RNAi抑制CTGF用于治疗眼科疾病的制作方法

专利名称：：RNAi抑制CTGF用于治疗眼科疾病的制作方法RNAi抑制CTGF用于治疗目f^疾病发明领域本发明涉及可抑制眼科疾病中结締组织生长因子(CTGF)表达的干扰性RNA组合物领域。发明背景大多数眼科疾病都与细胞过程有关，这些过程包括细胞增殖、存活、迁移、分化和血管发生。CTGF是这些细胞过程的一种分泌的细胞因子和主J^h体。具体地，已知CTGF主要通过增加胶原蛋白I和纤连蛋白的沉积来增加细胞外基质的产生。CTGF的it^达被认为是硬皮病、纤维增生疾病、痣痕形成等疾病的主要病因因素，这些疾病中存在细胞外基质成分的过度积累.在小梁网(TM)区域的细胞外基质物质的过度积累是很多类型青光眼的标志，这种增加被认为增加了对水性流出物的阻力，从而导致眼内压升高。于2003年11月13日以WO03/092584公布并转让给Alcon公司的Fleenor等人的国际专利申请号PCT/US2003/012521描述在青光眼TM细胞中CTGFmRNA较正常TM细胞中有所增加。因此，可以认为CTGF在小梁网细胞的细胞外基质产生中发挥作用。黄斑变性是负责高精度视觉的中夹视网膜部分(被称作黄斑区)中感光细胞的丧失。黄斑变性与视网膜色素上皮和血管脉络膜之间膜中细胞外基质成分的异常沉积有关。这种碎屑状物质被称作脉络膜小疣。眼底镜检查可以观察到脉络膜小疣。正常眼睛的黄斑区没有脉络膜小疣，而在视网膜周围可能富含脉络膜小疣。如杲黄斑视力没有任何损失而在黄斑区出现软的脉络膜小疣，可以认为是AMD的早期。除了其他一些眼科疾病，脉络膜新血管形成还经常发生在黄斑变性中，并且与脉络膜内皮细胞增殖，细胞外基质的过量产生和纤维血管性视网膜下膜的形成有关。视网膜色素上皮细胞的增殖和血管生成因子的产生似乎实现脉络膜新血管的形成。糖尿病性视网膜病变是一种糖尿病中发生在由毛细血管基底膜增厚和毛细血管周细胞和内皮细胞之间缺乏接触引起的的眼科疾病。周细胞的丧失增加了毛细血管的渗漏，导致血-视网膜屏障的破坏。化膜的细胞增殖有关。视网膜色素上皮细胞的增殖和迁移在这种眼科疾病中很常见。与增殖性玻璃体视网膜病变有关的膜包括细胞外基质成分如I型、n型和iv型胶原蛋白，纤粘蛋白，而且这些膜会变得逐渐纤维化。创伤愈合疾病可以通过激活炎症细胞、释放生长因子和细胞因子、眼细胞的增殖和分化、毛细血管通透性的增加、基Ji膜基质成分的改变、细胞外JJt的沉积增加、纤维化、新血管形成和组织重塑，导致严重的目fUa织损伤。因此，CTGF的it^达被认为是这些目醋疾病的主要病因因素。目前的治疗手段没有直^i"对这些疾病的发病机制。发明概述本发明涉及能够耙向CTGFmRNA并干扰CTGFmRNA表达的千扰RNA。发明的这种干扰RNA可用于治疗CTGF相关的目科疾病如青光眼、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新血管形成、增殖性玻璃体视网膜病变和异常创伤愈合。本发明的一个实施方案是提供了减弱受试者眼中结締组织生长因子表达的方法。该方法包括对受试者的眼施用组合物，该组合物包含有效量的干扰RNA如19-49个核苷酸长度的双链(ds)siRNA或单链(ss)siRNA和可药用的栽体。双链siRNA包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域。此外，在生理条件下，反义序列与对应于SEQIDNO:l(人结締组织生长因子DNA的有义链序列，Genebank参考号为NMJ)01901)的mRNA的一部分杂交，并且具有至少19个核苷酸的与对应于SEQIDNO:1的mRNA杂交部分至少接近完全连续互补的区域。施用这种组合物可以减弱受试者眼中结締组织生长因子mRNA的表达。单链siRNA具有19-49个核苷酸的长度，在生理条件下能与对应于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、691、801、卯l、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的一部分杂交，并且具有能与对应于SEQIDNO:l的mRNA的杂交部分至少接近完全互补的区域。本发明的实施方案中，双链干扰RNA的反义链被设计为靶向对应于SEQIDNO:1的mRNA起始于或包含379、691、801、901、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的核苷酸序列。本发明的另一个实施方案是提供了在需要其的受试者中治疗结締組织生长因子有关的眼科疾病的方法.该方法包括对受试者的眼施用包含有效量的19-49个核苷酸的干扰RNA和可药用载体的组合物，这种干扰RNA包含有义链、反义链和至少19个核苷酸的至少接近完全连续的互补区域。反义序列在生理条件下与对应于SEQIDNO:1的mRNA的一部分杂交，并且具有至少19个核苷酸的能与对应于SEQIDNO:1的mRNA杂交部分至少接近完全连续互补的区域。以此治疗结締组织生长因子有关的眼科疾病。附图简述图1A显示SITOXTM数据，与图IB的数据一起证明小梁网细胞转染效率不是PHit的。以SITOXTM(Dharmacon)转染对照转染GTM3细胞。24小时后用锥虫蓝排除法实验确定SITOX培养物中剩余的活细胞数量，以此反映相对转染效率。空心条形无转染；实心条形用SITOXTM。图IB显示GTM3细胞^LV的siRNA的SIGLO图像，与图1A的数据一起证明转染效率不是限速的。用LIPOFECTAMINE2000TM将SIGLOsiRNA转染至GTM3细胞。24小时后用荧光显微术检测SIGLOsiRNA的^L^(红色不规则形状)'用DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲咮)鉴定单个的细胞核(蓝色圆形区域)，DAPI是双链DNA的染料.如图1A数据和图IB图像所示，几乎所有细胞或死亡(SITOXTM)或发出荧光(SIGLO)。图2A是一个示意图，显示CTGF基因的外显子(方盒)和内含子(线条)结构，以及siRNASl，S2，S3和QPCR引物/^^针组Ql和Q2相对于GenebankCTGF序列NMJ)01卯1的位置，以SEQIDNO:1提供序列NM_001901。在例1中提供了siRNA和引物/探针组的序列。图2B显示用外显子5的引物/探针组Q2对CTGFmRNA进行QPCR扩增。用SI和S4的siRNA，未检测到CTGFmRNA水平的明显下调。图2C显示用跨越外显子4/5的引物/探针组Ql对CTGFmRNA进行QPCR。每种siRNA都能观察到CTGFmRNA的下调，而用S2siRNA观察到~90%的下调。图3显示用不同浓度的S2siRNA检测CTGFmRNA水平下调的滴定研究。用引物/探针组Ql通过QPCR扩增对CTGFmRNA的下调进行估计。如实施例l所述，用O,1,3，10，30和100nMS2siRNA处理GTM3细胞，24小时后可观察到IC邻为2,5nM,发明详述RNA干扰被称作"RNAi，，，是一种以小的单链或双链RNA分子实现降低目的基因的表达的方法.干扰RNA包括双链或单链的小干扰RNA(dssiRNA或sssiRNA)、微型RNA(miRNA)、小发夹RNA(shRNA)等等。不希望被理论束蜂，RNA干扰似乎发生在体内，双链RNA前g切割成长度约为20-25个核苷酸的小RNA。切割是由RNAeIII-RNA解旋酶切丁酶完成的。siRNA的有义链，即有与目的mRNA序列完全相同序列的链被除去，留下与目的mRNA序列互补的"反义链"来降低mRNA的表达。siRNA的反义链似乎引导被称作RISC(RNA诱导沉默复合体)的蛋白复合体到达mRNA，然后RISC的Argonaute蛋白对mRNA进行切割，从而降低该mRNA的蛋白质产生。干扰RNA具有催化活性，亚化学剂量的mRNA相关的干扰RNA就能降低mRNA的表达。mRNA表达的降低也可通过转录和翻译的机制发生。本发明涉;ME眼科疾病中干扰RNA在抑制结締组织生长因子表达的用途。依照本发明，眼的组织，特别是眼的小梁网细胞，进行siRNA沉默，外源提供的siRNA实现沉默。此外本发明的方面已经确定，在使用基于PCR的方法来确定siRNA下调功效时，PCR的扩增引物应该i殳计成包括siRNA靶定序列，以精确测定沉默。除非另外表明，在此引用的核酸序列都以5，到3，方向书写。在此使用的术语"核酸"是指DNA或RNA、或它们的修饰形式，包含DNA中存在的嘌呤或嘧咬4^(腺嘌呤"A"、胞嘧咬"C"、鸟嘌呤"G"和胸腺嘧咬"T"),或RNA中存在的噪呤或嘧咬M(腺噪呤"A"、胞嘧咬"C"、鸟嘌呤"G"和尿嘧啶"U，，)。在此提供的干扰RNA可以包括"T，，威基，特别是在3，末端，虽然在RNA中并不天然存在"T"絲。"核酸"包括术语"絲苷酸"和"多核苷酸，，，可以指单链分子或是双链分子。双链分子是在A和T碱基、C和G威基、A和11>5^之间按Watson-Crick威基配对原则形成的。双链分子的两M之间可以部分、基本上或完全相互互补，并会形成双链体杂交分子，成键的强度依赖于磁基序列的性质和互补程度。已知编码mRNA的DNA的有义链或反义链序列，就能容易地确定mRNA的序列，例如，SEQIDNO:1提供了对应于结締组织生长因子mRNA的DNA有义链序列。由"U，，残基替代了"T，，碱基，mRNA序列与DNA的有义链完全一样。因此，可由SEQIDNO:1得知结締组织生长因子的mRNA序列。结締组织生长因子mRNA:ncbi.nlm.nih.gov的国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnology)的GenBank数据库提供了人类结締组织生长因子的信使RNA对应的DNA序列，参考号为NM—OOl卯l，如下以SEQIDNO:1提供。结締组织生长因子的编码序列为从146到1195位核香酸。SEQIDNO:1:1tccagtgscggsgccgcccggccgacagccccgagscgacagcccggcgcgtcccggtcc61ccacctccgaccaccgccagcgctccaggccccgcgctccccgctcgccgccaccgcgcc121ctccgctccgcccgcagtgccaaccatgaccgccgccagtatgggccccgtccgcgtcgc181cttcgtggtcctcctcgccctctgcagccggc卿ccgtcggccagaactgcagcgggcc241gtgccggtgcccggacgsgccggcgccgcgctgcccggcgggcgtgsgcctcgtgctggs301cggctgcggctgctgccgcgtctgcgccaagcagctgggcg3gctgtgc3ccgagcgcga361cccctgcgscccgcaca3gggcctcttctgtgacttcggctccccggcca3ccgcaag3t421cggcgtgtgcaccgccaaagatggtgctccctgcatcttcggtggtacggtgtaccgcag481cggsgagtccttccag3gcagctgcasgtaccagtgcacgtgcctggacggggcggtggg541ctgcatgcccctgtgcagcatggacgttcgtctgcccagccctgactgcoccttcccgag601g3gggtca3gctgcccggga33tgctgcgaggsgtgggtgtgtg3cg3gcccaaggaccs661aaccgtggttgggcctgccctcgc^gcttaccgactggaagacacgtttggcccagaccc721a3ctatg3ttag3gcca3ctgcctgjgtccsgsccacagsgtggsgcgcctgttcca3g3c781ctgtgggatgggcatctccacccgggttaccaatgacaacgcctcctgcaggctagagaa841gcagagccgcctgtgcatggtcaggccttgcgaagctgacctggaagaga.acattaagaa901gggcaaaaagtgcatccgtactcccaaaatctccaagcctatcaagtttgagctttctgg961ctgcaccagoatgaagacataccgagctaaattctgtggagtatgtaccgacggccgatg1021ctgcaccccccacagaaccaccaccctgccggtggagttcaagtgccctgacggcgaggt1081catgaagaagaacatgatgttcatcaagacctgtgcctgccattacaactgtcccggaga1141caatg3c3tctttgaatcgctgtactacsggaagatgtacggsgacatggcatgaagcca1201gagagtgagagacattaactcattagactggaacttgaactgattcacatctcatttttc1261cgtaaaaatgatttcagtagcacaagttatttaaat卿ttttctaactgggggaaaag1321attcccacccaattcaaaacattgtgccatgtcaaacaaatagtctatcttccccagaca1381ctggtttgaagaatgttaagacttgacagtggaactacattagtacacagcaccagaatg1441tatattaaggtgtggct加ggagcsgtgggagggtaccagcag33aggttagtatcatc1501agstagctettatacgagtastatgcctgctatttg33gtgt33ttg3g33gg朋a3ttt1561tagcgtgctc3ctg3cctgcctgtagcccc3gtg3c3gctsggatgtgcattctccagcc16213tca3gag3ctg3gtcaagttgttccttaagtcagaacagcagactcagctotgacattc1681tgattcgastgacactgttcaggaatcgga3tcctgtcgatt3g3ctggacagcttgtgg1741caagtgaatttcctgtaacsagccsgattttttaaaattt3tattgt3aatattgtgtgt1801gtgtgtgtgtgtgtstatatatatatatatgtacagttatctaagtt33tttaaagttgt1861ttgtgcctttttatttttgtttttaatgctUgatatttcaatgttagcctcaatttctg1921ascaccataggtagastgtaaagcttgtctg3tcgttcaa3gcatga抑t。gstacttat19813tgg33attctctcagstag33tg3cagtccgtcasaacagattgtttgc3aagggg3gg2041catcagtgtccttggcaggctgatttctaggtaggaaatgtggtagctcacgctcacttt2101taatgaacaaatggcctttattasaaactgagtgactctatatagctgatcag微tc2161acctggaagcatttgtttctactttgatatgactgt加cggacagttta卿tgag2221agtgtgaccaaaagttacatgtttgcacctttctagttgaaaataaagtata訓ct228133a3333333a的33cgac3gcsscggasttc.上述CTGFmRNA序列的等同物是它的备选剪切形式、等位基因形式或同源物。同源物是与SEQIDNO:1同源的来自另一哺乳动物物种的结締组织生长因子mRNA。与SEQIDNO:1相关的CTGF核^列是GeneBank检索号AK092280,AK125220，AY395801，AY550024，BT019794,BT019795,CR541759,M92934,U14750和X78947的序列，和U.S.5,585,270的SEQIDNO:1，在此引用作为参考。mRNA表达的减弱在此使用的短语"mRNA表达的减弱"是指相对于具有乱序的对照RNA，在细胞内施以一定量的干扰RNA使细胞中乾基因的全长mRNA转录物水平降低，从而mRNA翻译产生的蛋白质减少。mRNA表达的降低通常称作mRNA"下调"(knock-down)。此处的实施方案预计可以使表达量的下调在50%到100%之间，包括50%和100%。然而，本发明的目的并不必须要达到这种下调水平。而且，两组干扰RNA单独施用时对下调的影响是4艮微小的，但同时施用可以显著更有效。在一个实施方案中，单个的dssiRNA有效下调，下调量至少高达70%。在另一个实施方案中，两个或更多的dssiRNA—起有效下调，下调量至少高达70%。下调的检测通常是用定量聚合SI^式反应(QPCR)扩增测量mRNA水平，或用蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定(ELISA)测量蛋白质水平。分析蛋白质水平提供了对RNA诱导的沉默复合体(RISC)降解mRNA和翻译抑制的估测。检测下调的其它技术包括RNA溶液杂交、核酸酴床护、Northern杂交、反转录、用微阵列进行基因表达监测、抗体结合、放射免疫测定和荧光活化细胞分析。还有一种检测方法是过表达能诱导CTGF的回加入CTGFsiRNA，然后用上述任一方法检测CTGFmRNA/蛋白质的下调。通it^察人类或哺乳动物中眼科疾病的好转，也可以得到CTGF^L抑制的结论。例如，在老年性黄斑变性中，视觉丧失的减緩或逆转显示CTGF被抑制，青光眼病人中CTGFmRNA的沉默导致眼内压下降，延緩或阻止进行性青光眼受试者的症状的发作。发明实施方案的千扰RNA以催化方式进行，即，干扰RNA能够以亚化学剂量实现目的mRNA的抑制。与反义疗法相比，发挥治疗效果需要的干扰RNA明显更少。双链干扰RNA:在此使用的双链干扰RNA(也被称作dssiRNA)有有义核苷酸序列和反义核苷酸序列，有义和反义核酸序列包含由至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域。干扰RNA的长度包括19至49个核苷酸，可以包含19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸的长度。dssiRNA的反义链在生理条件下可与对应于SEQIDNO:1的mRNA的一部分杂交，具有至少19个核苷酸的能与对应于SEQIDNO:1的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补的区域。siRNA的反义链是siRNA的活性引导剂，因为反义链结合到细胞内的RISC复合体上，引导结合复合体特异地结合到mRNA的与反义RNA的序列互补的序列上，从而使结合复合体对mRNA的切割得以发生。选择siRNA的把序列"技术由Tuschl，T.etal，"ThesiRNAUserguide"提供，2004年5月6日^i丁，可从RockefellerUniversity网站获得，或通it^Ambion公司的网站的Technicalbulletin#506，"siRNADesignGuideHnes"，获得，使用搜索参数"最小35%,最大55%G/C含量，，从Invitrogen乂>司网站获得，和通过Dharmacon7>司网站获得。目的序列可以定位在编码区或mRNA的5，或3，非翻译区。在一个实施方案中，CTGF的DNA粑序列在SEQIDNO:1的1488到1506位核苷酸5，-ggttagtatcatcagatag-3，SEQIDNO:18.nt1488。本发明中靶向SEQIDNO:18的相应mRNA序列并在每条链上各有一个3，UU突出端的的双链siRNA是5'-gguu3guaucauc3gau3gUU-3，SEQIDNO:253'画UUccaaucauaguagucuauc-5，SEQIDNO:26.。3，突出端可以有许多"U，，残基，例如，在2，3，4,5和6之间并且包括2，3，4，5和6个的"U，，残基数目。5，末端同样有核苷酸的5，突出端。本发明的靶向SEQIDNO:18的相应mRNA序列并在每条链上各有一个3，TT突出端的的双链siRNA是5，-gguuagu3iicauc3g3U3gTT-3'SEQIDNO:273'-TTccaaucauaguagucuauc-5，SEQIDNO:28.双链siRNA的两^^可以通过发夹环连起来形成如下的单链siRNA:5'-gguuaguaucaucag3uagUUNNN\N3'-UUccaaucauaguagucuaucNNNNN/SEQIDNO:29.N是核苷酸A、T、C、G、U、或本领域技术人员已知的修饰形式。核苷酸N的数量在3-23、或5-15、或7-13、或4-9、或9-ll之间，并且包括3、23、5、15、7、13、4、9或9、11个，或核苷酸N的数量是9个。表1列举了SEQIDNO:1的CTGFDNA目的序列的实例，本发明中这些siRNA是按如上所阐明方式从SEQIDNO:l设计的。表1siRNA的CTGF把序列<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如上实例所引用的，M域技术人员能够利用表1所提供的乾序列信息，参考SEQIDNO:1中的序列位置，并加入或者缺失与SEQIDNO:1互补或接近互补的核苷酸，设计出比表l中提供的序列更长或更短的干扰RNA。由ds或sssiRNA指导的对靶RNA的切割反应具有高度的特异性。通常，含有与靶mRNA的部分相同的有义核苷酸序列和与有义链完全互补的反义部分的siRNA是抑制CTGFmRNA的实施方案。然而，在本发明的具体实践中并不要求siRNA的反义链与靶mRNA有100%的序列互补性。因此，本发明考虑到了可以由遗传突变、菌林多态性或进化分歧而产生的序列变异。例如，相对于把序列有插入、缺失或单点突变的siRNA序列都是有抑制效果的。siRNA的反义序列具有至少19个核苷酸与mRNA把序列接近完全连续互补。在此使用的"接近完全"是指siRNA的反义序列与把mRNA的至少一部分"基本上互补"，siRNA的有义序列与粑mRNA至少一部分"W上同一"。本领域技术人员已知的"同一性"是指通过匹配序列之间的核普酸顺序所确定的核苷酸序列之间的序列相关程度。在一个实施方案中，与靶mRNA序列具有80%和80%到100%互补性的反义RNA被认为具有接近完全的互补性，并且可以在本发明中使用."完全"连续互补性是指相邻碱基对的标准的Watson-Crick威基配对。"至少接近完全"连续互补包括在此使用的"完全"互补。设计用于确定同一性或互补性的计算机方法来提供核酸序列的最大程度的匹配，如BLASTP和BLASTN(Altschul，S.F.，etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)，以及FASTA。SEQIDNO:1的乾序列可以在mRNA的5，或3，非翻译区和mRNA的编码区中。双链干扰RNA的一条或两^:可以具有1到6个核苷酸的3，突出端，这些核苷酸可以是核糖核苷酸，或脱氧核糖核苷酸，或其混合物。突出端的核苷酸不是威基配对的。在本发明的一个实施方案中，干扰dsRNA包含TT或UU的3，突出端。双链siRNA的有义链和反义链可以为如上所述的由两条单链组成的双链体形式，或可以是单个分子，其中互补区域碱基配对并通过发夹或环共价连接形成单链。认为发夹在细胞内被称作切丁酶的蛋白质切割，以形成由两个单个的威基配对的RNA分子组成的干扰RNA。干扰RNA可以因一个或多个核苷酸的添加、缺失、替换或修饰而有别于天然存在的RNA。非核苷酸物质可以结合到干扰RNA的5，端、3，端，或内部。设计这种修饰通常是为了增加干扰RNA对核酸酶的抗性，增强细胞的摄入，增强细胞乾向，有助追踪干扰RNA，或进一步增加稳定性。例如，干扰RNA可以在突出端包含嘌呤核苷酸。例如，通过吡咯烷将胆固醇连接到siRNA分子的有义链的3，末端，也能使siRNA稳定。其他的修饰包括例如3，端生物素分子、已知具有细胞穿透性质的肽、毫微粒、拟肽、荧光染料，或树状聚体。核苷酸可以在分子的^部分上、糖部分上或磷酸部分上修饰并^本发明的实施方案中发挥作用。修饰包括如用烷基、烷氧基、氨基、脱氮杂、囟、羟基、硫幾基或其组合取代。核苷酸可以3皮有更高稳定性的类似物所置换，如用2，脱氣-T置换U,或具有糖修饰，如用2，#^或2，甲基、2，甲緣乙基，或2，-0，4，-C亚曱基桥取代2，羟基。核苷酸的嘌呤或嘧啶类似物的实例包括黄噪呤、次黄噪呤、氮杂噪呤、甲减基腺噪呤、7-脱氮杂-腺苷、O-和N-修饰的核苷酸。核苷酸的磷酸基团可以用氮或硫(硫代鳞酸)取代磷睃基团上的一个或多个氧进行^务饰，在反义siRNA上可以有与对应于SEQIDNO:1的mRNA的一部分不互补的区域。不互补区域可以在互补区域的3，端、5，端、或两端。千扰RNA可以由合成产生，如体外转录、siRNA表达栽体、或PCR表达盒，作为转染siRNA良好发挥功能的干扰RNA也作为体内表达的siRNA良好发挥功能。干扰RNA能够利用受保护的核糖核苷亚磷跣胺和常规DNA/RNA合成仪进行化学合成，也可从商业供应商如AmbionInc.(Austin,Texas)、Invitrogen(Carlsbad,CA)或Dharmacon(Lafayette，Colo"USA)处H得。干扰RNA能用如溶剂提取或树脂，沉淀，电泳，层析，或这些方法的组合进行纯化。备选地，可以使用几乎不经纯化的干扰RNA，以避免样品处理过程中的损失。干扰RNA可以从重组质粒表达提供给受试者，这些质粒利用组成型或诱导型启动子如U6或HIRNApolIII启动子、巨细胞病毒启动子、SP6、T3或T7启动子，这些都是本领域技术人员已知的。例如，Invivogen(SanDiego，CA)的psiRNATM允许在细胞内从RNApolIII启动子产生siRNA。用重组质粒表达的干扰RNA可以用标准技术分离。表达干扰RNA的病毒栽体可来自腺病毒、腺伴随病毒、牛痘病毒、逆转录病毒(例如慢病毒、棒状病毒、鼠白血病病毒)、疱渗病毒等等，使用上述启动子，如用于质粒的启动子。病毒栽体的选择、栽体表达干扰RNA的方法、递送病毒栽体的方法都在本领域技术人员能力之内。干扰RNA的表达也可通过使用SILENCEREXPRESSTM(Ambion，Austin,Texas)通it^达盒(SECs)提供，该表达盒具有由PCR产生的人HI、人U6或小鼠U6启动子。沉默表达盒是包含启动子和发夹siRNA模板侧翼终止序列的PCR产物。发夹siRNA转染进细胞后，从PCR产物表达，并诱导特异的沉默。生理条件下的杂交"杂交"是这样的技术，其中允许单链核酸(DNA或RNA)相互作用，从而那些有互补或接近互补的^序列的核酸形成称作杂合物的以氩鍵连接的复^。杂U应是灵敏的，并具有选择性，当鉴定样品中以低浓度存在时的特定目的序列.杂交的特异性(如严格性)是由体外预杂交和杂交液中的盐或甲耽胺的浓度，和杂交温度控制的，并且是本领域中已知的。具体地，通过降低盐浓度、提高甲跣胺的浓度，或升高杂交温度，可以提高严格性.例如，高严格逸务泮可以在37'C到42t:,约50%的甲跣胺下发生，低严格性条件可以在约30'C到35'C,约35%到25%的甲酰胺下发生，在Sambrook,J,，1989，分子克隆:实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约上提供了杂交严格条件的实例。严格杂交条件的另外的实例包括400mMNaCl，40mMPIPESPH6.4,lmMEDTA，50。C或70。C12-16小时，然后洗涤，或在1XSSC中70。C杂交或1XSSC，50%甲酰胺中50'C杂交，然后0.3XSSC中7(TC洗涤，或在4XSSC中70'C杂交或4XSSC，50%甲酰胺中50。C杂交，然后1XSSC中67。C洗涤。杂交的温度比杂合物的解链温度(Tm)低约5到10°C，当杂合物的长度在19到49个4对之间时，用下面的公式计算解链温度Tm。C-81,5+16.6(logn)Na+l)+0.41(。/oG+CH600/N),其中N是杂合物的>5^数，[Na+是杂交緩冲液中钠离子的浓度。本发明的实施方案中，在体外高度严旨ft下能与CTGFmRNA杂交的干扰RNA的反义链在体内生理条件下也能特异性结合。在高度严^件下不与核酸杂交的相关核酸的鉴定或分离在降低的严格性条件下进行。单链干扰RNA:如上所引，干扰RNA最终以单链形式发挥作用。发现sssiRNA实现mRNA的沉默，虽然比双链RNA效率要低。因此，本发明的实施方案也提供了sssiRNA的施用，其中单链siRNA在生理条件下可与对应于SEQIDNO:1的mRNA的一部分杂交，具有能与对应于SEQIDNO:1的mRNA的杂交部分的至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域。单链siRNA的长度为关于如上所引双链siRNA的19-49个核苷酸。单链siRNA具有5，磷酸或在原位或在体内在5，位磷酸化。术语"5，砩酸化，，用于描述如具有通过酯键连接5，糖的C5羟基的磷酸基团的多核苷酸或寡核苷酸(如，5，核糖或脱氧核糖，或它们的类似物)。单链siRNA可以有单-,双-，或三-个磷酸基团。单链siRNA可通过化学合成，或如双链siRNA通过栽体产生'5，磷酸基团可以经激酶加入，或5，磷酸可以是核酸酶对RNA的切割产生.递送如双链siRNA那样进行.在一个实施方案中，施用具有受保护的末端和核酸酶抗性修饰的单链siRNA用于沉默。单链siRNA可以干燥保存或溶于水溶液中。为保持稳定，溶液可含有緩冲剂或盐，以抑制退火或用于稳定。发夹干扰RNA:发夹干扰RNA是单链的，在一a内既有有义链和反义链。为了通过DNA载体表达，对应于有义siRNA序列的至少19个核苷酸的相应DNA寡核香酸通过短的间隔区连接到它的反向互补反义序列上。如果所选的表达载体需要，可以增加3，末端T，，以及形成限制性位点的核苷酸。所产生的RNA转录物自身折叠形成茎-环结构。施用方式干扰RNA可通过眼组织注射直接递送到眼，如眼周、结膜、sub-Tenons、前房内、玻璃体内、视网膜下、目鋒后的、或小管内注射；或利用导管或其它放置装置直接应用于眼，所述装置如视网膜丸剂、眼内插入物、栓剂，或包含多孔的、非多孔的或^状物质的;tiA物；通过在局部眼滴剂或软骨剂；或通过盲管中的緩释装置，或通过tiLA临近巩膜(经巩膜)或眼内的緩释装置来递送。眼内注射可以通过角膜到达前房，使得药剂到达小梁网。小管内注射可以1静脉收集通道，排空施莱姆管或i^施莱姆管。受试者需要眼科疾病治疗或有发生眼科疾病危险的受试者是指有与情况危险的人或其他哺乳动物。这些眼科疾病可以包括例如青光眼、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新血管形成、增殖性玻璃体视网膜病变和创伤愈合，和有疤痕过度产生、内皮细胞增殖、纤维增殖的状况。与这些疾病相关的眼结构可以包括例如视网膜，脉络膜，晶状体，角膜，小梁网，视杆，视锥，神经节，黄斑，虹膜，巩膜，眼房，玻璃体腔，睫状体，^1#经盘，视盘，或视网膜中凹。制剂和剂量药物包含按重量计高达99n/。的本发明的干扰RNA或其盐，其与生理学可接受的眼科栽体媒介如水，緩冲剂、盐水、甘氨酸、透明质酸、甘露醇等等混合在一起.本发明中干扰RNA以溶液剂、混悬剂或乳剂施用。以下是在本发明体现的可能的制剂的实例.<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>一般说来，本发明实施方案中干扰RNA的有效量包含眼部或近眼部从200pM到100nM，或从lnM到50nM，或从5nM到约25nM的细胞间浓度。根据熟练临床医生的常规判断，每天一到四次递送局部组合物到眼表面。制剂的PH值是约pH4-9，或pH4.5到pH7.4。虽然精确的方案交由临床医生去判断，干扰RNA可以每天一到四次在每只眼中滴一滴或由临床医生指导。制剂的有效量依赖于如受试者的年龄，种族，性别等因素，或眼科疾病的严重程度。在一个实施方案中，干扰RNA以治疗剂量局部递送到眼，到达小梁网，视网膜或视神经头，从而改善CTGF相关的疾病进程。可接受的载体眼科可接受栽体是指那些至多、几乎不或不导致眼刺激的那些载体，其如需要可拔J^适的防腐作用，并以均匀的剂量递送本发明的一种或多种干扰RNA。用于施用本发明实施方案的干扰RNA的可接受栽体包括MinisTransIT-TKOsiRNA转染试剂(MinisCorporation,Madison,Wisconsin)、LIPOFECTIN、lipofectamine、OLIGOFECTAMINE(Invitrogen，Carlsbad,CA)、CELLFECTIN、DHARMAFECTTM(Dharmacon，Chicago,IL)或聚阳离子如^Jl氨酸、脂质体或脂溶物质如胆固醇。脂质体是由标准的囊泡形成脂质和固醇类如胆固醇所形成的，可以包括把分子，如与内皮细lfe^面抗原有结合亲和力的单克隆抗体。另外，脂质体可以是聚乙二醇化的脂质体。对于眼科递送，干扰RNA可以与B^可接受的防腐剂、共溶剂、表面活性剂、增稠剂、渗透促进剂、緩冲剂、氯化钠、或水形成一种水性的无菌眼科混悬剂或溶液剂。目M"溶液制剂可以通过将抑制剂溶解在生理学可接受的等渗水性緩冲液中制备.另外，眼科溶液剂可以包括眼科可接受的表面活性剂以促进抑制剂的溶解。在本发明的组合物中可以加入粘性助剂(buildingagents),如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等，以提高化合物的滞留。为了制备无菌的眼科软骨制剂，干扰RNA在适当的载体如矿物油、液体羊毛脂或白矿脂中和防腐剂组合在一起。无菌眼科劍欧制剂可以根据本领域其他眼科制剂的方法，将干扰RNA悬浮在从如CARBOPOL-940(BFGoodrich，Charlotte,NC)等的组合制备的亲水基质中制备。如VISCOAT(AlconLaboratories,Inc"FortWorth,TX)可以用于眼内注射。当干扰RNA在眼中的渗透力不够时，本发明的其他组合物可以含有渗透促进剂如crem印hor和TWEEN⑧80(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯，SigmaAldrich，St丄ouis，MO)。试剂盒本发明的实施方案提供了包括用于减弱细胞中CTGFmRNA表达的试剂的试剂盒。该试剂盒含有DNA模板，它有两种不同的启动子如T7启动子，T3启动子或SP6启动子，每个都能有效连接编码对应于干扰RNA的两条互补单链RNA的核苷酸序列。RNA从DNA模板转录出来，退火形成双链RNA,其有效减弱乾mRNA的表达。该试剂盒任选含有用于从DNA模板扩增DNA序列的扩增引物，和用于合成RNA的核苷三磷酸(如ATP,GTP，CTP和UTP)。任选地，试剂盒含有两种RNA聚合酶，每个都能和DNA模板上的启动子结合，和实现启动子有效连接的核苷酸序列的转录，用于纯化单链RNA的纯化柱，如大小排阻层析柱，一种或多种緩冲液，如使单链RNA退火以产生双链RNA的緩冲液，和用于纯化双链RNA的RNA酶A或RNA酶T。实施例1用于沉默小梁网细胞中CTGF的干扰RNA及检测沉默的标准本发明检测了在人小梁网(TM)细胞中，CTGF干扰RNA对内源性CTGF表达水平的下调能力.本发明也提供了在使用QPCR引物测量时，测定干扰RNA对mRNA水平功效的标准.以l:l(w/v)的比例，用CTGF干扰RNA的标准体外浓度(100nM)和LIPOFECTAMINE2000(Invitrogen，Carlsbad,California),转染名为GTM3或HTM-3(参见Pang,I.H.etal.，1994，Curr.EyeRes.13:51-63)的转化的人TM细胞系。使用商业设计的未知序列干扰RNA库(siGENOMESMARTPOOL⑧CTGF干扰RNA(在此称作siRNAS4)，Dharmacon，Lafayette,Colorado)来耙定CTGF。乱序和核纤层蛋白A/CsiRNA(Dharmacon)用作对照。对照实验结果是，与乱序干扰RNA对照比较，用核纤层蛋白A/C干扰RNA下调核纤层蛋白A/C的效率接近卯。/。。最初的研究表明，使用siGENOMESMARTPOOL⑧CTGFsiRNAM國012633-00画0020(siRNAS4)时，用针对外显子5中的CTGFmRNA3，UTR的引物/探针组Q2，CTGF的下调效率约20%到30%。Q2是来自ABI(AppliedBiosystemsFosterCity，CA)的QRCRTAQMAN⑧引物/探针组，为了确定CTGFsiRNA效率低下的原因，测量了几个变量。测试CTGF干扰RNA的剂量反应以确定是否使用了次最优的干扰RNA浓度或次最优的干扰RNA:脂质比例。得到的数据表明低的CTGFmRNA下调与所使用的干扰RNA浓度或干扰RNA:脂质比例无关。考虑到细胞摄入对siRNA活性的重要性和转染TM细胞的固有困难，在上述条件下测量了TM细胞的转染效率。由SITOXTM(Dharmacon)递送到细M诱导的细胞死亡或用SIGLOTM(Dharmacon)检测细胞质荧光测量的细胞荧光来反映细胞的转染效率.在两种情形下，几乎所有细胞不是死亡(图1A;s汀oxTM)就是发荧光的(图ib;siglo),表明转染效率几乎是定量的，并JLfc这个过程中不是fflil步骤.更进一步地，结合两个不同的称作Q2和Q1(ABI，Applied股osystemsFosterCity,CA)的QPCRTAQMAN⑧引物/探针组，检测了AmbionInc.(Austin，Texas)的另外三种称作siRNASl、S2和S3的单独的CTGFsiRNA序列。AmbionsiRNA的把序列如下，对于CTGF的核苷酸(nts)使用GenBank参考号NM一001卯1中Sl的把标(nts379-397):gggcctcttctgtgacttcSEQIDNO:2S2的乾标(nts901-919):gggcaaaaagtgcatccgtSEQIDNO:5S3的把标(ntsl488國1506):ggttagtatcatcagatagSEQIDNO:18上面每条乾序列的每M上都有3，TT突出端的双链siRNA为siRNASI:5'-gggccucuucugugacuucTT-33'-Ttcccggagaagacacug3ag-5'SEQIDNO:30SEQIDNO:31siRNAS2:5，-gggcaaaaagugc3uccguTT-3'3'-TTcccguuuuuc3cguaggca-5'siRNAS3:SEQIDNO:32SEQIDNO:335'-gguuagu3UC3ucagauagTT-33'-TTccaaucauaguagucuauc-5'SEQIDNO:28SEQ，DNO:27QPCRQl引物是ABIASSAYONDEMANDTM的专有序列hs00170014一ml(AppliedbioSystems)。QPCRQ2正向引物具有序列5，画CAGCTCTGACATTCTGATTCGAA-3，SEQIDNO:34Q2反向引物具有序列5，-TGCCACAAGCTGTCCAGTCT-3，SEQIDNO:35Q2探针具有序列5，-AATCGACAGGATTCCGATTCCTGAACAGTG-3，SEQIDNO:36并且在5，末端有FAM基团(6l基荧光素)，在3，末端有TAMRA基团(AppliedbioSystems)。图2A中显示了引物/探针组相对于各个siRNA的siRNA把位点的位置。图2A示意图也显示了CTGF基因外显子(盒)和内含子(线)的结构，和siRNASI、S2、S3和QPCR引物/探针组Ql和Q2对应于GenBankCTGF序列NMJ)Ol卯l(以SEQIDNO:l换一供)的位置.图2B显示用外显子5引物/^4{"组Q2和siRNASl-S4进行CTGFmRNA的QPCR扩增，当使用SI和S4siRNA时，Q2引物/探针组没有检测到CTGFmRNA水平的显著下调.证明通过siRNAS2和S3的下调。相对于SIsiRNA的靶标，引物/探针组Q2更接近于S2和S3siRNA的靶标。图2C显示用跨越外显子4/5的引物/探针组Ql进行CTGFmRNA的QPCR扩增。证明每个siRNA都能使CTGFmRNA下调，用Ql引物/探针组检测时，用S2siRNA观察到约卯。/o的下调。引物/^^针组Ql在证明siRNA下调时似乎比Q2引物/^4f组更有效。图2B和图2C的数据表明用针对3，-UTR的引物/探针组Q2扩增的特定区域可以相对稳定，因此估测CTGFmRNA被把定siRNA切割和降解的选择较少。因此，在QPCR的扩增区域位于siRNA靶定区域以外的特定情况下，siRNA的功效可能被低估了。为了降低非特异性脱耙效应，测量了抑制CTGFmRNA表达的最低可以s股NA浓度。用引物/探针组Ql通过QPCR估测CTGFmRNA的下调。图3显示GTM3细胞中CTGFS2siRNA的剂量反应。用0、1、3、10、30和100nM剂量范围的S2siRNA处理GTM3细胞24小时后，观察到IC50为2,5nM。数据用GraphPadPrism4软件(GraphPadSoftware，Inc.,sanDiego，CA)，使用可变斜率、S形剂量反应算法、最大约束100%进行拟合。这个实施例的结果证明i)小梁网细胞进行siRNA沉默，ii)在此引用的所有siRNA都实现一定程度的沉默，和iii)当使用基于PCR的方法确定siRNA下调功效时，PCR扩增引物设计成包括siRNA耙序列以使沉默检测最优化，已经表明RISC内切核酸酶对牝mRNA的切割发生在靠近siRNA靶序列中心(Elbashir，S.M.，etal.，2001,GenesDev15:188-200)并且由ArgonauteRNA酶H活性完成(Liu，J.，etalScience305:1437-1441)。然而，似乎不能保证剩余mRNA的彻底降解。Argonaute切割后剩下稳定的mRNA片段，用QPCR扩增这些片段任一种，都可以低估在此显示的siRNA功效。本发明提供了一个实施方案，其中QPCR引物组包括siRNA乾序列，以保证最佳的siRNA效率读出。在此所引的参考文献，在能对在此阐述过的提供示范性步骤或其他细节的补充的程度上，都特别引入作为参考。根据^^开，本领域技术人员将会理解，可以对本文公开的实施方案进行明显的修改而不偏离本发明的精神和范围。根据^/>开，可以进行和实施根据本公开的所有实施方案而不用过度实验。在;*^>开和其等同实施方案中给出了本发明的完整范围。本说明书不应被解释为不当地缩小本发明应有的完蒼床护范围。除非另外i兌明，在此使用的术语"一个，，是指"一个"，"至少一个，，或"一个或多个"。权利要求1.减弱受试者眼中结缔组织生长因子mRNA的表达的方法，其包括对受试者的眼施用包含有效量的长度为19到49个核苷酸的干扰RNA和可药用载体的组合物，该干扰RNA包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列，和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域；其中反义序列在生理条件下与对应于SEQIDNO1的mRNA的一部分杂交，并且具有至少19个核苷酸的与对应于SEQIDNO1的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补的区域，其中结缔组织生长因子mRNA的表达被减弱。2.权利要求l的方法，其中受试者具有结締组织生长因子相关的眼科疾病。3.权利要求l的方法，其中受试者处于患结締组织生长因子相关的眼科疾病的危险中。4.权利要求2的方法，其中结締組织生长因子相关的眼科疾病是青光眼、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新血管形成、增殖性玻璃体视网膜病变或创伤愈合。5.权利要求l的方法，其中反义序列具有与对应于SEQIDNO:1的mRNA杂交部分至少接近完全连续互补的至少21到23个核苷酸的区域，并包含有义和反义序列的每条序列的3，末端的额外的TT序列。6.权利要求l的方法，其中有义核苷酸序列和反义核苷酸序列通过环状核苷M列连接。7.权利要求l的方法，其中通过局部、玻璃体内或经巩膜途径施用所述组合物。8.权利要求1的方法，其中反义序列设计成靶定对应于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、691、801、901、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的核苷酸序列。9.权利要求1的方法，其中反:JUf列设计成靶定对应于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、901或1488位核普酸的核苷酸序列。10.权利要求1的方法，其中反义序列设计成靶定对应于SEQIDNO:1的mRNA的包含379、691、801、901、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的核苷酸序列。11.权利要求1的方法，其中反义序列设计成靶定对应于SEQIDNO:l的mRNA的包含379、卯l或1488位核苷酸的核苷酸序列。12.权利要求l的方法，其中反义序列包含3，-TTcccguuuuucacguaggca-5，SEQIDNO:33。13.权利要求l的方法，其中反5L^列包含3，-TTcccggagaagacacugaag-5，SE(JIDNO:31。14.权利要求l的方法，其中反5Uf列包含3，-TTccaaucauagimgucuauc-5，SEQIDNO:28。15.权利要求l的方法，其中干扰RNA包含5，-gggccucuucugugacuucTT-3'SEQIDNO:30和3，-TTcccggagaagacacugaag-5，SEQIDNO:31。16.权利要求l的方法，其中干扰RNA包含5，-gggcaaaaagugcauccguTT-3，SEQIDNO:32和3，-TTcccguuuuucacguaggca-5，SEQIDNO:33。17.权利要求l的方法，其中干扰RNA包含5'國gguuaguaucaucagauagTT國3'SEQIDNO:27和3,-TTccaaucauaguagucuauc誦5，SEQIDNO:28。18.权利要求1的方法，其还包括对受试者的眼施用另一种干扰RNA，其长度为19到49个核苷酸，并且包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列，和至少19个核苷酸的至少接近完全互补的区域；其中该另一种干扰RNA的反义序列在生理条件下与对应于SEQIDNO:1的mRNA的另一部分杂交，并且该反义序列具有与对应于SEQIDNO:1的mRNA的另一杂交部分至少接近完全连续互补的至少19个核苷酸的区域。19.减弱受试者眼中结締组织生长因子mRNA表达的方法，其包括对受试者的目Mfe用包含有效量的长度为19到49个核苷酸的单链干扰RNA和可药用载体的组合物；其中该单链干扰RNA在生理条件下与对应于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、691、801、卯l、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的一部分杂交，并且该干扰RNA具有与对应于SEQIDNO:1的mRNA的杂交部分至少接近完全互补的区域，其中结締组织生长因子mRNA的表达被减弱。20.组合物在生产治疗需要其的受试者的结締组织生长因子相关的目|1#疾病的药物中的用途，该组合物包含有效量的长度为19到49个核苷酸的千扰RNA和可药用栽体，该千扰RNA包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列，和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域；其中反5C^列在生理^Hf下与对应于SEQEDNO:1的mRNA的一部分杂交，并且具有至少19个核苷酸的与对应于SEQIDNO:1的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补的区域。21.权利要求20的用途，其中结締组织生长因子相关的眼科疾病是青光眼、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新血管形成、增殖性玻璃,网膜病变或异常的创伤愈合。22.权利要求20的用途，其中反义序列具有与对应于SEQIDNO:1的mRNA杂交部分至少接近完全连续互补的至少21到23个核苷酸的区域，并包含有义和反义序列的每条序列的3，末端的额外的TT序列。23.权利要求20的用途，其中有义核苷酸序列和反义核苷酸序列通过环状核苷酸序列连接。24.权利要求20的用途，其中通过局部、玻璃体内或经巩膜途径施用所述组合物。25.权利要求20的用途，其中反义序列设计成耙定对应于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、691、801、卯l、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的核苷酸序列。26.权利要求20的用途，其中反义序列设计成靶定对应于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、卯l或1488位核苦酸的核苷酸序列。27.权利要求20的用途，其中反义序列设计成靶定对应于SEQIDNO:1的mRNA的包含379、691、801、901、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的核苷酸序列。28.权利要求20的用途，其中反^列设计成靶定对应于SEQIDNO:l的mRNA的包含379、卯l或1488位核苷酸的核苷酸序列。29.权利要求20的用途，其中反5C^列包含3，画TTcccguuuuucacguaggca-5，SEQIDNO:33。30.权利要求20的用途，其中反义序列包含3，画TTcccggagaagacacugaag-5，SEQIDNO:31。31.权利要求20的用途，其中反义序列包含3，-TTcccguagucuauc-5"SEQIDNO:28。32.权利要求20的用途，其中干扰RNA包含5'誦gggccucuucugugacuucTT誦3'SEQIDNO:30和3，-TTcccggagaagacacugaag誦5，SEQIDNO:31。33.权利要求20的用途，其中干扰RNA包含5'-gggcaaaaagugcauccguTT-3，SEQIDNO:32和3，-TTcccguuuuucacguaggca-5，SEQIDNO:33。34.权利要求20的用途，其中干扰RNA包含5，-gguuaguaucaucagauagTT-3，SEQIDNO:27和3，-TTccaaucauaguagucuauc-5，SEQIDNO:28.35.权利要求20的用途，其中组合物还包含另一种干扰RNA，其长度为19到49个核苷酸，并且包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列，和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域；其中该另一种干扰RNA的反义序列在生理条件下与对应于SEQIDNO:l的mRNA的另一部分杂交，并且该反义序列具有与对应于SEQIDNO:1的mRNA的另一杂交部分至少接近完全连续互补的至少19个核苷酸的区域。36.组合物在生产治疗需要其的受试者中结締组织生长因子相关的BM"疾病的药物中的用途，该組合物包含有效量的长度为19到49个核苷酸的单链干扰RNA和可药用栽体；其中该单链干扰RNA在生理条件下与对应于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、691、801、901、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的一部分杂交，并且该干扰RNA具有与对应于SEQIDNO:l的mRNA的杂交部分至少接近完全互补的区域。全文摘要提供了RNA干扰技术用于抑制与CTGF表达有关的眼科疾病中结缔组织生长因子mRNA的表达。与异常CTGF表达有关的眼科疾病包括青光眼、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新血管形成、增殖性玻璃体视网膜病变和创伤愈合。通过施用本发明的干扰RNA来治疗这些疾病。文档编号A61K48/00GK101160138SQ200580047923公开日2008年4月9日申请日期2005年12月19日优先权日2004年12月23日发明者A·R·谢帕德,彭玉豪申请人:爱尔康公司