Drd1及其激动剂在制备治疗nlrp3炎症小体相关炎症性疾病药物中的用途
【专利摘要】本发明公开了DRD1蛋白及其激动剂在制备治疗NLRP3炎症小体相关炎症性疾病药物中的用途。所述蛋白在其内源性激动剂多巴胺的作用下，诱导炎症小体重要成分NLRP3蛋白的降解，起到抑制IL-1β等炎性因子成熟和分泌的效果，从而抑制NLRP3炎症小体的活化。本发明提供了DRD1蛋白作为NLRP3炎症小体相关炎症性疾病(外周系统炎症和中枢系统炎症)的靶点的应用，可以用于筛选研发NLRP3炎症小体相关炎症性疾病的药物。本发明还提供了DRD1蛋白的人工合成激动剂A-68930，(±)-SKF-38393 hydrochloride，SKF 89626和6-Chloro-PB hydrobromide的抗炎效果，为这些激动剂或其活性成分制备抗炎药物和治疗炎症性疾病提供了原创思路和理论支持。
【专利说明】DRD1及其激动剂在制备治疗NLRP3炎症小体相关炎症性疾 病药物中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及DRDl蛋白及其激动剂在制备治疗NLRP3炎症小体相关炎症性疾病药 物中的用途。
【背景技术】
[0002] NLRP3炎症小体是一种胞内的多聚蛋白复合物，它主要由NLRP3(NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 3), ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)和caspase-1三种蛋白质所组成。NLRP3炎症小体及其信号通路在 启动炎症及其相关免疫应答过程中具有至关重要的作用（Davis et al.，2011，Annu Rev Immunol ;Marltinon et al·，2009, Immunol)。所以，NLRP3炎症小体的活化，必须受到精确 而严格的调控。如果炎症反应的失调，比如过度放大或者持续存在，都会引发机体损伤，甚 至导致炎症性疾病的发生。NLRP3炎症小体的异常活化会促进多种人类重大疾病的发生发 展，比如说二型糖尿病（Zhou et al·，2010, Nat Immunol ;Yan et al·，2013, Immunity)、动 脉粥样硬化（Duewell et al·，2010, Nature)、痛风（Martinon et al·，2006, Nature)、肠 炎（Siegmund et al. ,2001, Proc Natl Acad Sci USA·)、肝炎（Negash et al·，2013, PLoS Pathog)、娃肺（Dostert et al·，2008, Science)、紫外线所诱导的皮肤晒伤（Watanabe et al.，2007, J Investig D ermatol. ;Feldmeyer et al.，2007, Curr Biol)和接触性超敏反 应（Watanabe et al. , 2007, J Investig Dermatol ；Sutterwala et al. , 2006, Immunity)> 胺毒血症（Mao et al.,2013,Cell Res),甚至是肿瘤（Ghiringhelli et al.,2009,Nat Med;Allen et al.,2010,J Exp Med)和神经退行性疾病（Halle et al.,2008,Nat Tmmunol)等。
[0003] 既然NLRP3炎症小体及其诱导的炎症反应参与多种人类重大疾病的发生过程， NLRP3炎症小体自然就成为对这些疾病进行预防和治疗的潜在靶点。目前该领域的基础和 临床研究主要集中在利用IL-I受体中和性抗体或者拮抗剂来阻断IL-I与其受体结合，从 而抑制炎症反应（Dinarello et al.，2012, Annu Rev Immunol)。但是，虽然 IL-1 是 NLRP3 活化之后产生的一个非常重要的介导炎症的效应分子，但并不是唯一的分子。NLRP3炎症小 体活化也能产生IL-18、IL-33、HMGB1和促炎症的脂类物质等炎症介质，因而抑制IL-I活性 可能并不会产生很好的抗炎效果（von Moltke et al.，2012, Nature)。与针对IL-I及其受 体的干预手段相比，靶向NLRP3炎症小体活化的干预手段则能从根本上抑制IL-1、IL-18、 IL-33和HMGBl等介导的炎症反应，有可能取得更好的抗炎效果。但是，迄今为止，还没有有 效的针对NLRP3炎症小体的抗炎药物问世。
[0004] 多巴胺（DA)是一种重要的神经递质。它不仅能够调节机体的行为，运动，内分 泌，心血管，肾脏和消化系统功能，而且还可以作为神经系统和免疫系统的分子桥梁。在 几乎所有的免疫细胞中，多巴胺受体都有表达。多巴胺受体共发现有五个亚型，分别是 Drdl，Drd2, Drd3, Drd4和Drd5,其中，Drdl和Drd5被称为Dl样多巴胺受体，而Drd2， Drd3和Drd4被称为D2样多巴胺受体。多项报道指出，多巴胺通过它的各个受体，可以 有效调节免疫细胞的活化，增殖和细胞因子的分泌（Beck et al·，2004, Crit Care5Shao et al.，2013, Nature)。另外，多巴胺受体Drd2缺陷鼠摧患神经炎症，这提示了多巴胺 和它的下游信号通路具有抗炎功能（Shao et al.，2013, Nature)。而且，有报道指出，多 巴胺持续低水平与帕金森氏病发病过程中的免疫系统紊乱和中枢神经系统炎症密切相关 (Wullner&Klockgether，2003, J Neurol ;Meredith et al·，2005, Immunology)。这些工作 提示我们，多巴胺很可能具有抗炎功能，无论是在外周，还是在中枢系统。但是，目前该领域 的基础和临床研究主要集中在用多巴胺及多巴胺受体的激动剂来治疗和缓解帕金森氏病， 还没有用于治疗NLRP3炎症小体相关的炎症性疾病的成功范例。
[0005] 我们通过确定多巴胺对NLRP3炎症小体的抑制作用，研究多巴胺的靶标受体。多 巴胺抗炎靶点的确定，可以为多种NLRP3炎症小体相关的炎症性疾病提供治疗思路和理论 依据，更可以为筛选和制备治疗炎症性疾病的药物提供分子靶点和制备思路。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供DRDl蛋白作为制备治疗NLRP3炎症小体相关的炎症性疾病 的药物应用，提供DRDl蛋白的激动剂多巴胺，A-68930,（±)-SKF-38393hydrochloride， SKF 89626和6-Chloro-PB hydrobromide作为治疗NLRP3炎症小体相关的炎症性疾病的药 物的活性成分的应用。
[0007] 具体而言，本发明的第一个方面提供DRDl蛋白用于制备治疗炎症性疾病药物或 试剂盒，用作治疗NLRP3炎症小体相关炎症性疾病的药物的靶点以及用于筛选治疗NLRP3 炎症小体相关炎症性疾病药物的用途。
[0008] 在一个优选的实施方案中，所述DRDl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No :1所示。
[0009] 在一个优选的实施方案中，所述炎症性疾病为NLRP3炎症小体相关的炎症性疾 病。
[0010] 在一个优选的实施方案中，所述炎症性疾病为二型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风、 肠炎、肝炎、硅肺、紫外线所诱导的皮肤晒伤、接触性超敏反应、脓毒血症肿瘤或神经退行性 疾病。
[0011] 在Iv优选的实施方案中，所述炎症包括中枢系统炎症和外周系统炎症，优选为 外周腹腔炎症。
[0012] 本发明的第二个方面提供DRDl蛋白的激动剂用于制备治疗炎症性疾病的药物或 试剂盒的用途。
[0013] 在一个优选的实施方案中，所述激动剂通过DRDl蛋白发挥治疗作用。
[0014] 在一个优选的实施方案中，所述炎症性疾病为NLRP3炎症小体相关的炎症性疾 病。
[0015] 在一个优选的实施方案中，所述炎症性疾病为二型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风、 肠炎、肝炎、硅肺、紫外线所诱导的皮肤晒伤、接触性超敏反应、脓毒血症肿瘤或神经退行性 疾病。
[0016] 在一个优选的实施方案中，所述炎症包括中枢系统炎症和外周系统炎症，优选为 外周腹腔炎症。
[0017] 在一个优选的实施方案中，所述DRDl蛋白的激动剂选自多巴胺、A-68930、 (±) -SKF_38393hydrochloride、SKF 89626 和 6_Chlor〇-PB hydrobromide 或其组合。
[0018] 在一个优选的实施方案中，所述DRDl蛋白的激动剂可以抑制IL-I β的分泌、通过 其膜上受体DRDl抑制NLRP3炎症小体的活化、诱导NLRP3的降解，从而实现治疗炎症性疾 病，尤其是NLRP3炎症小体相关的炎症性疾病。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图IDA抑制IL-I β的分泌
[0020] 图2DA抑制NLRP3炎症小体的活化
[0021] 图3DA通过其膜上受体DRDl抑制NLRP3炎症小体的活化
[0022] 图4DA诱导NLRP3的降解
[0023] 图5DA通过其膜上受体DRDl诱导NLRP3的降解
[0024] 图6DRD1激动剂抑制NLRP3炎症小体的活化
[0025] 图7DRD1激动剂Α-68930诱导NLRP3的降解
[0026] 图8DA可以通过DRDl抑制小胶质细胞炎症小体的活化
[0027] 图9DA可以通过DRDl抑制星形胶质细胞炎症小体的活化
[0028] 图10DRD1蛋白可以抑制中枢系统炎症
[0029] 图IlDRDl激动剂Α-68930可以抑制中枢系统炎症
[0030] 图12DA可以抑制LPS诱导的外周系统炎症
[0031] 图13DRD1蛋白可以抑制LPS诱导的外周系统炎症
[0032] 图14DA可以抑制MSU诱导的外周腹腔炎症
[0033] 图IOTRDl蛋白可以抑制MSU诱导的外周腹腔炎症
【具体实施方式】
[0034] 以下的实例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方 法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常 规生化试剂商店购买得到的。
[0035] BMDM(骨髓来源的巨噬细胞）：制备方法见文献（Yan et al.，2013, Immunity)。
[0036] 小胶质细胞：制备方法见文献（Shao et al.，2012, Nature)。
[0037] 星形胶质细胞：制备方法见文献（Shao et al.，2012, Nature)。
[0038] Drdl 缺陷鼠：来源见文献（Martinon et al.，2006,Nature ;Kelly et al.，1997， Neuron ；Drago et al. , 1994, Proc Natl Acad Sci USA) 〇
[0039] 抗鼠 IL-I β 抗体：R&D, AF-401-NA。
[0040] 抗鼠 caspase-1 抗体：Adipogen, AG-20B-0042。
[0041] 抗 NLRP3 抗体：Adipogen, AG-20B-0014。
[0042] 抗 β-actin 抗体：Abmart, P30002。
[0043] 抗 ASC 抗体：Santa Cruz, sc-22514。
[0044] DA(多巴胺）：Sigma，H8502。
[0045] Ultrapure LPS ：Invivogen,tlrl-3pelps〇
[0046] Nigericin(尼日利亚菌素）：Sigma，N7143。
[0047] MSU(尿酸结晶）：Sigma，U0881。
[0048] ATP :Sigma，A1852。
[0049] Imject-Alum(In) ：Pierce Biochemicals, 77161 〇
[0050] MPTP :Sigma, M0896。
[0051] LPS :Sigma, L2630。
[0052] A-68930 :Sigma，A8852。
[0053] (±)-SKF-38393hydrochloride :Sigma，D047。
[0054] SKF 89626 :Sigma，S3066。
[0055] 6_Chlor〇-PB hydrobromide :Sigma, S143。
[0056] 实施例I，DA及其激动剂在体外抑制巨噬细胞NLRP3炎症小体的活化
[0057] 一、DA抑制IL-I β的分泌
[0058] 1，第一天，将BMDM分到十二孔板上，每个孔5*105个细胞。
[0059] 2,第二天，先吸去上清，每孔加入 500μ 1 含ultra_LPS(500ng/ml)的 opti-MEM，处 理三个小时。分成五组，每组三个复孔。
[0060] 第一组，阴性对照组。
[0061] 第二组，每孔加入终浓度为10μ M的Nigericin半小时。
[0062] 第三组，每孔加入终浓度为0. 15mM的DA三个小时，再加入终浓度为10μ M的 Nigericin 半小时。
[0063] 第四组，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时，再加入终浓度为10μ M的 Nigericin 半小时。
[0064] 第五组，每孔加入终浓度为0.25mM的DA三个小时，再加入终浓度为10μ M的 Nigericin 半小时。
[0065] 3,步骤2处理后的细胞，收集细胞上清（SN)和细胞裂解液（Input)用抗鼠 IL-I β 抗体和抗鼠 caspase-1抗体进行western blotting分析。结果见图1 (泳道1为第一组， 泳道2为第二组，泳道3为第三组，泳道4为第四组，泳道5为第五组）。
[0066] 在第一信号LPS和第二信号Nigericin的共同作用下，炎症小体活化，p20和 IL-I β成熟并分泌到上清之中（泳道2)，DA的加入，有效地抑制了 p20和IL-I β成熟和 分泌，并且，这种效果是呈剂量依赖性的（泳道3,泳道4和泳道5)。
[0067] 二、DA抑制NLRP3炎症小体的活化
[0068] 1，第一天，将BMDM分到十二孔板上，每个孔5*105个细胞。
[0069] 2,第二天，先吸去上清，每孔加入 500 μ 1 含ultra-LPS (500ng/ml)的 opti-MEM，处 理三个小时。分成十组，每组三个复孔。
[0070] 第一组，阴性对照组。
[0071] 第二组，每孔加入终浓度为150 μ g/ml的MSU六小时。
[0072] 第三组，每孔加入终浓度为10 μ M的Nigericin半小时。
[0073] 第四组，每孔加入终浓度为2. 5mM的ATP半小时。
[0074] 第五组，每孔加入终浓度为300 μ g/ml的Alum六小时。
[0075] 第六组，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时。
[0076] 第七组，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时，再加入终浓度为150 μ g/ml的 MSU六小时。
[0077] 第八组，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时，再加入终浓度为IOM的 Nigericin 半小时。
[0078] 第九组，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时，再加入终浓度为2. 5mM的ATP 半小时。
[0079] 第十组，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时，再加入终浓度为300 μ g/ml的 Alum六小时。
[0080] 3,步骤2处理后的细胞，收集细胞上清（SN)和细胞裂解液（Input)用抗鼠 IL-I β 抗体和抗鼠 caspase-1抗体进行western blotting分析。结果见图2 (泳道1为第一组， 泳道2为第二组,泳道3为第三组,泳道4为第四组,泳道5为第五组,泳道6为第六组,泳 道7为第七组，泳道8为第八组，泳道9为第九组，泳道10为第十组）。
[0081] Nigericin，MSU，ATP和Alum是几乎已知的所有可以活化NLRP3炎症小体的第二 信号。在第一信号LPS和这些第二信号的共同作用下，炎症小体活化，p20和IL-I β成熟 并分泌到上清之中（泳道2,泳道3,泳道4和泳道5)，DA的加入，有效地抑制了这些刺激剂 所诱导的Ρ20和IL-I β成熟和分泌（泳道7,泳道8,泳道9和泳道10)。
[0082] 三、DA通过其膜上受体DRDl抑制NLRP3炎症小体的活化
[0083] 1，第一天，将野生鼠（WT)和Drdl缺陷鼠的BMDM分到十二孔板上，每个孔5*105个 细胞。
[0084] 2,第二天，先吸去上清，每孔加入 500 μ 1 含ultra-LPS (500ng/ml)的 opti-MEM，处 理三个小时。两种BMDM各分成三组，共六组，每组三个复孔。
[0085] 第一组，WT鼠 BMDM，阴性对照组。
[0086] 第二组，WT鼠 BMDM，每孔加入终浓度为10 μ M的Nigericin半小时。
[0087] 第三组，WT鼠 BMDM，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时，再加入终浓度为 10 μ M 的 Nigericin 半小时。
[0088] 第四组，Drdl缺陷鼠 BMDM，阴性对照组。
[0089] 第五组，Drdl缺陷鼠 BMDM，每孔加入终浓度为10 μ M的Nigericin半小时。
[0090] 第六组，Drdl缺陷鼠 BMDM，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时，再加入终浓 度为IOM的Nigericin半小时。
[0091] 3,步骤2处理后的细胞，收集细胞上清（SN)和细胞裂解液（Input)用抗鼠 IL-I β 抗体和抗鼠 caspase-1抗体进行western blotting分析。结果见图3 (泳道1为第一组， 泳道2为第二组，泳道3为第三组，泳道4为第四组，泳道5为第五组，泳道6为第六组）。
[0092] 对于野生型鼠的巨噬细胞来讲，DA的加入，有效的抑制了 Nigericin所诱导的p20 和IL-I β成熟和分泌（泳道3)，也就是说，有效的抑制了 NLRP3炎症小体的活化。而对于 Drdl缺陷鼠的巨噬细胞，DA的加入，并不能有效的抑制NLRP3炎症小体的活化（泳道6)。 因此，DA是通过其膜上受体DRDl起到抑制NLRP3炎症小体活化的作用的。
[0093] 四、DA诱导NLRP3的降解
[0094] 1，第一天，将BMDM分到十二孔板上，每个孔2*105个细胞。
[0095] 2,第二天，先吸去上清，每孔加入 500μ 1 含ultra_LPS(500ng/ml)的 opti-MEM，处 理三个小时。分成六组，每组三个复孔。
[0096] 第一组，阴性对照组。
[0097] 第二组，每孔加入终浓度为0. 15mM的DA三个小时。
[0098] 第三组，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时。
[0099] 第四组，每孔加入终浓度为0. 25mM的DA三个小时。
[0100] 第五组,每孔加入终浓度为0. 2mM的DA两个小时。
[0101] 第六组，每孔加入终浓度为〇. 2mM的DA四个小时。
[0102] 3,步骤2处理后的细胞，收集细胞裂解液用抗NLRP3抗体，抗ASC抗体，抗鼠 caspase-1抗体和抗β-actin抗体进行western blotting分析。结果见图4A和图4B (图 4A泳道1为第一组，泳道2为第二组，泳道3为第三组，泳道4为第四组。图4B泳道1为第 一组，泳道2为第五组，泳道3为第三组，泳道4为第六组）。
[0103] DA可以使得BMDM中的NLRP3降解，并且，这种降解是呈现剂量与时间依赖性的。 这可以证明，DA可以诱导NLRP3降解，这也许是DA抑制NLRP3炎症小体活化的原因。
[0104] 五DA通过其膜上受体DRDl诱导NLRP3的降解
[0105] 1，第一天，将野生鼠（WT)和Drdl缺陷鼠的BMDM分到十二孔板上，每个孔2*105个 细胞。
[0106] 2,第二天，先吸去上清，每孔加入 500μ 1 含ultra_LPS(500ng/ml)的 opti-MEM，处 理三个小时。两种BMDM各分成两组，共四组，每组三个复孔。
[0107] 第一组，WT鼠 BMDM，阴性对照组。
[0108] 第二组，WT鼠 BMDM，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时。
[0109] 第三组，Drdl缺陷鼠 BMDM，阴性对照组。
[0110] 第四组，Drdl缺陷鼠 BMDM，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时。
[0111] 3,步骤2处理后的细胞，收集细胞裂解液用抗NLRP3抗体，抗ASC抗体，抗鼠 caspase-Ι抗体和抗β-actin抗体进行western blotting分析。结果见图5 (泳道1为第 一组，泳道2为第二组，泳道3为第三组，泳道4为第四组）。
[0112] DA在膜上有五个受体，DRD1，DRD2, DRD3, DRD4和DRD5,接下来，我们看DA是否是 通过DRDl行使其功能的。DA可以诱导野生鼠 BMDM中NLRP3的降解，但是，在Drdl缺陷鼠 中，DA的这种作用就没有了，因此，DA是通过其膜上受体Drdl起作用的。
[0113] 六、DRDl激动剂抑制NLRP3炎症小体的活化
[0114] 1，第一天，将BMDM分到十二孔板上，每个孔5*105个细胞。
[0115] 2,第二天，先吸去上清，每孔加入 500μ 1 含ultra_LPS(500ng/ml)的 opti-MEM，处 理三个小时。分成十五组，每组三个复孔。
[0116] 第一组，阴性对照组。
[0117] 第二组，每孔加入终浓度为10μ M的Nigericin半小时。
[0118] 第三组，每孔加入终浓度为的ΙΟμΜ的Α-68930三个小时，再加入终浓度为ΙΟμΜ 的Nigericin半小时。
[0119] 第四组，每孔加入终浓度为20μΜ的Α-68930三个小时，再加入终浓度为ΙΟμΜ的 Nigericin 半小时。
[0120] 第五组，每孔加入终浓度为30 μ M的Α-68930三个小时，再加入终浓度为10 μ M的 Nigericin 半小时。
[0121] 第六组，阳性对照组。每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时，再加入终浓度为 10 μ M 的 Nigericin 半小时。
[0122] 第七组，每孔加入终浓度为20 μ M的（±) -SKF_38393hydrochloride三个小时，再 加入终浓度为10 μ M的Nigericin半小时。
[0123] 第八组，每孔加入终浓度为40 μ M的（±) -SKF_38393hydrochloride三个小时，再 加入终浓度为10 μ M的Nigericin半小时。
[0124] 第九组，每孔加入终浓度为ΙΟΟμΜ的（±)-SKF_38393hydrochloride三个小时， 再加入终浓度为10 μ M的Nigericin半小时。
[0125] 第十组，每孔加入终浓度为20 μ M的SKF 89626三个小时，再加入终浓度为10 μ M 的Nigericin半小时。
[0126] 第^^一组，每孔加入终浓度为40μ M的SKF 89626三个小时，再加入终浓度为 10 μ M 的 Nigericin 半小时。
[0127] 第十二组，每孔加入终浓度为ΙΟΟμΜ的SKF 89626三个小时，再加入终浓度为 10 μ M 的 Nigericin 半小时。
[0128] 第十三组，每孔加入终浓度为20 μ M的6_Chlor〇-PB hydrobromide三个小时，再 加入终浓度为10 μ M的Nigericin半小时。
[0129] 第十四组，每孔加入终浓度为40 μ M的6_Chlor〇-PB hydrobromide三个小时，再 加入终浓度为10 μ M的Nigericin半小时。
[0130] 第十五组，每孔加入终浓度为100 μ M的6_Chlor〇-PB hydrobromide三个小时，再 加入终浓度为10 μ M的Nigericin半小时。
[0131] 3,步骤2处理后的细胞，收集细胞上清（SN)和细胞裂解液（Input)用抗鼠 IL-I β 抗体和抗鼠 caspase-1抗体进行western blotting分析。结果见图6Α和图6Β (图6Α泳 道1为第一组，泳道2为第二组，泳道3为第三组，泳道4为第四组，泳道5为第五组，泳道6 为第六组；）图6B泳道1为第一组，泳道2为第二组，泳道3为第六组，泳道4为第七组，泳 道5为第八组，泳道6为第九组，泳道7为第十组，泳道8为第十一组，泳道9为第十二组， 泳道10为第十三组，泳道11为第十四组，泳道12为第十五组）。
[0132] 如图6A所示，在第一信号LPS和第二信号Nigericin的共同作用下，炎症小体活 化，p20和IL-I β成熟并分泌到上清之中（泳道2) ,A-68930的加入，有效地抑制了 p20和 IL-I β成熟和分泌，并且，这种效果是呈剂量依赖性的（泳道3,泳道4和泳道5)。图6B研 究了其它几种 DRDl 的激动剂（±)-SKF-38393hydrochloride，SKF 89626 和 6-Chloro-PB hydrobromide。这些激动剂的加入，可以有效地抑制了 p20和IL-I β成熟和分泌，并且，这 种效果是呈剂量依赖性的（泳道4,泳道5和泳道6显示了（±) -SKF-38393hydrochloride 的抑制效果；泳道7,泳道8和泳道9显示了 SKF 89626的抑制效果；泳道10,泳道11和泳 道 12 显不了 6-Chloro-PB hydrobromide 的抑制效果）。
[0133] 七DRDl激动剂A-68930诱导NLRP3的降解
[0134] 1，第一天，将BMDM分到十二孔板上，每个孔2*105个细胞。
[0135] 2,第二天，先吸去上清，每孔加入 500μ 1 含ultra_LPS(500ng/ml)的 opti-MEM，处 理三个小时。分成六组，每组三个复孔。
[0136] 第一组，阴性对照组。
[0137] 第二组，每孔加入终浓度为20μΜ的A-68930三个小时。
[0138] 第三组，每孔加入终浓度为30 μ M的Α-68930三个小时。
[0139] 第四组，每孔加入终浓度为40μΜ的Α-68930三个小时。
[0140] 第五组，每孔加入终浓度为30 μ M的Α-68930两个小时。
[0141] 第六组，每孔加入终浓度为30μ M的Α-68930四个小时。
[0142] 3,步骤2处理后的细胞，收集细胞裂解液用抗NLRP3抗体，抗ASC抗体，抗鼠 caspase-1抗体和抗β-actin抗体进行western blotting分析。结果见图7Α和图7Β (图 七A泳道1为第一组，泳道2为第二组，泳道3为第三组，泳道4为第四组。图7B泳道1为 第一组泳道2为第五组，泳道3为第三组，泳道4为第六组）。
[0143] DRDl激动剂Α-68930可以使得BMDM中的NLRP3降解，并且，与DA相同，这种降解 是呈现剂量与时间依赖性的。
[0144] 实施例2, DRDl蛋白可以抑制中枢系统炎症
[0145] 一、DA可以通过DRDl抑制小胶质细胞炎症小体的活化
[0146] 1，第一天，将野生鼠（WT)和Drdl缺陷鼠的小胶质细胞分到十二孔板上，每个孔 1*10 6个细胞。
[0147] 2,第二天，先吸去上清，每孔加入 500μ 1 含ultra_LPS(500ng/ml)的 opti-MEM，处 理三个小时。两种小胶质细胞各分成三组，共六组，每组三个复孔。
[0148] 第一组，WT鼠小胶质细胞，阴性对照组。
[0149] 第二组，WT鼠小胶质细胞，每孔加入终浓度为10 μ M的Nigericin半小时。
[0150] 第三组，WT鼠小胶质细胞，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时，再加入终浓 度为10 μ M的Nigericin半小时。
[0151] 第四组，Drdl缺陷鼠小胶质细胞，阴性对照组。
[0152] 第五组，Drdl缺陷鼠小胶质细胞，每孔加入终浓度为10 μ M的Nigericin半小时。
[0153] 第六组，Drdl缺陷鼠小胶质细胞，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时，再加 入终浓度为10 U M的Nigericin半小时。
[0154] 3,步骤2处理后的细胞，收集细胞上清用ELISA的方法进行IL-I β等细胞因子的 测定。结果见图8。
[0155] 对于野生型鼠的小胶质细胞来讲，DA的加入，有效的抑制了 Nigericin所诱导的 IL-I β的分泌，也就是说，有效的抑制了 NLRP3炎症小体的活化。而对于Drdl缺陷鼠的小 胶质细胞，DA的加入，并不能有效的抑制NLRP3炎症小体的活化。因此，与巨噬细胞类似， 在小胶质细胞之中，DA也是通过其膜上受体DRDl起到抑制NLRP3炎症小体活化的作用的。
[0156] 二、DA可以通过DRDl抑制星形胶质细胞炎症小体的活化
[0157] 1，第一天，将野生鼠（WT)和Drdl缺陷鼠的星形胶质细胞分到十二孔板上，每个孔 1*106个细胞。
[0158] 2,第二天，先吸去上清，每孔加入 500μ 1 含ultra_LPS(500ng/ml)的 opti-MEM，处 理三个小时。两种星形胶质细胞各分成三组，共六组，每组三个复孔。
[0159] 第一组，WT鼠星形胶质细胞，阴性对照组。
[0160] 第二组，WT鼠星形胶质细胞，每孔加入终浓度为10μ M的Nigericin半小时。
[0161] 第三组，WT鼠星形胶质细胞，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时，再加入终 浓度为10 Ii M的Nigericin半小时。
[0162] 第四组，Drdl缺陷鼠星形胶质细胞，阴性对照组。
[0163] 第五组，Drdl缺陷鼠星形胶质细胞，每孔加入终浓度为10μ M的Nigericin半小 时。
[0164] 第六组，Drdl缺陷鼠星形胶质细胞，每孔加入终浓度为0. 2mM的DA三个小时，再 加入终浓度为10 μ M的Nigericin半小时。
[0165] 3,步骤2处理后的细胞，收集细胞上清用ELISA的方法进行IL-I β等细胞因子的 测定。结果见图9。
[0166] 对于野生型鼠的星形胶质细胞来讲，DA的加入，有效的抑制了 Nigericin所诱导 的IL-I β的分泌，也就是说，有效的抑制了 NLRP3炎症小体的活化。而对于Drdl缺陷鼠的 星形胶质细胞，DA的加入，并不能有效的抑制NLRP3炎症小体的活化。因此，与巨噬细胞和 小胶质细胞类似，在星形胶质细胞之中，DA也是通过其膜上受体DRDl起到抑制NLRP3炎症 小体活化的作用的。
[0167] 三DRDl蛋白可以抑制中枢系统炎症
[0168] 1，第一天，选取8?12周的野生鼠（WT)和Drdl缺陷鼠。两种鼠各分成两组，每 组三只，共四组。
[0169] 第一组，野生型鼠，腹腔注射PBS作为阴性对照，每两小时注射一次，共注射五次。
[0170] 第二组，野生型鼠，腹腔注射ΜΡΤΡ，注射剂量为20mg/kg，每两小时注射一次，共注 射五次。
[0171] 第三组，Drdl缺陷鼠，腹腔注射PBS作为阴性对照，每两小时注射一次，共注射五 次。
[0172] 第四组，Drdl缺陷鼠，腹腔注射MPTP，注射剂量为20mg/kg，每两小时注射一次，共 注射五次。
[0173] 2,第二天，用拔眼球的方法收集血液，室温放置半个小时，再低速离心半小时，收 集血清。
[0174] 3,步骤2得到的血清用ELISA的方法进行IL-I β和IL-18等细胞因子的测定。结 果见图10。
[0175] Drdl缺陷鼠的本底细胞因子水平与野生型鼠类似，但是，在MPTP作用下，Drdl缺 陷鼠的IL-I β和IL-18等炎性细胞因子水平相比野生型鼠有明显的升高，这表示，DRDl在 机体抑制中枢系统炎症中起到了重要作用，所以，它的缺失，会导致机体炎性因子分泌水平 升高。
[0176] 四DRDl激动剂Α-68930可以抑制中枢系统炎症
[0177] 1，第一天，选取8?12周的野生鼠（WT)。鼠分成三组，每组三只。
[0178] 第一组，野生型鼠，腹腔注射PBS作为阴性对照，每两小时注射一次，共注射五 次。
[0179] 第二组，野生型鼠，腹腔注射ΜΡΤΡ，注射剂量为20mg/kg，每两小时注射一次，共注 射五次。
[0180] 第三组，野生型鼠，腹腔注射A-68930,注射剂量为5mg/kg，每八小时注射一次，共 注射三次；并且，在第一次注射A-68930八小时后，腹腔注射MPTP，注射剂量为20mg/kg，每 两小时注射一次，共注射五次。
[0181] 2,第二天，用拔眼球的方法收集血液，室温放置半个小时，再低速离心半小时，收 集血清。
[0182] 3,步骤2得到的血清用ELISA的方法进行IL-I β和IL-18等细胞因子的测定。结 果见图11。
[0183] 在MPTP作用下，鼠的IL-I β和IL-18等炎性细胞因子水平有明显的升高，而同 时注射了 DRDl激动剂Α-68930的鼠，IL-I β和IL-18等炎性细胞因子水平显著下降，这表 示，DRD1激动剂Α-68930可以有效的抑制MPTP所诱导的炎性细胞因子的高表达，也就是说， DRDl激动剂Α-68930可以抑制中枢系统炎症。
[0184] 实施例3, DRDl蛋白可以抑制外周系统炎症
[0185] 一、DA可以抑制LPS诱导的外周系统炎症
[0186] 1，选取8?12周的野生鼠（WT)，鼠分成三组，每组三只。
[0187] 2,第一组，野生型鼠，腹腔注射PBS作为阴性对照
[0188] 第二组，野生型鼠，腹腔注射LPS，注射剂量为20mg/kg
[0189] 第三组，野生型鼠，同时腹腔注射LPS和DA，其中，LPS的注射剂量为20mg/kg，DA 的注射剂量为50mg/kg
[0190] 3,四小时后，用拔眼球的方法收集血液，室温放置半个小时，再低速离心半小时， 收集血清。
[0191] 4,步骤3得到的血清用ELISA的方法进行IL-I β和IL-18等细胞因子的测定。结 果见图12。
[0192] 在LPS作用下，IL-I β和IL-18等炎性细胞因子水平有明显的升高，而DA的加入 可以有效的抑制这些炎性因子的水平，这表示，DA可以有效的抑制LPS诱导的外周炎症。
[0193] 二、DRDl蛋白可以抑制LPS诱导的外周系统炎症
[0194] 1，选取8?12周的野生鼠（WT)和Drdl缺陷鼠，两种鼠各分成两组，每组三只，共 四组。
[0195] 2,第一组，野生型鼠，腹腔注射PBS作为阴性对照
[0196] 第二组，野生型鼠，腹腔注射LPS，注射剂量为20mg/kg
[0197] 第三组，Drdl缺陷鼠，腹腔注射PBS作为阴性对照
[0198] 第四组，Drdl缺陷鼠，腹腔注射LPS，注射剂量为20mg/kg
[0199] 3,四小时后，用拔眼球的方法收集血液，室温放置半个小时，再低速离心半小时， 收集血清。
[0200] 4,步骤3得到的血清用ELISA的方法进行IL-I β和IL-18等细胞因子的测定。结 果见图13。
[0201] Drdl缺陷鼠的本底细胞因子水平与野生型鼠类似，但是，在LPS作用下，Drdl缺陷 鼠的IL-I β和IL-18等炎性细胞因子水平相比野生型鼠有明显的升高，这表示，DRDl在机 体抑制外周炎症中起到了重要作用，所以，它的缺失，会导致机体炎性因子分泌水平升高。
[0202] 三、DA可以抑制MSU诱导的外周腹腔炎症
[0203] 1，选取8?12周的野生鼠（WT)，鼠分成三组，每组三只。
[0204] 2,第一组，野生型鼠，腹腔注射PBS作为阴性对照
[0205] 第二组，野生型鼠，腹腔注射MSU，注射剂量为每只鼠 0. 5mg
[0206] 第三组，野生型鼠，同时腹腔注射MSU和DA，其中，MSU的注射剂量为每只鼠0. 5mg， DA的注射剂量为50mg/kg
[0207] 3,六小时后，向鼠的腹腔中打入lOmlPBS，并取腹腔灌洗液。
[0208] 4,步骤3得到的腹腔灌洗液用ELISA的方法进行IL-I β等细胞因子的测定。结 果见图14。
[0209] 在MSU的作用下，IL-I β等炎性细胞因子水平有明显的升高，而DA的加入可以有 效的抑制这些炎性因子的水平，这表示，DA可以有效的抑制MSU诱导的外周腹腔炎症。
[0210] 四、DRDl蛋白可以抑制MSU诱导的外周腹腔炎症
[0211] 1，选取8?12周的野生鼠（WT)和Drdl缺陷鼠，两种鼠各分成两组，每组三只，共 四组。
[0212] 2,第一组，野生型鼠，腹腔注射PBS作为阴性对照
[0213] 第二组，野生型鼠，腹腔注射MSU，注射剂量为每只鼠 0. 5mg
[0214] 第三组，Drdl缺陷鼠，腹腔注射PBS作为阴性对照
[0215] 第四组，Drdl缺陷鼠，腹腔注射MSU，注射剂量为每只鼠 0. 5mg
[0216] 3,六小时后，向鼠的腹腔中打入lOmlPBS，并取腹腔灌洗液。
[0217] 4,步骤3得到的腹腔灌洗液用ELISA的方法进行IL-I β等细胞因子的测定。结 果见图15。
[0218] Drdl缺陷鼠的本底细胞因子水平与野生型鼠类似，但是，在MSU作用下，Drdl缺陷 鼠的IL-I β等炎性细胞因子水平相比野生型鼠有明显的升高，这表示，DRDl在机体抑制外 周腹腔炎症中起到了重要作用，所以，它的缺失，会导致机体炎性因子分泌水平升高。
【权利要求】
1. DRD1蛋白用于制备治疗炎症性疾病的药物或试剂盒的用途。 2. DRD1蛋白用作治疗NLRP3炎症小体相关炎症性疾病的药物的靶点的用途。 3. DRD1蛋白用于筛选治疗NLRP3炎症小体相关炎症性疾病药物的用途。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的用途，所述炎症性疾病为NLRP3炎症小体相关的炎 症性疾病，优选为二型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风、肠炎、肝炎、硅肺、紫外线所诱导的皮肤 晒伤、接触性超敏反应、脓毒血症肿瘤或神经退行性疾病，所述DRD1蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No :1 所示。
5. 根据权利要求1-3任一项所述的用途，所述炎症包括中枢系统炎症和外周系统炎 症，优选为外周腹腔炎症。 6. DRD1蛋白的激动剂用于制备治疗炎症性疾病的药物或试剂盒的用途。
7. 根据权利要求6所述的用途，所述激动剂通过DRD1蛋白发挥治疗作用。
8. 根据权利要求6所述的用途，所述炎症性疾病为NLRP3炎症小体相关的炎症性疾病， 优选为二型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风、肠炎、肝炎、硅肺、紫外线所诱导的皮肤晒伤、接触 性超敏反应、脓毒血症肿瘤或神经退行性疾病。
9. 根据权利要求6所述的用途，所述炎症包括中枢系统炎症和外周系统炎症，优选为 外周腹腔炎症。
10. 根据权利要求6所述的用途，所述DRD1蛋白的激动剂选自多巴胺、A-68930、 (±)-SKF_38393hydrochloride、SKF 89626 和 6_Chlor〇-PB hydrobromide 或其组合。
【文档编号】A61K31/55GK104258398SQ201410541635
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】周荣斌, 江维, 闫宜青 申请人:中国科学技术大学