蚕虫草在抗呼吸道合胞病毒的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于中药领域，公开了蚕虫草在制备抗呼吸道合胞病毒药物中的应用。经体内外实验证明，蚕虫草对呼吸道合胞病毒RSV有显著的抑制作用，本发明为蚕虫草临床用于治疗呼吸道合胞病毒RSV感染性疾病提供实验依据，对研制抗呼吸道合胞病毒RSV的药物提供一定的指导意义，具有重要的参考价值。
【专利说明】蚕虫草在抗呼吸道合胞病毒的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药领域，涉及蚕虫草在制备抗呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus, RSV)的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 当前呼吸道感染的治疗分别施用用于治疗、预防或改善病毒性、细菌性和真菌性 呼吸道感染的抗病毒剂、抗细菌剂和抗真菌剂。呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV)主要引起呼吸系统感染，在婴幼儿、老年以及免疫缺陷人群引起严重肺炎，是人 类上呼吸道感染的重要病原之一。但在抗病毒治疗中，由于病毒的细胞寄生性及细胞内繁 殖等特点，其治疗具有一定难度。三氮唑核苷（Ribavirin，又名病毒唑）是目前治疗RSV感 染唯一有效的化学药物，动物实验结果发现，若以气雾形式给予适当的剂量，可使肺和鼻中 的RSV滴度减少，药物能直接到达细小支气管，而其他方式给药则很难获得治疗浓度。中药 由于其直接及间接的抗病毒作用特点，使其在治疗病毒类疾病具有独特优势，其能在抗病 毒同时兼有解热、抗炎等作用，还能增强机体免疫功能，阻止病毒进入细胞组织，同时很少 伤害正常组织细胞，毒副作用较小，故其临床使用前景广阔。
[0003] 北冬虫夏草[Cordyc epsmilitaris(Fr. )Link]又名蛹虫草，属于子囊菌纲、肉座 菌目、麦角菌科、虫草属真菌，是虫草属的模式种。以家蚕幼虫为寄主栽培北虫草，也简称为 蚕虫草，其虫草形态更接近天然虫草。《新华本草纲目》称其"味甘，性平"，具有"益肺肾、补 精髓、止血化痰"的功效。现代研究表明北虫草有增强人体免疫力及抗肿瘤的作用，在治疗 肺虚咳嗽、支气管炎、哮喘方面以及抗菌、抗血栓、抗氧化等方面也具有显著作用。但关于蚕 虫草在呼吸系统的作用未见报道，其对于呼吸道合胞病毒（RSV)抑制活性也没有任何启示 的可能。
[0004] 为了寻求新的治疗药物，需要开发能够从根本上治疗病因并有效地改善疾病症状 的天然药物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供蚕虫草在制药中的新用途：
[0006] 蚕虫草在制备抗RSV药物中的应用。
[0007] 经实验证明，蚕虫草对RSV有显著的抑制作用：抑制RSV在HEK293细胞出现CPE 效应（Cytopathic Effect，CPE)，其对呼吸道合胞病毒A亚型的抑制率为108. 62%，对呼吸 道合胞病毒B亚型的抑制率为103. 13% ;通过肺部病变评分可见其能有效改善RSV肺炎幼 大鼠的症状，治疗效果良好。
[0008] 本发明涉及的蚕虫草在制备治疗呼吸道合胞病毒（RSV)药物中的用途属于首次 公开，而且其对于呼吸道合胞病毒（RSV)抑制活性强的意想不到。
【具体实施方式】
[0009] 以下将结合具体实施例对本发明做进一步阐述，这些实例仅用于说明目的，而不 用于限制本发明范围。
[0010] 实施例1
[0011] 蚕虫草制备：采用5龄家蚕，北虫草菌注射接种，正常饲养，将硬化蚕培养至子实 体长出。冷冻干燥后，粉碎至120目，备用。
[0012] 实施例2蚕虫草对呼吸道合胞病毒（RSV)的作用研究
[0013] 试样配制：自制蚕虫草（方法如实施例1)、蛹虫草（购买）、虫草花（购买）、冬虫 夏草（购买）粉碎后，溶解于DMEM液（含2%小牛血清）中备用，配制浓度为100 μ g/mL。
[0014] 利巴韦林注射液（湖北潜江制药股份有限公司生产，批号081004,国药准字 !119993455)，规格 ：10011^/11^(支），用含2%小牛血清的01^培养基配制浓度为20(^8/ mL〇
[0015] 细胞株与病毒株：人胚肾细胞（HEK293，RSV病毒敏感细胞）购自美国Clontech公 司；呼吸道合胞病毒（RSV)A亚型（Long株）、B亚型（R6株），由中国科学院武汉分院病毒 所提供。
[0016] 细胞的培养及RSV扩增：人胚肾细胞（HEK293)，镜下观察细胞呈三角形或多角形， 生长状态良好的细胞每2-3天传代，0.25 %胰酶消化l-2min，镜下观察细胞回缩变圆时停 止消化，每次分3-4瓶，于37°C、5% C02培养箱饱和湿度下培养。HEK293细胞以l*105/mL 接种24孔板，待细胞长成单层时弃培养液，接种病毒液200 μ L/孔，置37°C、5% C02培养箱 中吸附1. 5h后，补充含2%胎牛血清的维持液至lmL/孔，继续培养3-5d。逐日观察细胞病 变（cytopathic effect，CPE)，典型病变是融合的大泡，病变达75%以上时，置_70°C (至 少2h)和37°C反复冻融3次。收集病毒液，2500r/min离心lOmin。弃沉淀，收集病毒上清 液，分装后于_70°C保存备用。
[0017] 细胞最大无毒浓度的测定：参照文献（汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血 清对呼吸道合胞病毒抑制作用的实验研究，南京中医药大学学报，2008 ;24(1) :25-27)的 方法，将虫草样品和利巴韦林接种于96孔板中的HEK293上，每孔100 μ L，并设正常细胞对 照组。置37°C、5%C02培养箱中培养，观察细胞病变至72h。弃去上清液，用移液器每孔加 入奶7(111^/1^)10(^1^。置培养箱中孵育411。吸弃孔内上清液，每孔加入10(^1^1^0，振 荡，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值。确定药物 的最大无毒浓度。结果可见在HEK293细胞中，蚕虫草、蛹虫草、虫草花和利巴韦林的最大无 毒浓度为500 μ g/mL。
[0018] 呼吸道合胞病毒A、B亚型组织培养半数感染量（50percent Tissue Culture Infective Dose，TClD5(l)的测定：HEK293细胞接种96孔细胞板，每孔100yL。病毒悬液用 不完全培养基（不含新生牛血清的培养基）10倍稀释8个浓度。接种细胞，长成单层时吸 弃培养液，PBS洗细胞面，接种各稀释度的病毒液。并设正常细胞对照组。置37°C、5%C0 2 培养箱中吸附2h。吸弃病毒液，培养箱中培养，逐日观察病变程度并记录。以最高稀释度不 再出现新病变时为终点，细胞病变程度用-?++++表示：无细胞病变时为25%以下细 胞出现病变为 " + "，25%?50%为 "++"，50%?75%为 "+++"，75%?100%为 "++++"。用 Reed-Muench 公式计算 TCID5Q。结果可见在 HEK293 中，RsvA 亚型 TCID5Q 为 ΚΓ3·98, RSVB 亚 型 TCID5Q 为 ΚΓ3·64。
[0019] 不同虫草样品对RSV的抑制作用：将1*105浓度的HEK293细胞接种到96孔培养板 上，置37°C、5% C02箱培养。待细胞长成单层，在18?36h内，吸弃培养液，PBS洗细胞面， 每孔接种l〇〇TCID 5(lRSVA或B亚型，置37°C、5% C02培养箱吸附2h。吸弃病毒液，分别加入 不同虫草样品，并设利巴韦林药物对照、病毒对照、空白对照和正常细胞对照，每组5个复 孔，每孔100 μ L。利巴韦林用维持液稀释成200 μ g/mL，正常细胞和病毒对照只加维持液， 置37°C、5%C02培养箱。每日在倒置显微镜下观察细胞病变。72h后加入MTT(lmg/mL)，每 孔1〇〇μ L，置37°C、5%% C02培养箱，4h后，小心吸弃孔内上清液，每孔加入100μ LDMS0， 振荡，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值。
[0020]
【权利要求】
1.蚕虫草在制备抗呼吸道合胞病毒的药物中的应用。
【文档编号】A61P31/14GK104208105SQ201410489659
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】韦敏, 吕晔, 郑生智, 蒋翠平, 刘菲 申请人:江苏省中国科学院植物研究所, 江苏富柏传媒有限公司