一种可复制型肾癌治疗性dna疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种可复制型肾癌治疗性DNA疫苗，是将复合基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7插入可复制型DNA疫苗载体pSVK中得到的。该疫苗是一种可以诱导自身抗肿瘤免疫反应的DNA疫苗，疫苗本身的安全性好，为恶性肿瘤的预防和治疗提供了新的方法和思路，应用前景广阔。
【专利说明】—种可复制型肾癌治疗性DNA疫苗
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种可复制型肾癌治疗性DNA疫苗。
【背景技术】
[0002]肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是肾脏恶性程度较高的肿瘤之一，也是泌尿系常见的肿瘤。过去30年中肾细胞癌的发病率连年上升(Rohrmann K, StaehlerM，Haseke N，et al.1mmunotherapy in metastatic renal cell carcinoma.World JUrol (2005) 23:196 - 201)。病人确诊时已经到了晚期，同时在行根治性切除术后的肾癌中也有20% -30%会发生转移，对于失去手术机会的RCC目前还没有令人满意的治疗方法(Schrader AJ, Varga Z,Hegele A,et al.Second-line strategies for metastaticrenal cell carcinoma:classics and novel approaches.J Cancer Res ClinOncol (2006) 132:137 - 149)。因此，晚期肾癌治疗迫切需要更加有效的新型治疗方案。
[0003]随着肿瘤免疫学以及分子生物学方面研究的深入，肿瘤免疫治疗作为一种清除肿瘤细胞的新方法逐步受到重视，它是通过激活机体的免疫系统特异地清除肿瘤细胞，目前也逐步应用到肾癌的治疗研究中(1.Vissers JL, De Vries IJ, SchreursMW, et al.The renal cell carcinoma-associated antigen G250encodes a humanleukocyte antigen (HLA)-A2.1-restricted epitope recognized by cytotoxicT lymphocytes.Cancer Res, 1999,59 (21):5554 - 5559.2.Cho-Lea Tso,AmnonZisman, Allan Pantuck, et al.1nduction of G250-targeted and T-Cel1-mediatedAntitumor Activity against Renal Cell Carcinoma Using a Chimeric FusionProtein Consisting of G250and Granulocyte/Monocyte-Colony Stimulating Factor.Cancer Research2001:61, 7925 - 7933)。研究表明肾癌对放化疗都不敏感，但其免疫原性很高，这都使免疫治疗作为肾癌治疗的一种新型治疗手段而倍受重视(Mokelo P, etal.Vaccines, coming of age after200years.FEMS Microbiol Rev, 2000, 24(1):9-20.)?
[0004]一、新型可复制型疫苗载体系统
[0005]甲病毒(Alphavirus)是披膜病毒(togavirus family)家族成员之一,它可以在不同细胞内进行自我复制。最近，利用甲病毒的自我复制功能，借助病毒的复制元件构建而成的新型可复制型DNA疫苗，显示出良好的应用前景。本研究前期在塞姆利基森林病毒(SFV)的基础上构建而成的新型可复制型DNA疫苗载体pSVK。该疫苗载体具备有以下优点:(1)载体本身具有很强的自我复制功能，外源基因能够得到有效表达；(2)其本身具有高效的复制和翻译功能，势必会占用宿主细胞的大部分资源，最终会引起宿主细胞的凋亡而被机体清除，降低了机体的免疫耐受；(3)转录和翻译的过程是在宿主细胞的细胞质内进行，能够大大降低外源基因与宿主细胞基因整合的概率，提高其安全性。
[0006]二、靶抗原的选择
[0007]G250是从肾癌细胞系中筛选和克隆出的一种具有良好组织特异性的肿瘤相关抗原，也叫碳酸酐酶 IX (Carbonic Anhydrase IX, CAIX) (Na Kagaway, Uemure H, HiraoY, et al.Radiation Hybrid Mapping of the Human MN/CA9Locus to ChromosomeBand9pl2 -pl3.Genomics, 1998 ;53:118-119.)。G250 基因位于染色体 9pl2_13 上，共含有10898个碱基对，包含11个外显子和10个内含子。在低氧环境中，G250可以调节细胞的增殖，并在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。有研究表明，用G250单克隆抗体进行组织染色，几乎所有肾透明细胞癌和其它大部分类型肾癌细胞中都有G250的表达，80%的转移灶也有表达，而正常肾脏组织中很少或基本不表达。G250内存在HLA-21限制性T淋巴细胞表位，可以在体外诱导G250特异性T淋巴细胞免疫活性(1.0pavsky R, PastorekovaS，Zeinik V, etal.Gene, anovel member of the carbinic angydase famiIu: structureand exon to protein domain relationships.Genomics, 1996, 33:480-487.2.GrabmaierK, Vissers JL, De Weijert MC, etal.Molecular cloning and immunogenicity of renalcell carcinoma-associated antigen G250.1nt J Cancer, 2000，85(6):865 - 870.)。所以在近几年对肾癌相关抗原的研究中，G250成了肾癌免疫治疗中的一个理想靶点。
[0008]Hideki等将G250基因克隆至腺病毒载体后转染人外周血单核细胞，以诱导外周血淋巴细胞的细胞毒性反应，研究结果证明，该载体能够引发CTL反应并可以裂解表达G250的自体肾癌肿瘤细胞，对肾细胞癌有很好的杀伤作用(Hideki Mukouyama, INicolette K.et al.Generation of Kidney Cancer-Specific Antitumor ImmuneResponses Using Peripheral Blood Monocytes Transduced With a RecombinantAdenovirus Encoding Carbonic Anhydrase9.Clinical Cancer Re search2004，10:1421 - 1429.)。Uemura等的I期临床研究是用来源于G250的3个肽段制作肽疫苗，来治疗细胞因子抵抗性进展期肾细胞癌(Uemura H, Fujimoto K, Tanaka M, etal.APhase I Trial of Vaccination of CA9_Derived Peptides for HlA-A24_PositivePatients with Cytokine-Refractory Metastatic Renal Cell Carcinoma.Clin CancerRes.2006(6):1768-1775.) 0试验结果证实:病人可以很好的耐受疫苗，无明显毒副反应；在大部分病人体内可以检测到肽特异性CTLs反应及体液反应，甚至有3例患者肾癌转移灶消失或缩小，目前该疫苗有望进入II期临床研究阶段。综上所述，人G250抗原是发展肾癌免疫基因治疗的理想靶点。
[0009] DNA疫苗作为免疫治疗的一种方式，已经在临床或临床前的实验研究中广泛开展。DNA疫苗因为其安全性好，特异性高且易于产业化等方面的优势成为肾癌免疫治疗的重要发展方向(Leclerc C，et al.New approaches in vaccine development.CompImmunol Microbiol Infect Dis.2003, 26(5-6):329-41.) ? 随着免疫学、分子生物学和细胞生物学技术的不断发展，更高效和更安全的疫苗形式不断出现，近年来，一种具有“自我复制”功能的、以RNA病毒复制元件为基础的可复制性DNA疫苗的出现是DNA疫苗发展过程中的一个重大突破(1.Kenneth Lundstrom.Alphaviruses in Gene Therapy[J].Viruses,2009,I (I),13-25.2.Schlesinger S.Alphavirus vectors: development andpotential therapeutic applications.Expert Opin Biol Ther, 2001，I(2):177-191.3.Jonathan OR, Sergey AD,KurtIK.Alphavirus vectors and vaccination[J].Rev Med Virol，2002，12:279-296.)。这种疫苗在被宿主体内的抗原递呈细胞摄取后被转录成RNA复制子，可利用宿主细胞内的大量RNA复制酶自我复制，实现肿瘤抗原基因的高效转录并诱导机体产生特异的细胞免疫和体液免疫应答，达到治疗肿瘤的目的(1.Wang Z,TroiloP J, Wang X,et al.Detection of integration of plasmid DNA intohost genomic DNA following intramuscular injection and electroporation[J].Gene Ther, 2004, 11 (8):711-721.2.Gupta PK, SS Dahiya, et al.Sindbis virusreplicon-based DNA vaccine encoding Rabies virus glycoprotein elicits specifichumoral and cellular immune response in dogs[J].Acta Virol.2009，53(2):83-88.)。这种疫苗集合了传统DNA疫苗、RNA疫苗以及RNA复制子疫苗的三种优势:(I)疫苗本身具有很强的自我复制功能，外源基因能够得到有效的表达；(2)疫苗的稳定性好，便于生产、储存还有运输；(3)由于疫苗本身具有高效的复制和翻译功能，势必会占用宿主细胞的大部分资源，最终会引起宿主细胞的凋亡而被机体清除，降低了机体的免疫耐受；(4)转录和翻译的过程是在宿主细胞的细胞质内进行，能够大大降低外源基因与宿主细胞基因整合的概率，提高其安全性。所以说，可复制性DNA疫苗在疫苗的开发和生产中具有非常广阔的前景，目前尚未出现可供肾癌治疗使用的可复制性DNA疫苗。
【发明内容】
[0010]本发明目的在于提供一种可复制型肾癌治疗性DNA疫苗。
[0011]本发明所提供的可复制型肾癌治疗性DNA疫苗，是将复合基因sig-tG250-Fc-GP1-1RES-GM/B7 (简称G250FGB)插入可复制型DNA疫苗载体pSVK中得到的，所述G250FGB复合基因是自5’端至3’端依次由tG250复合抗原基因、人IgG Fe段基因(GenBank 号:Z17370)、GPI 基因(GenBank 号:XM676434)、GM/CSF 基因(GenBank 号:NM-000758)和 B7.1 基因(GenBank 号:NM_005191)组成的融合基因。
[0012]其中，tG250复合抗原基因是异种化嵌合抗原基因，同时含有人肾癌抗原G250、猴和鼠的肾癌抗 原CAIX基因，为了打破机体对自身抗原的免疫耐受，采用了分区段异种化抗原嵌合设计，使同源性较高的区段被异种化抗原代替，从而诱导不同种属间的交叉免疫反应。具体来讲，tG250抗原基因中自5’端第1-132、169-183、298-513位碱基分别为猴肾癌抗原 CAIX 基因(Genebank 号:XM001088481),自 5，端第 133-168、247_258、514_897、1084-1092 位碱基分别为人 G250 基因，(Genebank 号:AJ010158),而自 5’ 端第 184-246、259-297、898-1083、1093-1131位碱基分别为选取的是鼠肾癌抗原CAIX基因(Genebank号:BC120544)，tG250复合抗原基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0013]所述tG250复合抗原基因与人IgG Fe段和GPI基因融合，然后与GM/CSF基因和B7.1基因通过IRES序列相连组成G250FGB复合基因，其中，自5，端第70-201、238-252、367-582位碱基分别为猴肾癌抗原CAIX基因，自5，端第202-237、316-327、583-966、1153-1161 位碱基分别为人 G250 基因，自 5，端第 253-315,328-366,967-1152,1162-1200位碱基分别为鼠肾癌抗原CAIX基因，自5’端第1201-2473位碱基为Fe段基因，自5’端第2474-2600位碱基为GPI基因，自5’端第2622-3246位碱基为IRES序列，自5’端第3253-3684位碱基为GM/CSF基因，自5’端第3709-4497位碱基为B7.1基因，所述G250FGB复合基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
[0014]将以pSVK为出发载体构建的携带复合基因sig-tG250-Fc-GP1-1RES-GM/B7(简称G250FGB)的重组可复制型肾癌治疗性DNA疫苗命名为pSVK-G250FGB，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，其中，自5’端第7415-11913位碱基为G250FGB复合基因序列。[0015]本发明的可复制型肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-G250FGB可采用电穿孔肌肉内注射的方式进行免疫，免疫剂量一般为1-100μ g/kg,疗程为1-6个月。免疫剂量和疗程可根据实际情况进行调整。
[0016]上述可复制型肾癌治疗性DNA疫苗在制备预防和治疗肾癌药物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0017]含有上述可复制型肾癌治疗性DNA疫苗的组合物也属于本发明的保护范围。
[0018]上述含有可复制型肾癌治疗性DNA疫苗的组合物在制备预防和治疗肾癌药物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0019]本发明提供了一种安全、高效的抗肾癌DNA疫苗，克服了传统DNA疫苗存在的问题，主要体现在以下几个方面:[0020]创新策略1、高效可复制型DNA疫苗载体系统，前期以SFV RNA复制子衍生的真核表达载体PSFVl为骨架构建了具有自主知识产权的可复制型DNA疫苗载体。自行研发基于塞姆利基森林病毒复制子的可复制型DNA疫苗载体，能够“自主复制”高水平表达外源基因，而且载体抗性已经改造成为临床允许的卡那霉素抗性。基于该载体系统研发的基因疫苗，比常规DNA疫苗更加安全高效，诱导的免疫效力可比常规DNA疫苗提高1-2个数量级，是研究治疗性基因疫苗当前最先进的载体系统。
[0021]创新策略2、特异性肿瘤抗原异种化改造，抗原采用了肾细胞癌中高表达的肿瘤抗原tG250，并在设计的复合抗原中同时含有人、猴和鼠的CAIX基因，可打破机体的免疫耐受，诱导种与种的交叉性免疫应答。
[0022]创新策略3、加强抗原递呈能力，在复合抗原分子后，融合了人IgFc段，通过与抗原递呈细胞特别是DC细胞表面的相应受体结合，可以将抗原高效运送至抗原递呈细胞，实现闻效的抗原加工和递呈。
[0023]创新策略4、分子内佐剂协同增效，本项目研制的可复制型DNA疫苗，载体具备较大的容纳空间。联合应用了 GM-CSF、B7.1等分子内佐剂，可以在疫苗给药局部，协同创造活跃的免疫微环境，增强免疫共刺激，增强诱导高效的特异性细胞免疫和体液免疫。
[0024]创新策略5、高效诱导细胞免疫，治疗性疫苗，主要通过诱导细胞免疫清除体内残存的肿瘤细胞。可复制型DNA疫苗，能够模拟病毒自然感染过程(同时又无病毒感染的风险)，在细胞内表达抗原并通过MHC I类途径内源性递呈，激活CD8+T细胞反应。同时，抗原以细胞膜锚定形式表达，比分泌形式表达更容易诱导细胞免疫。
[0025]创新策略6、高效基因疫苗接种技术，利用电脉冲基因疫苗递送技术，大幅度提高了基因疫苗的免疫效力，为基因疫苗的临床应用提供了强大助力。通过瞬间脉冲电流增加靶细胞的渗透性而不杀伤细胞，外源DNA可以透过细胞膜进入细胞，使肌肉细胞摄取DNA质粒的效率比注射器直接肌注高100倍。而且更倾向于诱导THl类细胞免疫应答。为肾癌治疗性基因疫苗发挥高效临床治疗作用提供了重要保障。
[0026]通过观察各组免疫小鼠的肿瘤形态学的改变，可以发现疫苗组小鼠的肿瘤生长受到了一定的抑制，小鼠移植瘤成瘤时间较其余各对照组较晚，肿瘤的瘤生长明显得到延缓，免疫后荷瘤小鼠的生存期明显延长，肿瘤生长抑制率达到91.16%, DNA疫苗免疫小鼠后能够有效延长荷瘤小鼠的生存时间。这些结果说明，DNA疫苗pSVK-G250FGB可以有效抑制肿瘤的生长并能够延长荷瘤小鼠的生存时间。没能到达100%抑瘤，分析可能是由于我们所采用的renca细胞系的侵袭性比较强，免疫原性较弱并MHC I类分子的表达很低，因而会逃避部分免疫攻击的能力。
[0027]通过一系列的免疫学指标的检测，对肾癌DNA疫苗可能发挥作用的免疫学机制进行初步的探讨。ELISA法检测免疫小鼠血清中hG250抗体IgG水平的结果显示，经过疫苗免疫后的疫苗组和单独抗原对照组小鼠血清中均能检测到针对hG250蛋白的特异抗体，并与对照组相比有统计学意义。通过ELISA检测免疫后2周的小鼠血清中细胞因子IFN- Y的水平，发现疫苗组的IFN-Y的水平远远高于对照组，反应了小鼠体内Thl免疫反应的一定程度的增强，而Thl免疫反应主要介导的是细胞毒性免疫反应，可能在杀伤肿瘤细胞方面发挥一定的作用。ELISP0T法检测免疫后小鼠特异性淋巴细胞IFN-Y的分泌情况，特异性的抗原hG250刺激淋巴细胞后通过预包被的IFN-Y单克隆抗体显色对所形成的斑点进行计数。结果证实疫苗组和单独抗原对照组小鼠可以诱导特异性的淋巴细胞的IFN-Y分泌，与阴性对照组存在显著差异。这些结果说明用本发明的DNA疫苗免疫后诱导出了小鼠T细胞的IFN-Y特异性分泌，而IFN-Y与T细胞介导的细胞毒性免疫反应密切相关。通过HE染色的肿瘤组织切片来观察免疫小鼠肿瘤组织中的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，在经DNA疫苗pSVK-G250FGB免疫的小鼠肿瘤组织局部，可以观察到明显的TIL浸润，这说明疫苗免疫后的小鼠肿瘤组织中成功募集了具有肿瘤杀伤作用的淋巴细胞。
[0028]综上所述，本发明提供了一种可以诱导自身抗肿瘤免疫反应的DNA疫苗，为恶性肿瘤的预防和治疗提供了新的方法和思路，应用前景广阔。原因在于，本发明利用甲病毒的自我复制功能和复制元件构建的新型可复制型DNA疫苗既能保留原来DNA疫苗的稳定性好，便于生产储存和运输的优势，又拥有RNA复制子，具有自我复制能力，外源基因容易高效表达的优势，并且其在高效表达的同时还会占用宿主细胞的资源，引起宿主细胞自我凋亡被机体清除，提高了疫苗本身的安全性，因此，本发明的DNA疫苗具有广阔的应用前景。但是本发明仍存在一些不足，如仅仅采用了 renca这一种细胞模型，需要在其它细胞模型中最好是在肾癌转基因小鼠模型中进一步评价疫苗效果；其次，在免疫三次后接着就进行攻瘤，这样可以预先激活体内免疫反应，从而达到较好的抑瘤效果，但是随着肿瘤的生长其免疫抑制的能力也在增强，因此仍需要进一步完善肿瘤形成后再进行疫苗免疫并观察其治疗效果的研究。
[0029]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为转化有重组质粒pSVK-G250FGB的重组菌落的PCR快速鉴定结果
[0031]图2为重组质粒pSVK-G250FGB的单酶切鉴定结果
[0032]图3为重组载体pSVK-G250FGB的物理图谱
[0033]图4为Western印迹检测重组质粒pSVK_G250FGB在293T细胞中的表达情况
[0034]图5为免疫组化法检测肿瘤抗原G250在Balb/c小鼠体内的表达情况的检测结果
[0035]图6为PCR扩增的人G250基因的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果
[0036]图7为重组载体pIRES-neo-G250的双酶切鉴定结果
[0037]图8为重组载体pIRES-neo_G250的物理图谱
[0038]图9为稳定转染质粒pIRES-neo_G250的小鼠renca细胞株中人G250基因表达情况的RT-PCR检测结果
[0039]图10为稳定转染质粒pIRES-neo_G250的小鼠renca细胞株中人G250基因表达情况的流式细胞术检测结果
[0040]图11为稳定转染质粒pIRES-neo_G250的小鼠renca细胞株中人G250基因表达情况的免疫荧光法检测结果
[0041]图12为稳定转染质粒pIRES-neo_G250的小鼠renca细胞株中人G250基因表达情况的Western印迹法检测结果
[0042]图13为各组免疫小鼠皮下移植瘤成瘤时间
[0043]图14为各组免疫小鼠体内移植瘤的生长曲线
[0044]图15为手术剥离各组免疫小鼠的肿瘤组织
[0045]图16为各组免疫小鼠皮下移植瘤攻击25天后各组小鼠的平均瘤重
[0046]图17为各组免疫 小鼠皮下移植瘤的肿瘤生长抑制率
[0047]图18为皮下移植瘤攻击后各组免疫小鼠的存活时间
[0048]图19为免疫小鼠血清中G250特异抗体的ELISA法检测结果(免疫小鼠血清稀释100倍后的0D450nm值)
[0049]图20为各组免疫小鼠血清中细胞因子IFN- Y浓度检测结果
[0050]图21为各组免疫小鼠脾细胞IFN- Y分泌水平的ELISP0T检测结果
[0051]图22为各组免疫小鼠脾细胞IFN- Y分泌水平的ELISP0T斑点数检测结果
[0052]图23为免疫小鼠肿瘤组织中的肿瘤浸润淋巴细胞的病理组织形态学观察结果
【具体实施方式】
[0053]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:((Molecular Cloning:ALaboratory Manual)) (Sambrook, J.,Russell,David ff.,MolecularCloning:ALaboratory Manual,3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0054]所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
[0055]实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
[0056]所用引物均由由Invitrogen生物技术有限公司合合成。
[0057]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0058]实施例1、可复制型肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-G250FGB的构建与表达
[0059]一、构建可复制型DNA疫苗载体
[0060]1、构建携带PS与KANA融合基因(PS-KANA)的重组载体pUC19-PS_KANA
[0061]重组载体pUC19-PS_KANA的构建方法如下:
[0062]I)扩增PS基因:以含有氨苄青霉素抗性基因的复制子DNA疫苗载体 pSCAl (构建方法参见文献 Yu Y Z, Sun Z W，Yu W Y.Chinese Journal ofBiotechnology, 2005, 21 (5):33-38)为模板，在引物 PSCA-F
[0063](5， -CCGTCTAGAGATCATAATCAGCCAT-3，)和 PSCA-R
[0064](5，-CCGGCATGCCTCGAGACTAGTCTGTCAGACCAAG-3 ’)的引导下 PCR 扩增氨苄青霉素抗性基因的旁侧序列，所述5’端旁侧序列含有限制性内切酶Xba I识别位点，所述3’端旁侧序列含有限制性内切酶Sph I识别位点；PCR反应体系为=IOXPCR缓冲液10 μ 1，MgCl2 (2.5mM) 10 μ I, dNTPs 混合物(2.5mM) 8 μ I，合成引物(20 μ Μ)PSCA-F 和 PSCA-R 各2 μ 1，Taq DNA聚合酶(5U/μ I) 2 μ 1，加去离子水至100 μ I ;PCR反应条件为:先94°C预变性5min ;然后94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸Imin，共30个循环，最后72°C继续延伸IOmin ;反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明经PCR扩增获得了全长1273bp的基因片段，回收并纯化该基因片段，测序，测序结果表明该基因片段的核苷酸与预期结果相符，将该基因片段命名为PS基因。然后，将PS基因用限制性内切酶Xba I和Sph I进行双酶切后，与同样经Xba I和Sph I双酶切的载体pUC19连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经浓度50 μ g/mL的氨苄青霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定，鉴定结果表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带PS基因的重组载体，命名为pUC19-PS。
[0065]2)获得PS与KANA融合基因(PS-KANA):以含有卡那霉素抗性基因的载体PVAXI (购自Invitrogen公司)为模板，在引物KANA-F [0066](5，-CCGACTAGTATGATTGAACAAG-3，)和 KANA-R
[0067](5’ -CCGCTCGAGTCAGAAGAACTCGTC-3’ )的引导下 PCR 扩增 5’ 端携带限制性内切酶Spe I识别位点、3’端携带限制性内切酶Xho I识别位点的卡那霉素抗性基因；PCR反应体系为:10XPCR 缓冲液 5 μ 1，MgCl2 (2.5mM)5y I, dNTPs 混合物(2.5πιΜ)4μ 1，合成引物(20 μ Μ)KANA-F和 KANA-R各 I μ I, Taq DNA聚合酶(5U/μ I) I μ I，加去离子水至 50 μ I ；PCR反应条件为:先94°C预变性5min ;然后94°C变性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸30s，共30个循环，最后72°C继续延伸IOmin ;反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明经PCR扩增获得了全长795bp的基因片段，回收并纯化该基因片段，测序，测序结果表明该基因片段的核苷酸序列与预期结果相符，将该基因片段命名为KANA ；然后将KANA基因用限制性内切酶SpeI和Xho I进行双酶切后，与同样经SpeI和Xho I双酶切的重组载体PUC19-PS (步骤I)得到)连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经浓度50μ g/mL的氨苄青霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定；鉴定结果表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带PS与KANA融合基因(PS-KANA)的重组载体，命名为PUC19-PS-KANA。
[0068]2、获得复制子DNA疫苗载体pSVK
[0069]延续上述步骤，将复制子DNA载体pSCAl (以载体pSFVl为骨架，用CMV IE启动子替换SP6启动子，并在3’ UTR下游插入BGH转录终止子，构建基于DNA的复制子载体PSCA1，使得在多克隆位点插入外源基因而构建的质粒DNA可直接转染细胞，无需体外转录 RNA 的繁琐操作[Yu Y Z, Sun Z W，Yu W Y.Chinese Journal ofBiotechnology, 2005,21 (5):33-38])中的氨苄青霉素基因置换为卡那霉素基因，得到复制子DNA疫苗载体pSVK，进行以下步骤:
[0070]3)抗性基因置换:具体方法为:将载体pSCAl先用SphI单酶切，回收并纯化后在DNA聚合酶I (Klenow)的作用下，将酶切后产生的粘性末端补平后回收、纯化，再用SpeI进行单酶切并回收、纯化后作为目的载体(该目的载体的一端为平末端，另一端则是粘性末端SpeI)，经过该步操作载体pSCAl中的氨苄抗性基因及其旁侧序列已被酶切去除；将步骤2)得到的重组载体pUC19-PS-KANA先用Hind III单酶切，回收并纯化后在DNA聚合酶I(Klenow)的作用下，将酶切后产生的粘性末端补平后回收、纯化，然后再用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理，最后再用Xba I单酶切，回收并纯化2100bp的DNA片段(该DNA片段的一端为平末端，另一端为粘性末端XbaI)，该步酶切回收的DNA片段主要包含有pSCAl载体中氨苄抗性基因的旁侧序列与KANA抗性基因的融合基因即PS-KANA ;利用SpeI和XbaI属于同尾酶的特性，将回收并纯化的目的载体和DNA片段连接，经该步操作，PS-KANA融合基因被连入载体pSCAl中原氨苄基因及其旁侧序列所在位置，实现了 pSCAl载体中抗性基因的置换；将连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，进行抗性筛选，筛选结果表明连接产物转化入大肠杆菌DH5 α中后在氨苄青霉素抗性的LB平板中不再生长，而在含有卡那霉素抗性的LB平板中生长良好，表明复制子DNA疫苗载体pSCAl中的氨苄青霉素基因被成功置换为卡那霉素基因；再进行PCR和酶切鉴定，鉴定结果表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带卡那霉素抗性基因的复制子DAN疫苗载体，命名为pSVK，测序结果表明pSVK的核苷酸序列如序列表中序列I所示。
[0071]二、pSVK-G250FGB 的构建
[0072]1、载体pSVK的酶切
[0073]用平端酶Sma I对pSVK空载体进行单酶切，这样将环形的pSVK质粒线性化并且拥有了两个平端，酶切体系见表1，酶切反应条件为37°c。
[0074]表1 pSVK载体的SmaI单酶切体系
[0075]
【权利要求】
1.一种可复制型肾癌治疗性DNA疫苗，是将复合基因sig-tG250-Fc-GP1-1RES-GM/B7 (简称G250FGB)插入可复制型DNA疫苗载体pSVK中得到的，所述G250FGB复合基因是自5’端至3’端依次由tG250复合抗原基因、人IgG Fe段基因(GenBank号:Z17370)、GPI基因(GenBank 号:XM676434)、GM/CSF 基因(GenBank 号:NM_000758)和 B7.1 基因(GenBank号:NM-005191)组成的融合基因。
2.根据权利要求1所述的可复制型肾癌治疗性DNA疫苗，其特征在于:tG250抗原基因中自5，端第l_513bp选取的是猴肾癌抗原CAIX基因(Genebank号:XMOO 1088481)，自5，端第514-897bp选取的是人G250相应基因序列(Genebank号:A J010158),自5，端第898-1131bp选取的是鼠肾癌抗原CAIX基因(Genebank号:BC120544)，tG250复合抗原基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
3.根据权利要求1或2所述的可复制型肾癌治疗性DNA疫苗，其特征在于:所述tG250复合抗原基因与人IgG Fe段和GPI基因融合，然后与GM/CSF基因和B7.1基因通过IRES序列相连组成G250FGB复合基因；所述G250FGB复合基因中，自5’端第70_201、238_252、367-582位碱基分别为猴肾癌抗原CAIX基因，自5，端第202-237、316-327、583-966、1153-1161 位碱基分别为人 G250 基因，自 5，端第 253-315,328-366,967-1152,1162-1200位碱基分别为鼠肾癌抗原CAIX基因，自5’端第1201-2473位碱基为Fe段基因，自5’端第2474-2600位碱基为GPI基因，自5’端第2622-3246位碱基为IRES序列，自5’端第3253-3684位碱基为GM/CSF基因，自5’端第3709-4497位碱基为B7.1基因。
4.根据权利要求3所述的可复制型肾癌治疗性DNA疫苗，其特征在于:所述G250FGB复合基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
5.根据权利要求3或4所述的可复制型肾癌治疗性DNA疫苗，其特征在于:以pSVK为出发载体构建的携带复合基因G250FGB的重组可复制型肾癌治疗性DNA疫苗命名为PSVK-G250FGB，其核苷酸序列中，自5’端第7415-11913位碱基为复合基因G250FGB序列。
6.根据权利要求5所述的可复制型肾癌治疗性DNA疫苗，其特征在于:所述重组可复制型肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-G250FGB核苷酸序列如序列表中序列4所示。
7.权利要求1-6任一所述可复制型肾癌治疗性DNA疫苗在制备预防和治疗肾癌药物中的应用。
8.含有权利要求1-6任一所述可复制型肾癌治疗性DNA疫苗的组合物。
9.权利要求8所述含有可复制型肾癌治疗性DNA疫苗的组合物在制备预防和治疗肾癌药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK103948943SQ201410211372
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月19日 优先权日:2013年5月20日
【发明者】于继云, 阎瑾琦, 田仁礼, 李云奇, 肖毅, 张巍, 张亮, 王宇, 刘宁 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所