总骨矿物密度(BMD)的影响采用卵巢摘除术复制大鼠绝经后骨质疏松模型，手术后将大鼠分为模型组给予生理盐水，阳性对照组给予阿伦膦酸钠和雌二醇。苹果多酚分为高中低三个剂量组。大鼠给药治疗20周后，取大鼠的股骨进行骨密度扫描，扫描结果显示(图4)去卵巢大鼠的BMD明显低于假手术大鼠(P〈0.01)，与去卵巢大鼠相比，阳性药雌二醇和阿伦膦酸钠治疗后能明显抑制大鼠股骨BMD的下降(P〈0.01)，苹果多酚剂量依赖性地对抗去卵巢大鼠股骨的BMD下降(P〈0.01 或 Ρ〈0.05)。
[0035]实施例6:
苹果多酚对绝经后骨质疏松大鼠股骨生物力学性能的影响
采用卵巢摘除术复制大鼠绝经后骨质疏松模型，手术后将大鼠分为模型组给予生理盐水，阳性对照组给予阿伦膦酸钠和雌二醇。苹果多酚分为高中低三个剂量组。
[0036]卵巢摘除术后25周，三点弯曲结果显示(图5、图6)，股骨内在的特性生物力学指标骨应力(Maximum stress)及弹性模量(Young modulus)与假手术组相比均显著下降(P< 0.01)，而阿伦膦酸钠和雌二醇及苹果多酚治疗25周后可显著对抗去卵巢大鼠下降的骨应力及弹性模量(ρ〈ο.01)。[0037]实施例7:
苹果多酚对去卵巢大鼠股骨干骺端骨小梁微结构特性的影响采用卵巢摘除术复制大鼠绝经后骨质疏松模型，手术后将大鼠分为模型组给予生理盐水，阳性对照组给予阿伦膦酸钠和雌二醇。苹果多酚分为高中低三个剂量组。卵巢摘除术后25周，大鼠处死后取大鼠的股骨做Micro CT分析，结果显示(图7)去卵巢大鼠术后25周，股骨干骺端骨小梁SMI和Tb.Sp与假手术组相比显著升高(P < 0.01)，而BV/TV、Tb.N、Tb.Th及Conn.均低于假手术组大鼠，提示去卵巢大鼠导致股骨干骺端骨小梁微结构不良，而雌激素、阿伦膦酸钠及苹果多酚提取物治疗20周可以不同程度的改善大鼠股骨干骺端骨小梁的微结构。
[0038]实施例8:
HE染色观察苹果多酚对大鼠股骨骨小梁结构特性的影响
采用卵巢摘除术复制大鼠绝经后骨质疏松模型，手术后将大鼠分为假手术组给予生理盐水、模型组给予生理盐水，阳性对照组给予阿伦膦酸钠和雌二醇。苹果多酚分为高中低三个剂量组。大鼠处死后取大鼠的股骨做HE染色，结果显示(图8)卵巢摘除术后25周，去卵巢大鼠的股骨干骺端骨小梁与假手术组相比明显稀疏，骨小梁出现断裂，而雌激素、阿伦膦酸钠及苹果多酚提取物组治疗20周可以不同程度的改善大鼠股骨干骺端骨小梁的微结构。
[0039]本发明从苹果渣中分离提取苹果多酚能够用于制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中，同时解决苹果渣的废物利用，降低苹果多酚的生产成本，减少环境污染。苹果多酚在制备防治骨质疏松药 物时，药物的剂型可以是胶囊剂、片剂、口服液、散剂或注射剂。
【权利要求】
1.苹果多酚在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用，其特征是:所述的苹果多酚在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应用。
2.根据权利要求1苹果多酚在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用，其特征是:所述的苹果多酚的来源是从榨汁后的苹果渣中获得的，其提取方法是梯度乙醇浸泡法结合柱分离法获得苹果多酚。
3.根据权利要求2苹果多酚在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用，其特征是:所述的苹果多酚的提取方法具体步骤如下:步骤I)将苹果榨汁后，取苹果渣100克，立即用为95%的乙醇1000毫升浸泡，然后5-7日后换用80%的乙醇1000毫升浸泡，3_5日后换用70%的乙醇1000毫升浸泡，3-5日后再换用50%的乙醇1000毫升浸泡；步骤2)将4次的浸泡液合并，浓缩；步骤3)浸泡后的苹果渣用50%的乙醇1000毫升回流2h，共2次；回流液合并，浓缩；将步骤2)和步骤3)浓缩液用柱分离法进行分离:用大孔树脂进行粗分离，以60%乙醇1000毫升洗脱液收集、浓缩；浓缩液冻干，采用凝胶柱再次纯化，以50%的乙醇1000毫升洗脱，获得精制苹果多酚，上述百分数均为质量百分比浓度。
4.根据权利要求2或3苹果多酚在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用，其特征是:所述的用大孔树脂进行粗分离:将预处理好的大孔树脂分别采用乙醇湿法装柱，装柱高度40cm，柱半径5.0cm ;然后用无水乙醇冲洗至流出液不再出现白色浑浊为止，再用大量蒸馏水进行冲洗至流出液无醇味；将等量的浓缩液上柱，上样时流速为0.5^1.0ml/min，流出液重新上柱吸附一次，关闭柱子吸附过夜，然后依次用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、75%乙醇、95%乙醇4倍柱体积溶液洗脱，洗脱流速为3~5min/ml，上述百分数均为质量百分比浓度。
5.根据权利要求2或3苹果多酚在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用，其特征是:所述采用凝胶柱再次纯化指的是:将预处理好的S^hadex LH-20凝胶用乙醇湿法装柱，在凝胶柱上加入浓度为0.163g/ml经DlOl大孔树脂初步纯化后的苹果多酚样品，上样时流速为0.5^1.0ml/min，关闭柱子吸附过夜，然后依次用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、75%乙醇、95%乙醇4倍柱体积溶液洗脱，洗脱流速为0.5ml/min ;上述百分数均为质量百分比浓度。
6.根据权利要求1、2或3中的任意一种苹果多酚在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用，其特征是:所述的苹果多酚在制备防治骨质疏松药物的剂型是胶囊剂、片剂、口服液、散剂或注射剂。
7.根据权利要求3或4苹果多酚在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用，其特征是:所述的大孔树脂为大孔树脂AB-8、D101、XDA-7或XDA-8。
【文档编号】A61K36/73GK103830370SQ201410053765
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月18日 优先权日:2014年2月18日
【发明者】梅其炳, 刘莉, 王娟, 岳正刚, 滕增辉, 孙阳 申请人:中国人民解放军第四军医大学