治疗眼科疾病的方法

治疗眼科疾病的方法
【专利摘要】本发明涉及治疗眼科疾病的方法。本发明描述了使用针对类淀粉-β肽的抑制剂(包括单克隆抗体)用于治疗眼科疾病(例如年龄相关的黄斑退化)的方法。
【专利说明】治疗眼科疾病的方法
[0001]本发明是申请日为2008年3月6日、申请号为200880007669.6、题为“治疗眼科
疾病的方法”的中请的分案申请。
[0002]本申请要求2008年3月3提交的美国申请N0.12/041,581的权益，美国申请N0.12/041，581要求2007年3月9日提交的美国临时申请N0.60/894, 181的权益，美国申请N0.12/041, 581和美国临时申请N0.60/894, 181都通过引用整体并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明涉及使用针对类淀粉_β肽的抗体的方法，用于治疗和/或预防眼科疾病，例如年龄相关黄斑退化，以及用于其它眼病理学中，例如青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括糖尿病性黄斑水肿)、脉络膜新生血管膜(CNV)、葡萄膜炎、近视退化、眼肿瘤、视网膜中央静脉阻塞(central retinal vein occlus1n)、虹膜红变、眼新血管生成、中心衆液性视网膜病变(central serous retinopathy)、眼表面问题(ocular surface discus)(例如干眼)、视网膜中央动脉阻塞、囊样黄斑部水肿及任何其它视网膜退化性疾病。
[0004]发明背景
[0005]在美国，65岁以上个体中减小的最佳矫正视力的最常见起因为被称为年龄相关的黄斑退化(AMD)的视网膜病症。随着AMD进展，该疾病特征在于敏锐、中心视力的损失。受AMD影响的眼睛区域为黄斑-视网膜中心的小区域，其主要由感光细胞组成。占AMD患者的约85%-90%的所谓"干型"AMD (亦称为"地图状萎缩(geographic atrophy)")涉及由细胞总体萎缩造成的眼睛色素分布改变、感光体损失及视网膜功能减少。所谓"湿型"AMD涉及引起视网膜下空间中凝血或伤痕的异常脉络膜血管增生。因此，湿型AMD的发作是由于在神经视网膜下形成异常脉络膜新生血管网络(脉络膜新血管生成，CNV)而发生。新形成的血管是过度渗漏的。这引起视网膜下流体及血液积累，引起视敏度损失。最终，随着涉及脉络膜及视网膜的大的盘状伤痕的形成，在所涉及区域中，功能性视网膜完全损失。尽管干型AMD患者可保持品质减小的视力，但湿型AMD经常导致失明。(Hamdi及Kenney, Age-related Macular degenerat1n—a new viewpoint, Frontiers in B1science,e305-314，2003年5月)。CNV不仅在湿型AMD中还在其它眼病理学，例如青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括糖尿病性黄斑水肿)、布鲁赫膜(Bruch' s membrane)破裂、近视退化、眼肿瘤及其它相关视网膜退化性疾病中发生。
[0006]AMD是发病机制为明显多因性的常见病症，其中遗传及环境因素在其发作及进展中起作用。各种所进行的研究已确定了 AMD的若干风险因素，例如吸烟、衰老、家族史(Milton, Am J 0phthalmol88,269(1979) ；Mitchell 等人，Ophthalmology102,1450-1460(1995) ;Smith 等人，0phthalmologyl08，697-704(2001))、性别(女性中 7 倍较高可能性:Klein等人,0phthalmology99,933-943 (1992))及种族(白种人最易受影响)。其它风险因素可包括眼睛特征，例如远视(farsightedness、hyperopia)及浅色眼睛，以及心血管疾病及高血压。疾病发作进展中的遗传参与的证据亦已有文献记录(参见上文Hamdi 及 Kenney)。[0007]目前，不存在用于研究AMD的普遍接受的动物模型。Malek等人(PNAS102，11900-5(2005))的初始研究已产生了具有当组合时近似人类AMD的形态特征的三个风险因素的动物模型。值得注意的是该小鼠模型的发展已提供了测试针对AMD的治疗靶标和新颖分子机制的机会。仍存在对鉴定新颖靶标及能够治疗和/或预防以下眼科疾病的治疗剂的需要，所述眼科疾病例如年龄相关黄斑退化(湿型及干型)、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括糖尿病性黄斑水肿)、脉络膜新生血管膜(CNV)、葡萄膜炎、近视退化、眼肿瘤、视网膜中央静脉阻塞、虹膜红变、眼新血管生成、中心浆液性视网膜病变、眼表面问题(例如干眼)、视网膜中央动脉阻塞、囊样黄斑部水肿及其它视网膜退化性疾病。

【发明内容】

[0008]本发明公开了与眼科疾病的发病机制有关联的新颖治疗靶标。特别地，本发明公开了治疗眼科疾病的下述方法，其包含向个体施用有效量的抑制剂β_类淀粉(Αβ)肽。可将Αβ抑制剂施用至患有以下眼科疾病的个体:例如年龄相关黄斑退化(湿型及干型'AMD')、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括糖尿病性黄斑水肿)、脉络膜新生血管膜(CNV)、葡萄膜炎、近视退化、眼肿瘤、视网膜中央静脉阻塞、虹膜红变、眼新血管生成、中心浆液性视网膜病变、眼表面问题(例如干眼)、视网膜中央动脉阻塞、囊样黄斑部水肿及其它视网膜退化性疾病。在一种实施方式中，抑制剂为抗体、反义分子、SiRNA分子、核糖核酸酶或小分子化合物。
[0009]在一种实施方式中，本发明提供了治疗患有年龄相关的黄斑退化的个体的下述方法，其包含向个体施用包含治疗有效量的β_类淀粉(Αβ)肽的抑制剂的医药组合物。本发明的另一种实施方式涉及治疗患有年龄相关的黄斑退化(AMD)的个体的下述方法，其包含向个体施用包含治疗有效量的Αβ抑制剂的医药组合物。 [0010]本发明的另一种实施方式提供了治疗有效量的Αβ抑制剂的用途，所述用途用于制备供促进患有AMD的患者康复用的药物。在此实施方式的一方面中，抗体包含具有受损的效应器功能的Fe区。在此实施方式的另一方面中，疾病为AMD，包括湿型及干型AMD。
[0011]本发明还提供了治疗或预防与Αβ的类淀粉沉积相关的疾病的方法，其包含向个体施用有效剂量的医药组合物，该医药组合物包含与A β肽或Αβ肽的聚集形式特异性结合的抗体。在此实施方式的另一方面中，抗体包含与天然存在的Fe区具有变异的Fe区，其中该变异引起受损的效应器功能。在一些实施方式中，施用该抗体产生比施用无变异的抗体更少的脑微出血。
[0012]用于本发明的方法的抗体及多肽与Αβ肽或Αβ肽的聚集形式特异性结合。在一种实施方式中，抗体或多肽具有受损的效应器功能。在一些实施方式中，抗体或多肽不是F(ab' )2片段。在一些实施方式中，抗体或多肽不是Fab片段。在一些实施方式中，抗体或多肽不是单链抗体scFv。
[0013]与Αβ肽或Αβ肽的聚集形式特异性结合且包含具有受损的效应器功能的重链恒定区的多肽亦可用于本文所述的方法中的任一种。在一些实施方式中，多肽包含衍生自抗体9TL、6G或表3或表8中所示的其变异体的序列(例如一或多个CDR)。
[0014]在一些实施方式中，抗体或多肽包含具有受损的效应器功能的重链恒定区，其中重链恒定区包含Fe区。在一些实施方式中，Fe区中的N-糖基化被移除。在一些实施方式中，Fe区包含N-糖基化识别序列内的突变，由此使抗体或多肽的Fe区未经N-糖基化。在一些实施方式中，Fe区是经聚乙二醇化的。在一些实施方式中，抗体或多肽的重链恒定区为含有突变A330P331至S330S331 (参考野生型IgG2a序列的氨基酸编号)的人类重链IgG2a恒定区。在一些实施方式中，抗体或多肽包含IgG4的、包含突变E233F234L235至P233V234A235 的恒定区。
[0015]在一些实施方式中，抗体或多肽与A β肽的残基1-16内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与A β肽的N末端特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Αβ肽的残基16-28内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体与Aβ肽的C末端侧上的表位特异性结合，例如由氨基酸25或之后氨基酸开始的表位。抗体可与Αβ肽1-37、1-38、1-39、1-40、1-41、1-42、1-43中的任一种特异性结合。在一些实施方式中，抗体可与C末端截短A β肽的游离C末端氨基酸特异性结合，例如A β 1-37、1-38、1-39、1-40、1-41、1-42、1-43。在一种实施方式中，抗体或多肽与A ^_4(|肽上的表位特异性结合。在此实施方式的另一方面中，抗体或多肽与Ah_42肽上的表位特异性结合。在此实施方式的再一方面中，抗体或多肽与A β卜43肽上的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与A β H0肽的残基28-40内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与A &_42肽的残基28-42内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与A β U肽的残基28-43内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与A β肽特异性结合，而没有与全长类淀粉前驱蛋白质(APP)结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与A β的聚集形式特异性结合，而没有与可溶形式结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与A β的可溶形式特异性结合，而没有与聚集形式结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Αβ的聚集形式及可溶形式特异性结合。
[0016]在一些实施方式中，抗体或多肽与A β ^的C末端肽33-40特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与包括氨基酸35-40的、Αβ ^上的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与包括氨基酸36-40的、的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与包括氨基酸39和/或40的、Αβ L上的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与A β ho特异性结合，但并不与A β H2和/或A β H3特异性结合。在一些实施方式中，抗体包含本文所述的抗体9TL或衍生自9TL的抗体的可变区。在一些实施方式中，抗体或多肽竞争地抑制抗体9TL、6G和/或衍生自9TL或6G的抗体或多肽与各A β肽的结合。
[0017]在一些实施方式中，抗体或多肽以高于其与Αβ卜42及Αβ U结合的亲和性与Aii1,结合。在此实施方式的另一方面中，抗体不是抗体2294。在一些实施方式中，抗体与包括氨基酸25-34及40的、Αβ ^上的表位结合。在一些实施方式中，抗体包含本文所述的抗体6G或衍生自6G的抗体的可变区。在一些实施方式中，抗体或多肽竞争地抑制抗体6G和/或衍生自6G的抗体或多肽与A β的结合。
[0018]在一些实施方式中，抗体或多肽以约10nM或以下、或20ηΜ或以下，或2ηΜ或以下的结合亲和性(Kd)与Αβ肽结合。在此实施方式的一方面中，抗体或多肽以约10nM或以下、50ηΜ或以下，或2ηΜ或以下的Kd与A β ^40肽结合。在此实施方式的另一方面中，抗体或多肽亦以约10nM或以下，50ηΜ或以下，或2ηΜ或以下的Kd与Αβ卜42肽结合。
[0019]可以以本领域中已知的任何方法施用与Αβ肽特异性结合的抗体或多肽，包括:静脉内、皮下、经由吸入、动脉内、肌肉内、心内、心室内、非经肠、鞘内及腹膜内。施用可通过注射和/或可为全身性(例如静脉内)或局部施用。这通常也适用于本发明的多肽及多核苷酸。
[0020]本发明还提供了通过施用医药组合物来治疗眼科疾病的方法，所述医药组合物包含有效量的、与Αβ肽或Αβ肽的聚集形式特异性结合且具有受损的效应器功能的抗体或多肽中的任一种，或编码所述抗体或多肽的多核苷酸，及医药学上可接受的赋形剂。
[0021]本发明还提供了包含下述组合物中的任何一种或多种的试剂盒及组合物，所述组合物包含有效量的与Αβ肽或Αβ肽的聚集形式特异性结合的抗体或多肽中的任一种，或编码所述抗体或多肽的多核苷酸。一般在合适包装中且具备适当说明书的这些试剂盒可用于本文所述的方法中的任一种。
[0022]本发明还提供了一种制造治疗性人化抗体的方法，该治疗性人化抗体用于治疗与人类个体脑中的Αβ肽的类淀粉沉积相关的疾病，该方法包含:选择与Αβ肽特异性结合的第一人化抗体；及改变该抗体的Fe区，以提供相对于所述第一人化抗体具有受损的效应器功能的治疗性人化抗体。
[0023]本发明的另一种实施方式涉及保护或恢复个体视网膜功能的方法，其包含向所述个体施用包含治疗有效量的Aβ抑制剂的医药组合物。在一种实施方式中，抑制剂为抗体、反义分子、siRNA分子、核糖核酸酶或小分子化合物。
[0024]本发明的另一种实施方式涉及保持或复原个体视敏度的方法，其包含治疗有效量的Αβ抑制剂。 [0025]在上文实施方式的一方面中，上文方法用于并不正亦因阿兹海默氏症(Alzheimer, s disease)、唐氏综合征(Down, s syndrome)或脑类淀粉血管病变而受治疗的个体中。
[0026]本发明的上述方法包括作为抗体的Αβ抑制剂。在一方面中，本文中所公开的本发明涉及与A β ^肽(表4中所示的SEQ ID NO:15)的C末端结合的抗体。因此在一方面中，该方法包含用抗体9TL(可互换称为"9TL")进行的治疗，抗体9TL通过具有ATCC检录号PTA-6124及PTA-6125的表达载体来产生。图1中展示了 9TL的重链及轻链可变区的氨基酸序列。图1中还展示了抗体9TL(包括Chothia及Kabat CTR)的互补决定区(CTR)部分。应当理解:提到对9TL区域的任何部分或整体涵盖由具有ATCC检录号PTA-6124及PTA-6125的表达载体产生的序列，和/或图1中所示出的序列。
[0027]在另一方面中，本发明包含施用具有表3中示出的氨基酸序列的9TL的抗体变异体。
[0028]在另一方面中，本发明包含施用包含抗体9TL或表3中所示的其变异体的片段或区域的抗体。在一种实施方式中，片段为抗体9TL的轻链。在另一种实施方式中，片段为抗体9TL的重链。在又一种实施方式中，片段含有来自抗体9TL的轻链和/或重链的一或多个可变区。在又一种实施方式中，片段含有来自图1中所示的轻链和/或重链的一或多个可变区。在又一种实施方式中，片段含有来自抗体9TL的轻链和/或重链的一或多个CDR。
[0029]在另一方面中，本发明包含施用多肽(其可为或可不为抗体)，其包含以下各物中的任何一种或多种:a)抗体9TL或表3中所示的其变异体的一或多个CDR ；b)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的重链的CDR H3 ；c)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链的CDR L3 ；d)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链的三个CDR ;e)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的重链的三个CDR ；f)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链的三个CDR及来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的重链的三个CDR。本发明另外提供施用多肽(其可为或可不为抗体)，其包含以下各物中的任何一种或多种:a)衍生自抗体9TL或表3中所示的其变异体的一或多个(一、二、三、四、五或六个)CDR ;b)衍生自来自抗体9TL的重链的⑶R H3的⑶R ;和/或c)衍生自来自抗体9TL的轻链的⑶R L3的⑶R。在一些实施方式中，⑶R为图1中所示的⑶R。在一些实施方式中，衍生自抗体9TL或表3中所示的其变异体的一种或多种⑶R与9TL或其变异体的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个⑶R至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89 %、至少约90 %、至少约91%、至少约92 %、至少约93 %、至少约94 %、至少约95 %、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%—致。
[0030]在另一方面中，本发明包含施用抗体6G(可互换称为"6G")。图8中展示6G的重链及轻链可变区的氨基酸序列。图8中亦展示抗体6G (包括Chothia及Kabat CTR)的互补决定区(CDR)部分。
[0031]在另一方面中，本发明包含施用具有表8中示出的氨基酸序列的6G的抗体变异体。
[0032]在另一方面中，本发明包含施用包含抗体6G或表8中所示的其变异体的片段或区域的抗体。在一种实施方式中，片段为抗体6G的轻链。在另一种实施方式中，片段为抗体6G的重链。在又一种实施方式中，片段含有来自抗体6G的轻链和/或重链的一或多个可变区。在又一种实施方式中，片段含有来自图8中所示的轻链和/或重链的一或多个可变区。在又一种实施方式中，片段含有来自抗体6G的轻链和/或重链的一或多个CDR。 [0033]在另一方面中，本发明包含施用下述多肽(其可为或可不为抗体)，所述多肽包含以下各物中的任何一种或多种:a)抗体6G或表8中所示的其变异体的一或多个CDR ；b)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的重链的CDRH3 ；c)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链的CDR L3 ；d)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链的三个CDR ；e)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的重链的三个CDR ；f)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链的三个CDR及来自抗体6G或表8中所示的其变异体的重链的三个CDR。本发明另外包含施用多肽(其可为或可不为抗体)，其包含以下各物中的任何一种或多种:a)衍生自抗体6G或表8中所示的其变异体的一或多个(一、二、三、四、五或六个)CDR ;b)衍生自来自抗体6G的重链的⑶RH3的⑶R ;和/或c)衍生自来自抗体6G的轻链的⑶R L3的⑶R。在一些实施方式中，⑶R为图8中所示的⑶R。在一些实施方式中，衍生自抗体6G或表8中所示的其变异体的该或此类⑶R至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%、至少约90%、至少约91 %、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%与6G或其变异体的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个⑶R —致。
[0034]在另一方面中，本发明包含施用包含下述重链可变区及下述轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:26中所示的抗体6G重链可变区的三个⑶R，所述轻链可变区包含来自SEQ IDNO:27中所示的抗体6G轻链可变区的三个⑶R。在另一方面中，本发明包含施用包含下述重链可变区及下述轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ IDNO:28, SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30中所示的三个CDR，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32及SEQ IDNO:33中所示的三个CDR。在再一方面中，本发明包含含有SEQID NO:26中所示的氨基酸序列的重链可变区及含有SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列的轻链可变区。在再一方面中，本发明包含SEQ ID NO:36中所示的重链氨基酸序列及SEQ IDNO:37中所示的轻链氨基酸序列。
[0035]在一些实施方式中，⑶R为Kabat⑶R。在其它一些实施方式中，⑶R为Chothia⑶R。在其它一些实施方式中，⑶R为Kabat与Chothia⑶R的组合(亦称为"组合⑶R"或"扩展⑶R")。换言之，对于含有一种以上⑶R的任何给定实施方式而言，⑶R可为Kabat、Chothia和/或组合⑶R中的任一种。
[0036]在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列，其中LI为L、V或I ;其中Y2为Y或W ;其中S3为S、T或G ;其中L4为L、R、A、V、S、T、Q或E ;其中V6为￥、1、1\?、(:、0、5^或？；且其中Y7为Y、H、F、W、S、1、V或A。在一些实施方式中，氨基酸序列为重链可变区中的CDR3。在本文中为方便起见，在本文上下文中或提到氨基酸时，“为/是(“is”)”指参照在SEQ ID中的位置来选择给定位置的氨基酸。举例而言，"LI为L、V或I"指在SEQ IDNO:5中位置I的氨基酸L可被V或I取代。
[0037]在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列，其中Y8为Y、A或H ;且其中All为A或S ;且其中K12为K或A。在一些实施方式中，氨基酸序列为轻链可变区中的CDR1。
[0038]在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列，其中LI为L、M、N、C 、F、V、K、S、Q、G、S ;其中G3为G、S或T ;其中T4为T或S ;其中H5为H或 L ;其中 Y6 为 Y、P、A、W、Q、M、S 或 E ;其中 V8 为 V、L、K、H、T、A、E、或 M ;且其中 L9 为 L、1、T、S或V。在一些实施方式中，氨基酸序列为轻链可变区中的⑶R3。
[0039]在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含重链可变区，该重链可变区包含:(a)SEQ ID NO:3 中所示的 CDRl 区域；(b) SEQ ID NO:4 中所示的 CDR2 区域；及(c) SEQ ID NO:5中所示的⑶R3区域，其中LI为L、V或I ;其中Y2为Y或W ;其中S3为S、T或G ;其中L4为L、R、A、V、S、T、Q 或 E ;其中 V6 为 V、1、T、P、C、Q、S、N 或 F ;且其中 Y7 为 Y、H、F、W、S、1、V或A。
[0040]在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含轻链可变区，该轻链可变区包含:(a)SEQ IDNO:6中所示的⑶Rl区域，其中Y8为Y、A或H ;且其中All为A或S ;且其中K12为K或A ; (b) SEQ ID NO:7中所示的CDR2区域；及(c) SEQ ID NO:8中所示的CDR3区域，其中LI 为 L、M、N、C、F、V、K、S、Q、G、S ;其中 G3 为 G、S 或 T ;其中 T4 为 T 或 S ;其中 H5 为 H 或 L ;其中 Y6 为 Y、P、A、W、Q、M、S 或E ;其中 V8 为 V、L、K、H、T、A、E 或 M ;且其中 L9 为 L、1、T、S或V。
[0041]在一些实施方式中，本发明的抗体为人抗体。在其它实施方式中，本发明的抗体为人化抗体。在一些实施方式中，抗体为单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体(或多肽)系经分离。在一些实施方式中，抗体(或多肽)为基本上纯的。
[0042]抗体的重链恒定区可来自任何类型的恒定区，例如IgG、IgM、IgD、IgA及IgE ;及任何同型(isotype),例如 IgGl、IgG2、IgG3 及 IgG4。
[0043]在一些实施方式中，抗体包含经修饰恒定区，例如免疫惰性(其包括部分免疫惰性，且可与术语"具有受损的效应器功能"互换使用)的恒定区，其例如并不触发补体介导溶胞、并不刺激抗体依赖细胞介导细胞毒性(ADCC)或并不活化微神经胶质细胞。在一些实施方式中，如 Eur.J.1mmunol.(1999)29:2613-2624 ；PCT 申请案第 PCT/GB99/01441 号；和/或英国专利申请案第9809951.8号中所述来修饰恒定区。在其它实施方式中，抗体包含人类重链IgG2a恒定区，该恒定区包含以下突变:A330P331至S330S331 (参考野生型IgG2a序列的氨基酸编号)。Eur.J.1mmunol.(1999) 29:2613_2624。在一些实施方式中，抗体包含IgG4的恒定区，该恒定区包含以下突变:E233F234L235至P233V234A235。在再其它一些实施方式中，针对N连接糖基化而对恒定区去糖基化(aglycosylated)。在一些实施方式中，通过使寡糖附接残基(例如Asn297)突变和/或侧接作为恒定区中N-糖基化识别序列的部分的残基，从而针对N连接糖基化而使恒定区去糖基化。在一些实施方式中，针对N连接糖基化而对恒定区去糖基化。以酶促方式或通过表达于糖基化缺乏宿主细胞中，从而可针对N连接糖基化而使恒定区去糖基化。
[0044]在另一方面中，本发明提供一种多核苷酸(其可经分离)，其包含编码抗体9TL或6G或表3及表8中所不的其变异体的片段或区域的多核苷酸。在一种实施方式中，片段为抗体9TL或6G的轻链。在另一种实施方式中，片段为抗体9TL或6G的重链。在又一种实施方式中，片段含有来自抗体9TL或6G的轻链和/或重链的一或多个可变区。在又一种实施方式中，片段含有来自抗体9TL或6G的轻链和/或重链的一或多个(亦即一、二、三、四、五、六个)互补决定区(⑶R)。
[0045]附图简述
[0046]图1展示了 9TL抗体的重链可变区(SEQ ID NO:1)及轻链可变区(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。Kabat⑶R表示为粗体，Chothia⑶R以下划线表示。对重链及轻链可变区的
氨基酸残基依次编号。
[0047]图2展示了通过肽竞争进行的抗体9TL的表位定位。将A β ^40肽固定于SA芯片上。接着，使各与 10 μ M 各种肽(Αβ 的氨基酸 28-40、1-40、1-28、28-42、22-35、1-16、1-43、33-40、1-38或17-40)或无肽预培育Ih的单克隆抗体2289及9TL Fab片段(各50ηΜ)流到该芯片上。测量抗体Fab片段对固定A β ^40肽的结合。
[0048]图3是展示了通过肽竞争进行抗体2Η6的表位定位的图。将A β ^40肽固定于SA芯片上。使各与 16 μ M各种肽(Α β 的氨基酸 1-16、1-28、1-38、1-40、1-42、1-43、17-40、17-42、22-35,25-35或33-40)或无肽预培育Ih的单克隆抗体2289、2286或2Η6 (各10nM)流到该芯片上。测量抗体与固定Aii1,肽的结合。
[0049]图4是展示了抗体2Η6、2286及2289与不同Αβ肽C末端变异体的结合的图。将GST-Aβ 变异体(Μ35Α、V36A、G37A、G38A、V39A 或 V40A)或 GST-Αβ 肽 1-39、1-41、1-40、1-42固定于ELISA板上。将各固定的肽与单克隆抗体2286、2Η6或2289 (各mAb0.3nM) 一起培育，且通过进一步依次以经生物素标记的抗小鼠IgG(H+L)及Sterptavidin-HRP培育来检测其结合。
[0050]图5为来自老化脂蛋白元同功异型物E4 (AP0E4)小鼠在正常膳食相对于高脂肪及胆固醇膳食下的a波及b波㈧及样品视网膜电图⑶的强度图。
[0051]图6为对比正常膳食动物的先前研究所绘的仅AP0E4小鼠b波的强度图。R2迹线展示:当以抗A β抗体治疗AMD状小鼠(E4-HFC-R2)时的视网膜功能的保护或恢复。[0052]图7展示AMD状(AP0E4)小鼠脑部的全Αβ免疫组织化学。载片A(以抗Αβ抗体治疗的AMD状小鼠)展示阴性类淀粉检测。载片B、C及D(以介载体(vehicle)注射治疗的AMD状小鼠)展示阳性类淀粉检测。载片E系取自阳性对照且系取自血小板衍生APP小鼠模型(pdAPP，在血小板衍生生长因子启动子控制下的突变(V717F)人类APP (Games，D.等人，Nature373:523-527(1995))的脑。
[0053]图8展示6G抗体的重链可变区(SEQ ID NO:1)及轻链可变区(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列。Kabat⑶R系呈粗体文且Chothia⑶R系经加下划线。对重链及轻链可变区的氨基酸残基依次编号。
[0054]图9展示通过ELISA进行的抗体6G的表位定位。将A β肽(1-16、1-28、17-40、17-42、22-35、28-40、28-42、1-38、1-40、1-42、1-43 及 33-40)固定于 ELISA 板上。将单克隆抗体6G(20nM)与各种固定肽培育I小时。使用山羊抗人类κ HRP缀合二抗来测量与固定Αβ肽结合的抗体6G。
[0055]图10展示通过ELISA进行的抗体6G的表位定位。将各种A β肽固定于ELISA板上。将抗体6G与各种固定肽培育lh。使用山羊抗人类K HRP缀合二抗来测量与固定Aβ肽结合的抗体6G。" NB"指未检测到结合。
[0056]图11为展示Αβ上抗体6G结合的表位的示意图。其中展示了 Αβ在类淀粉前驱蛋白质(APP)中及APP的部分在细胞膜中的相对位置。"CT99"指APP的C末端99个氨基酸。 [0057]图12为展示用针对A β !_16 (m2324)及抗体6G的单克隆抗体对APP表达细胞进行免疫染色的照片。上方的图展示了细胞与m2324或6G(各5μg/ml) —起培育且通过二次Cy3缀合山羊抗小鼠或抗人抗体来检测结合之后在萤光显微镜下的细胞。下方的图展示了在显微镜下所观察的细胞。
[0058]图13为仅五个研究组的AP0E4小鼠的b波强度图:正常膳食的对照AP0E4小鼠；高脂肪及胆固醇膳食('HFC')的对照AP0E4小鼠(AMD状模型)；以7G10治疗的AP0E4-HFC小鼠；以2H6治疗的AP0E4-HFC小鼠；及以6G治疗的AP0E4-HFC小鼠。
[0059]图14为仅三个研究组的AP0E4小鼠的b波强度图:正常膳食的对照AP0E4小鼠；对照AP0E4HFC小鼠；及以6G治疗的AP0E4-HFC小鼠。
[0060]发明详述
[0061]AMD的小鼠模型已有助于测试如下假设:不受理论限制，脂质输送调节异常及类淀粉沉积可促进见于年龄相关黄斑退化、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括黄斑水肿)及其它相关视网膜退化性疾病中所观察到视网膜变化的发病机制。已在阿兹海默氏症中广泛研究了 Αβ沉积，且先前研究已表明Αβ在年龄相关黄斑退化(Yoshida，T.等人，J.0f Clin.1nvest.,115(10):2793-2800(2005) ；Anderson, D.等人，Experimental EyeResearch78:243-256(2004) Johnson, L 等人，PNAS，99(18):11820-11835(2002))及青光眼(McKinnon SJ, Front B1sci8:1140-56(2003) ；Tatton 等人，Surv Ophthalmol.48:S25-37 (2003))中的潜在作用。然而，迄今尚未存在关于A β抑制剂是否可通过实现视网膜保护和/或恢复而在治疗黄斑退化中提供治疗性益处的讨论。此外，尚未有关于Αβ同功异型物中的任一种是否可有差异地促进AMD发病机制的讨论。
[0062]如上文所讨论，Αβ为见于阿兹海默氏症中的神经炎斑的主要成份。Αβ为β类淀粉前驱蛋白质(β APP或APP)的分裂产物。APP为一种含有大异位N末端域、跨膜域及小细胞质C末端尾部的I型跨膜糖蛋白。染色体21上单一 APP基因转录的替代性拼接产生氨基酸数目不同的若干同功异型物。阿兹海默氏症中的先前研究已确定Ai^_42同功异型物对类淀粉沉积必不可少，且与Αβ卜4(|相反，Ai^_42可以是阿兹海默氏症的发病机制中的引发分子(McGowan，E.等人，Neuron47:191-199 (2005))。阿兹海默氏症中的其它研究而且表明A β H。同功异型物实际上可抑制类淀粉沉积，且A β ^40抑制剂可使得阿兹海默氏症进程恶化(Kim，J.等人，Neurob1logy of Disease，27 (3):627-633 (2007))。
[0063]本文中所公开的本发明提供通过施用治疗有效量的抗体9TL或6G或由其衍生的抗体或多肽来预防和/或治疗个体中眼科疾病的方法，此类眼科疾病例如年龄相关黄斑退化(湿型及干型)、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括糖尿病性黄斑水肿)、布鲁赫膜破裂、近视退化、眼肿瘤及其它相关视网膜退化性疾病。抗体9TL及其衍生物已被描述于W02006036291中，其公开内容通过引用全部并入本文中。用于所公开方法中的抗体及多肽与Αβ H。的C末端结合。抗体6G及其衍生物已被描述于W02006036291及W02006118959中，其公开内容通过引用全部并入本文中。本发明的方法意欲包括Αβ的所有抑制剂，其包括但不限于:小分子化合物及生物制剂，例如抗体、反义分子、siRNA分子及核糖核酸酶。
[0064]通用技术
[0065]除非另作说明，否则本发明的实施将采用本领域内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的公知技术。这些技术已被充分解释于例如以下的文献中:Molecular Cloning:A Laboratory Manual, second edit1n (Sambrook 等人，1989)Cold Spring Harbor Press ；01igonucleotide Synthesis(M.J.Gait 编，1984)；Methods in Molecular B1logy, Humana Press ；Cell B1logy:A Laboratory Notebook (J.E.Cellis 编，1998)Academic Press ;Animal Cell Culture(R.1.Freshney 编，1987)；Introduct1n to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather 及 P.E.Roberts,1998)PlenumPress ；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle, J.B.Griffiths 及
D.G.Newell 编，1993-1998)J.Wiley and Sons ；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.) ；Handbook of Experimental Immunology (D.M.Weir 及 C.C.Blackwell 编)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller 及 M.P.Calos 编，1987) ；CurrentProtocols in Molecular B1logy (F.M.Ausubel 等人编，1987) ；PCR:The PolymeraseChain React1n, (MuIlis 等人 编，1994) ；Current Protocols in Immunology (J.E.Coligan 等人 编，1991) ；Short Protocols in Molecular B1logy(Wiley and Sons,
1999)；Immunob1logy(C.A.Janeway 及 P.Travers,1997) ；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.编，IRL Press, 1988-1989) ；Monoclonalantibodies:a practical approach (P.Shepherd 及 C.Dean 编，Oxford University Press,
2000)；Using antibodies:a laboratory manual (E.Harlow 及 D.Lane (Cold Spring HarborLaboratory Press, 1999) ；The Antibodies (M.Zanetti 及 J.D.Capra 编，Harwood AcademicPublishers,1995)。
[0066]定义
[0067]" Αβ肽抑制剂"是能够减少Αβ肽产生和/或沉积的任何药剂。Αβ肽抑制剂包括但不限于:抗体、反义分子、siRNA分子、核糖核酸酶或小分子化合物。此外，Αβ肽抑制剂是能够结合Αβ肽且减少Αβ斑沉积的任何药剂，其包括能够中断类淀粉前驱蛋白质蛋白质裂解为产物Αβ肽的任何药剂。抑制Αβ肽产生及沉积的其它目标包括但不限于:例如能够抑制或压制β分泌酶(亦称为BACEl或memapsin-2)或、分泌酶复合物(其最低限度由四种个别蛋白质组成:早老素(presenilin)、尼卡斯群(nicastrin)、前咽缺陷I (APH-1)及早老素增强子2(PEN-2))的小分子治疗剂或siRNA。
[0068]"抗体"为免疫球蛋白分子，其能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区的抗原识别位点来与例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的靶标特异性结合。如本文中所用地，该术语不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，而且涵盖其片段(例如Fab、Fab'、Fiab1 )2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白，及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。抗体包括任何类别的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，且抗体不需属于任何特定类别。视其重链的恒定结构域的抗体氨基酸序列而定，免疫球蛋白可被归于不同类别。存在五个主要类别的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此类者中的若干者可进一步分成亚类(同型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及IgA2。将对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、Y及μ。不同类别免疫球蛋白的次单位结构及三维构型是公知的。
[0069]如本文中所用地，"单克隆抗体"指由基本上同类的抗体群体获得的抗体，即:包含该群体的个别抗体除可微量存在的可能天然存在的突变外均相同。单克隆抗体为高度特异性的，它们针对单一抗原位点。而且，与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，各单克隆抗体针对抗原上的单一抗原性位点。修饰语"单克隆"表明抗体的特征在于由抗体的基本上同类群体获得，且不应理解为需要通过任何特定方法来产生抗体。举例而言，根据本发明欲使用的单克隆抗体可通过先由Kohler及Milstein,1975，Nature, 256:495所述的融合瘤方法来制得，或可通过例如美国专利第4，816，567号中所述的重组DNA方法制得。亦可自使用(例如)McCafferty等人，1990, Nature, 348:552-554中所述技术产生的噬菌体文库来分离单克隆抗体。
[0070]如本文中所用地，"人化"抗体指非人(例如鼠类)抗体的下述形式，其是含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗体的其它抗原结合子序列)。在极大程度上，人化抗体是人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被经来自非人类物种(供体抗体)的CDR的残基置换，所述非人物种例如是具有所需特异性、亲和性及能力的小鼠、大鼠或兔。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应非人类残基置换。此外，人化抗体可包含既未在接受者抗体中也未在输入CDR或框架序列中发现的残基，但将其包括进来以进一步改善及优化抗体效能。一般而言，人化抗体将包含至少一个且通常二个可变结构域的基本上全部，其中CDR区域的全部或基本上全部均对应于非人类免疫球蛋白的那些，并且，FR区域的全部或基本上全部均为人类免疫球蛋白共有序列的那些。最优地，人化抗体还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区或域(Fe)，通常为人类免疫球蛋白的彼者。抗体可具有如W099/58572中所述经修饰的Fe区。其它形式的人化抗体具有一或多个相对于原始抗体而言经改变的⑶R(—、二、三、四、五、六个)，其还被称为一或多个"衍生自"一或多个来自原始抗体的⑶R的⑶R。
[0071] 如本文中所用，"人抗体"表示具有相应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序和/或已使用本领域中已知或本文中所公开的制造人抗体的技术中的任一种制得的抗体。人抗体的此定义包括包含至少一个人类重链多肽或至少一个人类轻链多肽的抗体。一个这样的实例为包含鼠类轻链及人类重链多肽的抗体。可使用各种本领域中已知的技术来制造人抗体。在一种实施方式中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan 等人，1996,Nature B1technology, 14:309-314 ；Sheets 等人，1998,PNAS, (USA) 95:6157-6162 ;Hoogenboom 及 Winter，1991，J.Mol.B1l.，227:381 ;Marks 等人，1991，J.Mol.B1l.，222:581)。还可通过将人类免疫球蛋白基因座引入内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活的转殖基因动物(例如小鼠)中来制造人抗体。在美国专利第5，545，807 号；第 5，545，806 号；第 5，569，825 号；第 5，625，126 号；第 5，633，425 号；及第5，661, 016号中描述此方法。或者，可通过永生化产生针对祀标抗原的抗体的人类B淋巴细胞来制备人抗体(此B淋巴细胞可自个体中回收或可经体外免疫)。例如参见Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss,第 77 页(1985) ；Boemer 等人，1991，J.1mmunol.，147(1):86-95 ;及美国专利第 5，750，373 号。
[0072]如本文中所用，术语"9TL"及"抗体9TL"可互换使用，以指通过保藏号为ATCCPTA-6124及ATCCPTA-6125的表达载体产生的抗体。图1中展示了重链及轻链可变区的氨基酸序列。图1中图解性地示出了抗体9TL (包括Chothia及KabatOTR)的⑶R部分。编码重链及轻链可变区的多核苷酸展示于SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10中。在实例中描述了对9TL的分析。
[0073]如本文中所用地，术语"6G"及"抗体6G"可互换使用，以指具有SEQ ID NO:36中所示的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:37中所示的轻链氨基酸序列的抗体。图8中展示了重链及轻链可变区的氨基酸序列。图8中图解性地示出了抗体6G(包括Chothia及KabatCDR)的CDR部分。编码重链及轻链的多核苷酸展示于SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:39中。在实例中描述了对6G的分析。 [0074]术语"多肽"、"寡肽"、"肽"及"蛋白质"本文中可互换使用，以指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可为线性或带支链的，其可包含修饰氨基酸且其可杂有非氨基酸。所述术语也涵盖已经天然修饰或通过干预(intervent1n)来修饰的氨基酸聚合物；例如双硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如与标记组份缀合。该定义内还包括例如含有一或多个氨基酸类似物(例如包括非天然氨基酸等)的多肽以及本领域中已知的其它修饰。应了解:因为本发明的多肽基于抗体，所以多肽可作为单链或相关链的形式出现。
[0075]如本文中可互换使用的"多核苷酸"或"核酸"指任何长度的核苷酸的聚合物，其包括DNA及RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰核苷酸或碱基和/或其类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶来并入聚合物中的任何受体。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可在聚合物组装之前或之后进行。核苷酸的序列可杂有非核苷酸组份。在聚合之后可对多核苷酸进一步修饰，例如通过与标记组份缀合来修饰。其它类型的修饰包括(例如)"盖子(cap)"、以类似物取代天然存在的核苷酸中的一种或多种、核苷酸间修饰，例如具有不带电的连接的修饰(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酸酯、胺基甲酸酯等)及具有带电的连接的修饰(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有侧位部分的修饰(例如蛋白质，例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-离胺酸等)、具有嵌入剂的修饰(例如吖啶、补骨脂素等)、含有螯合剂的修饰(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)、含有烷化剂的修饰、具有经修饰的连接的修饰(例如α-变旋异构核酸等)，以及多核苷酸的未经修饰形式。另外，通常存在于糖中的任何羟基可(例如)经膦酸酯基、磷酸酯基置换，经标准保护基保护，或经活化以制备与其它核苷酸的其它键，或可与固体支撑物缀合。5'及3'末端OH可经磷酸化或经胺或具有I至20个碳原子的有机封端基团部分取代。其它羟基也可衍生至标准保护基。多核苷酸亦可含有本领域中一般已知的核糖或脱氧核糖类似物，包括(例如)2' -O-甲基_、' _0_烯丙基、2'-氟-或2' _叠氮基_核糖、碳环糖类似物、α -变旋异构糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、批喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose))、非环状类似物及脱碱基核苷类似物，例如甲基核糖苷。一或多个磷酸二酯连接可被备选的连接基团置换。这些备选的连接基团基团包括但不限于:其中磷酸盐/酯被P(0)S("硫代酯")、P (S) S (" 二硫代酯")、(O) NR2 ("酰胺酸酯")、P (O) R、P (O) OR'、⑶或 CH2 (,"甲缩醛")置换的实施方式，其中R或!^各自独立地为H或经取代或未经取代的烷基，它们任选地含有醚(-0-)键的烷基(1-20个C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有键均需相同。先前的描述也适用于本文中所提及的所有多核苷酸，包括RNA及 DNA。
[0076]抗体的"可变区"指单独或呈组合形式的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链及轻链的可变区各由四个通过三个亦称为高变区的互补决定区(CDR)连接的框架区(FR)组成。各链中的CDR由FR紧密保持在一起，且与来自其它链的CDR —起促成抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种测定CDR的技术:(I)基于交叉物种序列可变性的方法(亦即，Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第五版，1991, Nat1nal Institutes of Health, Bethesda MD));及(2)基于抗原抗体复合物的结晶学研究的方法(ΑΙ-lazikani 等人(1997) J.Molec.B1l.273 =927-948))。如本文中所用地，CDR可指由任一 种方法或由两方法的组合界定的CDR。
[0077]抗体的"恒定区"指单独或呈组合形式的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。
[0078]与抗体或多肽"优先结合"或"特异性结合"(本文中可互换使用)的表位是本领域中充分了解的术语，且在本领域中，测定此特异性或优先结合的方法也是公知的。与分子与替代性细胞或物质的反应或缔合相比，若分子更频繁、更迅速、以更大持续时间和/或更大亲和性与特定细胞或物质反应或缔合，则将该分子称为展现"特异性结合"或"优先结合"。与抗体与其它物质的结合相比，若抗体以更大亲和性、亲和力、更容易和/或以更大持续时间与靶标结合，则抗体与靶标"特异性结合"或"优先结合"。举例而言，与A β H0表位特异性或优先结合的抗体与其与其它A β H。表位或非A β ^40表位的结合相比，能以更大亲和性、亲和力、更容易和/或更大持续时间与此表位结合。通过阅读此定义还应了解:例如，与第一靶标特异性或优先结合的抗体(或部分或表位)可与或可不与第二靶标特异性或优先结合。因此，"特异性结合"或"优先结合"未必需要(尽管其可包括)独占结合。大体而言，但并非一定，提到结合指优先结合。
[0079]如本文中所用地，"基本上纯"指至少50%纯(亦即无污染物)、更优选至少90%纯、更优选至少95%纯、更优选至少98%纯、更优选至少99%纯的物质。[0080]"宿主细胞"包括可以是或已是用于并入多核苷酸插入物的载体接受者的个别细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，且由于天然、偶然或故意突变，子代可不必完全与原始亲本细胞相同(在形态学或染色体组DNA补体方面)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。
[0081]术语"Fe区"用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域。"Fe区"可为天然序列Fe区或变异Fe区。尽管免疫球蛋白重链的Fe区的边界可改变，但人类IgG重链Fe区通常被定义为自位置Cys226的氨基酸残基或自Pro230至其羧基末端的伸展。Fe区中的残基编号为如在 Kabat 中 EU 指数的编号。Kabat 等人，Sequences of Proteins of ImunologicalInterest,第 5 版，Public Health Service, Nat1nal Institutes of Health, Bethesda,Md.，1991。免疫球蛋白的Fe区一般包含两个恒定结构域:CH2及CH3。
[0082]如本文中所用地，"Fe受体"及"FcR"描述与抗体的Fe区结合的受体。优选的FcR是天然序列人类FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR( Y受体)，其包括Fe Y R1、Fc Y RII及Fe Y RIII亚类受体，包括这类受体的等位基因变异体及备选剪接形式。FcyRII受体包括Fe Y RIIA("活化受体")及Fe Y RIIB("抑制受体")，其具有主要在其细胞质域中存在不同的类似氨基酸序列。FcR系综述于Ravetch及Kinet, 1991, Ann.Rev.Tmmunol.,9:457-92 ； Cape I 等人，1994, Immunomethods, 4:25-34 ;及 de Haas 等人，1995，J.Lab.Clin.Med.，126:330-41中。"FcR"亦包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer 等人，1976, J.1mmunol.，117:587 ;及 Kim 等人，1994, J.1mmunol.，24:249)。
[0083]"补体依赖细胞毒性"及"⑶C"指在补体存在下将靶标溶胞。通过将补体系统的第一组份(Clq)结合于与同源抗原复合的分子(例如抗体)来引发补体活化路径。为评定补体活化，可进行 ⑶C检验,例如，如Gazzano-Santoro等人，J.1mmunol.Methods, 202:163(1996)中所述进行。
[0084]"功能性Fe区"具有天然序列Fe区的至少一种效应器功能。示例性的"效应器功能"包括=Clq结合；补体依赖细胞毒性(CDC) ；Fc受体结合；抗体依赖细胞介导细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的调降等。此类效应器功能一般需要Fe区与结合域(例如抗体可变结构域)组合，可使用各种本领域中已知用以评估此类抗体效应器功能的检验来对其加以评定。
[0085]"天然序列Fe区"包含与自然界中发现的Fe区的氨基酸序列一致的氨基酸序列。"变异Fe区"包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fe区的氨基酸序列、然而保持天然序列Fe区的至少一种效应器功能的氨基酸序列。与天然序列Fe区相比或与亲本多肽的Fe区相比，变异Fe区在天然序列Fe区中或在亲本多肽的Fe区中优选具有至少一个氨基酸取代，例如约一至约十个氨基酸取代，且优选约一至约五个氨基酸取代。本文中变异Fe区将与天然序列Fe区和/或与亲本多肽的Fe区优选具有至少约80%序列一致性，且最优选与其具有至少约90%序列一致性，更优选与其具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%序列一致性。
[0086]如本文中所用地，"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性"及"ADCC"指细胞介导反应，其中表达Fe受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀手(NK)细胞、嗜中性白血球及巨噬细胞)识别靶标细胞上的结合抗体，随后引起靶标细胞的溶胞。可使用体外ADCC检验来评定所关注分子的ADCC活性，例如美国专利第5，500，362号或第5，821，337号中所述的检验。用于此类检验的适用效应器细胞包括周围血液单核细胞(PBMC)及NK细胞。或者或另外，例如在动物模型中可体内评定所关注分子的ADCC活性，例如Clynes等人，1998，PNAS(USA),95 =652-656中所公开的动物模型。
[0087]如本文中所用地，"有效剂量"或"有效量"的药物、化合物或医药组合物为足以实现有利或所需结果的量。对于预防性用途而言，有利或所需结果包括例如消除或减小风险、减轻严重程度或延迟疾病发作的结果，该发作包括疾病的生物化学、组织和/或行为症状，在疾病发展期间呈现的其并发症及中间病理学表型。对于治疗性用途而言，有利或所需结果包括但不限于例如保护或恢复视网膜功能或保持或复原视敏度的临床结果。有效剂量可以一或多次施用来施用。为达成本发明的目的，有效剂量的药物、化合物或医药组合物为足以直接或间接地实现预防性或治疗性治疗的量。如在临床情形中了解，有效剂量的药物、化合物或医药组合物可与或可不与另一药物、化合物或医药组合物联合来达成。因此，在施用一或多种治疗剂的情形下可考虑"有效剂量"，并且，单一药剂若与一或多种其它药剂联合，所需结果可达成或已达成，单一药剂则可视为是以有效量给出的。
[0088]如本文中所用，"治疗"为获得有利或所需结果(包括临床结果)的方法。为达成本发明的目的，有利或所需临床结果包括但不限于:复原、预防或保护视网膜功能。
[0089]" Αβ肽的生物作用"或"Αβ生物活性"意谓Αβ在眼科疾病中的作用，其可为直接或间接作用，且不受理论限制地包括Αβ在脂质输送调节异常中的涉入。间接作用包括但不限于Aβ对视网膜功能及视敏度起作用。
[0090]如本文中所用，"延迟"眼科疾病的发展意谓推迟、阻碍、减缓、推延、稳定和/或延期疾病的发展。视疾病史和/或所治疗的个体而定，此延迟可具有变化的时间长度。对本领域技术人员而言显而易见:足够或显著延迟可实际上涵盖预防，因为个体并不发展该疾病。"延迟"眼科疾病发展的方法为当与不使用该方法相比时，在给定时间框架内减小疾病发展机率和/或在给定时间框架内减小疾病程度的方法。此类比较通常系基于临床研究，使用统计上显著数目的个体。
[0091]眼科疾病的"发展"意谓个体中眼科疾病的发作和/或进展。使用如本文所述的标准临床技术可检测眼科疾病的发展。然而，发展还表示最初可能不可检测的疾病进展。为达成本发明的目的，在此情况下，进展指如由标准眼科检查(ophthalmogicalexaminat1n)或通过较专业化测试来测定的疾病病况的生物学过程。多种诊断性测试包括但不限于视野、视敏度、萤光血管摄影术(fluorescein ang1graphy)、视网膜电图、光学同步断层摄影法(OCT)、视觉诱发电位(VEP)、靛氰绿、色彩视觉、阿姆斯勒方格表(Amslergrid)、眼内压及本领域技术人员已知的其它诊断工具。AMD的诊断性测试尤其包括但不限于:视敏度、眼底检查(fundoscopic examinat1n)、萤光血管摄影术、靛氰绿及眼同步断层摄影法(OCT)。"发展"包括出现、复发及发作。如本文中所用，眼科疾病的"发作"或"出现"包括初始发作和/或复发。
[0092]如本文中所用，"保护"视网膜功能指稳定或保持视网膜功能。如本文中所用，"恢复"视网膜功能系指在先前损害之后复原视网膜功能。视网膜功能的保护或恢复可通过测量统计上显著结果(亦即P <0.05)来测定，如通过上述眼科诊断工具中的任一种来测量，尤其例如视敏度、视网膜电图、视野、眼底检查、萤光血管摄影术、靛氰绿及眼同步断层摄影法(OCT)。举例而言，如下文实例4中所示，统计上显著的视网膜功能保护或恢复系由视网膜电图中b波振幅恢复来展示(P = 0.008)。
[0093]视敏度的"保持"或"复原"可通过标准视力表以及本领域中公知的多种眼科诊断工具来测量。
[0094]如本文中所用地，"联合"施用包括同时施用和/或在不同时间施用。联合施用亦涵盖以共制剂来施用或以独立组合物来施用。如本文中所用，联合施用意谓涵盖向个体施用抗Αβ抗体与另一药剂的任何状况，其可同时和/或独立发生。如本文中进一步讨论地，应了解:可以以不同给药频率或间隔来施用抗Αβ抗体及其它药剂。举例而言，抗Αβ抗体可每周施用，而其它药剂可较不频繁地施用。应了解:可使用同一施用途径或不同施用途径来施用抗Aβ抗体及其它药剂。
[0095]"生物样品"涵盖多种自个体获得的样品类型且可用于诊断或监测检验。该定义涵盖生物源的血液及其它液体样品、固体组织样品，例如活组织检查样品或组织培养物或由此衍生的细胞及其子代。该定义亦包括在取得其之后以任何方式操作的样品，例如通过以试剂处理、溶解或某些组份(例如蛋白质或多核苷酸)的富集或包埋于半固体或固体基质中以达成切片目的。术语"生物样品"涵盖临床样品，且亦包括培养物中的细胞、细胞上清液、细胞溶胞物、血清、血浆、生物流体及组织样品。
[0096]"个体"(或者称为"受检者")为哺乳动物，更优选为人类。哺乳动物亦包括但不限于农畜(例如牛)、体育动物、宠物(例如猫、狗、马)、灵长类动物、小鼠及大鼠。
[0097]如本文中所用，"载体"指能够在宿主细胞中递送且优选能够表达一或多种所关注基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于:病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、囊封于脂质粒中的DNA或RNA表达载体，及某些真核细胞，例如生产细胞。
[0098]如本文中所用地，"表达控制序列"意指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是，例如，组成性或诱导性启动子的启动子，或增强子。表达控制序列与待转录的核酸序列可操作地连接。
[0099]如本文中所用，"医药学上可接受的载剂"包括:当与活性成份组合时使该成份保持生物活性且对个体的免疫系统为非反应性的任何物质。实例包括但不限于标准医药载剂中的任一种，例如磷酸盐缓冲生理食盐水溶液、水、例如油/水乳液的乳液及多种类型的湿润剂。用于喷雾剂或非经肠施用的优选稀释剂为磷酸盐缓冲生理食盐水或生理(0.9%)食盐水。通过公知公知方法来调配包含此类载剂的组合物(例如参见Remington' sPharmaceutical Sciences,第 18版,A.Gennaro编，Mack Publishing C0.,Easton,PA, 1990 ；及 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第 20 版，Mack Publishing, 2000)。
[0100]如本文中所用的术语"k。/意指抗体与抗原缔合的缔合速率常数(on rateconstant)。
[0101]如本文中所用的术语"kf"意指抗体自抗体/抗原复合物解离的解离速率常数(off rate constant)。
[0102]如本文中所用的术语"Kd"意指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
[0103]组合物及组合物的制造方法
[0104] 抗Αβ抗体及多肽:[0105]1.抗体9TL及9TL衍生抗体及多肽
[0106]本发明涵盖组合物，包括医药组合物，其包含抗体9TL及表3中所示的其变异体或衍生自抗体9TL及表3中所示的其变异体的多肽；及包含编码9TL抗体及其变异体或多肽的序列的多核苷酸。如本文中所用，组合物包含一或多种与A β u的C末端结合的抗体或多肽(其可为或可不为抗体)和/或一或多种包含编码一或多种与A β H0的C末端结合的抗体或多肽的序列的多核苷酸。此类组合物可另外包含合适赋形剂，例如医药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂，其在本领域中是公知的。
[0107]本发明的抗体及多肽特征在于以下特征中的任一种(一种或多种):(a)与
的C末端肽28-40结合，但并不显著与A β卜42或A β !_43结合；(b)与A β ^40的C末端肽33-40结合；(c)抑制在个体中形成类淀粉斑；(d)减少个体眼睛中的类淀粉斑；(e)治疗、预防、改善一或多种眼科疾病症 状，该眼科疾病包括但不限于年龄相关黄斑退化(干型及湿型)、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括黄斑水肿)及其它相关视网膜退化性疾病；(f)产生视网膜功能的显著保护或恢复；及(g)产生视敏度的显著保持或复原。
[0108]与其它所报导的抗Αβ抗体相反，本发明的抗体及多肽还可展现想要的安全性。
[0109]因此，本发明提供以下各物中的任一种，或包含以下各物中的任一种的组合物(包括医药组合物):(a)抗体9TL或表3中所示的其变异体；(b)抗体9TL或表3中所示的其变异体的片段或区域；(c)抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链；(d)抗体9TL或表3中所示的其变异体的重链；(e)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链和/或重链的一或多个可变区；(f)抗体9TL或表3中所示的其变异体的一或多个⑶R( —、二、三、四、五或六个⑶R) ； (g)来自抗体9TL的重链的⑶R H3 ； (h)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链的CDR L3 ； (i)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链的三个CDR ；(i)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的重链的三个CDR ； (k)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链的三个CDR及来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的重链的三个⑶R ;及⑴包含(b)至(k)中的任一种的抗体。本发明还提供了包含以上各物中的任何一种或多种的多肽。
[0110]图1中图解性地示出了抗体9TL (包括Chothia及Kabat⑶R)的⑶R部分。⑶R区域的测定系是本领域内公知的。应当了解:在一些实施方式中，CDR可以是Kabat与Chothia⑶R的组合(亦称为"组合⑶R"或"扩展⑶R")。在一些实施方式中，⑶R为Kabat⑶R。在其它实施方式中，CDR为Chothia⑶R。换言之，在具有一种以上⑶R的实施方式中，⑶R可为Kabat、Chothia、组合⑶R或其组合中的任一种。
[0111]在一些实施方式中，本发明提供了下述多肽(其可为或可不为抗体)，其包含基本上与9TL或表3中所示的其变异体的至少一个⑶R、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或所有六个CDR —致的至少一个CDR、至少两个、至少三个或至少四个、至少五个或所有六个⑶R。其它实施方式包括具有基本上与9TL的至少两个、三个、四个、五个或六个⑶R一致或衍生自9TL的至少两个、三个、四个、五个或六个⑶R的抗体。在一些实施方式中，该至少一个、二个、三个、四个、五个或六个⑶R与9TL或表3中所示的其变异体的至少一个、二个、三个、四个、五个或六个CDR至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%—致。应了解，为达成本发明的目的，尽管活性程度与9TL或表3中所示的其变异体相比可改变(可更大或更小)，但结合特异性和/或总体活性一般得以保持。[0112]本发明还提供了下述多肽(其可为或可不为抗体)，其包含9TL或表3中所示的其变异体的氨基酸序列，该氨基酸序列具有以下各物中的任一种:9TL或表3中所示的其变异体的序列的至少5个邻接氨基酸、至少8个邻接氨基酸、至少约10个邻接氨基酸、至少约15个邻接氨基酸、至少约20个邻接氨基酸、至少约25个邻接氨基酸、至少约30个邻接氨基酸，其中此类氨基酸中的至少3者来自9TL (图1)或表3中所示的其变异体的可变区。在一种实施方式中，可变区是来自9TL的轻链。在另一种实施方式中，可变区来自9TL的重链。示例性多肽具有来自9TL的重链及轻链可变区的邻接氨基酸(上述长度)。在另一种实施方式中，5个(或5个以上)邻接氨基酸来自图1中所示的9TL的互补决定区(⑶R)。在一些实施方式中，邻接氨基酸来自9TL的可变区。
[0113]I1.抗体6G及6G衍生抗体及多肽
[0114]本发明另外还提供了治疗眼科疾病的方法，其包含施用与及Ai^43结合的抗体或多肽。在一些实施方式中，抗体或多肽以比其与Αβ卜42 卜43结合更高的亲和性与A β H。结合。在一些实施方式中，抗体与A β !_36> A β !_37> A β !_38及A β !_39结合。在一些实施方式中，抗体与Αβ 22_35结合。在一些实施方式中,抗体与Αβ 28_4(|结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与包括氨基酸25-34及40的Αβ ^上的表位结合。
[0115]本发明还提供了治疗眼科疾病的方法，其包含施用下述医药组合物，此类医药组合物包含本文所述的抗体或多肽中的任一种(例如抗体6G及表8中所示的其变异体或衍生自抗体6G及表8中所示的其变异体的多肽)；或本文所述的多核苷酸。如本文中所用，组合物包含一或多种与A β H。的C末端结合的抗体或多肽(其可为或可不为抗体)和/或一或多种包含编码一或多种与Αβ卜4(|的C末端结合的抗体或多肽的序列的多核苷酸。此类组合物可另外包含合适赋形剂，例如医药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂，其在本领域中是公知的。
[0116]本发明的抗体及多肽特征在于以下特征中的任一种(一种或多种):(a)与
Αβ !-40>Αβ !_42及Αβ !_43结合；(W与Αββ ^42及Αβ ^43结合，其中与Αβ ^40结合的亲
和性高于与Αβ H2 H3结合的亲和性；(C)与包括氨基酸25-34及40的Αβ^Ο上的表位结合；(d)与A β β i_37、A β υ及A β ^39结合，但与其与A β H。的结合相比具有较低未和性；(e)以小于约I μ M的Kd与Aβ 22-37结合；(f)与Αβ 22_35结合；(g)与Αβ 28_4(|结合；(h)并不与表达于细胞中的APP结合；(i)减少个体眼睛中的类淀粉斑；(j)治疗、预防、改善一或多种下述眼科疾病症状，所述眼科疾病包括但不限于年龄相关黄斑退化(干型及湿型)、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括黄斑水肿)及其它相关视网膜退化性疾病；(k)产生视网膜功能的显著保护或恢复；及(I)产生视敏度的显著保持或复原。本发明的抗体及多肽还可具有本文所述的受损的效应器功能。与其它报导过的抗Αβ抗体相比，具有受损的效应器功能的抗体及多肽可展现出想要的安全性。举例而言，本发明的组合物可能不引起显著或不可接受水准的以下各项中的任何一种或多种:脑维管结构中出血(脑出血)；脑膜脑炎(包括变换磁共振扫描)；脑脊髓液中白血球计数升高；中枢神经系统炎症。
[0117]因此，本发明提供以下各物中的任一种，或包含以下各物中的任一种的组合物(包括医药组合物):(a)抗体6G或表8中所示的其变异体；(b)抗体6G或表8中所示的其变异体的片段或区域；(c)抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链；(d)抗体6G或表8中所示的其变异体的重链；(e)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链和/或重链的一或多个可变区；(f)抗体6G或表8中所示的其变异体的一或多个CDR(—、二、三、四、五或六个CDR) ； (g)来自抗体6G的重链的CDR H3 ； (h)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链的CDR L3 ；⑴来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链的三个CDR ； (j)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的重链的三个CDR ； (k)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链的三个CDR及来自抗体6G或表8中所示的其变异体的重链的三个CDR ;及(I)包含(b)至(k)中的任一种的抗体。本发明亦提供包含以上各物中的任何一种或多种的多肽。
[0118]图8中图解性地示出了抗体6G (包括Chothia及Kabat⑶R)的⑶R部分。⑶R区域的测定系是本领域公知的。
[0119]在一些实施方式中，本发明提供了一种下述多肽(其可为或可不为抗体)，其包含基本上与6G或表8中所示的其变异体的至少一个⑶R、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或所有六个CDR —致的至少一个CDR、至少两个、至少三个或至少四个、至少五个或所有六个⑶R。其它一些实施方式包括具有基本上与6G的至少两个、三个、四个、五个或六个⑶R—致或衍生自6G的至少两个、三个、四个、五个或六个⑶R的抗体。在一些实施方式中，该至少一个、二个、三个、四个、五个或六个⑶R与6G或表8中所示的其变异体的至少一个、二个、三个、四个、五个或六个CDR至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%—致。应了解，为达成本发明的目的，尽管活性程度与6G或表8中所示的其变异体相比可改变(可更大或更小)，但结合特异性和/或总体活性一般得以保持。
[0120]本发明还提供了下述多肽(其可为或可不为抗体)，其包含6G或表8中所示的其变异体的氨基酸序列，该氨基酸序列具有以下各物中的任一种:6G或表8中所示的其变异体的序列的至少5个邻接氨基酸、至少8个邻接氨基酸、至少约10个邻接氨基酸、至少约15个邻接氨基酸、至少约20个邻接氨基酸、至少约25个邻接氨基酸、至少约30个邻接氨基酸，其中此类氨基酸 中的至少3者来自6G(图8)或表8中所示的其变异体的可变区。在一种实施方式中，可变区来自6G的轻链。在另一种实施方式中，可变区来自6G的重链。示例性多肽具有来自6G的重链及轻链可变区的邻接氨基酸(上述长度)。在另一种实施方式中，5个(或5个以上)邻接氨基酸来自图8中所示的6G的互补决定区(CDR)。在一些实施方式中，邻接氨基酸来自6G的可变区。
[0121]如下文所述的示例性实施方式，本发明的抗体及多肽的结合亲和性可变化，其不需为(但可为)一个特定值或范围。本发明的抗体及多肽对Αβ肽(包括或Aβ ΗρΑβ卜42或A β卜43肽)的结合亲和性(Kd)可为约0.1OnM至约0.80nM,约0.15nM至约0.75nM及约0.18nM至约0.72nM。在一些实施方式中，结合亲和性为约2pM、约5pM、约ΙΟρΜ、约15pM、约20pM、约40pM或大于约40pM。在一个实施方式中，结合亲和性在约2pM与22pM的间。在其它实施方式中，结合亲和性小于约ΙΟηΜ、约5nM、约InM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约 500pM、约 400pM、约 300pM、约 200pM、约 150pM、约 ΙΟΟρΜ、约 90pM、约 80pM、约 70pM、约60pM、约50pM、约40pM、约30pM、约ΙΟρΜ。在一些实施方式中，结合亲和性为约ΙΟηΜ。在其它实施方式中，结合亲和性小于约ΙΟηΜ、小于约50ηΜ、小于约ΙΟΟηΜ、小于约150nM、小于约200nM、小于约250nM、小于约500nM或小于约1000nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于约5nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于约InM。在其它实施方式中，结合亲和性为约0.1nM或约0.07nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于约0.1nM或小于约0.07nM。在其它实施方式中，结合亲和性为约ΙΟηΜ、约5ηΜ、约InM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约 500pM、约 400pM、约 300pM、约 200pM、约 150pM、约 ΙΟΟρΜ、约 90pM、约 80pM、约 70pM、约 60pM、约 50pM、约 40pM、约 30pM、约 1pM 中的任一种至约 2pM、约 5pM、约 ΙΟρΜ、约 15pM、约20pM或约40pM中的任一种。在一些实施方式中，结合亲和性为约ΙΟηΜ、约5ηΜ、约InM、约 900pM、约 800pM、约 700pM、约 600pM、约 500pM、约 400pM、约 300pM、约 200pM、约 150pM、约ΙΟΟρΜ、约 90pM、约 80pM、约 70pM、约 60pM、约 50pM、约 40pM、约 30pM、约 1pM 中的任一种。在其它实施方式中，结合亲和性为约2pM、约5pM、约ΙΟρΜ、约15pM、约20pM、约40pM或大于约40pM。本发明的抗体或多肽可与或^卜42肽的组合结合。在一个实施方式中，抗体或多肽与至少Αβ卜4(|及Αβ卜42肽结合。
[0122]本发明的抗体及多肽还可与A β卜36、A β !_37> A β卜38、A β卜39、A β ^42及A β ^43中的任何一种或多种结合，但在一些实施方式中，对此类肽中的任何一种或多种的结合亲和性小于其对Αβ 3卜4(|的结合亲和性。在一些实施方式中，抗体或多肽与Αβ卜38、A β卜39、A β !_42及A β H3中的任何一种或多种的Kd为与A β H0的Kd的至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约80倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍或至少约250倍。
[0123]本发明还提供了制造此类抗体或多肽中的任一种的方法。可通过本领域中已知的程序来制造本发明的抗体。可通过抗体的蛋白水解或其它降解、通过如上所述的重组方法(即单一或融合多肽)或通过化学合成来制造多肽。通过化学合成便利地制得抗体的多肽，尤其至多约50个氨基酸的较短多肽。化学合成方法是本领域已知的，并且可商业获得。举例而言，通过采用固 相方法的自动化多肽合成仪可制造抗体。还参见美国专利第5，807，715号;第 4, 816, 567 号;及第 6, 331, 415 号。
[0124]在另一替代方法中，可使用本领域中公知的程序以重组方式制得抗体。在一种实施方式中，多核苷酸包含编码抗体的重链和/或轻链可变区的序列。在另一种实施方式中，将包含核苷酸序列的多核苷酸克隆进一或多个用于表达或繁殖的载体中。可将编码所关注抗体的序列保持于宿主细胞中的载体中，接着将宿主细胞扩展且冷冻，以备后用。本文进一步描述了载体(包括表达载体)及宿主细胞。
[0125]本发明还涵盖本发明的抗体(例如9TL及6G)的单链可变区片段("scFv")。通过使用短连接肽来连接轻链和/或重链可变区，从而制得单链可变区片段。Bird等人(1988)Science242:423_426。连接肽的实例为(GGGGS) 3，其桥接一可变区的羧基末端与另一可变区的胺基末端的间约3.5nm。已设计且使用其它序列的连接子。Bird等人(1988)。连接子可又经修饰以获其它功能，例如药物附接或附接于固体支撑物。可以重组或合成方式制造单链变异体。为合成制造scFv,可使用自动合成仪。为重组制造scFv,可将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入合适宿主细胞中，该宿主细胞可为真核的，例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞；或为原核的，例如大肠杆菌(E.coli)。可通过例如多核苷酸连接反应的常规操作来制得编码所关注的scFv的多核苷酸。可使用本领域中已知的标准蛋白质纯化技术来分离得到的scFv。
[0126]本发明还涵盖其它形式的单链抗体，例如双功能抗体。双功能抗体是二价、双特异性抗体，其中，VH及VL域表达于单一多肽链上，但使用过短而无法使同一链上的两个结构域之间成对的连接子，由此使得所述结构域与另一链的互补结构域成对，且产生两个抗原结合位点(例如参见 Holliger, P.等人(1993)Proc.Natl.Acad Sc1.USA90:6444-6448 ；Poljak, R.J.等人(1994)Structure2:1121-1123)。
[0127]举例而言，可使用本文中所公开的抗体来制备双特异性抗体(对至少两种不同抗原(即具有结合特异性的单克隆抗体)。本领域中已知制造双特异性抗体的方法(例如参加Suresh等人，1986,Methods inEnzymologyl21:210)。传统上，重组制造双特异性抗体系基于两个免疫球蛋白重链-轻链对(其中两个重链具有不同特异性)的共表达(Millstein 及 Cuello, 1983，Nature305, 537-539)。
[0128]根据一种制造双特异性抗体的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选与包含铰链区、CH2及CH3区中的至少部分的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。其优选具有含有轻链缀合所必需的位点(存在于融合中的至少一种中)的第一重链恒定区(CHl)。将编码免疫球蛋白重链融合及(若需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入独立表达载体中且共转染于合适宿主生物体中。在该构建中所使用的三个多肽链的不等比率提供最适产率的实施方式中，此举提供调节三个多肽片段的相互比例的高灵活性。然而，当等比率的至少两个多肽链的表达产生高产率时或当比率不具有特定重要性时，可能在一表达载体中插入两个或所有三个多肽链的编码序列。
[0129]在一种方法中，双特异性抗体包含在一条臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，及在另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。在仅一半双特异性分子中具有免疫球蛋白轻链的此不对称结构促进所需双特异性化合物与非所需免疫球蛋白链组合的分离。在1994年3月3日公开的PCT公开文本第W094/04690号中描述了此方法。
[0130]包含两个共价连接抗体的异源缀合抗体也在本发明的范畴内。此类抗体已用于使免疫系统细胞靶向非所需细胞(美国专利第4，676，980号)，且用于治疗HIV感染(PCT申请公开文本第W09I/00360号及第W092/200373号；EP03089)。可使用任何便利的交联方法来制造异源缀合抗体。合适的交联剂及技术在本领域中是公知的，其被描述于美国专利第4，676，980 号中。
[0131]还可使用合成蛋白质化学的已知方法(包括涉及交联剂的方法)来体外制备嵌合或杂合抗体。举例而言，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚胺基硫醇盐及甲基-4-巯基丁酸酰亚胺酯。
[0132]可使用本领域中已知的任何方法来制造包含抗体9TL的一或多个⑶R或衍生自抗体9TL的一或多个CDR的人化抗体。举例而言，可用四个通用步骤，将单克隆抗体人化。这些步骤为:(1)测定起始抗体轻链及重链可变结构域的核苷酸及预测氨基酸序列，(2)设计人化抗体，即决定在人化过程期间使用何种抗体框架区，(3)实际的人化方法/技术，及(4)人化抗体的转染及表达。例如参见美国专利第4，816，567号；第5，807，715号；第5，866，692号；第 6，331，415 号；第 5，530，101 号；第 5，693，761 号；第 5，693，762 号；第 5，585，089 号；第 6，180，370 号；第 5，225，539 号；第 6，548，640 号。
[0133]在重组人化抗体中，可修饰Fe部分，以避免与Fe Y受体及补体免疫系统相互作用。此类型的修饰由 Cambridge University 的 Department of Pathology 的 Mike Clark 博士设计，且在1999年11月18日公开的W099/58572中描述过制备此类抗体的技术。
[0134]举例而言，若将抗体用于人类的临床试验及治疗，则可将恒定区设计为更类似于人类恒定区以避免免疫应答。例如参见美国专利第5，997，867号及第5，866，692号。
[0135]本发明涵盖对抗体9TL及6G的修饰，包括并不显著影响其特性的功能等同抗体及具有增强或减小活性和/或亲和性的变异体。举例而言，抗体9TL或6G的氨基酸序列可经突变，以获得对靶标Αβ肽具有所需结合亲和性的抗体。多肽修饰为本领域中的常规实践，无需在本文中详细描述。将多肽修饰示例于实例中。经修饰多肽的实例包括具有氨基酸残基保守性取代的多肽、并不显著不利地改变功能活性的一或多个缺失或添加氨基酸或使用化学类似物。
[0136]氨基酸序列插入包括长度范围介于一个残基至含有一百个或更多残基的多肽之间的氨基末端和/或羧基末端融合以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫胺酰基残基的抗体或与表位标签融合的抗体。抗体分子的其它插入变异体包括抗体的N末端或C末端与酶或多肽的融合，其增大抗体的血清半衰期。
[0137]取代变异体具有至少一个在所移除抗体分子中的氨基酸残基及插入其位置中的不同残基。虽然最关注的用于取代性诱变的位点包括高变区，但也涵盖FR改变。表1中在标题"保守性取代"下展示保守性取代。如果此类取代引起生物活性改变，则可引入在表1中被称为"示例性取代"或如下文参考氨基酸分类进一步描述的更实质性变化，并且对产物加以筛选。
[0138]表1:氨基酸取代
[0139]
【权利要求】
1.治疗患有眼科疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的β类淀粉(Αβ)肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体与选自由Αβ卜36、Αβ卜37、Αβ卜38、Αβ!_39>A β η。、A β !_42及A β !_43组成的组的A β肽特异性结合。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体与Αβ卜4(|上的表位特异性结合。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述抗体还与Aβ !_42上的表位特异性结合。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病为年龄相关的黄斑退化。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体以约10nM或更小的Kd与所述Aβ肽结合。
7.如权利要求3所述的方法，其中该抗体以约10nM或更小的Kd与所述Aβ卜4(|肽结合。
8.如权利要求8所述的方法，其中该抗体还以约10nM或更小的Kd与所述Aβ卜42肽结合。
9.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体与所述Aβ肽的C端结合。
10.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体与Aβ !_40上包括氨基酸25-34及40的表位结合。
11.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体以高于其与Aβ卜42及Αβ卜43结合的亲和性与A β H。结合，且其中所述抗体不是抗体2294。
12.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体的Fe区未经N-糖基化或具有相对于天然Fe区而言经改变的N-糖基化模式。
13.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体包含下述重链可变区和下述轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:26中所示的抗体6G重链可变区的三个⑶Rs，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:27中所示的抗体6G轻链可变区的三个⑶Rs。
14.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体包含下述重链可变区和下述轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列。
15.治疗患有年龄相关的黄斑退化的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗体，其中，所述抗体与A β ^40及A β卜42上的表位特异性结合。
【文档编号】A61P27/02GK104027803SQ201410211278
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2008年3月6日 优先权日:2007年3月9日
【发明者】家-扬·林 申请人:礼纳特神经系统科学公司