用于给禽类经眼施用疫苗的包含壳聚糖的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及通过经眼途径给禽类物种施用的包含壳聚糖和疫苗的疫苗组合物，和包括使用壳聚糖以增加或增强禽类物种中细胞介导的免疫和疫苗在禽类组织中的存留的接种方法或程序。
【专利说明】用于给禽类经眼施用疫苗的包含壳聚糖的组合物
[0001]本申请是申请日为2009年9月4日、申请号为200980138635.5的同名申请的分
案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及通过经眼途径给禽类物种施用的包含壳聚糖(chitosan)和疫苗的疫苗组合物以及接种的方法或程序(其包括使用壳聚糖以增加或增强禽类物种中对疫苗的免疫应答)。
[0003]发明背景
[0004]疫苗是给受试者施用以通过诱导对特定微生物(例如细菌或病毒或寄生虫)的主动免疫来增强对感染的抗性的抗原性材料的制剂。可将疫苗与佐剂共施用以增强免疫应答。佐剂的实例包括增强免疫系统对抗原的应答的化学和多肽免疫刺激剂。此类佐剂可包括例如氢氧化铝、磷酸铝、植物和动物油以及矿物油、细菌毒素、几丁质(chitin)衍生物和壳聚糖等，可将佐剂以足以增强免疫应答的量与疫苗一起施用。[0005]通常通过胃肠外注射例如皮下或肌内注射施用疫苗和佐剂。特别地，对于治疗上呼吸道的感染，还可进行至多种动物物种的鼻粘膜的直接施用。例如，欧洲专利EP865297B1描述了将来自病原体的蛋白质或多糖抗原和作为佐剂的壳聚糖鼻内共施用至小鼠。通过气雾剂、滴剂或吹入法将此类鼻内组合物配制为微球体形式的干粉，并且通过另外的几次连续鼻内施用允许增强IgA粘膜体液和IgG全身性免疫应答。
[0006] 申请人:现已发现，在相同的接种程序中与禽类疫苗组合使用的壳聚糖具有极大地增强细胞介导的免疫应答同时维持已接种的鸟类的高体液和全身性免疫应答的潜力(当通过经眼途径施用时)。此外，已发现，壳聚糖作用于禽类结膜并且导致疫苗在禽类组织中的存留(persistence)显著增加。
[0007]发明概述
[0008]本发明涉及经眼施用给禽类物种的疫苗组合物，其包含一种或多种疫苗和有效佐剂量的壳聚糖。本发明还涉及免疫禽类物种的方法，其包括给禽类物种经眼施用疫苗组合物，以及一种或多种疫苗与壳聚糖的组合在制造用于经眼施用以有效地免疫禽类物种抵抗感染性疾病的疫苗组合物中的用途。本发明还涉及禽类接种试剂盒，其包括疫苗组合物和用于所述疫苗组合物的经眼施用的工具或装置。
[0009]附图概述
[0010]图1:举例说明接种的时间线。
[0011]图2:举例说明抗原回忆(antigen recall)方案。
[0012]图3:显示如在经眼施用具有或不具有壳聚糖的CEVAC? VITAPEST L(CevaPhylaxia, Hungary)后2至5周测量的鸡Y -干扰素的产量水平(光密度)。
[0013]图4:显示已通过经眼途径接受具有或不具有壳聚糖的CJEVAG?UNI L或
CEVAC? VITAPEST L的SPF鸡的禽类组织中以卵感染剂量(EID5tl)表示的新城疫(ND)疫苗株的滴度。
[0014]图5:显示已通过经眼途径接受具有或不具有壳聚糖的CEVAG? UNI L(Ceva
Phylaxia, Hungary)或CEVAC? VITAPEST L的常规蛋鸡的禽类组织中以卵感染剂量(EID50)表示的新城疫疫苗株的滴度。
[0015]图6A和6B:显示在用活新城疫疫苗(NDV)接种SPF鸡(图6A)和常规蛋鸡(图6B)后的免疫活性和特异性细胞介导的免疫。通过经眼途径，在一日龄时用单独的GfifiiCf
VITAPEST L(黑色柱)或与壳聚糖组合的CTVACf VITAPEST L(灰色柱)接种鸟类。未接
种的动物以白色柱标示。用PMA/1no丝裂原(0.1 μ g/ml) gp-NDV回忆抗原(I μ g/ml)刺激脾细胞，在72小时的活化后收获被刺激的细胞的上清液。通过ChIFN Y捕获ELISA测定ChIFN Y的产量。结果相应于在各时间点上的光密度(0.D.)的平均值土标准差(n=5)。具有不同上标的平均值土标准差差异显著(P〈0.05)。
[0016]图7A和7B:显示在用活ND疫苗接种SPF鸡(图7A)和常规蛋鸡(图7B)后眼泪(lachrymal)抗体介导的免疫。在一日龄时通过经眼途径用单独的(黑色柱)或与壳聚糖
组合的(灰色柱)GEVAG? VITAPEST L接种鸟类。未接种的动物以白色柱标示。数据表
示在接种后指定的时间上通过ELISA测定的吸光度值(0.D.)的平均值土标准差(n=5)。将泪液样品以1:4(对于IgA/G)和1:32(对于IgM)稀释。具有不同上标的时间点上的平均值土标准差差异显著(P〈0.05)。N.D.=由于在NDV特异性IgA和IgG测量后剩余有限量的样品而未测定的。
[0017]图8A和8B:显示在用活ND疫苗接种SPF鸡(图8A)和常规蛋鸡(图8B)后胆汁抗体介导的免疫。在一日龄时，通过经眼途径，用单独的(黑色柱)或与壳聚糖组合的(灰
色柱)CEVAC? VITAPEST L接种鸟类。未接种的动物以白色柱标示。数据表示在接种后
指定的时间上通过ELISA测定的吸光度值(0.D.)的平均值土标准差(n=5)。将胆汁样品以1:50稀释。具有不同上标的时间点上的平均值土标准差差异显著(P〈0.05)。
[0018]图9A和9B:显示在用活ND疫苗接种SPF鸡(图9A)和常规蛋鸡(图9B)后十二指肠抗体介导的免疫。在一日龄时，用单独的(黑色柱)或与壳聚糖组合的(灰色柱)CEVAC? VITAPEST L接种鸟类。未接种的动物以白色柱标示。数据表示在接种后指
定的时间上通过ELISA测定的吸光度值(0.D.)的平均值土标准差(n=5)。在离体的十二指肠组织培养物的未稀释的上清液中测量Ig应答。具有不同上标的时间点上的平均值土标准差差异显著(P〈0.05)。
[0019]发明详述
[0020]本发明提供了用于给禽类物种经眼施用的疫苗组合物，该组合物包含一种或多种疫苗和有效佐剂量的壳聚糖。如上所述，已令人惊讶地发现，在经眼共施用后，壳聚糖和疫苗极大地增强了禽类物种的细胞介导的免疫应答并且导致疫苗在已接种的禽类的特定组织中的更长的存留。本发明的疫苗组合物从而对于提高禽类物种抗禽类疾病的长期保护作用特别有效。
[0021 ] 本领域技术人员完全理解术语“有效佐剂量”，其包括能够刺激抗经眼施用的抗原的免疫应答的壳聚糖的量，即，增加经眼施用的疫苗组合物的免疫应答(例如，如根据由脾细胞产生的Y-干扰素的水平和禽类组织中疫苗的存留测量的)的量。在壳聚糖存在的情况下观察到产生的Y-干扰素水平和疫苗组织存留时间的显著增加。例如，细胞应答的增加还可通过细胞增殖试验(通过在抗原回忆刺激后3H胸苷至分裂细胞内的掺入测量的)，通过测量CTL细胞对放射标记的靶细胞的细胞毒性活性(在一段时间内放射性同位素的释放的测定)或通过巨噬细胞迁移试验来证明。
[0022] 根据本发明，疫苗可以是任何禽类病原性或非病原性微生物，例如病毒、细菌、任何其他寄生虫、或抗原。此类疫苗可以是活的减毒微生物或被杀死的灭活微生物(完整的微生物或微生物的亚单位)、灭活的嵌合或重组微生物,被破坏的微生物、突变的微生物、有缺陷的微生物或其组合。疫苗还可以是包括微生物结构例如病毒、细菌或寄生虫的表位或抗原性部分的抗原，例如来自病原体的抗原性蛋白、重组蛋白，优选病毒抗原例如病毒衣壳蛋白、细胞壁蛋白、肽或者细菌或寄生虫结构的部分例如多糖、脂多糖和糖蛋白的制剂。疫苗还可以是DNA或重组DNA，所述DNA在DNA的引入后在细胞内产生来自病原体的抗原。可以以纯化或未纯化的形式提供抗原。
[0023]当疫苗是活的减毒(复制性)微生物例如病毒、细菌或其他禽类病原体时，减毒的病原体保持非致病性质，并且能够复制。减毒可来自天然或人工减毒方法。人工减毒通常使用各种技术包括在活的动物或多种天然培养基(包括器官、细胞、含胚的卵等)中传代来获得。人工减毒还可通过感染的器官的干燥、培养物的陈化、对低温或特定培养条件的适应、遗传缺失等来获得。
[0024]疫苗还可以是被杀死的灭活的微生物。通常通过化学或物理方法获得用于接种的灭活病毒的制剂。可通过用例如酶、甲醛、丙内酯、乙撑亚胺或其衍生物处理病毒来实现化学灭活。然后可中和或稳定所获得的灭活病毒。可通过将病毒经历高能辐射例如UV光、X射线或Y射线来进行物理灭活。
[0025]还可从商业来源购买此类减毒或灭活的微生物例如病毒、细菌或其他禽类寄生虫。
[0026]疫苗可以是同源(例如保护鸡的鸡病毒)或异源(例如保护鸡的火鸡病毒)类型。可选择地，疫苗制剂可包含活性抗原(live antigen)与特异性抗体的组合(称为免疫复合疫苗)。
[0027]根据本发明，疫苗或抗原可来源于导致由G.D.Butcher、J.P.Jacob和F.B.Mather (PS47,Veterinary Medicine-Large Animal Clinical SciencesDepartment, Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food andAgricultural Sciences, University of Florida;Mayl999)描述的常见禽类疾病(例如禽痘(Avian Pox)、新城疫、感染性支气管炎、鹌鹑支气管炎、淋巴系白细胞增生、马立克氏病(Marek’s Disease)、感染性法氏囊病、感染性喉气管炎、产蛋下降综合征、Reovirosis、感染性腱鞘炎、禽类脑脊髓炎、肿头综合征、火鸡鼻气管炎或禽流感)的病毒、来源于导致支原体病(mycoplasmosis)、巴斯德菌病、沙门氏菌病、博代菌病等的细菌和/或来源于导致球虫病、弯曲菌病的其他禽类寄生虫。用于本发明的疫苗组合物的优选疫苗包括完整的减毒活病毒株。
[0028]优选，疫苗来源于新城疫病毒(NDV)或来源于导致马立克氏病的病毒，即马立克氏病病毒(MDV)或火鸡疱疹病毒(HVT)。同样地，还可使用重组HVT (rHVT)和重组MDV (rMDV)。可通过将至少一个异源核酸序列(即，相应于与天然存在于HVT或MDV中的基因的核酸序列不同一的基因或其部分的DNA)整合入病毒基因组对此类重组病毒进行遗传修饰。可选择地，可通过将同源核酸序列(即，相应于与天然存在于HVT或MDV中的基因同一的基因或其部分的DNA)整合入病毒基因组来对rHVT或rMDV进行遗传修饰。
[0029]壳聚糖是几丁质的衍生物并且相应于由随机分布的β -(1-4)-连接的D-葡糖胺(脱乙酰化单位)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单位)组成的线性多糖。在商业上通过几丁质(其为甲壳类动物的外骨骼中的结构元件)的脱乙酰化作用产生壳聚糖。脱乙酰化的程度可用NMR光谱分析来测定。例如，商业壳聚糖的脱乙酰化程度在60-100%的范围内。
[0030]用于本发明的疫苗组合物的壳聚糖可通过脱乙酰化至大于40%的程度，优选50%至90%，更优选70%至95%的脱乙酰化来从几丁质产生。此类脱乙酰化壳聚糖可在商业名称〃Sea Cure+〃 壳聚糖谷氨酸盐下从 Protan Biopolymer A/S, Drammen, Norway 商购获得。壳聚糖的分子量可以在IOkD至500kD之间，优选在50kD至300kD之间和更优选在IOOkD至300kD之间。[0031 ] 根据本发明，壳聚糖可以以单羧甲基壳聚糖(Mono Carboxy MethylatedChitosan, MMC)(也称为羧甲基壳聚糖(CMC))的形式或以壳聚糖盐酸盐(HCl壳聚糖)的形式用作有效佐剂。HCl壳聚糖在本领域内是公知的并且例如由Kraeber Gmbh&C0.销售。
[0032]例如，用于疫苗组合物的HCl壳聚糖的浓度可在0.1%至5%的范围内，优选约0.5%或约1%。
[0033]根据本发明的疫苗组合物可用于抗感染性禽类疾病的禽类物种的有效免疫。事实上，如上所述，已发现在经眼施用后，此类疫苗组合物极大地增强禽类的细胞介导的免疫应答以及疫苗在许多禽类组织中的存留。实际上，在接种后一周，在禽类组织包括结膜、肺、脾、气管、消化道例如十二指肠、胰腺和盲肠集合淋巴样组织(caecal tonsil)中观察到疫苗在禽类组织中的存留。此外，在接种后，特别是在结膜、肺、十二指肠、胰腺和盲肠集合淋巴样组织中，这样的存留维持5周。
[0034]可用本发明的疫苗组合物经眼施用的禽类物种包括例如鸡、火鸡、鹅、鸭、雉鸡、鹌鹁或鴻子以及更常见地饲养的或驯养的家禽(poultry)或鸟禽(fowl)。
[0035]根据本发明的另外的方面，提供了本文中定义的疫苗组合物在接种禽类以抗禽类感染的方法中的用途，所述方法包括给禽类受试者经眼施用包含疫苗和有效佐剂量的壳聚糖的疫苗组合物。
[0036]根据本发明，可通过滴眼剂、喷雾剂或气雾剂分开地或同时施用有效量的壳聚糖和疫苗。可选择地，可相继地给禽类物种施用壳聚糖和疫苗，可在疫苗之前或疫苗之后施用壳聚糖。
[0037]本发明还涉及有效量的壳聚糖和疫苗用于制备疫苗组合物的用途，所述疫苗组合物用于增加抗禽类病原体的禽类免疫应答，其中通过滴眼剂、喷雾剂或气雾剂施用壳聚糖和疫苗，以及其中禽类的细胞介导的应答和禽类组织中病原体的存留增加。如上所述，疫苗可以是禽类寄生虫、病毒或细菌。更明确地，疫苗可以是活的减毒微生物、被杀死的灭活微生物，或完整的减毒或灭活微生物、其亚单位或其组合。同样地，根据本发明，还可分开或同时给禽类物种施用壳聚糖和疫苗。当相继地施用壳聚糖和病原体时，则可在疫苗之前或在疫苗之后施用壳聚糖。
[0038]此外，根据本发明的另外方面，提供了通过给禽类物种经眼施用在上文中定义的包含疫苗和有效佐剂量的壳聚糖的疫苗组合物将本文中定义的疫苗组合物用于增强保护性细胞介导的免疫应答和疫苗在禽类组织中的存留的方法的用途。
[0039]本发明还涉及免疫禽类物种的方法，其包括将如上所述的疫苗组合物施用至禽类物种的眼内的步骤。本发明还涉及通过将一种或多种疫苗与有效量的壳聚糖的组合施用至禽类物种的眼内来增加禽类物种中细胞介导的免疫和疫苗在禽类组织中的存留的方法。可分开、相继或同时施用疫苗和壳聚糖。
[0040]此外，根据本发明的方法，可通过喷雾、气雾剂或滴眼剂进行经眼施用。优选，在母源抗体逐渐减少后进行这样的经眼施用。
[0041]最优选，进一步进行接种的加强以刺激禽类的免疫应答，所述禽类已经历卵内接种或在数天龄时经历接种，从而诱导更高的免疫应答的刺激。可与第一次免疫相继或同时对I日龄或4周龄的禽类进行这样的接种加强。
[0042]可将根据本发明的眼用疫苗组合物配制为液体或干粉，以作为气雾剂、喷雾剂或滴眼剂施用。因此，可通过直接喷雾至鸟的头上来给禽类施用疫苗组合物。可选择地，如对于人一样，可将一滴或多滴疫苗组合物直接置于每一个体鸟的眼内。将根据本发明的优选组合物配制为液体形式的滴眼剂。
[0043]作为气雾剂、滴眼剂或喷雾剂施用的组合物可包含一种或多种类型的通常包含在此类组合物中的赋形剂，例如防腐剂、粘度调节剂、张力调节剂、泪液阻断剂、缓冲剂、稳定剂、载体、佐剂等，以制备经眼施用的制剂。为了确保壳聚糖在水性介质中保持可溶，以及确保抗原不受太酸的PH不利地影响，用于经眼施用的溶液优选具有范围在5.5至6.5内的pH。载体可以是本领域技术人员公知的许多水性缓冲剂的任一种，例如磷酸盐缓冲剂。可使用另外的佐剂。此类佐剂在本领域内是公知的并且可包括油乳剂、铝盐或凝胶例如氢氧化铝或磷酸铝、皂苷、维生素、来自细菌壁的提取物、基于聚丙烯酸的聚合物例如卡波普、非离子型嵌段聚合物、脂肪酸胺类例如阿夫立定(avridin)和DDA、基于葡聚糖(dextran)的聚合物例如硫酸葡聚糖和DEAE葡聚糖、生物可降解的微胶囊、脂质体、病毒免疫刺激物例如MDP、LPS和葡聚糖类(glucans)。
[0044]本发明还提供了包括用于分配包含疫苗和有效量的壳聚糖的眼用疫苗组合物的工具的产品或禽类接种试剂盒。更明确地，禽类接种试剂盒包括适合用于将疫苗组合物直接分配至禽类的眼中的分配装置。此类分配装置可以例如采取气雾剂、喷雾剂或滴眼剂递送系统的形式，并且可进行安排以只分配单个剂量或多个剂量至禽类的眼中。禽类接种试剂盒可包括各自包含有效量的壳聚糖和疫苗的分开的容器。根据本发明的禽类接种试剂盒还可包括具有关于药物组合物的施用和剂量的信息的技术说明书。
[0045]可以以有效地刺激细胞介导的免疫应答和增加疫苗例如疫苗病毒株在禽类物种中的存留的量施用疫苗。例如，可以一个或多个剂量给禽类施用疫苗，每一剂量包含例如IO5 至 108EID5。。
[0046]现有活疫苗由于通过母源抗体(MDA)的传递(通过卵黄转移，随后被再吸吸并且存在于小鸡血清中)而提供的抗病原体的一些保护作用在新孵化的禽类中的存在而通常受到限制。此类MDA可通过中和活疫苗而干扰接种。因此，对接种的免疫应答在常规鸡中可被延迟和/或限制，如之前在全身性水平上观察到的。
[0047]因而，优选在MDA已减弱后施用根据本发明的疫苗，从而允许在禽类可能暴露于NDV的毒株之前诱导良好的免疫应答。最优选，根据MDA的减弱，在2或3周龄时进行加强接种。
[0048]如在下面的实施例中更详细地显示的，对4组I天龄的SPF鸡(无明确病原体)或常规蛋鸡进行接种实验(图1)。使用滴眼剂通过经眼途径给所有组的鸡施用疫苗组合物。称为“阴性鸡”的组不接受任何疫苗。用一个剂量的GEVAG? uni L或用一个剂量的
CEVAC? VITAPEST L (两者都相应于活减毒新城疫病毒)接种第二和第三组。壳聚糖还被
用作佐剂。仅阴性和GEVAif VITAPEST L使用或不使用佐剂进行接种，以确认壳聚糖对细
胞介导的免疫和疫苗病毒在禽类组织中的存留的令人惊讶的作用。从第I至第5周每一周收集样品。评估和确认局部(BALT)免疫。
[0049]特别地，本 申请人:已证明，抗原回忆激活是特别有效的。事实上，接种后(p.v.)2至5周收集已接种的鸡的脾细胞并且将其与新城疫病毒蛋白接触以评估Y-干扰素(ChIFN Y )的产量水平。使用ELISA试剂盒通过光密度(0.D.)进行鸡Y-干扰素的测量。ChIFN Y的产量水平表示已接种的禽类中脾细胞的刺激水平，从而表示细胞介导的免疫的水平(图2)。
[0050]此外，已在下文实施例3中证明根据本发明的禽类经眼接种导致令人惊讶地高的对细胞介导的免疫的效 应。不受任何限制，已例如证明在经眼施用后壳聚糖对抗新城疫病毒的特异性细胞介导的免疫的阳性效应。已显示GEVACf VITAPEST L组和使用壳聚糖的
CEVAC? VITAPEST L组中ChIFNy的产量结果(图3)。已显示在SPF鸡接种后第二至第
五周，使用壳聚糖的VITAPEST LmMWtt CEVAC? vitapest l组更高的细胞介导的免疫水平。该差异在第2周在统计学上是显著的。
[0051]此外，已证明以壳聚糖为佐剂的疫苗的经眼施用诱导了疫苗病毒株在鸡组织中(在SPF鸡和常规蛋鸡中)的更长的存留(图4)。如下文实施例2中所显示的，已通过对在鸡的经眼接种后第I周和第5周收集的不同器官(即结膜、肺、气管、十二指肠、胰腺、盲肠集合淋巴样组织和脾)进行实时PCR实验，评估了在SPF鸡的经眼接种后新城疫病毒的存在。
[0052]已首先在SPF鸡的此类不同器官中评估了疫苗株病毒复制。在SPF鸡的接种后第一周，已在结膜、肺和脾中观察到相同水平的CMfAGe uni L疫苗病毒和GIMG?VITAPEST L疫苗病毒的病毒复制。CSYMfUNI L疫苗病毒基本上在气管中复制，与CEVAC? VITAPEST L具有统计学上显著的差异。CBVAC? vitapest l疫苗病毒基本上在消化道例如十二指肠、胰腺和盲肠集合淋巴样组织中复制，与GEYAC? UNI L具有统计学上显著的差异。在鸡的经眼接种后第5周，两种疫苗病毒株都在结膜中复制但在GEfACfUNI L组中只有一只鸡是阳性的。CEVAC? VITAPEST L疫苗病毒但非GBVMf UNI L同样地在其他器官中复制。
[0053]类似地，本 申请人:证明了疫苗病毒株在常规蛋鸡中的存留。特别地，已显示在鸡的
经眼接种后第一周，在GEVAG? uni L组中复制的水平更高。当壳聚糖用作佐剂时，在更多
器官中和在更长的时间内分离到病毒。在鸡的经眼接种后第5周，只在一些已接种的常规蛋鸡的结膜中分离到两种疫苗病毒株(图5)。
[0054]最后，本 申请人:已在下文的实施例4中证明，与通常在哺乳动物中观察到的相反，在家禽中由不同疫苗诱导的体液免疫未得到增强，从而当通过经眼途径给禽类施用时，显示了具有壳聚糖的疫苗组合物的特别出众的效应。
[0055]通过下列实施例举例说明(但不以任何方式限制)本发明。
实施例
[0056]实施例1:材料和方法
[0057]实施例1.1:鸡
[0058]分别从由Lohmann Valo (Cuxhaven, Germany)和 Wijverkenshatchery (Halle, Belgium)提供的卵孵化出SPF白色来亨鸡和常规蛋鸡(SSL: sex salelinked)。从28周龄的种鸡群(breeder flock)获得常规蛋鸡的卵，所述种鸡群接受下列ND接种方案:在4和8周龄时用NOBILIS Clone30 (Intervet)接种，然后在16周龄时用NOBILIS Newcavac (灭活的疫苗，Intervet)加强。在孵化后，将全部鸡保持在生物安全水平 3(BSL_3)隔离器中，在 Veterinary and Agrochemical Research Institute 的Biosafety and Bioethics Committees的授权和监督下按照国家和欧洲细则进行动物实验。
[0059]实施例1.2:疫苗、佐剂和攻击株
[0060]由CEVA-PHYLAXIA Veterinary Biologicals Co Ltd (Hungary)提供 CEVAC?
VITAPEST L减毒疫苗和壳聚糖(壳聚糖盐酸盐)佐剂。疫苗基于无症状PHY.LMV.42株(Meszaros J.Aerosol-vaccination against Newcastle disease.Deut TierarztlWochl991;98:117-164;Meszaros J, Szemeredi M, Tamasi G.1mmunization of day-oldchickens against Newcastle disease.Acta Vet Hungl992; 40:121-127)，其属于基因型 I (Czegledi A, Ujvari D, Somogyi E, Wehmann E, Werner 0,Lomniczi B.Third genomesize category of avian paramyxovirus serotypel(Newcastle disease virus)andevolutionary implications.Virus Res2006; 120:36-48)。在憐酸缓冲盐溶液(PBS 缓冲液)中重构疫苗批次以在50 μ I中获得I个剂量，其相应于~IO6EID5tl/剂量。壳聚糖盐酸盐是由两个单位的N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖胺组成的未分支二元杂多糖的氯化物。其通过通常导致70%至95%的脱乙酰化程度的几丁质的部分脱乙酰化获得。以0.5%(w/v)的终浓度将壳聚糖溶解在PBS缓冲液中，将其用于重构并且稀释疫苗至终浓度° 在 Mexico(Calderon NL, Galindo-Muniz F，Ortiz M, Lomniczi B, FehervariΤ, Paasch LH.Thrombocytopenia in Newcastle Disease:haematological evaluationand histological study of bone marrow.Acta Vet Hung2005; 53 (4): 507-513)分离用于攻击的Chimalhuacan NDV株，其属于II类基因型V。其是具有1.89的ICPI的速发型亲内脏株。IO5EID5tl的该株的眼鼻或直接经眼接种在于3至6周龄内被攻击的SPF鸡和商业母源免疫肉鸡中在3至6天内诱导100%的死亡率(个人观察)。
[0061 ] 实施例1.3:丝裂原和NDV抗原
[0062]丝裂原佛波醇12-豆蘧酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素(1no)购自Sigma(Belgium)0 如之前所述(Lambrecht B,Gonze M, Meulemans G, van den BergT.Assessment of the cell-mediated immune response in chickens by detection ofchicken interferon-gamma in response to mitogen and recall Newcastle diseaseviral antigen stimulation.Avian Path2004; 33:343-350)从 NDV La Sota株制备 NDV 回忆抗原，命名为NDV糖蛋白(gp-NDV)。
[0063]实施例1.4:疫苗株的组织分布和复制的测量
[0064]从下眼睑的结膜(其显示对NDV更易感)(Nakamura K，Ohta Y，Abe Y，ImaiK，Yamada M.Pathogenesis of conjunctivitis caused by Newcastle disease virusesin specific-pathogen-free chickens.Avian Path2004; 33 (3): 371-376)、气管、肺、脾、胰腺、十二指肠和盲肠集合淋巴样组织收集组织样品，并且将其保持冷冻直到处理。CEVAC? VITAPEST L疫苗株的组织分布和复制通过特异于CBVMf VITAPEST L
的 QRRT-PCR 测定，所述 QRRT-PCR 允许检测 IO2EID50/ 反应(104.18EID50/20mg 组织)。结果表示为每20mg组织的疫苗株滴度。如Van Borm S等人，A universal avianendogenous real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction controland its application to avian influenza diagnosis and quantification.AvianDis2007; 51:213-220所描述的，使用禽类α -肌动蛋白作为持家基因确认RNA提取方法和样品的质量。
[0065]实施例1.5:免疫活性和NDV特异性细胞介导的免疫的测量
[0066]分别通过脾淋巴细胞的有丝分裂和NDV抗原活化调查免疫活性和NDV特异性细胞介导的免疫。简而言之，无菌地从鸡中取出脾，分离脾细胞，用丝裂原(0.1 μ g/ml PM/1no)活化脾细胞作为脾细胞的离体可活化度的阳性对照，或用NDV回忆抗原(gp-NDV)(I μ g/ml)活化脾细胞。细胞应答表示为光密度(0.D.)值并且等于或大于0.1的0.D被认为是显著活化的证据。
[0067]实施例1.6:NDV特异性体液和局部抗体介导的免疫的测量
[0068]通过血细胞凝集抑制(HI)试验和通过NDV特异性IgG、IgA和IgMELISA估计NDV特异性体液免疫。通过ELISA测量泪液、肺、胆汁和十二指肠中局部抗体介导的对NDV的免疫。
[0069]实施例1.7:攻击性NDV株的口咽和泄殖腔排泄的测量
[0070]将口咽和泄殖腔棉签浸没在补充有抗生素(10000IU/ml青霉素、2mg/ml链霉素、lmg/ml庆大霉素和650 μ g/ml卡那霉素)的Iml脑心灌注取样缓冲液(37g溶解于I升蒸懼水)(Becton Dickinson Benelux, Belgium)中。将棉签于-80°C下保存直到进一步分析。为了利用定量实时逆转录-聚合酶链式反应(QRRT-PCR)进行分析，按照制造商的方案使用 MagMAX96AI/ND viral RNA Ambion 试剂盒(Applied Biosystems, Lennik, Belgium)在KingFisher磁性颗粒处理器(Thermo Scientific)上从50 μ I浸没的棉签提取RNA。将纯化的RNA洗脱在50 μ I洗脱缓冲液中。[0071]通过具有小改动的如上所述的定量实时逆转录-聚合酶链式反应(QRRT-PCR)测定Chimalhuacan NDV攻击株的基质基因拷贝的数量。简而言之，在初始逆转录步骤和热启动Taq-激活步骤后，在Applied Biosystems7500实时PCR循环仪上进行50个循环(在95°C下进行15秒，在54°C下进行34秒，在72°C下进行10秒)。弓丨物(M+4100和M-4220)和MGB-Taqman 探针(M+4169FAM-TAMRA)作用于基质基因并且由 Eurogentec (LiSge, Belgium)合成。通过与由Chimalhuacan NDV株的总病毒RNA组成的标准曲线相对照测定每一个样品的病毒滴度。在每一轮实验中包括该标准曲线。基于标准曲线的结果，特异于ChimalhuacanNDV株的NDV QRRT-PCR的灵敏度阈值(R2=0.998，效率=94.17%)被测定为IO1EID5tl/反应。其意指QRRT-PCR反应完全可以比得上高于IO2 7EID5ciAil拭样并且定量比较是可行的。结果表示为每ml拭样的攻击株的滴度。
[0072]此外，如Van Borm S 等人，A universal avian endogenous real-time reversetranscriptase-polymerase chain reaction control and its application to avianinfluenza diagnosis and quantification.Avian Dis2007; 51:213-220 中所述，使用禽类α -肌动蛋白验证了样品和RNA提取方法的质量。
[0073]实施例1.8:实验设计
[0074]对SPF鸡进行两个相似的实验(实验I和II)。在I日龄时，将105只SPF鸡在BSL-3隔离器中分成3组，每组35只。在同一天，分别使用单个剂量的用或未用0.5%壳聚糖作为佐剂的GEVAG? VITAPEST L疫苗通过眼鼻途径接种两个组。通过直接的经眼施用
进行相似的实验(数据未显示)。第三组保持未接种并且用作阴性对照组。接种后(P.V.)2天，人道地杀死鸡以获得血液、胆汁和十二指肠。从p.V.1至5周，以一周的间隔收集泪液，并且从相同的动物采集血液、脾、胆汁和十二指肠样品。在第I和第5周，在一个实验中另外地获取结膜、气管、肺、胰腺和盲肠集合淋巴样组织。在第3和第5周，在通过宁必妥(CEVASante Animale)注射无痛致死后从每一组的另外的鸡收集肺清洗物。在每一个时间点上使用5只鸡/组。在实验II中，在p.V.第2、3、4和5周获取泪液、血液、脾、胆汁和十二指肠的样品。
[0075]还在常规蛋鸡中进行2个另外的实验(实验III和IV)。在I日龄时，将90只常规蛋鸡在BSL-3隔离器中分配至3个组，每一组30只鸡。在同一天，如之前所述接种两个组；第三组保持未接种并且用作阴性对照组。除了只在P.V.第5周收集肺清洗物外，实验III的实验设置与实验I相似。在实验IV中，在p.V.第2、3、4和5周获取泪液、血液、脾、胆汁和十二指肠的样品。在5周龄时,通过眼鼻途径用105EID5(l/200 μ I的ChimalhuacanNDV株攻击每一组的10只鸡。逐个地鉴定鸡。在攻击后，每日就临床症状(头的水肿、萎靡不振、虚脱和神经体征)和死亡率监控鸡。在攻击后(p.ch.)第2、4、7和10天获取口咽和泄殖腔拭样。在P.ch.第11天，无痛致死存活的鸡并且收集血液样品。从5只鸡/组获取脾和十二指肠。
[0076]实施例1.9:统计分析
[0077]如之前所述使用Minitabl3和STATA10软件(用于Windows2000的统计程序)进行统计分析，并且当p〈0.05时差异被认为是显著的。
[0078]实施例2:疫苗株的组织分布和复制
[0079]全部器官样品对于α-肌动蛋白内源扩增对照显示阳性扩增信号(Ct〈40)，从而确认了它们的优良品质和RNA纯度。
[0080]在P.V.第I周在已接种的SPF鸡的全部器官样品中检测到VITAPEST L
病毒(表1)。在P.V.第5周,只在一些鸡的结膜、肺、脾、十二指肠、胰腺和盲肠集合淋巴样组织中检测到疫苗株。当使用壳聚糖时，更频繁地检测到疫苗株；然而，在病毒滴度之间无统计学上的差异。在接种I日龄的常规蛋鸡后I周，GEVAG? VITAPEST L疫苗株存在于结
膜、气管和十二指肠的几个样品中(表1)。当疫苗使用壳聚糖作为佐剂时，还在一些肺、脾和盲肠集合淋巴样组织样品中检测到疫苗株。尽管如此，在已接种的常规蛋鸡中，检测频率和滴度比在接种的SPF鸡中发现的更低。在P.V.第5周，在结膜中仍然可检测到疫苗病毒的复制。
[0081]轰1:在用具有或不具有壳聚糖佐剂的CXfiG? VITAPEST L疫苗接种I日龄SPF
鸡和常规蛋鸡后的疫 苗病毒的检测(分别地，实验I和III)。 [0082]
【权利要求】
1.包含活的减毒新城疫病毒和壳聚糖的组合物用于制备疫苗组合物的用途，所述疫苗组合物用于通过滴眼剂、喷雾剂或气雾剂经眼施用给禽类，从而免疫或接种所述禽类。
2.权利要求1的用途，其中分开或同时施用所述壳聚糖和所述活的减毒新城疫病毒。
3.权利要求1或2的用途，其中通过滴眼剂、喷雾剂或气雾剂相继地给禽类物种施用所述壳聚糖和所述活的减毒新城疫病毒，所述壳聚糖在所述活的减毒新城疫病毒之前或之后施用。
4.权利要求1的用途，其中所述疫苗组合物用于免疫或接种选自下列的禽类物种:饲养的或驯养的家禽或鸟禽，包括鸡、火鸡、鹅、鸭、雉鸡、鹌鹑或鸽子。
5.权利要求1的用途，其中所述疫苗组合物用于增加禽类物种中细胞介导的免疫和所述病毒在禽类组织中的存留。
6.壳聚糖和活的减毒新城疫病毒用于制备疫苗组合物的用途，所述疫苗组合物通过经由滴眼剂、喷雾剂或气雾剂的经眼施用，而免疫或接种禽类。
7.权利要求6的用途，其中分开地或同时地给禽类施用壳聚糖和所述活的减毒新城疫病毒。
【文档编号】A61K39/17GK103893758SQ201410156297
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2009年9月4日 优先权日:2008年9月5日
【发明者】Y·伽丁, V·帕莱, S·科姆特 申请人:诗华动物保健股份有限公司