一种从柚子皮中提取柚子多酚的方法
【专利摘要】本发明涉及一种柚子皮提取物的制备方法，具体地，涉及一种从柚子皮中提取柚子多酚的方法，它是一种以柚子皮为原料，经过提取溶媒提取、浓缩、分离纯化提取柚子多酚的方法，提取的方法采用水或乙醇加热提取，也可以用超声提取、或者微波提取；分离纯化采取柱层析分离纯化。提取物中柚子多酚重量含量为65％以上；所述提取物中柚子多酚中抗氧化性能指标TEAC和ORAC显示柚子多酚具有极强的抗氧化活性，能有效去除氧化物质。本发明方法生产的柚子多酚含量高，避免了活性成分的损失，提高了生产工艺，缩短了生产周期。
【专利说明】一种从柚子皮中提取柚子多酗的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种柚子皮提取物的制备方法，具体地，涉及一种从柚子皮中提取柚子多酚的方法。
【背景技术】
[0002]柚子是芸香科柑橘植物柚树的果实，在我国有悠久的栽培历史，远在公元前的周秦时代就有种植。其果皮中含有丰富的多酚(类黄酮)、果胶和膳食纤维等活性成分，不仅是食品行业重要的原料，还是植物化学研究的理想对象。柚子多酚具有良好的抗氧化能力，能有效防止心血管疾病。此外，还能保护模板质粒DNA免受紫外线的损伤，抑制肿瘤细胞的增殖和癌细胞的扩散。
[0003]作为我国南方重要的经济作物，柚子每年的产量高达十万吨。除可食用的果肉部分，仍有占鲜重20%~30%的果皮无法利用。这些农业废弃物的降解，一方面对生态系统的稳定产生巨大的压力，另一方面则浪费了其中大量的资源(如类黄酮、果胶、膳食纤维
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[0004]经过专利检索，目前还没有发现以柚子皮为原料提取柚子多酚的相关研究报导。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种从柚子皮中提取柚子多酚的方法，它是一种以柚子皮为原料，提取物中柚子多酚重量含量为65%以上，经过提取溶媒提取、浓缩、分离纯化提取柚子多酚的方法。本发明方法生产的柚子多酚含量高，避免了活性成分的损失，提高了生产工艺，缩短了生产周期。
[0006]为了解决上述问题，本发明采取如下技术方案:
[0007]—种从柚子皮中提取柚子多酚的方法，它是一种以柚子皮为原料，经过提取溶媒提取、浓缩、分离纯化提取柚子多酚的方法，提取物中柚子多酚重量含量为65%以上。
[0008]本发明的方法可以在提取前先将柚子皮破碎，柚子皮经破碎后有利于各种成分的充分溶出。
[0009]本发明方法所述溶媒为水或质量浓度为60%~70%的乙醇。
[0010]本发明方法所述提取方法为加热提取或超声提取或微波提取。
[0011]本发明方法所述加热提取次数为I~3次，溶媒用量为原料重量的3~12倍量，温度为90~100°C，提取时间为溶媒沸腾后I~3小时；所述柚子皮提取后需要进行回收醇处理，温度控制在25~60°C，真空度控制在0.06~1.0Mpa,回收醇的药液与原料重量比控制在1:2~1:5之间。
[0012]本发明方法所述超声波提取条件为工作频率15~80kHz，时间为5~120min。
[0013]本发明方法所述微波提取条件为工作频率900~2500MHz，时间为5~120min。
[0014]本发明方法所述分 离纯化为柱层析分离纯化，包括如下步骤:
[0015](I)提取液经浓缩、回收醇、离心后，直接进入大孔树脂柱，流速为0.5~1.5BV/hr ;所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度控制在25~60°C，真空度为0.08~1.0Mpa，浓缩至原来提取液体积的1/4~1/2 ;离心采用卧式离心机，转速为4800r/min ；
[0016](2)用质量浓度为70%的乙醇洗柱至流出液清澈，时间为2h ；
[0017](3)收集从大孔树脂柱中的流出的澄清、透明、略带醇味的洗脱液，收集洗脱液是树脂量的I~3倍；
[0018](4)醇水洗脱液浓缩、干燥，所述浓缩为真空浓缩，温度控制在25~60°C，真空度为0.06~1.0Mpa，浓缩至10~15波美度；干燥为喷雾干燥；进风口温度为160~200°C，出风口温度80~110°C。
[0019]其中，所述大孔树脂为以聚苯乙烯为骨架的材料，型号为D101、D130、AB-8、HP_20
中的一种。
[0020]本发明方法制备的提取物中柚子多酚中抗氧化性能指标TEAC和ORAC显示柚子多酚具有极强的抗氧化活性，能有效去除氧化物质。
[0021]柚子多酌中抗氧化性能指标TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)和 ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)抗氧化活性试验如下:
[0022]血清中ORAC的抗氧化性能试验
[0023]试剂准备:
[0024]l、225mM 磷酸盐冲液(ρΗ7.0):将 39mL0.45M NaH2PO4 和 61mL0.45MNaH2P04 混合，调节pH至7.0，用去离子水稀释至200mL (室温保存)；
[0025]2、60nM R-藻红蛋白(PE):用IOmL去离子水溶解19.8 μ L R-藻红蛋白(使用前摇匀)；
[0026]3、18mM AAPH:用IOmL去离子水溶解488.1mg AAPH (使用前摇匀)。
[0027]方法:
[0028]血清前处理
[0029]1、将20 μ L血清于1.5-mL的试管中混匀；
[0030]2、加入300 μ L η- 丁醇，等待十秒钟；
[0031]3、将试管于12，OOOrpm离心十分钟；
[0032]4、移取50L的上浮液到另一 1.5mL的试管中；
[0033]5、用纯氮吹干；
[0034]6、加入2mL225mM磷酸盐缓冲液(ρΗ7.0)。
[0035]ORAC 试验
[0036]1、将2mL预处理过的血清和2mL的PE于棕色试管中混匀；
[0037]2、37 °C预孵卵5分钟；
[0038]3、通过在37°C下加入2mLAAPH试剂开始荧光分析(激发光540nm)，在每3至5分钟将部分反应溶液转移至一小试管后测试荧光强度(如果荧光强度降低至原始值的20%以下，停止测试)
[0039]注意:
[0040]1、ORAC试验过程中要避光，关闭实验室荧光灯；
[0041]2、R-藻红蛋白处理后要及时使用；
[0042]3、AAPH溶解后，十分钟内必须使用，因为溶液不稳定；[0043]4、ORAC实验后用INHCl洗棕色试管，去除荧光蛋白。
[0044]血清中TEAC的抗氧化性能试验
[0045]l、1.25mM trolox 溶液(标准)
[0046]在10ml5mM PBS (pH7.4)里溶解 3.13mg trolox, _20°C保存
[0047]2、450mM过氧化氢(培养基)
[0048]将0.5ml30 %过氧化氢(H2O2)和9.3ml5mM PBS混匀，4°C保存(使用时用5mM PBS稀释成450 μ M H2O2溶液)
[0049]3、5mM ABTS (磷酸氢二铵)溶液(色原体)
[0050]将27.43mg ABTS溶解在10ml5mM ABTS中，4°C棕色试管避光保存(使用时用5mMPBS稀释成500 μ M ABTS溶液)
[0051]4、7O μ M Met Mb 溶液(色原体)
[0052](I)纯化 Met Mb 溶液
[0053]将68mg 肌球素(Mb)溶解于 10ml5mM PBS (400 μ M Mb)
[0054]将2.44mg of K3 [Fe (CN) 6]溶解于 10ml5mM PBS (740 μ M K3 [Fe (CN) 6])
[0055]取10ml400 μ M Mb和10ml 740 μ M K3 [Fe (CN) 6]混合后，室温下放置，活化15分钟
[0056]将Met Mb 溶液通过用 5mM PBS 平衡过的 Sephadex G15-120 柱(2.5 Φ X 40cm)
[0057]用下面的公式计算洗提收率:
[0058](2)甲酸纯度和浓度
[0059]用下列的微平衡计算各部分的纯度:
[0060][Met Mb] = 146A490-108A560+2.1A580
[0061][Ferry Mb] = -62A490+242A560-123A580
[0062][Mb02] = 2.8A490-127A560+153A580
[0063](减去700nm处的值来修正背景吸收)
[0064]当总蛋白血红素> 95%收集Met Mb部分，用上面的公式计算洗出液中的浓度。
[0065](3)制备 7O μ M Met Mb 溶液
[0066]用5mM PBS稀释纯化后的Met Mb溶液，4°C保存
[0067]实验方法:
[0068]1、36 μ 170 μ M Met Mb 到 1.5_ml 的样品试管中；
[0069]2、向试管中加入 300 μ 1500 μ M ABTS 和 487 μ 15mM PBS
[0070]3、加入 10 μ I 血清或 1.25mM torlox 溶液
[0071]4、慢慢混匀后，将试管于0°C储存5分钟
[0072]5、然后加入167 μ 1450 μ M H2O2，混匀，放置十分钟
[0073]6、室温下(20-25°C )精确控制时间，反应5分钟
[0074]7、用紫外分光光度计于734nm测试样品
[0075]Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC)
[0076]1、参考每单位1.25mM torlox溶液来计算血清样品的吸光率
[0077]2、参考1.0OmM torlox来计算血清样品中TEAC (mM)的值
【具体实施方式】[0078]以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
[0079]实施例1
[0080]一种从柚子皮中提取柚子多酚的方法，步骤如下:
[0081](I)选取没有发霉、未烂的新鲜柚子皮，破碎；
[0082](2)将原料与去离子水按1:3例混合装入提取罐，加热至90°C后回流3小时，收取提取液；
[0083](3)将收集的提取液导入浓缩器中进行减压浓缩，温度为25°C，真空度为1.0Mpa,浓缩至原来提取液体积的1/4 ；
[0084](4)将浓缩后的提取液通过卧式离心机离心，转速为4800r/min ；
[0085](5)离心后的提取液直接进入型号为DlOl大孔树脂柱，流速为1.5BV/hr，用质量浓度为70%的乙醇洗柱至流出液清澈，时间为2h，收集从大孔树脂柱中的流出的澄清、透明、略带醇味的洗脱 液，收集洗脱液是树脂量的I倍；
[0086](6)将洗脱液浓缩，温度控制在25°C，真空度为1.0Mpa，浓缩至10波美度；
[0087](7)喷雾干燥:进风口温度为160°C，出风口温度80°C ；
[0088](8)灭菌包装。
[0089]实施例2
[0090]一种从柚子皮中提取柚子多酚的方法，步骤如下:
[0091](I)选取没有发霉、未烂的新鲜柚子皮，破碎；
[0092](2)将原料与质量浓度为65%的乙醇按1:7例混合装入提取罐，加热至95°C后回流提取2小时，收取第一次提取液，第二次再加入原料重量5倍质量浓度为65%的乙醇回流提取I小时，收集第二次提取液，合并提取液:
[0093](3)将提取罐的药液抽入浓缩罐中进行减价浓缩，回收乙醇，温度控制在45°C，真空度为0.08Mpa,回收至无醇味后，将药液压入储液罐；
[0094](4)加水，静置，冷却:回收的乙醇药液与原料质量比为1:5 ；
[0095](5)将收集的提取液导入浓缩器中进行减压浓缩，温度为45 °C，真空度为0.08Mpa，浓缩至原来提取液体积的1/3 ；
[0096](6)将浓缩后的提取液通过卧式离心机离心，转速为4800r/min ；
[0097](7)离心后的提取液直接进入型号为D130大孔树脂柱，流速为0.5BV/hr，用离子水洗柱至流出液清澈，时间为2h，收集从大孔树脂柱中的流出的澄清、透明、略带醇味的洗脱液，收集洗脱液是树脂量的2倍；
[0098](8)将洗脱液浓缩，温度控制在45°C，真空度为0.08Mpa，浓缩至13波美度；
[0099](9)喷雾干燥:进风口温度为170°C，出风口温度90°C ；
[0100](10)灭菌包装。
[0101]实施例3
[0102](I)选取没有发霉、未烂的新鲜柚子皮，破碎；
[0103](2)将原料与质量浓度为60%的乙醇按1:10例混合装入提取罐，加热至100°C后回流提取3小时，收取第一次提取液，第二次再加入原料重量8倍质量浓度为60%的乙醇回流提取2小时，收集第二次提取液，第三次再加入原料重量5倍质量浓度为60%的乙醇回流提取I小时，合并提取液:[0104](3)将提取罐的药液抽入浓缩罐中进行减价浓缩，回收乙醇，温度为60°C，真空度为0.06Mpa,回收至无醇味后，将药液压入储液罐；
[0105](4)加水，静置，冷却:回收的乙醇药液与原料质量比为1:2 ；
[0106](5)将收集的提取液导入浓缩器中进行减压浓缩，温度为60°C，真空度为0.06Mpa，浓缩至原来提取液体积的1/2 ；
[0107](6)将浓缩后的提取液通过卧式离心机离心，转速为4800r/min ；
[0108](7)离心后的提取液直接进入型号为AB-8大孔树脂柱，流速为1.5BV/hr，用离子水洗柱至流出液清澈，时间为2h，收集从大孔树脂柱中的流出的澄清、透明、略带醇味的洗脱液，收集洗脱液是树脂量的3倍；
[0109](8)将洗脱液浓缩，温度控 制在60°C，真空度为0.06Mpa，浓缩至15波美度；
[0110](9)喷雾干燥:进风口温度为180°C，出风口温度100°C ；
[0111](10)灭菌包装。
[0112]实施例4
[0113](I)选取没有发霉、未烂的新鲜柚子皮，破碎；
[0114](2)将原料与质量浓度为70%的乙醇按1:3例混合，进行超声波提取，提取条件为工作频率80kHz，时间为5min，提取3次，合并提取液；
[0115](3)将提取罐的药液抽入浓缩罐中进行减价浓缩，回收乙醇，温度控制，50°C，真空度为0.07Mpa,回收至无醇味后，将药液压入储液罐；
[0116](4)加水，静置，冷却:回收的乙醇药液与原料质量比为1:3 ；
[0117](5)将收集的提取液导入浓缩器中进行减压浓缩，温度为50°C，真空度为0.07Mpa，浓缩至原来提取液体积的1/4 ；
[0118](6)将浓缩后的提取液通过卧式离心机离心，转速为4800r/min ；
[0119](7)离心后的提取液直接进入型号为HP-20大孔树脂柱，流速为0.5BV/hr，用离子水洗柱至流出液清澈，时间为2h，收集从大孔树脂柱中的流出的澄清、透明、略带醇味的洗脱液，收集洗脱液是树脂量的3倍；
[0120](8)将洗脱液浓缩，温度控制在50°C，真空度为0.07Mpa，浓缩至10波美度；
[0121](9)喷雾干燥:进风口温度为200°C，出风口温度110°C ；
[0122](10)灭菌包装。
[0123]实施例5
[0124](I)选取没有发霉、未烂的新鲜柚子皮，破碎；
[0125](2)将原料与质量浓度为65 %的乙醇按1:9例混合，进行超声波提取，提取条件为工作频率15kHz，时间为120min，提取2次，合并提取液；
[0126](3)将提取罐的药液抽入浓缩罐中进行减价浓缩，回收乙醇，温度控制，40°C，真空度为0.08Mpa,回收至无醇味后，将药液压入储液罐；
[0127](4)加水，静置，冷却:回收的乙醇药液与原料质量比为1:5 ；
[0128](5)将收集的提取液导入浓缩器中进行减压浓缩，温度为40°C，真空度为
0.08Mpa，浓缩至原来提取液体积的1/2 ；
[0129](6)将浓缩后的提取液通过卧式离心机离心，转速为4800r/min ；
[0130](7)离心后的提取液直接进入型号为DlOl大孔树脂柱，流速为1.5BV/hr，用离子水洗柱至流出液清澈，时间为2h，收集从大孔树脂柱中的流出的澄清、透明、略带醇味的洗脱液，收集洗脱液是树脂量的2倍；
[0131](8)将洗脱液浓缩，温度控制在40°C，真空度为0.08Mpa，浓缩至13波美度；
[0132](9)喷雾干燥:进风口温度为190°C，出风口温度100°C ；
[0133](10)灭菌包装。
[0134]实施例6
[0135](I)选取没有发霉、未烂的新鲜柚子皮，破碎；
[0136](2)将原料与质量浓度为60%的乙醇按1:12例混合，进行微波提取，提取条件为工作频率900MHz，时间为120min，提取2次，合并提取液；
[0137](3)将提取罐的药液抽入浓缩罐中进行减价浓缩，回收乙醇，温度控制，60°C，真空度为0.06Mpa,回收至无醇味后，将药液压入储液罐；
[0138](4)加水，静置，冷却:回收的乙醇药液与原料质量比为1:5 ；
[0139](5)将收集的提取液导入浓缩器中进行减压浓缩，温度为45 °C，真空度为
0.06Mpa，浓缩至原来提取液体积的1/4 ； [0140](6)将浓缩后的提取液通过卧式离心机离心，转速为4800r/min ；
[0141](7)离心后的提取液直接进入型号为DlOl大孔树脂柱，流速为1.5BV/hr，用离子水洗柱至流出液清澈，时间为2h，收集从大孔树脂柱中的流出的澄清、透明、略带醇味的洗脱液，收集洗脱液是树脂量的I倍；
[0142](8)将洗脱液浓缩，温度控制在60°C，真空度为0.06Mpa，浓缩至10波美度；
[0143](9)喷雾干燥:进风口温度为180°C，出风口温度110°C ；
[0144](10)灭菌包装。
[0145]实施例7
[0146](I)选取没有发霉、未烂的新鲜柚子皮，破碎；
[0147](2)将原料与质量浓度为70%的乙醇按1:8例混合，进行微波提取，提取条件为工作频率2500MHz，时间为5min，提取3次，合并提取液；
[0148](3)将提取罐的药液抽入浓缩罐中进行减价浓缩，回收乙醇，温度控制，30°C，真空度为1.0Mpa,回收至无醇味后，将药液压入储液罐；
[0149](4)加水，静置，冷却:回收的乙醇药液与原料质量比为1:4 ；
[0150](5)将收集的提取液导入浓缩器中进行减压浓缩，温度为30°C，真空度为1.0Mpa,浓缩至原来提取液体积的1/3 ；
[0151](6)将浓缩后的提取液通过卧式离心机离心，转速为4800r/min ；
[0152](7)离心后的提取液直接进入型号为D130大孔树脂柱，流速为0.5BV/hr，用离子水洗柱至流出液清澈，时间为2h，收集从大孔树脂柱中的流出的澄清、透明、略带醇味的洗脱液，收集洗脱液是树脂量的2倍；
[0153](8)将洗脱液浓缩，温度控制在30°C，真空度为1.0Mpa，浓缩至15波美度；
[0154](9)喷雾干燥:进风口温度为190°C，出风口温度90°C ；
[0155](10)灭菌包装。
【权利要求】
1.一种从柚子皮中提取柚子多酚的方法，其特征在于:它是一种以柚子皮为原料，经过提取溶媒提取、浓缩、分离纯化提取柚子多酚的方法，提取物中柚子多酚重量含量为65%以上。
2.根据权利要求1所述从柚子皮中提取柚子多酚的方法，其特征在于:所述溶媒为水或质量浓度为60%~70%的乙醇。
3.根据权利要求1所述从柚子皮中提取柚子多酚的方法，其特征在于:所述提取方法为加热提取或超声提取或微波提取。
4.根据权利要求3所述从柚子皮中提取柚子多酚的方法，其特征在于:所述加热提取次数为1~3次，溶媒用量为原料重量的3~12倍量，温度为90~100°C，提取时间为溶媒沸腾后1~3小时；所述柚子皮提取后需要进行回收醇处理，温度控制在25~60°C，真空度控制在0.06~1.0Mpa，回收醇的药液与原料重量比控制在1:2~1:5之间。
5.根据权利要求3所述从柚子皮中提取柚子多酚的方法，其特征在于:所述超声波提取条件为工作频率15~80kHz，时间为5~120min。
6.根据权利要求3所述从柚子皮中提取柚子多酚的方法，其特征在于:所述微波提取条件为工作频率900~2500MHz，时间为5~120min。
7.根据权利要求1所述从柚子皮中提取柚子多酚的方法，其特征在于:所述分离纯化为柱层析分离纯化。
8.根据权利要求1或7 所述从柚子皮中提取柚子多酚的方法，其特征在于，所述柱层析分离纯化包括以下步骤: (1)提取液经浓缩、回收醇、离心后，直接进入大孔树脂柱，流速为0.5~1.5BV/hr ;所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度控制在25~60°C，真空度为0.08~1.0Mpa,浓缩至原来提取液体积的1/4~1/2 ;离心采用卧式离心机,转速为4800r/min ； (2)用质量浓度为70%的乙醇洗柱至流出液清澈，时间为2h； (3)收集从大孔树脂柱中的流出的澄清、透明、略带醇味的洗脱液，收集洗脱液是树脂量的I~3倍； (4)醇水洗脱液浓缩、干燥，所述浓缩为真空浓缩，温度控制在25~60°C，真空度为0.06~l.0Mpa，浓缩至10~15波美度；干燥为喷雾干燥:进风口温度为160~200°C，出风口温度80~110°C。
9.根据权利要求8所述从柚子皮中提取柚子多酚的方法，其特征在于，所述大孔树脂为以聚苯乙烯为骨架的材料，型号为D101、D130、AB-8、HP-20中的一种。
【文档编号】A61K36/752GK103961442SQ201410179149
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】周冠旻 申请人:桂林军供生化技术开发有限公司