五子衍宗方的新用途
【专利摘要】五子衍宗方的新用途。本发明提供了如下组合物在制备卵巢移植术术前或/和术后的辅助用药物中的用途：所述组合物的原料药包括如下重量配比的药味：枸杞子30～50份、菟丝子30～50份、覆盆子15～25份、五味子3～7份、车前子7～13份。本发明研究发现，在进行卵巢移植术前或/和后使用五子衍宗丸，可以促进冻存后自体移植卵巢卵泡生长发育，恢复自体移植冻存卵巢卵母细胞的发育能力，促进体外培养的未成熟卵母细胞成熟，提高体外胚胎发育的2-细胞胚胎发育率和桑葚胚发育率，对冻存后自体移植卵巢功能有良好的保护作用，可有效提高卵巢移植的成功率，为卵巢移植手术提供了一种新的辅助手段。
【专利说明】五子衍宗方的新用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及五子衍宗方的新用途。
【背景技术】
[0002] 人类是通过有性繁衍的物种，生命的延续，离不开男性和女性双方的遗传信息及 其载体-遗传基因。女性的卵母细胞有着女性的全部遗传基因，卵母细胞都来自卵巢。而 成熟卵母细胞更是珍稀细胞，大多数妇女一生中也仅拥有400?500个。
[0003] 随着医学诊断和治疗技术的不断进步，临床肿瘤患者的长期生存时间和生存质量 得到提高，肿瘤患者也有年轻化趋势，但对大多数年轻女性肿瘤患者，尤其是盆腔肿瘤患者 进行生殖器官的切除或者使用放疗或化疗仍然是必要的，使这些患者在很年轻时就要承受 卵巢早衰甚至是丧失生育能力的风险。常规放疗和化疗方案在杀灭肿瘤细胞的同时，也直 接破坏了生殖细胞，导致卵巢功能下降。加之越来越多育龄人群推迟生育，使得生育年龄的 肿瘤患者，尤其是未生育的少女肿瘤患者在获得新生的同时，又不得不面临生育能力的丧 失和卵巢早衰的问题。在因重大意外事件-譬如汶川大地震-而丧失亲人的不少再生育妇 女，也面临同样的痛苦窘境。
[0004] 目前，保护卵巢功能的方法主要有：激素疗法、药物干预、卵巢移位、卵巢组织冻存 移植、卵母细胞冻存植入和胚胎冻存植入。激素疗法可外源性代替卵巢的内分泌功能，却 不能改善生育能力，且有增加激素依赖性肿瘤的发生和诱发血栓的风险；药物保护和卵巢 移位可短时间减少放化疗对卵巢的损害，但仍无法完全保护卵巢免受化疗药和放射线的危 害；通过卵母细胞和胚胎的保存，可以收集经自然发情周期排卵，或者经化学药物诱导后实 现超数排卵，并人工拾卵，随后受精；也可以通过卵巢切除术保存部分卵巢组织或保存整个 卵巢，移植并收集各级卵泡组织获得卵母细胞。近四十年来，得益于辅助生殖技术一体外成 熟（IVM)、体外受精（IVF)、体外培养（IVC)和胚胎移植（ET)等的迅速发展，使卵母细胞及 胚胎冷冻保存成为临床上最为成熟的辅助生殖技术，但因其时效性的局限，收集前需特殊 处理，也无法恢复女性患者自身的卵巢分泌功能，且有法律、宗教及伦理的束缚，临床使用 受到一定限制。而直接冷冻卵巢组织能保存大量不成熟卵母细胞，较之于成熟卵母细胞， 不成熟卵母细胞体积小，结构简单，亚细胞器较少，代谢率低，无透明带，对低温敏感度低， 不易受冷冻伤害，并且不需要刺激卵巢促卵泡成熟，可以在任何时候进行冷冻保存和移植， 且不需要激素的处理，不存在伦理问题，而且可以提供生殖功能和内分泌功能的双重保障， 是一种理想的保存女性生育能力的方法，也是上述方法中唯一可以完全重建卵巢功能的方 法。
[0005] 卵巢冻存移植，主要分为同种自体移植、同种异体移植和异种移植，其中，同种自 体移植是较为常见的移植方法，它又包括卵巢自体原位移植和卵巢自体异位移植。卵巢自 体原位移植是将冷冻保存卵巢组织移植到卵巢解剖部位卵巢窝或卵巢蒂的位置，手术创伤 较大，对移植卵巢的观察较困难。可以恢复自然的卵巢功能，尤其是生育能力，实现自然妊 娠。有报道，新鲜和冻存卵巢组织移植后，两者在术后的内分泌功能和生育能力的恢复无明 显差异。已有成功自然妊娠后产下健康胎儿的报道。冷冻卵巢移植后4?8个月恢复卵巢 功能，月经恢复，卵泡发育并排卵。
[0006] 卵巢自体异位移植是将卵巢或卵巢组织移植到自身卵巢非正常解剖部位。移植 部位有肾包膜下、肌肉、腹壁、腋窝、乳房和前臂等部位，只能恢复卵泡发育和卵巢内分泌功 能，不能自然妊娠，需要借助体外受精_胚胎移植等辅助生殖技术。异位移植手术操作简 单，便于检测，但卵巢移植皮下，血供较差，容易缺血坏死。将人卵巢组织移植皮下是为了便 于检测移植卵巢组织卵泡发育和卵母细胞采集。有报道，移植到腹部皮下，经激素处理后， 获得20个卵母细胞，其中8个采用胞浆内精子注射方法，获得一个4-细胞胚胎。移植到腹 直肌的卵巢组织内分泌功能恢复，持续28周。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供五子衍宗方的新用途。
[0008] 具体地，本发明提供了如下组合物在制备卵巢移植术术前或/和术后的辅助用药 物中的用途：所述组合物的原料药包括如下重量配比的药味：
[0009] 枸杞子15?50份、宽丝子15?50份、覆盆子15?25份、五味子3?7份、车前 子7?13份。
[0010] 进一步地，所述卵巢移植术为冻存卵巢移植手术。
[0011] 更进一步地，所述冻存卵巢移植手术为冻存卵巢自体移植手术。
[0012] 优选地，所述冻存卵巢自体移植手术为冻存卵巢自体异位移植手术。
[0013] 其中，所述辅助用药物是提高移植卵巢的存活率，促进移植卵巢中卵泡生长，改善 移植卵巢生殖能力或/和改善移植卵巢卵母细胞发育能力的药物。
[0014] 进一步地，所述组合物的原料药包括如下重量配比的药味：枸杞子40份、菟丝子 40份、覆盆子20份、五味子5份、车前子10份。
[0015] 进一步地，所述组合物的原料药重量配比如下：枸杞子15?50份、宽丝子15?50 份、覆盆子15?25份、五味子3?7份、车前子7?13份。
[0016] 优选地，所述组合物的原料药重量配比如下：枸杞子40份、菟丝子40份、覆盆子 20份、五味子5份、车前子10份。
[0017] 本发明研究发现，在进行卵巢移植术前或/和后使用五子衍宗丸，可以促进冻存 后自体移植卵巢卵泡生长发育，恢复自体移植冻存卵巢卵母细胞的发育能力，促进体外培 养的未成熟卵母细胞成熟，提高体外胚胎发育的2-细胞胚胎发育率和桑葚胚发育率，对冻 存后自体移植卵巢功能有良好的保护作用，可有效提高卵巢移植的成功率，为卵巢移植手 术提供了一种新的辅助手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1冻存后自体异位移植第7天卵巢及邻近区域形态变化
[0019] 图2冻存后自体异位移植第21天卵巢及邻近区域形态变化
[0020] 图3冻存后自体异位移植第35天卵巢及邻近区域形态变化
[0021] 图4回收卵巢均重变化趋势
[0022] 图5冻存后自体异位移植第7天卵巢卵泡发育的组织形态学变化（HE100x):
[0023] 图6冻存后自体异位移植第21天卵巢卵泡发育的组织形态学变化（HE100x):
[0024] 图7冻存后自体异位移植第35天卵巢卵泡发育的组织形态学变化（HE100x):
[0025] 图8冻存后自体异位移植第7天卵巢组织VEGF表达变化：
[0026] 图9冻存后自体异位移植第21天卵巢组织VEGF表达变化：
[0027] 图10冻存后自体异位移植第35天卵巢组织VEGF表达变化：
[0028] 图11五子衍宗丸对冻存后自体异位移植卵巢组织细胞凋亡的影响
[0029] 图12五子衍宗丸对移植卵巢卵泡及周围组织细胞凋亡的影响
[0030] 图13冻存后自体异位移植卵巢与在位卵巢卵母细胞形态，其中，A:五子2-21d组 卵母细胞（l〇〇x);B:五子2-21d组MII期卵母细胞（800x);C:精子（800x);D:在位卵巢卵 母细胞（l〇〇x) ;E:退化裸卵（400x) ;F:PMSG-21d组卵母细胞（200x) ;G:在位卵巢卵母细 胞（100x) ;H:MI期卵母细胞（400x) ;1 :五子2-35d组卵母细胞（200x);J:GV期卵母细胞 (400x)。
[0031] 图14回收卵母细胞数量，与模型组比较，*p< 0. 05
[0032] 图15补肾对移植卵巢卵母细胞体外受精和胚胎发育的影响，其中，注：A:受精 前卵母细胞（200x) ;B:受精后卵母细胞（800x) ;C:2-细胞胚胎（800x) ;D:多个桑葚胚 (200x)；E：
[0033] 桑葚胚（800x);F:退化的受精卵（800x)。
[0034] 图16PCR扩增程序图
[0035] 图17血管生成相关基因相对表达量
[0036] 图18和图18续卵泡闭锁相关基因相对表达量
[0037] 图19卵泡生长相关基因相对表达量
[0038] 图20卵泡分化相关基因相对表达量
【具体实施方式】
[0039] 以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。
[0040] 试验例1五子衍宗丸对冻存后自体异位移植小鼠卵巢体内发育的影响 [0041]卵巢为雌性哺乳动物的性腺，其主要功能为产生卵子并排卵和分泌雌性激素。卵 巢中卵泡的发育始于胚胎时期，其内有大量原始卵泡形成，并进入自主发育和闭锁的轨道， 直到发育期开始选择征募原始卵泡进入卵泡生长发育过程，产生成熟卵母细胞来繁殖后 代，但终生仅有少量卵子在自然繁殖过程中得到利用，其余大多数卵泡通过细胞凋亡机制 而自行退化。
[0042] 近年来，卵巢冷冻保存技术和卵巢移植技术得到了迅速发展，在人类生殖医学领 域，被认为是保存和延续女性生殖能力的一种有效方法。目前，在这一研究领域，以中医药 理论和方法进行的研究报道尚不多见，本实验以肾主生殖理论为指导，研究左归丸、右归丸 和五子衍宗丸对小鼠自体异位移植冻存复苏卵巢组织体内发育的影响，为发展辅助生殖领 域的中医药技术积累基础资料。
[0043] 1材料和方法
[0044] 1. 1实验材料
[0045]1. 1. 1实验动物
[0046] 健康SPF级五周龄昆明小鼠，个体体重22-24克，购自成都达硕生物科技有限公 司。合格证号：scxk(川）2008-24。适应性喂养五天，所有实验小鼠均采用自然光照，室温 10?15°C，自由采食颗粒饲料和自由饮水方式饲养，随机分组进行实验。
[0047] 1. 1. 2主要仪器与试剂
[0048] 配置试剂：冷冻液：MEM+10%FBS+1. 5MDMS0+0.lMsucrose;
[0049] 解冻液：MEM+10% FBS+1. 0MDMS0+0.lMsucrose
[0050] 解冻液：MEM+10% FBS+0. 5MDMS0+0.lMsucrose
[0051] 解冻液：MEM+10% FBS+0. lMsucrose
[0052] 解冻液：MEM+10% FBS
[0053] TBS液：三羟基氨基甲烷1. 21g+氯化钠7. 6g+优普水800ml，浓盐酸调PH值至 7. 2-7. 4,定容至 1000mlTBS-T液：TBS液+Tween20 (体积比 0? 05 % )
[0054] 抗原修复液：柠檬酸0. 38g+柠檬酸三钠2. 45g+优普水900ml，浓盐酸调PH值至 6. 0,定容至 1000ml
[0055] 1. 2实验设计
[0056] 小鼠随机分组，摘取卵巢并冻存，7天后将冻存卵巢复苏，自体移植到小鼠背部皮 下。实验从卵巢移植当天开始计算天数，植入当天记为〇d，分别于移植后7天、21天、35天 和（或）42天回收移植卵巢，每次回收不少于六只小鼠。
[0057] 本次实验中，按照补肾方药煎剂灌胃时间的不同，分为1组（灌胃6天后摘除卵 巢，术后停止中药灌胃）、2组（灌胃6天后摘除卵巢，术后继续中药灌胃）和3组（摘除卵 巢前不灌胃，摘除卵巢后中药灌胃）。
[0058] 具体分组如下：
[0059] 右归丸处理组：右归丸煎剂每日灌胃一次，并分别于卵巢移植后7天、21天、35天 和（或）42天回收卵巢移植体，观察移植后卵巢及卵泡发育。根据回收卵巢移植体的时间分 为右归l-7d组、右归l-21d组、右归2-7d组、右归2-21d组、右归2-35d组、右归3-7d组、 右归3-21d组和右归2-42d组。
[0060] 左归丸处理组：左归丸煎剂每日灌胃一次，并分别于卵巢移植后7天、21天、35天 和（或）42天回收卵巢移植体，观察移植后卵巢及卵泡发育。根据回收卵巢移植体的时间分 为左归l-7d组、左归l-21d组、左归2-7d组、左归2-21d组、左归2-35d组、左归3-7d组、 左归3-21d组和左归2-42d组。
[0061] 五子衍宗丸处理组：五子衍宗丸煎剂每日灌胃一次，并分别于卵巢移植后7天、21 天、35天和（或）42天回收卵巢移植体，观察移植后卵巢及卵泡发育。根据回收卵巢移植体 的时间分为五子l-7d组、五子l-21d组、五子2-7d组、五子2-21d组、五子2-35d组、五子 3-7d组、五子3-21d组和五子2-42d组。
[0062]PMSG处理组：PMSG3IU每日腹腔注射，并分别于卵巢移植后7天、21天、35天回收 卵巢移植体，观察移植后卵巢及卵泡发育。根据回收卵巢移植体的时间分为PMSG-7d组、 PMSG-21d组和PMSG-35d组。
[0063] 模型组：生理盐水每日灌胃一次，并分别于卵巢移植后7天、21天、35天回收卵 巢移植体，观察移植后卵巢及卵泡发育。根据回收卵巢移植体的时间分为模型_7d组、模 型-2Id组和模型-35d组。
[0064] 正常组：定期摘取卵巢观察卵巢及卵泡发育。分为正常_7d组、正常_21d组和正 常-35d组。
[0065] 1. 3实验方法
[0066] 1. 3. 1小鼠卵巢采集冻存和复苏
[0067] 采集已编号小鼠腹腔注射1%Pentobarbital0? 25-0. 3ml/只，5-10分钟四肢瘫 软后，在超净台下，背部剪毛，75%酒精消毒手术部位，沿背正中线剪开皮肤，钝性分离皮下 组织和肌肉组织，在背肌外缘进入腹腔，找到卵巢囊，将卵巢囊牵拉至切口外，避开血管，在 卵巢囊上撕开一小口，暴露卵巢，钝性采取卵巢，即刻放入MEM培养液中，眼科镊压迫止血， 对合肌层和皮下组织，缝合皮肤。对手术后小鼠进行保温，待其苏醒后放入小鼠饲养笼中 进行常规饲养，不需拆线。观察其健康状况。
[0068] 冻存参照Gosden的冷冻程序，将MEM液清洗后的卵巢放入已加好1ml冷冻液 的1.5ml冻存管中，4°C放置30分钟，放入程序冷冻仪中，起始温度：4°C，样品上机后， 以-2°C/分钟的速率降至_7°C，soaking5分钟，人工置冰，以-0. 3°C/分钟的速率降 至-34°C，再以-10°C/分钟的速率降至-140°C，样品快速下机，迅速投入液氮中。
[0069] 复苏将冻存管从液氮中取出，室温放置30秒，37°C水浴加温融化，在超净台下将 卵巢组织依次放入解冻液中：
[0070] MEM+10 %FBS+1. 0MDMS0+0.lMsucrose中放置 5 分钟，MEM+10 % FBS+0. 5MDMS0+0.lMsucrose中放置 5 分钟，MEM+10 %FBS+0.lMsucrose中放置 5 分钟， MEM+10%FBS中放置30分钟。
[0071] 1.3. 2冻存卵巢自体移植
[0072] 卵巢摘除7天后行自体卵巢移植术，小鼠腹腔注射1 %Pentobarbital 0. 25-0. 3ml/只，5-10分钟后四肢瘫软后，在超净台下，背部剪毛，75%酒精消毒手术部位， 避开上次手术切口部位剪开皮肤，钝性分离皮下组织，纳入卵巢，缝合皮肤。对手术后小鼠 进行保温，待其苏醒后放入小鼠饲养笼中进行常规饲养，不需拆线。观察其健康状况。
[0073] 1.3. 3移植卵巢回收
[0074] 根据各组预定时间，每组每次取样不少于6个。先自眼眶内眦静脉丛取血， 3000rpm离心10分钟，血清-40°C冰箱储存以备E2测定。小鼠断颈后，术野75%酒精消毒， 取出移植卵巢并称重，用于组织学检查的卵巢放入中性福尔马林中室温保存，其余卵巢组 织直接放入已用DEPC处理的冻存管中，-80°C冰箱储存，用于后续实验。
[0075] 卵巢回收：取出的移植卵巢，存活，颜色红润，表面有血管分布或其周围有明显血 管生长。
[0076] 卵巢回收率（％ )=(回收卵巢数/移植卵巢数）X100%
[0077] 1. 3. 4卵巢组织的脱水包埋和切片
[0078] 卵巢组织经中性福尔马林液固定后，依次放入75%，80%，95%及100%乙醇梯度 脱水，二甲苯透明。放入60°C石蜡中浸渍，室温下冷却凝固。将石蜡块按5um的厚度连续切 片，每间隔10张切片染色一张。将切片在40°C水中展平，平铺于载玻片上。将载玻片放入 60°C烤箱中烤片。
[0079] 1. 3. 5石蜡切片苏木素-伊红染色
[0080] 二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，自来水洗片刻。苏木素液染核10分钟，自来水洗片 刻，1 %盐酸酒精分化30秒，流水冲洗片刻。复染0. 5%伊红溶液染色5分钟。自来水洗片 亥IJ。逐级升浓度酒精脱水，二甲苯浸泡，中性树脂封片。光学显微镜观察。
[0081] 卵泡分级标准：原始卵泡为单层扁平颗粒细胞包绕卵母细胞；初级卵泡为单层立 方颗粒细胞包绕卵母细胞；次级卵泡为两层或两层以上立方颗粒细胞包绕卵母细胞；窦状 卵泡为卵泡内有窦腔形成。若卵泡失去圆形或椭圆形结构，颗粒细胞缺失，出现核固缩，排 列紊乱，卵母细胞核固缩，形态失常，均为形态异常的卵泡。
[0082] 形态正常卵泡百分率（％ )=(形态正常卵泡/总卵泡）X100%
[0083] 损伤卵泡百分率（％ )=(损伤卵泡/总卵泡）X100%
[0084] 1. 3.6VEGF免疫组化
[0085] 烤片：将待做卵巢切片置于切片架上，60°C恒温烤箱过夜；
[0086] 脱蜡：烤好的切片依次放入二甲苯I中10分钟，之后二甲苯II中10分钟；
[0087] 水化：切片经下行酒精水化，分别在无水乙醇，95%酒精，80%酒精，75%酒精中依 次浸泡各5分钟。TBS液浸泡5分钟；
[0088] 微波修复抗原：先将枸橼酸抗原修复液（配制方法见1.1.2)，微波炉加热至 92°C_98°C，再将切片浸入持续15分钟（注意控制好温度）。置室温下自然冷却后，自来水 冲洗，优普水洗涤2X5分钟，TBS洗涤2X5分钟。
[0089] 封闭：滴加封闭缓冲液，37°C湿盒孵育30分钟；
[0090] 加一抗：滴加已稀释好的即用型VEGF-抗，4°C湿盒过夜；
[0091] 洗涤：取出昨天过夜的湿盒，37°C复温30分钟，TBS-T洗涤3X5分钟；
[0092] 封闭：滴加封闭缓冲液，37°C湿盒孵育10分钟；
[0093] 加二抗：滴加生物素化羊抗兔IgG(浓度0? 005mg/ml)，37°C湿盒孵育30分钟；
[0094] 洗涤：TBS-T洗涤3X5分钟；
[0095] 加HRP-SA:滴加HRP-SA液（浓度20nM)，37°C湿盒孵育30分钟；
[0096] 洗涤：TBS-T洗涤3X5分钟，TBS洗涤2X5分钟；
[0097] 显色：配制DAB工作液：计算好样本数量集中配制，每个样本用量为：50iil优普 水加入 2. 5ii1DAB-ASolution，混匀后再加入 2. 5ii1DAB-BSolution和 2. 5ii1DAB-C Solution，即用即配；样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50ii1DAB工作液，室温显 色反应30秒?2分钟，镜下控制反应时间，切片从显微镜上拿下来后直接入优普水终止反 应并洗涤三次，每次5分钟。苏木素复染，3分钟后流水冲洗后，光学显微镜下观察并拍照。
[0098] 结果判定：细胞浆内和细胞膜呈现棕黄色，明显高于背景为阳性细胞。
[0099] 1. 3.HUNEL细胞凋亡原位检测分析
[0100] 烤片：将待做卵巢石蜡切片置于切片架上，60°C恒温烤箱过夜；
[0101] 脱蜡：烤好的石蜡切片依次放入二甲苯I中10分钟，之后二甲苯II中10分钟；
[0102] 水化：切片经下行酒精水化，分别在100%无水乙醇、95%酒精、80%酒精和75% 酒精中依次浸泡，每次5分钟；
[0103] 洗涤：切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分钟；
[0104] 促渗：用PBS液配制1%TritonX-100通透液，将切片浸入通透液中，室温促渗5 分钟；
[0105] 洗涤：切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分钟；
[0106] 封闭：用甲醇+10%优普水+10%过氧化氢（30% )，配制封闭液，将切片浸入封闭 液中，室温（15-25°C)封闭10分钟；
[0107] 洗涤：切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分钟；
[0108] 通透：计算好样本数量，集中配制ProteinaseK工作液，每个样本按98ii1 1XPBS加入2iil50XProteinaseK的比例配制，即用即配，每个样本上滴加lOOiil ProteinaseK工作液，37°C湿盒孵育30分钟；
[0109] 洗涤：切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分钟；
[0110] 制阳性片：用 60ii1DNaseI(50U/ii1)加 40ii1DNaseIBuffer制 100ii1 含 3000U的DNaseI反应液，在一张样本切片上滴加100ill上述配制好的DNaseI反应液， 37°C湿盒孵育10分钟；
[0111] 洗涤：制好的阳性片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分钟；
[0112] TdT酶反应：配制TdT酶反应液：每样本用量：45ii1EquilibrationBuffer加 1.〇11113;[01:;[11-11-(1171?和4.01111(^￡1^50116，计算好样本数集中配制（阴性对照片不 计），即用即配，注意避光；样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50ylTdT酶反应液， 放入温盒中，37°C避光湿盒孵育60分钟（注：阴性对照样本不加TdT酶反应液）；
[0113] 洗涤：孵育后的切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分钟，注意避光；
[0114] 荧光标记：配制Str印tavidin-FITC标记工作液：每个样本用量为：45ul Labelingbuffer加入5ulStreptavidin-FITC标记液，计算好样本数集中配置，阴性对照 片同样计入，即用即配，注意避光；样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50yl配好的 Str印tavidin-FITC标记工作液，放入湿盒中，37°C避光孵育30分钟。
[0115] 洗涤：孵育后的切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分钟，注意避光；
[0116] DAPI复染：用DAPI室温避光复染细胞核10分钟；
[0117] 洗涤：孵育后的切片浸入1XPBS漂洗三次，每次5分钟，注意避光；
[0118] 荧光显微镜检测：激发波长450-500nm，发射波长515-565nm，上机观察拍照。
[0119] 细胞凋亡：卵母细胞或颗粒细胞核为绿色荧光，明显高于背景。
[0120] 卵泡凋亡率：阳性细胞卵泡与总卵泡数的比值。
[0121] 卵母细胞凋亡率：卵母细胞阳性细胞与总卵泡数的比值。
[0122] 颗粒细胞凋亡率：颗粒细胞阳性细胞与总卵泡数的比值。
[0123] 1. 3. 8小鼠雌二醇定量分析（ELISA法）
[0124] 所需试剂和微孔板条室温平衡30分钟后，从铝箔袋中取出所需板条，微孔架固 定；设置标准品孔、样本孔和空白孔，移取90yL标准品以及样本至相应微孔中（整个加样 时间控制在10分钟内）；每孔加入提前复融的冻干雌二醇HRP酶结合物10iiL，充分混合10 秒，25-28°C避光孵育120分钟；弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置60秒，甩去 洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物溶液100yL，室温（18-24°C)避 光孵育20分钟。每孔加入终止液50yL，终止酶反应，10分钟内，在450nm波长处测定各孔 的0D值。
[0125] 结果判断在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应0D值作纵坐标，绘制出 标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
[0126] 1.3. 9制备中药煎剂
[0127] 药材均购自成都中医药大学第二附属医院中药房。
[0128] 每剂药置于1000ml烧杯中，加优普水浸泡30分钟，先大火煮沸，文火维持沸腾25 分钟后滤出药汤，将三次收取的药汤浓缩后储存备用。
[0129] 方剂组成
[0130] 右归丸：熟地黄24份山药12份山茱萸9份枸杞子12份菟丝子12份鹿角胶 12份杜仲12份肉桂6份当归9附子6份
[0131] 左归丸：熟地24份山药12份枸杞子12份山茱萸12份川牛膝12份菟丝子 12份鹿胶12份龟胶12份
[0132] 五子衍宗丸：枸杞子40份、菟丝子40份、覆盆子20份、五味子5份、车前子10份。
[0133] 1.3. 10剂量设定
[0134] 按照"实验动物与人按表面积等效量换算比率"，算出小鼠的等效剂量。专人给小 鼠灌服，每天一次。
[0135] 各复方药物人用剂量分别参见WS3-B-0054-89(右归丸）、WSl-B-0053-89(左归 丸）和《中国药典》2010版一部532页（五子衍宗丸项）。
[0136] 1. 4数据处理及分析
[0137] 运用MicrosoftExcel2007软件进行实验数据处理和作图。采用spss20统计软 件进行方差分析与显著性检验。实验数据以平均值土标准差表示，对卵巢回收率进行卡方 检验。
[0138] 2 结果
[0139] 2. 1小鼠术后一般状态观察
[0140] 小鼠一般术后1?3小时苏醒，苏醒前注意保暖。小鼠术后未见活动异常，对外界 刺激反应灵敏，进食水正常，性情温顺。手术切口愈合良好，未见渗出感染化脓等现象。
[0141] 2. 2补肾对自体异位移植卵巢存活及回收率的影响
[0142] 本次实验共有摘除卵巢后再自体异位移植昆明小鼠246只，摘除后经冻存再自体 异位移植卵巢492个。冻存移植卵巢总有效回收率为68. 70%。经卡方检验，各实验组间差 异统计显著性分析见表1. 1和表1. 2。
[0143] 表1. 1移植卵巢回收率（一）
[0144]
【权利要求】
1. 如下组合物在制备卵巢移植术术前或/和术后的辅助用药物中的用途：所述组合物 的原料药包括如下重量配比的药味： 枸杞子15?50份、宽丝子15?50份、覆盆子15?25份、五味子3?7份、车前子 7?13份。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述卵巢移植术为冻存卵巢移植手术。
3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述冻存卵巢移植手术为冻存卵巢自体 移植手术。
4. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述冻存卵巢自体移植手术为冻存卵巢 自体异位移植手术。
5. 根据权利要求1?4任意一项所述的用途，其特征在于：所述辅助用药物是提高移 植卵巢的存活率，改善移植卵巢生殖能力或/和改善移植卵巢卵母细胞发育能力的药物。
6. 根据权利要求1?4任意一项所述的用途，其特征在于：所述辅助用药物是促进移 植卵巢中卵泡生长的药物。
7. 根据权利要求1?4任意一项所述的用途，其特征在于：所述辅助用药物是改善移 植卵巢生殖能力或/和改善移植卵巢卵母细胞发育能力的药物。
8. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述组合物的原料药包括如下重量配比 的药味： 枸杞子40份、菟丝子40份、覆盆子20份、五味子5份、车前子10份。
9. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述组合物的原料药重量配比如下： 枸杞子15?50份、宽丝子15?50份、覆盆子15?25份、五味子3?7份、车前子 7?13份。
10. 根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述组合物的原料药重量配比如下： 枸杞子40份、菟丝子40份、覆盆子20份、五味子5份、车前子10份。
【文档编号】A61P15/08GK104257879SQ201410462408
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月11日 优先权日:2014年9月11日
【发明者】陆华, 曹胜 申请人:成都中医药大学