一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型dna疫苗的制作方法

一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型dna疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其活性成分包括：以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤抗原复合基因的抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA，以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE。本发明为抗肿瘤主动免疫治提供一种新的选择，应用前景广阔。
【专利说明】一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗。【背景技术】
[0002]治疗性疫苗概述
[0003]治疗性肿瘤疫苗是防治恶性肿瘤术后复发转移的重要技术手段，近年来发展迅速，2010年PR0VENGE⑧(sipuleucel-T)成为首个获得批准进入临床使用的细胞疫苗，用于治疗激素抵抗的转移性前列腺癌。继预防性疫苗之后，目前，治疗性疫苗在国际疫苗研究领域异军突起，已经成为国际生物技术药物开发的热点领域。治疗性疫苗可通过重新唤起机体对靶抗原的免疫应答能力，在已患病个体诱导特异性免疫应答，清除病原体或异常细胞，使疾病得以治疗。
[0004]DNA疫苗由于能够通过MHC I类抗原递呈途径诱导细胞免疫，特别是能够诱导抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte, CTL)活性,被公认为是一种具有良好应用前景的免疫治疗方法，对研究治疗重大慢性疾病的新型治疗性疫苗药物极为有利。然而近期研究表明DNA疫苗在大动物模型和人体试验中治疗效果欠佳，有必要对传统DNA疫苗进行升级换代或免疫增效。
[0005]近年来，国际上逐步发展起一种新型基因疫苗载体系统，称为复制子DNA疫苗(即可复制型DNA疫苗)，将具有“自主复制”功能的RNA病毒复制元件置于DNA疫苗载体中构建而成。用于开发复制子载体的主要是单股正链RNA病毒(如甲病毒)，其中以塞姆利基森林病毒SemLiki Forest virus (SFV)的研究最为广泛。与传统DNA疫苗相比，可复制型DNA疫苗在安全性和高效性两个方面都有重要突破。复制子DNA疫苗不仅可以“自主复制”高水平表达外源基因，而且在自主复制过程中产生的双链RNA中间体还是高效的免疫佐剂(能够刺激细胞因子及分子伴侣产生)，可同时诱导全身免疫、粘膜免疫、抗体应答和CTL反应。此外，复制子DNA疫苗的自我复制和转录均在胞浆内完成，被转染细胞最后会发生凋亡，因此不会与宿主染色体发生整合。新型复制子DNA疫苗既克服了常规DNA疫苗免疫力低下、安全性不能保障的缺陷，又保留了 DNA疫苗稳定、低成本、激发免疫反应全面的优点。
[0006]众所周知，术后复发和转移是目前恶性肿瘤治疗的关键性难题，抗肿瘤主动免疫治疗有望通过激活患者体内的细胞免疫及体液免疫反应，建立机体对肿瘤抗原的免疫记忆，防止肿瘤的复发与转移。当前，治疗性疫苗已经成为国际生物技术药物开发的热点领域，本发明的发明人前期以塞姆利基森林病毒SemLiki Forest virus (SFV)可复制型衍生的真核表达载体PSFVl为骨架，构建了可复制型DNA载体pSVK，与传统DNA疫苗相比，可复制型DNA疫苗具有表达更高效、应用更安全、成本更低廉的优势。
[0007]肿瘤血管生成概述[0008]健康成人的脉管系统是非常稳定的，除了卵巢黄体中血管周期性生长和妊娠期的血管生长等少数情况外，罕见新生血管生成。肿瘤血管生成的概念由Judah Folkman于1971年首次提出，它是指内皮细胞在相关刺激血管生成信号传导的作用下由相对静止转为快速生长，从而由已存在的血管组织中产生新生血管组织的过程，这是一个细胞与细胞、细胞与基质之间相互作用的多步骤复杂过程，包括内皮细胞增殖、转移、分化、细胞外基质降解及基底膜形成。1996年，Hanahan等又提出了 “血管生成开关(angiogenic switch) ”的概念，将肿瘤的生长分为血管前期和血管期:血管前期的肿瘤细胞主要依靠被动扩散从周围组织获取氧气及营养物质并运走代谢废物，如果没有新生血管长入，肿瘤细胞将处于休眠状态或发生凋亡，肿瘤组织生长的最大直径不会超过l_2mm ;血管期，由于新生血管的生成满足了肿瘤组织进一步生长代谢的需要，从而使肿瘤细胞不断分裂增殖，并且成为肿瘤组织浸润侵袭、远处转移的第一路径。另有研究表明，除实体肿瘤外，血管生成在血液恶性肿瘤的发病机理中同样发挥了重要作用。因此“血管生成开关”是恶性肿瘤早期的关键事件。在缺氧、炎症、代谢性应激等刺激原作用下，促血管生成因子呈现出明显的优势，打破了与血管生成抑制因子之间的平衡状态，促使内皮细胞增殖和血管形成。主要的促血管生成因子有:血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, F1DGF)、酸性/碱性成纤维细胞生长因子(acid/basic fibroblast growth factor, aFGF/bFGF)、转化生长因子(transforminggrowth factor, TGF)、膜岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、血管生成素(angiogenesis)等；主要的血管生成抑制因子有:TNF_a、血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、白介素-12 (interleukin-12)等。血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现的最为强大专一的促进血管内皮细胞增殖的因子。
[0009]1、VEGF 及其受体 VEGFR
[0010]人VEGF 家族包括 VEGF-A (即通常所指的 VEGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盘生长因子(placenta growth factor, PLGF)以及内分泌腺来源的血管内皮生长因子(endocrine gland-derived vascular endothelial growth factor, EG-VEGF),其中VEGF-A是VEGF家族中最重要的成员，它是由二硫键共价相连的同源二聚体所构成的糖蛋白，相对分子量约34-46 X 103kD,序列高度保守，因其mRNA剪切不同产生6种亚型:VEGFm、VEGF145, VEGF165, VEG F183、VEGF189和VEGF2tl6，其中VEGF165亚型是最重要的单体，发挥促进内皮细胞增殖的作用。
[0011]VEGFR 家族目前发现有 5 种，其中 VEGFR1 (Flt-1)、VEGFR2 (KDR/Flk-1)、VEGFR3(Flt-4)属于酪氨酸激酶受体(receptortyrosine kinases,RTKs)超家族,另外两种为Npn (neuropil I in)-1及Npn_2。VEGFR是VEGF生物信号传导级联通路的门户，VEGF与之结合后使其二聚体化，进一步激活受体酪氨酸激酶导致其自身磷酸化，受体自身磷酸化启动了下游通路(包括一系列第二信使的激活)。VEGFR2由1356个氨基酸构成，与RTK家族其它成员一样，具有4个结构区域:细胞外7个免疫球蛋白样配体结合域，I个跨膜区域，膜内酪氨酸激酶区域及下游羧基末端区域。研究表明，第3个Ig样结构域对于配体结合起关键作用，第2和4个结构域能够调节配体结合速率，第5和6个结构域对于配体结合到受体后的固定是必须的，第I个Ig样结构域可能参与调控配体的结合。VEGFR1主要是在胚胎发生过程中诱导VEGF-A与VEGFR2结合，发挥其促血管生成作用；VEGFR3信号通路主要参与调控淋巴管形成；VEGF/VEGFR2信号通路是生理性及病理性血管生成最重要的限速步骤，对肿瘤的血管生成至关重要。因此，VEGF及VEGFR2不仅是目前临床中各种抗肿瘤血管靶向治疗最主要的靶位，而且也是肿瘤学基础研究领域中的热点。
[0012]2、以VEGF/VEGFR2为靶位的抗肿瘤血管生成主动免疫治疗
[0013]自2003年贝伐单抗(Bevacizumab)被FDA批准治疗结直肠癌以来,至今已有多种抗血管生成单克隆抗体被证实具有抗肿瘤的临床疗效，但这些药物不仅费用高昂，而且抗血管能力有限、血浆半衰期短，临床治疗经常需要大剂量长期静脉给药，由此带来较多毒副反应，使患者需要住院治疗及特殊护理，这些都给患者及医疗体系带来巨大的经济负担。随着分子免疫学及肿瘤免疫学的迅猛发展，肿瘤治疗性疫苗因其特异性高、针对性强且毒副作用小等特点，已经成为恶性肿瘤主动免疫治疗发展的重要方向，特别是以VEGF/VEGFR2为靶位的抗肿瘤血管生成主动免疫治疗取得了令人鼓舞的研究进展。[0014]经过多年的失败与努力，第一个肿瘤治疗性疫苗PR0VENGE已经于2012年在美国由 FDA 批准上市用于治疗前列腺癌(Cheever MA, Higano CS.PROVENGE (Sipuleucel-T) inprostate cancer:thefirst FDA-approved therapeutic cancer vaccine.Clin CancerRes, 2011，17:3520-3526.)，很多其它种类的肿瘤治疗性疫苗也处在不同的研究阶段，这些治疗性疫苗都是以肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens, TAA)为祀位的，而抗肿瘤血管生成主动免疫治疗攻击的是肿瘤组织中基因相对稳定且容易到达的血管系统，以内皮细胞中过表达的各种抗原为靶位，可以克服长期以来各种单纯攻击肿瘤细胞治疗的局限性，如肿瘤细胞的异质性、MHC抗原丢失、细胞水平上的免疫抑制及免疫逃避、以及血脑屏障等生理屏障的阻碍等，因此，抗肿瘤血管生成主动免疫治疗作为一种崭新的抗肿瘤治疗策略，呈现出诱人的前景。但是，抗肿瘤血管生成主动免疫治疗仍然存在以下一些不足:①肿瘤组织可能利用其它非VEGF信号通路诱导新生血管形成或利用血管生成拟态(即肿瘤细胞模拟并取代内皮细胞形成管腔样的结构)继续得到血供。②抗肿瘤血管生成治疗理论上只能抑制肿瘤组织生长，单纯的抗血管生成并不能彻底根除肿瘤细胞。大量研究也表明，抗血管生成治疗与传统治疗联合应用时会发挥更强的抗肿瘤作用。③抗血管生成治疗可能会引起高血压、心血管栓塞等不良反应，对正常伤口的愈合以及女性月经周期的变化也会产生一定的影响。总之，抗血管生成主动免疫治疗这一领域将来的发展有待于克服上述各种不足，有望为肿瘤患者提供一种崭新的治疗选择。

【发明内容】

[0015]本发明针对恶性肿瘤治疗中的核心难题“免疫耐受”，基于自主研发的复制子DNA疫苗载体PSVK，开展了系统性的免疫增效策略研究，并成功构建了一种新型的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗。
[0016]本发明所提供的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗的活性成分包括以下组分:
[0017]I)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤抗原复合基因(CAVA)的抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗，命名为pSVK-CAVA，所述肿瘤抗原复合基因(CAVA)自5’端至3’端依次由凋亡抑制蛋白Survivin肿瘤抗原(SUR)基因、异位人绒毛膜促性腺激素hCG β -CTP37 (hmCTP)基因、人 IgG Fe 段基因(GenBank 号:Z17370)、GPI 基因(GenBank 号:XM676434)、IRES 序列、GM-CSF 基因(GenBank 号:NM-000758)和 B7.1 基因(GenBank 号:NM-005191)构成，肿瘤抗原复合基因(CAVA)的结构如图1所示；
[0018]2)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因(CAVE)的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗，命名为pSVK-CAVE，所述肿瘤血管复合基因(CAVE)自5’端至3’端依次由异种化的小鼠VEGFR2胞外l-4IgG样区域(肿瘤血管靶抗原)基因、人IgGFe 段(GenBank 号:Z17370)基因、GPI 基因(GenBank 号:XM676434)、IRES 序列和人 IL-12基因的 p35 亚基(GenBank 号:GI24430218)和 p40 亚基(GenBank 号:GI24497437)构成，肿瘤血管复合基因(CAVE)的结构如图2所示。
[0019]所述复制子DNA疫苗载体pSVK的核苷酸序列如序列表中序列I所示。
[0020]所述肿瘤抗原复合蛋白(CAVA)的氨基酸序列如序列表中序列2(939aa)所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列3 (3752bp)所示，抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA的核苷酸序列如序列表中序列4(14748bp)所示；
[0021]序列表中序列2由939个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1_91位氨基酸残基为凋亡抑制蛋白Survivin肿瘤抗原(SUR),自氨基端第92-169位氨基酸残基为异位人绒毛膜促性腺激素hCGi3 -CTP37 (hmCTP)，自氨基端第170-499位氨基酸残基为人IgG Fe段，自氨基端第500-533位氨基酸残基为GPI，自氨基端第534-677位氨基酸残基为GM-CSF，自氨基端第678-939位氨基酸残基为B7.1 ；
[0022]序列表中序列3由3752个碱基组成，自5’端第1_273位碱基编码凋亡抑制蛋白Survivin肿瘤抗原(SUR)基因，自5’端第274-507位碱基编码异位人绒毛膜促性腺激素hCG β-CTP37 (hmCTP)基因，自5’端第508-1774位碱基编码人IgG Fe段，自5’端第1775-1901位碱基编码GPI融合基因，自5’端第1902-2549位碱基为IRES序列，自5’端第2550-2978位碱基编码GM-CSF基因，自5’端第2979-3752位碱基编码B7.1基因；
[0023]序列表中序列4由14748个碱基组成，自5’端第7484-11235位碱基编码CAVA基因，其余部分为pSVK 载体序列。
[0024]所述肿瘤血管复合蛋白(CAVE)的氨基酸残基序列如序列表中序列5(1341aa)所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列6 (4876bp)所示，抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE的核苷酸序列如序列表中序列7(15986bp)所示；
[0025]序列表中序列5由1341个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1_416位氨基酸残基为小鼠VEGFR2胞外l-4IgG样区域(肿瘤血管靶抗原)，自氨基端第417-746位氨基酸残基为人IgG Fe段，自氨基端第747-780位氨基酸残基为GPI，自氨基端第781-1341位氨基酸残基为人IL-12 (包含p35和p40两个亚基)；
[0026]序列表中序列6由4876个碱基组成，自5’端第1-1248位碱基编码小鼠VEGFR2胞外l-4IgG样区域(肿瘤血管靶抗原)基因，自5’端第1249-2490位碱基编码人IgG Fe段，自5，端第2491-2617位碱基编码GPI基因，自5，端第2618-3194位碱基为IRES序列，自5’端第3195-4876位碱基编码人IL_12(包含p35和p40两个亚基)基因；
[0027]序列表中序列7由15986个碱基组成，自5’端第7484-12458位碱基编码CAVE基因，其余部分为pSVK载体序列。
[0028]本发明的双质粒可复制型DNA疫苗可采用电穿孔肌肉内注射的方式进行免疫，免疫剂量一般为 1-100 μ g (pSVK-CAVAl-100 μ g, pSVK-CAVE 1-100 μ g, pSVK-CAVA 与pSVK-CAVE的注射剂量比例为1:l)/kg，疗程为1-6个月。免疫剂量和疗程可根据实际情况进行调整。
[0029]本发明提供了一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其活性成分是选择在多种实体肿瘤中广泛表达的两种肿瘤抗原hCG和Survivin，并选择与肿瘤血管新生关系密切的靶点VEGFR2，利用异种化抗原设计技术，配合多种免疫增效策略，可以有效打破肿瘤自身抗原的免疫耐受，激活高效的细胞免疫和体液免疫反应。通过预防模型免疫动物实验验证了 pSVK-CAVA与pSVK-CAVE联合应用的抗肿瘤疗效，实验结果表明联合应用两种可复制型DNA疫苗pSVK-CAVA及pSVK-CAVE与单独应用及空白对照组相比，在小鼠体内可以诱导产生更强的特异性细胞和体液免疫反应，能够抑制移植瘤的生长，通过这两种疫苗的联合应用实现了:①直接攻击瘤细胞本身，抑制和清除术后残存的肿瘤细胞；②遏制肿瘤新生血管生成，使肿瘤生长缺乏足够的营养供应；③最终依靠激发的双重免疫反应，实现彻底控制肿瘤、并保持长期不复发状态，提高恶性肿瘤的临床治愈率。本发明通过构建新型双质粒可复制型抗肿瘤DNA疫苗，实现了特异性肿瘤抗原异种化改造、加强抗原递呈能力、分子内佐剂协同增效、高效诱导细胞免疫，有望打破恶性肿瘤治疗中“免疫耐受”这一核心难题，为抗肿瘤主动免疫治提供一种新的选择，应用前景广阔。
[0030]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】

【附图说明】
[0031]图1为肿瘤抗原复合基因的构成示意图
[0032]图2为肿瘤血管复合基因的构成示意图
[0033]图3为复制子DNA疫苗载体pSVK的物理图谱
[0034]图4为抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA的物理图谱
[0035]图5为携带肿瘤血管复合基因的重组质粒pVAXl-CAVE的物理图谱
[0036]图6为经酶切、纯化获得的pSVK载体及肿瘤血管复合基因目的片段的电泳检测结果
[0037]图7为pSVK-CAVE菌液的PCR鉴定结果
[0038]图8为抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE的物理图谱
[0039]图9为各组免疫小鼠皮下移植瘤成瘤时间
[0040]图10为各组小鼠体内移植瘤的生长曲线
[0041]图11为手术剥离各组小鼠肿瘤的离体瘤重
[0042]图12为皮下移植瘤攻击后各组小鼠的存活时间
[0043]图13为ELISA法检测免疫小鼠血清中的特异抗体的OD450值
[0044]图14为ELISA检测各组小鼠血清中抗体与人VEGFR2交叉免疫反应0D450nm值
[0045]图15为免疫后各组小鼠IFN- Y分泌水平的ELI SPOT检测结果
[0046]图16为小鼠皮下移植海藻酸盐包裹Renca肿瘤细胞颗粒表面毛细血管生成情况
[0047]图17为海藻酸盐包裹Renca肿瘤细胞颗粒表面毛细血管含血量检测结果
[0048]图18为免疫后小鼠肿瘤组织中毛细血管密度病理切片及免疫组化染色检测结果
【具体实施方式】
[0049] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J.,Russell,David ff.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001, NY, Cold Spring Harbor)。[0050]所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
[0051]实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
[0052]所用引物由大连宝生物公司合成。
[0053]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0054]实施例1、制备广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗
[0055]本发明广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗的活性成分为抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA和抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE，具体构建方法如下:
[0056]一、构建抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA
[0057]以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤抗原复合基因(CAVA)的抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA。
[0058]其中，肿瘤抗原复合基因(CAVA)自5’端至3’端依次由凋亡抑制蛋白Survivin肿瘤抗原(SUR)基因、异位人绒毛膜促性腺激素hCGi3-CTP37(hmCTP)基因、人IgG Fe段基因(GenBank 号:Z17370)、GPI 基因(GenBank 号:XM676434)、IRES 序列、GM-CSF 基因(GenBank号:NM-000758)和B7.1基因(GenBank号:NM_005191)组成，肿瘤抗原复合基因的结构如图1所示。
[0059]抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA具体构建方法包括以下步骤:
[0060]1、构建复制子DNA疫苗载体pSVK
[0061]1.1构建携带PS与KANA融合基因(PS-KANA)的重组载体pUC19-PS_KANA
[0062]重组载体pUC19-PS-KANA的构建方法如下:
[0063]I)扩增PS基因:以含有氨苄青霉素抗性基因的复制子DNA疫苗载体 pSCAl (构建方法参见文献 Yu Y Z, Sun Z W，Yu W Y.Chinese Journal ofBiotechnology, 2005，21 (5):33-38)为模板，在引物 PSCA_F(5’ -CCGTCTAGAGATCATAATCAGCCAT-3’ )和 PSCA-R(5，-CCGGCATGCCTCGAGACTAGTCTGTCAGACCAAG-3’ )的引导下 PCR 扩增氨苄青霉素抗性基因的旁侧序列，所述5’端旁侧序列含有限制性内切酶Xba I识别位点，所述3’端旁侧序列含有限制性内切酶Sph I识别位点；PCR反应体系为:10XPCR缓冲液10 μ I ,MgCl2 (2.5mM) 10 μ I，dNTPs 混合物(2.5mM)8y I，合成引物(20 μ M) PSCA-F 和 PSCA-R各2μ l，Taq DNA聚合酶(5U/μ I) 2 μ 1，加去离子水至100 μ I ;PCR反应条件为:先94°C预变性5min ;然后94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸Imin，共30个循环，最后72。。继续延伸IOmin ;反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明经PCR扩增获得了全长1273bp的基因片段，回收并纯化该基因片段，测序，测序结果表明该基因片段的核苷酸与预期结果相符，将该基因片段命名为PS基因。然后，将PS基因用限制性内切酶Xba I和Sph I进行双酶切后，与同样经Xba I和Sph I双酶切的载体pUC19连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经浓度50 μ g/mL的氨苄青霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定，鉴定结果表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带PS基因的重组载体，命名为PUC19-PS。
[0064]2)获得PS与KANA融合基因(PS-KANA):以含有卡那霉素抗性基因的载体PVAXI (购自 Invitrogen 公司)为模板，在引物 KANA_F(5’ -CCGACTAGTATGATTGAACAAG-3’)和KANA-R (5’ -CCGCTCGAGTCAGAAGAACTCGTC-3’ )的引导下PCR扩增5’端携带限制性内切酶Spe I识别位点、3’端携带限制性内切酶Xho I识别位点的卡那霉素抗性基因；PCR反应体系为:10XPCR 缓冲液 5 μ 1，MgCl2 (2.5mM)5y I, dNTPs 混合物(2.5πιΜ)4μ 1，合成引物(20 μ Μ)KANA-F和 KANA-R各 I μ I, Taq DNA聚合酶(5U/μ I) I μ I，加去离子水至 50 μ I ；PCR反应条件为:先94°C预变性5min ;然后94°C变性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸30s，共30个循环，最后72°C继续延伸IOmin ;反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明经PCR扩增获得了全长795bp的基因片段，回收并纯化该基因片段，测序，测序结果表明该基因片段的核苷酸序列与预期结果相符，将该基因片段命名为KANA ；然后将KANA基因用限制性内切酶SpeI和Xho I进行双酶切后，与同样经SpeI和Xho I双酶切的重组载体PUC19-PS (步骤I)得到)连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经浓度50μ g/mL的氨苄青霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定；鉴定结果表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带PS与KANA融合基因(PS-KANA)的重组载体，命名为PUC19-PS-KANA。[0065]1.2获得复制子DNA疫苗载体pSVK
[0066]延续上述步骤，将复制子DNA载体pSCAl (以载体pSFVl为骨架，用CMV IE启动子替换SP6启动子，并在3’ UTR下游插入BGH转录终止子，构建基于DNA的复制子载体PSCA1，使得在多克隆位点插入外源基因而构建的质粒DNA可直接转染细胞，无需体外转录 RNA 的繁琐操作[Yu Y Z, Sun Z V, Yu V Y.Chinese Journal ofBiotechnology, 2005,21 (5):33-38])中的氨苄青霉素基因置换为卡那霉素基因，得到复制子DNA疫苗载体pSVK，进行以下步骤:
[0067]3)抗性基因置换:具体方法为:将载体pSCAl先用SphI单酶切，回收并纯化后在DNA聚合酶I(Klenow)的作用下，将酶切后产生的粘性末端补平后回收、纯化，再用SpeI进行单酶切并回收、纯化后作为目的载体(该目的载体的一端为平末端，另一端则是粘性末端Spel)，经过该步操作载体pSCAl中的氨苄抗性基因及其旁侧序列已被酶切去除；将步骤2)得到的重组载体pUC19-PS-KANA先用Hind III单酶切，回收并纯化后在DNA聚合酶I(Klenow)的作用下，将酶切后产生的粘性末端补平后回收、纯化，然后再用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理，最后再用Xba I单酶切，回收并纯化2100bp的DNA片段(该DNA片段的一端为平末端，另一端为粘性末端XbaI)，该步酶切回收的DNA片段主要包含有pSCAl载体中氨苄抗性基因的旁侧序列与KANA抗性基因的融合基因即PS-KANA ;利用SpeI和XbaI属于同尾酶的特性，将回收并纯化的目的载体和DNA片段连接，经该步操作，PS-KANA融合基因被连入载体pSCAl中原氨苄基因及其旁侧序列所在位置，实现了 pSCAl载体中抗性基因的置换；
[0068]将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，进行抗性筛选，筛选结果表明连接产物转化入大肠杆菌DH5 α中后在氨苄青霉素抗性的LB平板中不再生长，而在含有卡那霉素抗性的LB平板中生长良好，表明复制子DNA疫苗载体pSCAl中的氨苄青霉素基因被成功置换为卡那霉素基因；再进行PCR和酶切鉴定。[0069]鉴定结果表明:用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带卡那霉素抗性基因的复制子DAN疫苗载体，命名为pSVK，测序结果表明pSVK的核苷酸序列如序列表中序列I所示，其物理图谱如图3所示。
[0070]2、抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA (又称PSCK_2PFcGB)的构建
[0071 ] 抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗命名为pSVK-CAVA (又称PSCK_2PFcGB)的构建方法参见博士论文:《新型可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的抑瘤活性及免疫学机制研究》，张亮，中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑，2012年第7期，
【公开日】期，20120710。其中肿瘤抗原复合基因CAVA的氨基酸序列如序列表中序列2所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示，抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA的核苷酸序列如序列表中序列4所示,其物理图谱如图4所示。
[0072]序列表中序列2由939个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1_91位氨基酸残基为凋亡抑制蛋白Survivin肿瘤抗原(SUR),自氨基端第92-169位氨基酸残基为异位人绒毛膜促性腺激素hCGi3 -CTP37 (hmCTP)，自氨基端第170-499位氨基酸残基为人IgG Fe段，自氨基端第500-533位氨基酸残基为GPI，自氨基端第534-677位氨基酸残基为GM-CSF，自氨基端第678-939位氨基酸残基为B7.1 ；
[0073]序列表中序列3由3752个碱基组成，自5’端第1_273位碱基编码凋亡抑制蛋白Survivin肿瘤抗原(SUR)基因，自5’端第274-507位碱基编码异位人绒毛膜促性腺激素hCG β-CTP37 (hmCTP)基因，自5’端第508-1774位碱基编码人IgG Fe段，自5’端第1775-1901位碱基编码GPI融合基因，自5’端第1902-2549位碱基为IRES序列，自5’端第2550-2978位碱基编码GM-CSF基因，自5’端第2979-3752位碱基编码B7.1基因； [0074]序列表中序列4由14748个碱基组成，自5’端第7484-11235位碱基编码CAVA基因，其余部分为pSVK载体序列。
[0075]二、构建抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE
[0076]以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因(CAVE)的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE。
[0077]肿瘤血管复合基因(CAVE)自5’端至3’端依次由异种化的小鼠VEGFR2胞外l_4IgG样区域(肿瘤血管靶抗原)基因、人IgG Fe段(GenBank号:Z17370)基因、GPI基因(GenBank 号:XM676434)、IRES 序列和人 IL_12p35 亚基(GenBank 号:GI24430218)和 p40亚基(GenBank号:GI24497437)基因组成，肿瘤血管复合基因(CAVE)的结构如图2所示。
[0078]抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE具体构建方法包括以下步骤:
[0079]1、构建复制子DNA疫苗载体pSVK
[0080]与步骤一中内容相同。
[0081]2、构建重组质粒 pVAX1-mVEGFR2(1_4)Fe hIL12 (简称 pVAXl-CAVE)
[0082]携带肿瘤血管复合基因的重组质粒pVAXl-CAVE的构建方法参见硕士论文:《免疫增效型广谱抗肿瘤血管生成基因疫苗的基础研究》，王伟，
【公开日】期2010年5月，其物理图谱如图5所示。
[0083]3、抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE的构建
[0084]3.1pSVK 及 pVAXl-CAVE 质粒的转化
[0085]将质粒pVAXl-CAVE和pSVK分别转化E.col1.DH5 α感受态大肠杆菌，具体操作步骤如下:
[0086]a.从_70°C冰箱取2支感受态E.col1.DH5 α，立即置于冰浴中，分别加入上述质粒各I μ 1，轻柔混匀后于4°C冰箱中冰浴30min ；
[0087]b.冰浴结束后，将上述感受态细胞转移至42°C水浴锅中热休克90s ；
[0088]c.热休克结束后，将感受态细胞重新放置在冰浴中静置l_2min ;
[0089]d.取转化后的菌体分别均匀涂布于含10 μ g/mL(pSVK)、50 μ g/mL (p VAX 1-CAVE)卡那霉素抗性的LB平板培养基上，37°C培养箱中倒置培养约12h ；
[0090]e.培养结束后，挑取单一克隆菌落，分别接种于含有上述卡那霉素抗性的LB液体培养基中，置于37°C摇床中振荡培养过夜(10-12小时)。
[0091]3.2pSVK及pVAXl-CAVE质粒的小量提取
[0092]按照北京三博远志生物技术有限责任公司质粒小量提取试剂盒抽提这两种质粒，具体操作步骤参见质粒小量提取试剂盒说明书。
[0093]3.3pSVK载体的酶切、纯化
[0094]首先利用限制性内切酶Sma I对pSVK载体进行单酶切，使环状质粒线性化，获得拥有两个平端的线性化的pSVK载体，酶切体系如下:
[0095]
【权利要求】
1.一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其活性成分包括以下组分: 1)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤抗原复合基因(CAVA)的抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗，命名为pSVK-CAVA，所述肿瘤抗原复合基因(CAVA)自5’端至3’端依次由凋亡抑制蛋白Survivin肿瘤抗原(SUR)基因、异位人绒毛膜促性腺激素hCG β -CTP37 (hmCTP)基因、人 IgG Fe 段基因(GenBank 号:Z17370)、GPI 基因(GenBank 号:XM676434)、IRES 序列、GM-CSF 基因(GenBank 号:NM-000758)和 B7.1 基因(GenBank 号:NM-005191)组成； 2)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因(CAVE)的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗，命名为pSVK-CAVE，所述肿瘤血管复合基因(CAVE)自5’端至3’端依次由异种化的小鼠VEGFR2胞外l-4IgG样区域(肿瘤血管靶抗原)基因、人IgG Fe段(GenBank 号:Z17370)基因、GPI 基因(GenBank 号:XM676434)、IRES 序列和人 IL_12(包含P35和p40两个亚基，通过Furin2A多肽连接)基因组成。
2.根据权利要求1所述的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于:所述复制子DNA疫苗载体pSVK的核苷酸序列如序列表中序列I所示。
3.根据权利要求1或2所述的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于:所述肿瘤抗原复合蛋白(CAVA)的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
4.根据权利要求3所述的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于:编码所述肿瘤抗原复合蛋白(CAVA)的氨基酸残基序列如序列表中序列3所示。
5.根据权利要求1至4任一所述的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
6.根据权利要求1或2所述的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于:所述肿瘤血管复合蛋白(CAVE)的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
7.根据权利要求6所述的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于:编码肿瘤血管复合蛋白(CAVE)的氨基酸残基序列如序列表中序列6所示。
8.根据权利要求6或7所述的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于:抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE的核苷酸序列如序列表中序列7所示。
【文档编号】A61K48/00GK103948944SQ201410211389
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月19日 优先权日:2013年5月20日
【发明者】于继云, 阎瑾琦, 王伟, 张亮, 徐元基, 张巍, 贾锐, 王越, 王宇 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所