林蛙提取混合液及其在治疗及预防脚气的药物中的用途
【专利摘要】一种林蛙提取混合液及其在治疗及预防脚气的药物中的用途，属于医学生物制药【技术领域】。是将林蛙干除杂除尘后粉碎，再加入复合酶水解液，取离心后的上层上清液；将剩余混合物研磨后剪切，喷雾干燥成粉末状，将该超微粉加入到醋酸中超声后纱网过滤，离心后取上清液减压浓缩，从而得到多糖、抗菌肽和钙离子的混合物；将上述物质混合得到林蛙提取混合液。该混合液是纯生物制剂，无任何副作用，所含抑菌效果显著的小分子抗菌肽结合钙离子，增强其对真菌细胞壁的破坏，并能更好地进入真菌细胞达到抑菌效果；所含短肽胶原蛋白在多糖的作用下可更好的进入正常细胞，给予细胞充足营养，增强细胞防御功能，帮助正常细胞抵御外界破坏因素，并可修复受损细胞。
【专利说明】林蛙提取混合液及其在治疗及预防脚气的药物中的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于医学生物制药【技术领域】，具体涉及一种林蛙提取混合液及其在制备治疗及预防脚气的药物中的用途。
【背景技术】
[0002]脚气，是一种极常见的皮肤病。成人中70?80%的人患有脚气，只是轻重不同而已。常在夏季加重，冬季减轻，也有人终年不愈。致病菌多系毛癣菌属与表皮癣菌种，主要菌种有红色毛癣菌、石膏样毛癣菌、絮状表皮癣菌、玫瑰色毛癣菌。脚气不易治愈的主要原因除去这些真菌有较强的耐药性之外，在治疗过程中，病患处的湿润、厌氧环境又是其剩余真菌的有力温床；同时患者体内含有真菌，当外用停止给药时,体内的真菌可继续繁殖,导致了脚气的反复发作，很难根治。
[0003]目前，国内对林蛙皮抗菌肽进行了研究，申报的专利也在增多，以林蛙为关键词，检索国内外专利，没有查到国外关于林蛙的专利，国内专利中CN1216768A “生物抗菌肽及其制备方法”是涉及一种具有广谱抗菌活性的林蛙蛙皮生物抗菌肽及其制备方法；CN1583166A “林蛙抗菌肽喷雾剂及其制备方法”、CN1583165A “林蛙抗菌肽凝胶剂及其制备方法”是涉及保护林蛙皮肤抗菌肽以喷雾剂和凝胶剂两种形式用于临床皮肤感染、烧伤烫伤感染领域；CN1679632A“林蛙镇痛水提物及其制备方法及其制备方法”是关于保护从林蛙皮中提取的一种具有镇痛作用的林蛙镇痛水提物及其制备技术。均是以林蛙皮为原料，提取了林蛙皮抗菌肽。CN103073628A—种利用超声波从林蛙体中提取抗菌肽的生产制备方法是以林蛙体为原料采用超声提取抗菌肽，提取的抗菌肽是分子量为4KDa最适pH值为3.5，等电点Pl值为8.0 — 10.5的碱性多肽。以上专利均以抗菌肽为保护内容，申请保护其在抗菌方面的作用，所述抗菌是指抵抗细菌和真菌包括大肠杆菌、绿脓杆菌等革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌及临床耐药菌克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、酵母菌的一种或多种；并且抗菌治疗途径均为外用给药。CN103432058A “林蛙胶原蛋白液及其制备工艺”是以林蛙皮提取物、西洋参皂甙、五味子浸出液、芦荟提取物和水配制而成；CN102492760A “一种利用复合酶生产活性东北林蛙胶原蛋白低聚肽的方法”是以干东北林蛙皮为原料；CN102229972A “制备林蛙皮胶原蛋白肽的方法”是以林蛙皮为原料，以上三个专利均是以林蛙皮为原料或主要原料提取林蛙皮中所含的胶原蛋白。
[0004]现有技术中的提取方法均未提取林蛙含有的多糖和钙离子，且仅单纯提取林蛙抗菌肽，或单纯提取林蛙胶原蛋白，最主要的是提取的抗菌肽或胶原蛋白的分子量范围不固定，差值较大，未有详细说明，未将有效成分合理利用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是提供一种林蛙提取混合液，其是由如下步骤制备得到:
[0006](I)将10?45重量份林蛙干除杂除尘后分别经20?100目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒径在500 μ m以下，按照Ig:1?1mL的比例加入复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶I?5wt%、胰蛋白酶2?4wt%，风味蛋白酶I?3wt%，酶解温度为50?55°C，酶解时间为I?2h，酶解pH为7.0?7.5，而后85?90°C下灭酶5?15min，将混合物在温度10?30°C时离心,离心时间为I?5min,离心转速为2000?4000rpm,取离心后混合液体积20?40%的上层上清液，此时上层上清液中含有林蛙干短肽胶原蛋白(由于离心力的作用，短链胶原蛋白将集中在上层上清液中，长链蛋白分子将会集中在混合液的中下层剩余混合物中)，其分子量为2?3KDa，等电点pi值为7.5?7.8，其中碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)占上层上清液的11.04?12.89% (质量比)，酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)占上层上清液的17.99?19.13% (质量比)。
[0007]取上清后剩余混合物(原体积的60?80 % )放入胶体磨，研磨2?15min，使混合物的平均粒径在300 μ m以下；将混合物放入高剪切分散乳化机内，剪切I?15min，使混合物平均粒径在100?200μπι之间，将混合物进行喷雾干燥成粉末状，此时得到林蛙干提取短肽胶原蛋白后剩余纤维、骨质等物质的超微粉；
[0008](2)将纤维、骨质等物质的超微粉加入到质量浓度为2?10%醋酸中，醋酸与超微粉的体积质量比(mL:g)为10:1?40:1 ;超声5?75min，超声温度为4?30°C;经150 μ m纱网过滤，150 μ m纱网上面未过滤物质加入质量体积比为Ig:1?8mL的0.01?0.03mol/L氢氧化钠，进行微波提取，微波功率为500?600W，微波时间3?9min，再次经150 μ m纱网过滤；合并两次滤液，30?50°C下搅拌10?30min,搅拌速度为100?200rpm ;搅拌后的滤液离心，离心温度为4?30°C,离心时间为2?40min,离心转速为2000?15000rpm ;取上清，减压浓缩，压力为600?700托，温度为65?70°C，浓缩体积比为8?40:1，此时得到多糖、抗菌肽和钙离子的混合物，其中多糖的分子量为I?5KDa ;抗菌肽的分子量为I?3KDa，其等电点pi值为7.5?8.0，且其中碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)占多糖、抗菌肽和钙离子混合物的11.28?13.05% (质量比)，酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)占多糖、抗菌肽和钙离子混合物的10.01?11.47% (质量比)；
[0009]将步骤(I)和步骤(2)得到的产物混合，即得到本发明所述的林蛙提取混合液。
[0010]本发明将林蛙所含抑菌效果显著的小分子抗菌肽结合钙离子，增强其对真菌细胞壁的破坏，并能更好地进入真菌细胞达到抑菌效果；短肽胶原蛋白在多糖的作用下可更好的进入正常细胞，给予细胞充足营养，增强细胞防御功能，帮助正常细胞抵御外界破坏因素，并可修复受损细胞。
[0011]所述林蛙提取混合液可以与药学上可接受的载体或赋形剂形成药物制剂，所述制剂可以为喷雾剂、气雾剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂或湿巾等外用剂型。
[0012]所述林蛙提取混合液可以与药学上可接受的载体或赋形剂形成药物制剂，所述制剂可以为口服液、颗粒剂、混悬液、乳剂等口服剂型。
[0013]本发明的目的之二是提供一种治疗及预防脚气的林蛙提取混合液软膏剂，其由如下步骤制备得到:
[0014](I)油相的制备:取5?15重量份石蜡、2?10重量份单硬脂酸甘油脂、10?20重量份白凡士林、5?30重量份液体石蜡、I?15重量份司盘40、2?10重量份乳化剂0P、I?8重量份对羟基苯甲酸乙酯，混合后研磨混匀，得到油相；
[0015](2)林蛙提取混合液软膏剂的制备:将步骤(I)制得的油相与由10?45重量份林蛙干按上述方法制备得到的林蛙提取混合液分别加热至70?100°C，将林蛙提取混合液加入到所述油相中，边加入边搅拌，搅拌时间为10?15min，搅拌速度为100?300rpm，再经纳米匀质机匀质4?7次，115?121°C灭菌10?30min ;将I?5重量份冰片加热到70?100°C过0.45 μ m膜，无菌条件下与上述灭菌后产物混合均匀，即得到本发明所述的用于治疗及预防脚气的林蛙提取混合液软膏剂。
[0016]用法用量:外用，每日早晚两次患部涂敷，I?3mL/次，7天为I疗程。
[0017]本发明的目的之三是提供一种治疗及预防脚气的林蛙提取混合液喷雾剂，其由如下方法制备得到:
[0018]向由10?45重量份林蛙干按上述方法制备得到的林蛙提取混合液中加入2?4重量份的PEG44QQ、1?5重量份的氯化钠、I?2重量份的苯扎溴铵，100?200rpm下搅拌10?25min，加水至1000重量份，150?200rpm下搅拌10?30min，使上述物质充分混匀，115?121°C下灭菌10?20min ；自体冷却至室温后分装入气雾剂瓶，即得林娃提取混合液喷雾剂。
[0019]本发明的目的之四是提供一种治疗及预防脚气的林蛙提取混合液湿巾，其由如下方法制备得到:
[0020]向由10?45重量份林蛙干按上述方法制备得到的林蛙提取混合液中加入2?4重量份的PEG44QQ、1?5重量份的氯化钠、I?2重量份的苯扎溴铵，100?200rpm下搅拌10?25min，加水至1000重量份，150?200rpm下搅拌10?30min，使上述物质充分混匀，115?121°C下灭菌10?20min ;自体冷却至室温后每50?60mL加入到放有(15?20)cmX (15?20)cm无菌无纺布的独立包装袋内，密封即得林蛙提取混合液湿巾。
[0021]本发明的目的之五是提供一种治疗及预防脚气的林蛙提取混合液口服剂，其由如下步骤制备得到:
[0022](I)减压浓缩:将由10?45重量份林蛙干按上述方法制备得到的林蛙提取混合液在减压条件下进行蒸馏，压力在8X 13?3 X 14帕，温度为50?85°C，浓缩比为I?5:1，得浓缩液；
[0023](2)将I?5重量份醋酸锌缓慢加入到浓缩液中，边加入边搅拌，搅拌速度为100?300rpm，搅拌时间为10?15min ;加完后用0.lmol/L的NaOH调节pH为6.2?6.5，搅匀后使其自然沉降，4°C冷却过夜；
[0024](3)将上述产物0.45 μ m滤膜过滤，得澄清液体后，加入5?15重量份柠檬酸、5?25重量份蜂蜜、5?30重量份白砂糖，加热至40?75°C，100?300rpm搅拌，搅拌时间10?30min，混合均匀，趁热0.45 μ m滤膜过滤，再向清液中加入5?15重量份黄原胶和5?15重量份山梨酸钾，经0.22 μ m滤膜精滤；
[0025](4)灌装压盖:在无菌条件下灌装，压盖封口 ；
[0026](5)灭菌:加热到62?65°C，保持30?50min，自体冷却至常温即为林蛙提取混合液口服剂。
[0027]用法用量:内服，每日早晚两次口服，1mL/次，7天为I疗程。
[0028]本发明的积极效果在于:林蛙提取混合液是纯生物制剂，无任何副作用，所含抑菌效果显著的小分子抗菌肽结合钙离子，增强其对真菌细胞壁的破坏，并能更好地进入真菌细胞达到抑菌效果；所含短肽胶原蛋白在多糖的作用下可更好的进入正常细胞，给予细胞充足营养，增强细胞防御功能，帮助正常细胞抵御外界破坏因素，并可修复受损细胞。本发明对皮肤粘膜无刺激、杀菌速度快、使用简便，适合不同年龄人群使用。本发明对足部皮肤具有保护作用，提高足部皮肤防御能力，预防脚气的发病率。毒副作用小，标本兼治，疗效显著，临床症状消失迅速，还可起到预防效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1:林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图。
[0030]采用Tricine电泳法测短肽胶原蛋白分子量，以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，得出所含短肽胶原蛋白分子量约为2?3KDa。
[0031]图中左侧为标准的marker，即标准分子量蛋白质的电泳图，由左向右依次为实施例一中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例二中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例三中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例四中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例五中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图。
[0032]图2:多糖分子量标准曲线。
[0033]以标准葡聚糖Tl (分子量I 000)、T3(分子量3 000)、Τ5(分子量5 000)、Τ10(分子量10 000)，蓝葡聚糖(分子量2 000 000)为标准品，经S印hadex G-25凝胶柱(10cmX 1.5cm)以超纯水洗脱,流速为1.2mL/min, 254nm检测多糖分子量分布，计算出每种标准葡聚糖糖峰洗脱体积。以分子量为200万的蓝葡聚糖和葡萄糖作为标准糖来确定层析柱的外水体积Vo和总体积Vt，Ve为总体积减去外水体积。以Ve/Vt为横坐标，Ig(Mw)为纵坐标作标准曲线，计算多糖分子量的公式为:
[0034]Ig (Mw) = (K1 - K2) Ve/Vt
[0035]Mw:多糖分子量；
[0036]Ve:待测样品的糖峰洗脱体积；
[0037]Vo:分子筛排阻层析柱的外水体积；
[0038]Vt:分子筛排阻层析柱的总体积；
[0039]KpK2S 常数。
[0040]以蓝葡聚糖和不同分子量葡萄糖标准制作得出多糖分子量标准曲线；
[0041]图3:林蛙提取混合液所含多糖经S印hadex G_25凝胶柱层析得到的洗脱曲线。
[0042]采用凝胶层析制备方法检测，用S印hadex G_25凝胶柱层析254nm下紫外检测仪测定林蛙提取混合液洗脱曲线，得出洗脱体积Ve。将洗脱体积Ve，带入公式Ig(Mw)=(K1 -K2) Ve/Vt，根据标准葡聚糖曲线(图2所示曲线)，算出林蛙提取混合液所含多糖分子量Mw约为I?5Kda。
[0043]图4:混合多糖标准RP-HPLC分析图谱。
[0044]采用高效液相色谱法测定绘制单糖标准曲线，称取多糖标准样品，加入ImL无水盐酸-甲醇，充N2封管后，100°C水解16h后吹干液体。甲醇解后的多糖标准样品经干燥后，加入2mol/L三氟乙酸2mL，120°C充N2封管水解3h，水解产物倒入蒸发皿中，加入适量无水乙醇45°C水浴蒸除三氟乙酸。PMP柱前衍生化及其处理，取0.5mL PMP试剂和0.5mL0.3mol/L的NaOH溶液于蒸发皿中，将干燥物溶解后取其中的0.1 mL于小离心管中，7 O °C水浴30min。进行高效液相检测。
[0045]高效液相色谱分析条件
[0046]仪器:Shimadzu LC_14ATvp液相色谱仪，附SPD-10AVD紫外检测器
[0047]色谱柱:DIKMAInertsil 0DS-3 μ m(150X4.6mm)
[0048]检测温度:35°C
[0049]检测波长:245nm
[0050]洗脱液:82%PBS (0.1M, pH7.0), 18% Acetonitrile (v/v)
[0051]流速:1.0mT ,/mi η
[0052]图5:林蛙提取液所含多糖组分的RP-HPLC分析图谱。
[0053]采用高效液相法分析其单糖组成情况，利用混合多糖的标样确定组分中单糖的比例。林蛙提取混合液中含有的单糖有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸，其中鼠李糖:甘露糖:半乳糖:葡萄糖:木糖:阿拉伯糖:岩藻糖的比例约为1:4:6:12:7:5:3(体积比)，糖醛酸含量中葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸=1:1(体积比)；
[0054]图6:林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图。
[0055]采用Tricine电泳法测抗菌肽分子量，以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，得出所含抗菌肽分子量约为I?3Kda。
[0056]图中左侧为标准的marker，即标准分子量蛋白质的电泳图，由左向右依次为实施例一中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例二中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例三中林蛙提取混合液中上所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例四中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例五中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0057]下面结合实施例对本发明作进一步描述。本发明所用林蛙干产自是我国东北地区长白山麓。中国林娃(Rana temporaria chensinensis)俗称田鸡、哈士蟆、雪哈等,在动物分类上属两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属，是我国东北地区长白山麓的特有品种，属于药、食两用的珍贵蛙种，并且资源丰富。
[0058]实施例一林蛙提取混合液的制备
[0059]取林蛙干20g(中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房)，除杂除尘后分别经20目、50目、100目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒径在500 μ m以下，按照Ig:6mL的比例加入复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶3wt%、胰蛋白酶2wt%，风味蛋白酶lwt%jK94wt%，酶解温度为52°C，酶解时间为1.5h，酶解pH为7.2，而后87°C、1min灭酶，将混合物在温度25°C时离心，离心时间为3min，离心转速为2500rpm，取上层上清液(总体积的25% )，此时提取了林蛙干中含有的短肽胶原蛋白；
[0060]上层上清液所含胶原蛋白中(紫外光谱分析法分析氨基酸类别，氨基酸自动分析仪收集测定氨基酸质量分数)精氨酸、赖氨酸、组氨酸的含量(占上层上清液的质量百分数)分别为3.12%,7.43%,0.73%，天冬氨酸、谷氨酸的含量(占上层上清液的质量百分数)分别为 7.86%、11.19%。
[0061]取上清后剩余混合物(原体积的75% )，放入胶体磨，研磨3min，使混合物的平均粒径在300 μ m以下；将混合物放入高剪切分散乳化机内，剪切2min，使混合物平均粒径在100?200μπι之间，将混合物进行喷雾干燥成粉末状，此时得到林蛙干提取短肽胶原蛋白后剩余纤维、骨质等物质的超微粉碎；
[0062]将纤维、骨质等物质的超微粉加入到质量浓度为4%醋酸中，醋酸与超微粉的体积质量比(mL:g)为17:1。超声，超声时间为:30min，超声温度为20°C ;过滤，经150μπι纱网过滤；150μπι纱网上面未过滤物质加入质量体积比为1:5的0.02mol/L氢氧化钠，进行微波提取，微波功率为550W，微波时间4min，再次经150 μ m纱网过滤；合并两次滤液，搅拌15min，搅拌速度为160rpm ;搅拌后的滤液离心，离心温度为20°C，离心时间为lOmin，离心转速为5000rpm;取上清，减压浓缩，压力为600托，温度为68°C，浓缩体积比为15:1 ;此时得到多糖、抗菌肽、钙离子混合物(钙离子的检测采用EDTA滴定法检测)；
[0063]混合物中多糖(Sephadex G - 25凝胶柱分离收集单糖,高效液相色谱法测定单糖组成)主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸组成，其中含单糖鼠李糖:甘露糖:半乳糖:葡萄糖:木糖:阿拉伯糖:岩藻糖约为1:4:6:12:1:0.5:1(体积比)，糖醛酸含量中葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸=1:1(体积比)；
[0064]混合物所含抗菌肽中(紫外光谱分析法分析氨基酸类别，氨基酸自动分析仪收集测定氨基酸质量分数)精氨酸、赖氨酸、组氨酸的含量(占混合物的质量百分数)分别为2.73%,8.16%、0.69%，天冬氨酸、谷氨酸的含量(占混合物的质量百分数)分别为
4.47%,5.98%。
[0065]将短肽胶原蛋白、多糖、抗菌肽、钙离子混合，得到林蛙提取混合液，体积是53mL，其中含钙离子 42.4mg(80mg/100ml)。
[0066]实施例二林蛙提取混合液软膏剂的制备
[0067]处方组成(按重量份):林蛙干20g、石蜡8g，液体石蜡6g，白凡士林12g，单硬脂酸甘油酯1g,司盘40 9g,乳化剂0P3g,对轻基苯甲酸乙酯Ig,冰片lg。
[0068]制备方法:
[0069](I)林蛙提取混合液的制备
[0070]称取林蛙干20g(中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房)，按照实施例一的方法制备成林蛙提取混合液，得到林蛙提取液53mL
[0071](2)油相的制备:取8g石蜡、1g单硬脂酸甘油脂、12g白凡士林、6g液体石蜡、9g司盘40、3g乳化剂OP、lg对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相；
[0072](3)林蛙提取液软膏剂的制备:将步骤(2)制得的油相与林蛙提取混合液分别加热至90°C，将林蛙提取混合液加入到所述油相中，边加边搅拌，搅拌时间为12min，搅拌速度为150rpm，再经纳米匀质机匀质5次，115°C灭菌1min ;将冰片加热到90°C过0.45 μ m膜，无菌条件下与上述灭菌后产物混合均匀，即得到本发明所述的用于治疗及预防脚气的林蛙提取混合液软膏剂。
[0073]实施例三林蛙提取混合液喷雾剂的制备
[0074]处方组成(按重量份):林娃干20g、氯化钠19mg PEG400 2 3mg,苯扎溴铵6mg。
[0075]制备方法:
[0076]称取林蛙干20g(中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房)，按照实施例一的方法制备成林蛙提取混合液，得到林蛙提取液53mL，中加入上述配方量的PEG4_、氯化钠、苯扎溴铵，120rpm搅拌,搅拌时间为1min,加水至100mL, 150rpm搅拌1min,使上述物质充分混匀，121°C灭菌lOmin。自体冷却至室温，分装入气雾剂瓶(20mL/瓶)，即得。
[0077]实施例四林蛙提取混合液湿巾的制备
[0078]处方组成(按重量份):林娃干20g、氯化钠24mg PEG4qq llmg,苯扎溴铵2mg。
[0079]制备方法:
[0080]称取林蛙干20g(中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房)，按照实施例一的方法制备成林蛙提取混合液，得到林蛙提取液53mL，中加入上述配方量的PEG4_、氯化钠、苯扎溴铵，130rpm搅拌,搅拌时间为13min,加水至1500mL, 130rpm搅拌lOmin,使上述物质充分混勻，121°C灭菌lOmin。自体冷却至室温,每50mL加入到放有无菌无纺布(15cmX15cm)独立包装袋内，密封即得。
[0081 ] 实施例五林蛙提取混合液口服剂的制备
[0082]处方组成(按重量份):林娃干20g,朽1檬酸5g,蜂蜜21g,白砂糖22g,黄原胶6g份，山梨酸钾Sg，醋酸锌lg。
[0083]制备方法:
[0084](I)称取林蛙干20g(中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房)，按照实施例一的方法制备成林蛙提取混合液，得到林蛙提取液53mL，
[0085](2)减压浓缩:将林蛙提取混合液在减压条件下进行蒸馏，压力在9.1XlO3帕，温度为75°C，浓缩比为1.06:1，得浓缩液501^ ；
[0086](2)调节混合液
[0087]将研细的醋酸锌缓慢加入林蛙提取混合液中，边加边搅拌，130rpm搅拌，搅拌时间为1min ;加完后用0.lmol/L NaOH调节pH为6.4±0.1，搅匀后使其自然沉降，4°C过夜；
[0088](3)过滤
[0089]经0.45 μ m滤膜过滤，得澄清液体后，加入上述配方量的柠檬酸、蜂蜜、白砂糖，力口热45°C, 150rpm搅拌,搅拌时间为12min,搅拌均勻；0.45 μ m滤膜过滤,再向清液中加入上述配方量的黄原胶、山梨酸钾，120rpm搅拌,搅拌时间为1min,搅拌均勻；经0.22 μ m滤膜精滤；
[0090](4)灌装压盖
[0091]在无菌条件下灌装，每瓶10mL，压盖封口；
[0092](5)灭菌
[0093]将灌装好的林蛙提取混合液口服制剂加热到65°C，保持30min，自体冷却至室温即为成品。
[0094]以下试验例表明本发明在治疗脚气药物中的用途
[0095]试验例I
[0096]采用完全随机的方法，将600例受试对象分配到治疗组(420例，共7组)和对照组(180例，3组)。治疗组分别采用实施例二、实施例三、实施例四、实施例五、实施例二 +实施例五、实施例三+实施例五、实施例四+实施例五制成的林蛙提取混合液制剂，对照组采用新脚气膏(市售广州九福堂生物制药)、林蛙皮抗菌肽(采用CN1216768A方法制备)、林蛙体抗菌肽(采用CN103073628A方法制备)。根据疗效标准判断疗效，结果见表I。
[0097]用法:实施例二组、实施例三组、实施例四组、新脚气膏组、林蛙皮抗菌肽组、林蛙体抗菌肽组为外用组，每日早晚两次清洗足部后使用药物，实施例二组每次用药量为2g，用药方式为涂抹足部，2次/d ;实施例三组每次用药时喷足部5次，大约为2mL药液，2次/d ;实施例四组每次用药时擦拭足部Imin以上，2次/d ;新脚气膏组每次用药量为2g，用药方式为涂抹足部，2次/d ;林蛙皮抗菌肽组每次用药量为2mL，用药方式为涂抹足部，2次/d ；林蛙体抗菌肽组每次用药量为2mL，用药方式为涂抹足部，2次/d ；
[0098]实施例五组为口服组；实施例二 +实施例五组、实施例三+实施例五组、实施例四+实施例五组为外用+ 口服组。实施例五组每日早晚口服，每次10mL，服药期间无食物禁忌；实施例二 +实施例五组每日早晚口服实施例五，每次10mL，并且早晚两次清洗足部后外用实施例二，每次用药量为2g，用药方式为涂抹足部，2次/d ;实施例三+实施例五组每日早晚口服实施例五，每次10mL，并且早晚两次清洗足部后外用实施例三，每次用药时喷足部5次，大约为2mL药液，2次/d ;实施例四+实施例五组每日早晚口服实施例五，每次10mL，并且早晚两次清洗足部后外用实施例四，每次用药时擦拭足部Imin以上，2次/d。
[0099]各组同时停用其他相关手段和治疗药物，均以7天为I疗程。
[0100]临床分类主要有:糜烂型脚气、水泡型脚气、鳞屑角化型脚气。临床主要症状表现为:
[0101]糜烂型:趾间潮湿，浸溃发白，干涸脱屑后，剥去皮屑为湿润、潮红的糜烂面或伴有裂口，有奇痒，易继发感染。
[0102]水疱型:好发于足缘、足底部，初起为壁厚饱满的小水疱，有的可融合成大疱，疱液透明，周围无红晕。自觉奇痒，搔抓后常因继发感染而引起丹毒、淋巴管炎等。
[0103]鳞屑角化型:好发于足跟、足缘部。由于真菌感染引起皮肤干燥、角质粗厚、脱屑，易发生皲裂。本型无水疱及化脓，病程缓慢，多常年不愈，大多数患者由糜烂型、水疱型转化--? 。
[0104]统计学方法:计量资料用t检验，记数资料用X2及Rdiit检验，P〈0.05为差异有统计学意义。
[0105]疗效评定标准:
[0106]参照《中药新药治疗脚气的临床研究指导原则》中关于疾病疗效判定标准。痊愈:症状，体征消失或基本消失，积分值减少1>95% ;显效:症状，体征明显改善，积分值减少^ 70% ;有效:症状，体征有好转，积分值减少> 30% ;无效:症状，体征未见好转，积分值减少 <30% ο
[0107]表1:本发明治疗脚气的情况(例)
[0108]
【权利要求】
1.一种林蛙提取混合液，其由如下步骤制备得到: (1)将10?45重量份林蛙干除杂除尘后分别经20?100目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒径在500 μ m以下，按照Ig:1?1mL的比例加入复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶I?5wt%、胰蛋白酶2?4wt%，风味蛋白酶I?3wt%，酶解温度为50?55°C，酶解时间为I?2h，酶解pH为7.0?7.5，而后85?90°C下灭酶5?15min，将混合物在温度10?30°C时离心,离心时间为I?5min,离心转速为2000?4000rpm,取离心后混合液体积20?40%的上层上清液； (2)将取上清后剩余混合物放入胶体磨，研磨2?15min,使混合物的平均粒径在300 μ m以下；将混合物放入高剪切分散乳化机内，剪切I?15min，使混合物平均粒径在100?200 μ m之间，将混合物进行喷雾干燥成粉末状，此时得到剩余混合物的超微粉； 将上述超微粉加入到质量浓度为2?10%醋酸中，醋酸与超微粉的体积质量比为10?40mL:lg ;超声5?75min，超声温度为4?30°C;经150 μ m纱网过滤，150 μ m纱网上面未过滤物质加入质量体积比为Ig:1?8mL的0.01?0.03mol/L氢氧化钠，进行微波提取，微波功率为500?600W，微波时间3?9min，再次经150 μ m纱网过滤；合并两次滤液，30?50°C下搅拌10?30min,搅拌速度为100?200rpm ;搅拌后的滤液离心,离心温度为4?30°C,离心时间为2?40min，离心转速为2000?15000rpm ;取上清，减压浓缩，压力为600?700托，温度为65?70°C，浓缩体积比为8?40:1 ; (3)将步骤(I)和步骤(2)得到的产物混合，即得到林蛙提取混合液。
2.权利要求1所述的林蛙提取混合液在制备治疗及预防脚气的药物中的用途。
3.一种治疗及预防脚气的林蛙提取混合液软膏剂，其由如下步骤制备得到: (1)油相的制备:取5?15重量份石腊、2?10重量份单硬脂酸甘油脂、10?20重量份白凡士林、5?30重量份液体石蜡、I?15重量份司盘40、2?10重量份乳化剂ΟΡ、1?8重量份对羟基苯甲酸乙酯，混合后研磨混匀，得到油相； (2)林蛙提取混合液软膏剂的制备:将步骤(I)制得的油相与权利要求1所述的由10?45重量份林蛙干制得的林蛙提取混合液分别加热至70?100°C，将林蛙提取混合液加入到所述油相中，边加入边搅拌，搅拌时间为10?15min，搅拌速度为100?300rpm，再经纳米匀质机匀质4?7次，115?121°C灭菌10?30min ;然后将I?5重量份冰片加热到70?100°C过0.45 μ m膜，无菌条件下与上述灭菌后产物混合均匀，即得到用于治疗及预防脚气的林蛙提取混合液软膏剂。
4.一种治疗及预防脚气的林蛙提取混合液喷雾剂，其由如下方法制备得到:向权利要求I所述的由10?45重量份林蛙干制得的林蛙提取混合液中加入2?4重量份的PEG4.、I?5重量份的氯化钠、I?2重量份的苯扎溴铵，100?200rpm下搅拌10?25min，加水至1000重量份，150?200rpm下搅拌10?30min，使上述物质充分混匀，115?121°C下灭菌10?20min ；自体冷却至室温后分装入气雾剂瓶，即得到治疗及预防脚气的林蛙提取混合液喷雾剂。
5.一种治疗及预防脚气的林蛙提取混合液湿巾，其由如下方法制备得到:向权利要求1所述的由10?45重量份林蛙干制得的林蛙提取混合液中加入2?4重量份的PEG4.、I?5重量份的氯化钠、I?2重量份的苯扎溴铵，100?200rpm下搅拌10?25min，加水至1000重量份，150?200rpm下搅拌10?30min，使上述物质充分混匀，115?121°C下灭菌10?20min ；自体冷却至室温后每50?60mL加入到放有(15?20) cmX (15?20) cm无菌无纺布的独立包装袋内，密封即得到治疗及预防脚气的林蛙提取混合液湿巾。
6.一种治疗及预防脚气的林蛙提取混合液口服剂，其由如下步骤制备得到: (1)减压浓缩:将权利要求1所述的由10?45重量份林蛙干制得的林蛙提取混合液在减压条件下进行蒸馏，压力在8 X 13?3 X 14帕，温度为50?85°C，浓缩比为I?5:1，得浓缩液； (2)将研细的I?5重量份醋酸锌缓慢加入到浓缩液中，边加入边搅拌，搅拌速度为100?300rpm，搅拌时间为10?15min ;加完后用NaOH调节pH为6.2?6.5，搅匀后使其自然沉降，4°C冷却过夜； (3)将上述产物0.45 μ m滤膜过滤，得澄清液体后，加入5?15重量份柠檬酸、5?25重量份蜂蜜、5?30重量份白砂糖，加热至40?75°C，100?300rpm搅拌，搅拌时间10?30min,混合均匀，趁热再次0.45 μ m滤膜过滤，再向清液中加入5?15重量份黄原胶和5?15重量份山梨酸钾，最后经0.22 μ m滤膜精滤； (4)灌装压盖:在无菌条件下灌装，压盖封口； (5)灭菌:加热到62?65°C，保持30?50min，自体冷却至室温即得到治疗及预防脚气的林蛙提取混合液口服剂。
【文档编号】A61K9/12GK104173382SQ201410360106
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】滕乐生, 李佺, 谢晶, 刘艳, 逯家辉, 孟庆繁, 张 杰, 刘瑜, 刘博通, 滕利荣, 王迪, 周毓麟 申请人:吉林大学