响应面法优化超声-微波协同提取的山茱萸总皂苷及方法
【专利摘要】本发明响应面法优化超声-微波协同提取山茱萸总皂苷的方法，包括以下步骤：(1)材料处理，得到山茱萸药材粉末；(2)超声-微波协同提取，得到总皂苷样液；(3)大孔树脂纯化，洗脱液浓缩干燥后得到粉末状的山茱萸总皂苷。本发明山茱萸总皂苷，由以上所述的提取方法制得。本发明通过结合超声波的空化作用和微波的高能红外加热作用，实现对样品进行快速、高效、可靠地处理，在缩短提取时间，提高提取效率，保证提取物结构的同时，通过分别对料液比、微波功率、超声功率和提取时间的进行限定，山茱萸总皂苷的提取率达到13.96mg/g，提取率提高达20％，原料利用率高，高效省时，大大节约了成本，适应于工业生产。
【专利说明】响应面法优化超声-微波协同提取的山茱萸总皂苷及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于总皂苷的提取【技术领域】，涉及响应面法优化超声-微波协同提取的山 茱萸总皂苷及方法。
【背景技术】
[0002] 山茱萸为山茱萸科山茱萸属多年生植物，其药用部位为成熟果实去核后的干燥果 肉，是世界上三大名贵木本药材之一，具有补肝益肾、涩精固脱、内热消渴等功效。山茱萸果 肉中含有环烯醚萜类、皂苷类、鞣质类、多糖、维生素、氨基酸和矿物质等多种有效成分。现 代药理学研究表明，皂苷是山茱萸的重要生物活性成分之一，具有调节免疫、降血糖、抗心 律失常及抑制细胞株增殖分裂等作用。
[0003] 目前，有关山茱萸总皂苷的提取方法包括浸提法、回流法、超声法和微波法等。其 中浸提法、回流法耗时且提取率低；超声法、微波法则杂质多，提取不彻底等缺点，并且由于 提取条件的限定没有统一标准，对山茱萸不能充分利用，提取率低，无法满足山茱萸总皂苷 工业生产的提取要求。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种提取率高，时间短，参数控制精准 的，响应面法优化超声-微波协同提取的山茱萸总皂苷的及方法。
[0005] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0006] 本发明响应面法优化超声-微波协同提取山茱萸总皂苷的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)材料处理：
[0008] 将新鲜成熟的山茱萸果实在开水中浸泡数分钟后，流水冲洗冷却，剥除果核；将剩 余的果肉干燥后粉碎，过40目筛，得到山茱萸药材粉末；
[0009] (2)超声-微波协同提取：
[0010] 称取一定量的山茱萸药材粉末，置于反应容器中，按料液比为1: 1〇?1:30的比例 加入体积分数为70 %的乙醇溶液并密封，连接好冷凝装置，在温度70°C，微波功率200? 600W，超声功率240?420W的条件下提取3?12min得到提取液；提取液挥去乙醇后通过 水饱和正丁醇萃取，合并萃取液后减压挥去正丁醇，经蒸馏水复溶得到总皂苷样液；
[0011] (3)大孔树脂纯化：
[0012] 将总皂苷样液过HPD-300型大孔树脂，洗脱液浓缩干燥后得到粉末状的山茱萸总 皂苷。
[0013] 优选的，步骤（2)中，将山茱萸药材粉末与体积分数为70%的乙醇溶液按料液比 为1 ;15?1:25混匀，于70°C提取3?9min，微波功率为300?500W，超声功率为300? 420W。
[0014] 优选的，所述的步骤（2)中，将山茱萸粉末与70%乙醇溶液按料液比为1 : 21混 匀，于70°C提取5min，微波功率为417W，超声功率为369W。
[0015] 优选的，所述的料液比1:21，微波功率为417W，超声功率为369W和时间5min的提 取条件由响应面法优化得到，步骤如下；
[0016] 1)制备山茱萸总皂苷样品液；称取山茱萸药材粉末lg，置于反应瓶中，加入70% 的乙醇溶液密封，连接好回流装置，在一定条件下提取，抽滤，挥去乙醇，水饱和正丁醇萃 取，定容至20mL，得到山茱萸总皂苷样品液备用；精密称取齐墩果酸标品2. Omg，用无水乙 醇制得0. 2mg/mL的标准品溶液，并绘制标准曲线；按照标准曲线下的检测方法进行测定， 并根据回归方程计算山茱萸总皂苷样品液中总皂苷的含量；
[0017] 2)单因素实验；根据步骤1)中山茱萸总皂苷样品液的制备方法，分别按料液比、 超声功率、微波功率和提取时间四个单因素设计若干组单因素实验；
[0018] 3)响应面法优化；以山茱萸总皂苷提取率为响应因子，采用Design-Expert软件 中的Box-Behnken原理在步骤2)中单因素实验的基础上进行响应面实验，模拟得到二次多 元回归方程如下：
[0019] R1 = 13. 76 + 0. 34A + 0. 25B + 0. 16C - 1. 22D + 0. 25AB + 0. 34AC - 0. 01AD+0. 42BC+0. 068BD+0. 21CD - 0. 75A2 - 1. 02B2 - 0. 85C2 - 1. 49D2
[0020] 其中，R1为相应因子，A为料液比的影响量，B为微波功率的影响量，C为超声功率 的影响量，D为时间的影响量；
[0021] 4)通过Design-Expert软件对回归方程的求解，得到山茱萸总阜苷提取的最佳 条件为：料液比1:21. 47、微波功率417. 37W、超声功率368. 78W、时间4. 81min ;再以实际 操作为约束条件，将修正得到最佳提取工艺参数为：料液比1:21、微波功率417W、超声功率 369W、时间 5min。
[0022] 本发明响应面法优化超声-微波协同提取的山茱萸总皂苷，由以上任意一项技术 方案所述的提取方法制得。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0024] 本发明通过结合超声波的空化作用和微波的高能红外加热作用，实现对样品进 行快速、高效、可靠地处理，在缩短提取时间，提高提取效率，保证提取物结构的同时，通过 分别对料液比、微波功率、超声功率和提取时间的进行限定，山茱萸总皂苷的提取率达到 13. 96mg/g，相比较超声或微波辅助技术，使提取率提高达20 %，在时间上仅为超声辅助技 术的1/4,原料利用率高，高效省时，大大节约了成本，适应于工业生产。
[0025] 进一步的通过采用响应面法，分别对料液比、微波功率、超声功率和提取时间的进 行优化，确定了在超声-微波协同提取下最优的工艺参数区间，以及工艺参数的最优取值； 响应面法优化是配合单因素变量的分析和设置，通过对回归模拟分析得到最佳工艺参数， 回归方程精度高，拟合性好，使得在最优的工艺参数区间内得到超声微波提取工艺的最佳 提取参数，对山茱萸总皂苷的提取更为精准，提高工业生产中的效率和产值。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1是料液比对总皂苷提取率的影响图，其中：微波功率为500W，超声功率为 360W，时间为 6min。
[0027] 图2是微波功率对总皂苷提取率的影响图，其中：料液比为1:20,超声功率为 360W，时间为 6min。
[0028] 图3是超声功率对总皂苷提取率的影响图，其中：料液比为1:20,微波功率为 400W，时间为 6min。
[0029] 图4是时间对总皂苷提取率的影响图，其中：料液比为1:20,微波功率为400W，超 声功率为360W。
[0030] 图5是料液比和微波功率对总皂苷提取率影响图，5a为响应曲面图，5b为等高线 图。
[0031] 图6是料液比和超声功率对总皂苷提取率影响图，6a为响应曲面图，6b为等高线 图。
[0032] 图7是料液比和时间对总皂苷提取率影响图，7a为响应曲面图，7b为等高线图。
[0033] 图8是微波功率和超声功率对总皂苷提取率影响图，8a为响应曲面图，8b为等高 线图。
[0034] 图9是微波功率和时间对总皂苷提取率影响图，9a为响应曲面图，9b为等高线图。
[0035] 图10是超声功率和时间对总皂苷提取率影响图，10a为响应曲面图，10b为等高线 图。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0037] 实例 1
[0038] 本发明响应面法优化超声-微波协同提取山茱萸总皂苷的方法，包括如下步骤：
[0039] (1)材料处理：将新鲜成熟的山茱萸果实在开水中浸泡数分钟后，流水冲洗冷却， 剥除果核；将剩余的果肉干燥后粉碎，过40目筛，得到山茱萸药材粉末；
[0040] (2)超声-微波协同提取：称取一定量的山茱萸药材粉末，置于反应容器中，按 料液比为1:21的比例加入体积分数为70 %的乙醇溶液并密封，连接好冷凝装置，在温度 70°C，微波功率417W，超声功率369W的条件下提取5min得到提取液；提取液挥去乙醇后通 过水饱和正丁醇萃取，合并萃取液后减压挥去正丁醇，经蒸馏水复溶得到总皂苷样液；
[0041] (3)大孔树脂纯化：将总皂苷样液过HPD-300型大孔树脂，洗脱液浓缩干燥后得到 粉末状的山茱萸总皂苷。
[0042] 经计算得到的山茱萸总皂苷的提取率达13. 96mg/g。
[0043] 实例 2
[0044] 本发明响应面法优化超声-微波协同提取山茱萸总皂苷的方法，包括如下步骤：
[0045] (1)材料处理：将新鲜成熟的山茱萸果实在开水中浸泡数分钟后，流水冲洗冷却， 剥除果核；将剩余的果肉干燥后粉碎，过40目筛，得到山茱萸药材粉末；
[0046] (2)超声-微波协同提取：称取一定量的山茱萸药材粉末，置于反应容器中，按 料液比为1:10的比例加入体积分数为70 %的乙醇溶液并密封，连接好冷凝装置，在温度 70°C，微波功率600W，超声功率500W的条件下提取6min得到提取液；提取液挥去乙醇后通 过水饱和正丁醇萃取，合并萃取液后减压挥去正丁醇，经蒸馏水复溶得到总皂苷样液；
[0047] (3)大孔树脂纯化：将总皂苷样液过HPD-300型大孔树脂，洗脱液浓缩干燥后得到 粉末状的山茱萸总皂苷。
[0048] 经计算得到的山茱萸总皂苷的提取率达11. 68mg/g。
[0049] 实例 3
[0050] 本发明响应面法优化超声-微波协同提取山茱萸总皂苷的方法，包括如下步骤：
[0051] (1)材料处理：将新鲜成熟的山茱萸果实在开水中浸泡数分钟后，流水冲洗冷却， 剥除果核；将剩余的果肉干燥后粉碎，过40目筛，得到山茱萸药材粉末；
[0052] (2)超声-微波协同提取：称取一定量的山茱萸药材粉末，置于反应容器中，按 料液比为1:15的比例加入体积分数为70 %的乙醇溶液并密封，连接好冷凝装置，在温度 70°C，微波功率200W，超声功率420W的条件下提取9min得到提取液；提取液挥去乙醇后通 过水饱和正丁醇萃取，合并萃取液后减压挥去正丁醇，经蒸馏水复溶得到总皂苷样液；
[0053] (3)大孔树脂纯化：将总皂苷样液过HPD-300型大孔树脂，洗脱液浓缩干燥后得到 粉末状的山茱萸总皂苷。
[0054] 经计算得到的山茱萸总皂苷的提取率达11. 84mg/g。
[0055] 实例 4
[0056] 本发明响应面法优化超声-微波协同提取山茱萸总皂苷的方法，包括如下步骤：
[0057] (1)材料处理：将新鲜成熟的山茱萸果实在开水中浸泡数分钟后，流水冲洗冷却， 剥除果核；将剩余的果肉干燥后粉碎，过40目筛，得到山茱萸药材粉末；
[0058] (2)超声-微波协同提取：称取一定量的山茱萸药材粉末，置于反应容器中，按 料液比为1:25的比例加入体积分数为70 %的乙醇溶液并密封，连接好冷凝装置，在温度 70°C，微波功率300W，超声功率240W的条件下提取12min得到提取液；提取液挥去乙醇后 通过水饱和正丁醇萃取，合并萃取液后减压挥去正丁醇，经蒸馏水复溶得到总皂苷样液；
[0059] (3)大孔树脂纯化：将总皂苷样液过HPD-300型大孔树脂，洗脱液浓缩干燥后得到 粉末状的山茱萸总皂苷。
[0060] 经计算得到的山茱萸总皂苷的提取率达12. 05mg/g。
[0061] 实例 5
[0062] 本发明响应面法优化超声-微波协同提取山茱萸总皂苷的方法，包括如下步骤：
[0063] (1)材料处理：将新鲜成熟的山茱萸果实在开水中浸泡数分钟后，流水冲洗冷却， 剥除果核；将剩余的果肉干燥后粉碎，过40目筛，得到山茱萸药材粉末；
[0064] (2)超声-微波协同提取：称取一定量的山茱萸药材粉末，置于反应容器中，按 料液比为1:30的比例加入体积分数为70 %的乙醇溶液并密封，连接好冷凝装置，在温度 70°C，微波功率500W，超声功率300W的条件下提取3min得到提取液；提取液挥去乙醇后通 过水饱和正丁醇萃取，合并萃取液后减压挥去正丁醇，经蒸馏水复溶得到总皂苷样液； [0065] (3)大孔树脂纯化：将总皂苷样液过HPD-300型大孔树脂，洗脱液浓缩干燥后得到 粉末状的山茱萸总皂苷。
[0066] 经计算得到的山茱萸总皂苷的提取率达12. 79mg/g。
[0067] 为了确定本发明的最佳原料配比和最佳工艺步骤，发明人进行了大量的实验室研 究试验，试验情况如下。
[0068] -、选取的材料、仪器和试剂。
[0069] 山茱萸于2010年10月采集于浙江淳安，称取已去核的山茱萸干燥果肉，粉碎，过 40目筛后放置在干燥器中备用。
[0070] 仪器包括X0-200微波超声波组合反应系统（南京先欧仪器制造有限公司）；超 微量微孔板分光光度计（美国BioTek) ;RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）； HH-2B型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；SHB-HIA型循环水式多用真空泵（陕西太 康生物科技有限公司）；DFT-50手提式粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。
[0071] 试剂包括购自于Sigma公司的齐墩果酸标品；均为分析纯的无水乙醇、香草醛、冰 醋酸、高氯酸、正丁醇。
[0072] 二、试验方法如下。
[0073] 山茱萸总皂苷样品的制备；称取山茱萸药材粉末lg，置于反应瓶中，加入70%的 乙醇溶液密封，连接好回流装置，在一定条件下提取，抽滤，挥去乙醇，水饱和正丁醇萃取， 定容至20mL，备用。一定条件至少包括加入的料液比，提取时的超声功率、微波功率和提取 时间四个条件。
[0074] 1、标准曲线的绘制。
[0075] 精密称取齐墩果酸标品2. Omg，无水乙醇定容至10mL容量瓶中，即得0. 2mg/mL 的标准品溶液。精密吸取标品溶液 〇. 〇〇、〇. 18、0. 24、0. 30、0. 36、0. 42、0. 48、0. 54、0. 60、 0. 66、0. 72mL至lOmL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后，依次加入新配制的5%香草醛-冰醋 酸0. 2mL，高氯酸0. 8mL，60°C水浴15min。取出置冰水中冷却，再加冰醋酸5mL，摇匀后于 550nm波长下测定吸光度（A值）。以齐墩果酸的浓度c ( μ g/mL)为横坐标，A值为纵坐标， 绘制标准曲线得：A = 0. 0475c - 0. 0376,其中 R2 = 0. 9993。
[0076] 总皂苷含量测定：精密吸取山茱萸样品液50 μ L，按照标准曲线下的检测方法进 行测定，并根据回归方程计算总皂苷的含量。
[0077] 2、单因素实验设计。
[0078] 根据样品液的制备方法，分别设置料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)、超声功 率（240、300、360、420、480吣、微波功率（200、300、400、500、600吣和提取时间（3、6、9、12、 15min)4个单因素实验，研究各个因素对山茱萸总皂苷提取率的影响。
[0079] 3、响应面优化实验设计。
[0080] 根据单因素实验结果，选取料液比、超声功率、微波功率和时间4个因素并确定各 个因素适宜的水平数，以山茱萸总皂苷提取率（R1)为响应因子，采用Design-Expert软件 中的Box-Behnken原理进行响应面实验设计，并对实验结果进行分析。选取的因素水平及 编码见表1。
[0081] 表lBox-Behnken设计实验因素水平及编码
[0082]
【权利要求】
1. 响应面法优化超声-微波协同提取山茱萸总皂苷的方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 材料处理： 将新鲜成熟的山茱萸果实在开水中浸泡数分钟后，流水冲洗冷却，剥除果核；将剩余的 果肉干燥后粉碎，过40目筛，得到山茱萸药材粉末； (2) 超声-微波协同提取： 称取一定量的山茱萸药材粉末，置于反应容器中，按料液比为1:10?1:30的比例加入 体积分数为70%的乙醇溶液并密封，连接好冷凝装置，在温度70°C，微波功率200?600W， 超声功率240?420W的条件下提取3?12min得到提取液；提取液挥去乙醇后通过水饱和 正丁醇萃取，合并萃取液后减压挥去正丁醇，经蒸馏水复溶得到总皂苷样液； (3) 大孔树脂纯化： 将总皂苷样液过HPD-300型大孔树脂，洗脱液浓缩干燥后得到粉末状的山茱萸总皂 苷。
2. 根据权利要求1所述的响应面法优化超声-微波协同提取山茱萸总皂苷的方法，其 特征在于：所述的步骤（2)中，将山茱萸药材粉末与体积分数为70%的乙醇溶液按料液比 为1 ;15?1:25混匀，于70°C提取3?9min，微波功率为300?500W，超声功率为300? 420W。
3. 根据权利要求1或2所述的响应面法优化超声-微波协同提取山茱萸总皂苷的方 法，其特征在于：所述的步骤（2)中，将山茱萸粉末与70%乙醇溶液按料液比为1 : 21混 匀，于70°C提取5min，微波功率为417W，超声功率为369W。
4. 根据权利要求3所述的响应面法优化超声-微波协同提取山茱萸总皂苷的方法，其 特征在于：所述的料液比1:21，微波功率为417W，超声功率为369W和时间5min的提取条件 由响应面法优化得到，步骤如下； 1) 制备山茱萸总皂苷样品液；称取山茱萸药材粉末lg，置于反应瓶中，加入70%的乙 醇溶液密封，连接好回流装置，在一定条件下提取，抽滤，挥去乙醇，水饱和正丁醇萃取，定 容至20mL，得到山茱萸总皂苷样品液备用；精密称取齐墩果酸标品2. Omg，用无水乙醇制得 0. 2mg/mL的标准品溶液，并绘制标准曲线；按照标准曲线下的检测方法进行测定，并根据 标准曲线的线性回归方程计算山茱萸总皂苷样品液中总皂苷的含量； 2) 单因素实验；根据步骤1)中山茱萸总皂苷样品液的制备方法，分别按料液比、超声 功率、微波功率和提取时间四个单因素设计若干组单因素实验； 3) 响应面法优化；以山茱萸总皂苷提取率为响应因子，采用Design-Expert软件中的 Box-Behnken原理在步骤2)中单因素实验的基础上进行响应面实验，模拟得到二次多元回 归方程如下： R1 = 1 3. 76 + 0. 34A + 0. 25B + 0. 16C - 1. 22D + 0. 25AB + 0. 34AC - 0. 01AD+0. 42BC+0. 068BD+0. 21CD - 0. 75A2 - 1. 02B2 - 0. 85C2 - 1. 49D2 其中，R1为相应因子，A为料液比的影响量，B为微波功率的影响量，C为超声功率的影 响量，D为时间的影响量； 4) 通过Design-Expert软件对回归方程的求解，得到山茱萸总皂苷提取的最佳条件 为：料液比1:21. 47、微波功率417. 37W、超声功率368. 78W、时间4. 81min ;再以实际操作为 约束条件，将修正得到最佳提取工艺参数为：料液比1:21、微波功率417W、超声功率369W、 时间5min。
5.响应面法优化超声-微波协同提取的山茱萸总皂苷，其特征在于，所述的山茱萸总 皂苷由权利要求1-4中任意一项所述的提取方法制得。
【文档编号】A61P3/10GK104107208SQ201410325553
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】康杰芳, 王红菊, 杨宁, 白嫄, 王韶君, 王喆之 申请人:陕西师范大学