一种猪附红细胞体病疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪附红细胞体病疫苗及其制备方法。本发明中包含：猪附红细胞体的培养、猪附红细胞体灭活、疫苗佐剂的乳化等制备工艺获得灭活的猪附红细胞体疫苗，对其稳定性、黏度等理化性质进行检测，并通过小鼠检测疫苗的安全性、给小猪进行免疫实验，进行了特异性免疫和非特异性两个方面的免疫检测，以及灭活疫苗对动物的保护作用以及疫苗临床效果的检测。优势特点:从临床和实验数据可以看出本疫苗具有安全性和保护性，还具有制作工艺简单，易获得、成本低等特点，可以大量用于兽医临床。本发明对猪附红细胞体的预防具有重要的作用，对减少猪附红细胞体病对养猪业带来的损失具有很重要的临床意义。
【专利说明】一种猪附红细胞体病疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于家畜疫苗【技术领域】，特别涉及一种猪附红细胞体病预防的疫苗及其制备方法，是兽医领域的一种有效、安全的疫苗。
【背景技术】
[0002]猪附红细胞体病是由猪附红细胞体(M.suis)引起，具有宿主专一性特点，常引起机体发热、溶血、黄疸等症状的人兽共患传染病。该病可引起新生仔猪和断奶仔猪虚弱和贫血，肥育猪生长缓慢，母猪繁殖障碍、受胎率低、不发情、流产和死胎等综合性症状。它不仅导致畜产品质量和产量的降低，还可造成猪只大批死亡。更严重的是感染附红细胞体病的猪只免疫机能大大下降，会继发感染其他的病症，比如断奶野猪圆环病毒与猪附红细胞体、猪附红细胞体与皮肤疥螨混合性感染、非典型性猪瘟与猪附红细胞体病混合感染等，这些混合感染对该病的治疗增加了难度，给养猪业带来严重的经济损失。此病感染极具普遍性，且为隐性感染，给我国养猪业带来严重的隐患与危害，因此，对M.suis病的预防是极为重要的。但是，目前仍缺少一种能够广泛应用于临床的安全、有效、生产成本较低的疫苗对该病进行预防。
[0003]进年来，也有猪附红细胞体疫苗的研究。吕舟、郑秀红等研究的亚单位疫苗，对小鼠有一定的效果，但疫苗能否在其他动物体内产生免疫保护作用还有待于进一步研究，其临床意义甚少；Ηοθ1ζ1θ K等研究的疫苗可产生强的免疫水平，但不能起保护作用。此灭活疫苗结合了临床和实 验室两个方面对其免疫效果和保护作用的研究，从特异性和非特异性2个方面等对其免疫效果进行检测。
[0004]基于上述问题，本发明提供了一种能够预防猪附红细胞体的灭活疫苗及其制备方法，为猪附红细胞体病预防提供了理论基础。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了解决目前市场和临床上没有一种安全、有效的预防猪附红细胞体的疫苗，而提供一种猪附红细胞体灭活疫苗及其制备方法。
[0006]一种猪附红细胞体病疫苗的制备方法，包括以下步骤:
[0007]将感染了猪附红细胞体的红细胞接种到细胞培养基中，培养基配方:60_65wt%PPLO肉汤基础液、5-10wt % M199基础液，9_10wt %的0.25wt %的酵母浸出液、
2.5-3.5wt %浓度为0.5g/mL的葡萄糖溶液、l_2wt %浓度为4.5mg/mL的L-丝氨酸、
0.5-lwt%浓度为4mg/mL的NAD、10_15wt%*活猪血清组成；培养过程中用超声波解离猪附红细胞体成单个病原体进行培养，检测其个数达到2.5-3.0xlO9个/mL ;然后将培养得到的猪附红细胞体灭活用于制备灭活疫苗。
[0008]培养基配方优选:60wt% PPLO肉汤基础液、1wt % M199基础液，1wt %的浓度为
0.25g/mL酵母浸出液、2.5wt%浓度为0.5g/mL的葡萄糖溶液、2wt %浓度为4.5mg/mL的L-丝氨酸、0.5wt%的浓度为4mg/mL的NAD、15wt%灭活猪血清组成。[0009]所述的猪附红细胞体病疫苗的制备方法:
[0010]将感染了猪附红细胞体的红细胞接种到细胞培养基中，置于37°C、含5% -10%CO2的培养箱培养，72h后红细胞溶血后更换培养基，再连续培养30d，每6d更换一次培养液，充分减少红细胞膜成份，用超声波解离猪附红细胞体成单个病原体后继续培养增殖，再次超声解离，检测其个数。
[0011]上述方法采用甲醛灭活猪附红细胞体。具体是采用浓度为0.3-0.5%的甲醛在37°C灭活猪附红细胞体20-28h。优选采用浓度为0.4%的甲醛在37°C灭活猪附红细胞体24h。
[0012]上述方法将灭活的猪附红细胞体作为水相与油相混合均匀，乳化后得到水包油的灭活疫苗即为制备好的灭活疫苗。具体是将油相和水相按体积1:1-2:1混合，抗原的浓度为4.28x108-4.48x10s个/mL。优选将油相和水相按体积1:1混合，抗原的浓度为4.38x10s个 /mL。
[0013]一种猪附红细胞体病疫苗，是由上述方法制备得到的疫苗。
[0014]现有技术中在猪附红细胞体的体外培养方面，Nonakaetal尝试了 M.suis的体外培养，选用添加肌昔的伊格尔(氏)培养(rEM)，并观察到染虫率的上升；国内张守发等、房春林等、张雪峰、郑海红等添加牛血清等成份的PRM1-1640，以阴性动物红细胞为载体均报道染虫率有一定程度的上升；李晓云用霉形体培养基培养M.suis，形成了猪附红细胞体的血影，且培养后增值的速度比较缓慢，这会影响猪附红细胞体的计数，而本发明的创新点在于疫苗制备所用的猪附红细胞体的培养基在李晓云等基础上进行了改进，主要是减少了PPLO基础液浓度，增加了 M199基础液，用猪血清替代了牛血清等；采用超声方法30min-lh使猪附红细胞体成 为单个存在的个体，使得猪附红细胞体的增值比较明显，同时有利于计数。
[0015]本发明的创新点主要在于猪附红细胞体的培养效果，李晓云方法培养的猪附红细胞体增殖较缓慢，因为猪附红细胞体成团存在，影响了其增殖，本发明用超声的方法将猪附红细胞体分离成单个后再培养有利于猪附红细胞体的增殖，其增殖的速度可以达30-40%。
[0016]本发明效果还在于，能够对猪附红细胞体的抗原能够引起较好的免疫反应，而不会引起其他的不良反应，且本发明制作工艺过程及结构简单，成本较低，使用安全可靠，适于大范围推广使用。
【具体实施方式】
[0017]以下结合实施案例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0018]疫苗的制备采用的是比较有效的、方便的灭活方式，对其检测也比较直观、可行。
[0019]能够通过实验室和临床结合的方式对疫苗的免疫效果、保护力效果进行实验，为以后的临床运用提供了可靠的依据，提高了研究的可行性。
[0020]实施例1、疫苗的制备包括以下步骤:
[0021]1、猪附红细胞体的培养。将感染了猪附红细胞体的红细胞接种到细胞培养瓶中，置于37°C、含5% CO2的培养箱培养，约72h后红细胞溶血变为带虫血影，再连续培养30天，充分减少红细胞膜成份，用超声波解离猪附红细胞体血影成单个病原体，用红细胞计数板计数后继续培养，到48h增殖到高峰，增殖数目达到30-40%，随后降低，在视野中可见到连成2 — 6个数量不等的增殖的猪附红细胞体，再将其超声成单个抗原，检测其个数，个数达到2.87xl09个/mL，用于疫苗制备。培养基配方:60-65% PPLO肉汤基础液、5-10% M199基础液，9-10%的0.25%酵母浸出液(酵母浸出膏溶于水制备得酵母浸出液)、2.5-3.5%浓度为0.5g/mL的葡萄糖溶液、1-2%浓度为4.5mg/mL的L-丝氨酸、0.5_1%浓度为4mg/mL的NAD、10-15%灭活猪血清组成。
[0022]2、疫苗水相的制备。选择甲醛为灭活抗原的灭活剂，利用不同的浓度进行灭活后对猪附红细胞体进行计数，找出最佳的灭活浓度；确定好灭活剂浓度后，确定灭活的时间，整个确定的灭活时间为24h，甲醛的浓度为0.4%，灭活的温度为37°C。
[0023]3、疫苗油相的制备。选择佐剂为疫苗佐剂，各试剂按照最佳配比成分添加，混匀后为制备好的油相。油相在显微镜下形成的大小基本一致油泡，不同视野中，数目和每个油泡差别不大，油相混合均匀。
[0024]4、疫苗的制备。将油相和水相1:1混合，猪红细胞体的蛋白浓度为8.703mg/mL，抗原的浓度为4.38x10s个/mL ;用磁力搅拌器使水相和油相混合均匀，乳化后得到水包油的灭活疫苗即为制备好的灭活疫苗。检测疫苗的稳定性、黏度、均匀度、以及油佐剂疫苗的型号等方面。稳定性:疫苗滴入清水中1min后，疫苗油滴在水中没有出现分散现象，疫苗离心2500、3000、3500rpmin离心15min后，均未观察有无分层现象；老化试验:疫苗放在37°C恒温培养箱10d、20d、30d后，未观察到有破乳现象；粘度试验:疫苗从ImL的吸液管中放出
0.5mL所需时间为5s ，其粘度是比较适合注射到动物体内的。
[0025]实施例2、疫苗效果的评价
[0026]1、安全性评价。
[0027]制备疫苗如上述所述，将制备好的疫苗注射20只昆明系小白鼠，每只肌肉注射
0.2mL，观察小鼠的饮食和精神状态，未发现很大的变化、21d小鼠无死亡。
[0028]将制备好的疫苗注射10头母猪、10头哺乳仔猪、10头保育猪、10头育肥猪，观察猪的精神状态、呼吸、脉搏正常，21d未出现死亡。
[0029]2、小白鼠免疫效果评价
[0030]将30只昆明小白鼠，随机分成2组，每组15只，肌肉注射0.2mL制备好的疫苗，7d后加强免疫一次，对照组注射同等剂量的生理盐水。观察对照组和免疫组的小鼠精神状态，21d后处死小鼠，称小鼠的体重、脾脏和胸腺的重量，测定小鼠的脾脏和胸腺指数。疫苗组小鼠的脾脏和胸腺指数均比对照组高，表明疫苗能够提高对小鼠的免疫反应。小鼠的脾脏和胸腺指数结果如下:
[0031]
【权利要求】
1.一种猪附红细胞体病疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 将感染了猪附红细胞体的红细胞接种到细胞培养基中，培养基配方:60-65wt% PPLO肉汤基础液、5_10wt% M199基础液，9-1(^七％的0.25wt%的酵母浸出液、2.5-3.5界七％浓度为0.5g/mL的葡萄糖溶液、l-2wt%浓度为4.5mg/mL的L-丝氨酸、0.5-lwt%浓度为4mg/mL的NAD、10-15wt%灭活猪血清组成；培养过程中用超声波解离猪附红细胞体成单个病原体进行培养，检测其个数达到2.5-3.0xlO9个/mL ;然后将培养得到的猪附红细胞体灭活用于制备灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的猪附红细胞体病疫苗的制备方法，其特征在于，培养基配方:60wt% PPLO肉汤基础液、10wt% M199基础液，10被％的浓度为0.25g/mL酵母浸出液、2.5wt%浓度为0.5g/mL的葡萄糖溶液、2wt%浓度为4.5mg/mL的L-丝氨酸、0.5wt%的浓度为4mg/mL的NAD、15wt%灭活猪血清组成。
3.根据权利要求1所述的猪附红细胞体病疫苗的制备方法，其特征在于， 将感染了猪附红细胞体的红细胞接种到细胞培养基中，置于37°C、含5% -10% CO2的培养箱培养，72h后红细胞溶血后更换培养基，再连续培养30d，每6d更换一次培养液，充分减少红细胞膜成份，用超声波解离猪附红细胞体成单个病原体后继续培养增殖，再次超声解离，检测其个数。
4.根据权利要求1所述的猪附红细胞体病疫苗的制备方法，其特征在于， 采用甲醛灭活猪附红细胞体。
5.根据权利要求4所述的猪附红细胞体病疫苗的制备方法，其特征在于， 采用浓度为0.3-0.5%的甲醛在37°C灭活猪附红细胞体20-28h。
6.根据权利要求5所述的猪附红细胞体病疫苗的制备方法，其特征在于， 采用浓度为0.4%的甲醛在37°C灭活猪附红细胞体24h。
7.根据权利要求1所述的猪附红细胞体病疫苗的制备方法，其特征在于，将灭活的猪附红细胞体作为水相与油相混合均匀，乳化后得到水包油的灭活疫苗即为制备好的灭活疫苗。
8.根据权利要求7所述的猪附红细胞体病疫苗的制备方法，其特征在于，将油相和水相按体积1:1-2:1混合，抗原的浓度为4.28x108-4.48x10s个/mL。
9.根据权利要求8所述的猪附红细胞体病疫苗的制备方法，其特征在于，将油相和水相按体积1:1混合，抗原的浓度为4.38xl08个/mL。
10.一种猪附红细胞体病疫苗，是由权利要求1-9任一种方法制备得到的疫苗。
【文档编号】A61P31/04GK104027796SQ201410288734
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】贾杏林, 唐丽, 李晓云 申请人:湖南农业大学